CN107868828A - 检测egfr基因t790m位点的特异性引物探针组合物及试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测EGFR基因T790M位点的特异性引物探针组合物及试剂盒和检测方法，试剂盒包括：上游引物、下游引物、检测T790M突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针。试剂盒针对人类EGFR基因T790M突变设计了特定序列的引物对和特定序列的探针并优化其反应体系，通过Raindropdigital PCR平台的方法，实现对EGFR基因T790M突变的高灵敏度检测并同时获得突变的丰度，其检出限最低可至100000之一。本发明进一步的可检测多样来源样本，既可以是肿瘤组织样本，也可以是ctDNA，扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围，为肺癌T790M突变患者治疗提供用药指导。

Description

检测EGFR基因T790M位点的特异性引物探针组合物及试剂盒 和检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种基于Raindrop微滴式数字PCR的检测EGFR基因T790M位点的特异性引物探针组合物及试剂盒和检测方法。

背景技术

一直以来肺癌都位居全球癌症相关死亡的首位。世界卫生组织国际癌症研究署发布的癌症报告显示：全球肺癌新发病例预测约161万例，死亡约138万例，居恶性肿瘤第一位，其中非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)占肺癌的80％以上。

随着转化医学的飞速发展，晚期非小细胞肺癌患者的治疗已从化疗时代向分子靶转向治疗时代，其中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是最重要的肺癌驱动基因。EGFR-TKIs是针对此靶点的小分子抑制剂，众多临床试验已经证实。EGFR基因活化突变的晚期NSCLC患者能从EGFR-TKIs显著获益。

然而，几乎所有的服务用EGFR-TKIs的患者最终将出现耐药，早期研究发现，越50％耐药的患者具有EGFR20号外显子第790位密码子错义突变(即T790M突变)，并且与EGFR-TKIs疗效密切相关。治疗前对患者进行T790M突变进行检测可以预测EGFR-TKIs疗效，因为研究显示，服用EGFR-TKIs的患者中，T790M高丰度组比低丰度组有着更短的无进展生存期及总生存期。

针对Egfr蛋白且靶向作用于EGFR T790M突变位点的第三代不可逆转的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，如rociletinib和osimertinib已在具有EGFR T790M突变位点的非小细胞肺癌病例中展示出了疗效，这些病例由于该位点的突变对Egfr蛋白的第一代TKI产生了耐药性。其中药物Osimertinib已被FDA批准用于病灶中含有EGFR T790M突变位点的转移性非小细胞肺癌患者的治疗。

目前检测EGFR基因突变最常用的样本来源是肿瘤的病理组织或细胞学标本，但是组织取材均为有创操作，有时难以实施，且这些操作受肿瘤大小、部位、患者一般情况等影响，有时不能取得满意的组织或组织量太少不能进行基因突变检测。并且随着疾病的进展和EGFR-TKIs耐药性的出现，常常需要再次进行分子生物学检测，而组织取材为有创操作，不能便捷、反复进行。近些年血浆游离DNA(ct DNA)被认为是一种可能代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本。肿瘤组织、肿瘤细胞坏死及脱落的肿瘤细胞进入血液后凋亡释游离DNA进入外周血。ctDNA用于肿瘤突变检测优势在于：操作无创；在疾病的任一进程中都可获取；可以作为一种肿瘤标记物，实现实时检测和动态监测；克服肿瘤组织的异质性。因此，使用外周血游离DNA监测患者EGFR基因突变状态，探索患者EGFR-TKI耐药机制及预测预后成为一条可行的途径。然而，目前使用ctDNA检测EGFR基因突变仍有一些技术上的挑战。1)ct DNA含量因人而异，并且大多数人含量较低；2)ct DNA片段相对小，约为180bp：3)ctDNA中肿瘤相关的DNA所占比例不同人差别较大，并且常因比例小而难以测出；4)以前的研究显示，与肿瘤组织相比，ctDNA检测EGFR突变灵敏度仅为43-66％。因此，高灵敏度的ctDNA EGFR基因突变检测技术的发展十分重要。

血液循环游离核酸的突变常常会低于PCR或NGS的最低检测限，基于此2种方案的技术不适用于血液循环游离核酸的检测。因此有必要提供一种能够敏感、特异的检测血液循环游离核酸中EGFR基因T790M位点的检测EGFR基因T790M位点的特异性引物探针组合物及试剂盒和检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测EGFR基因T790M位点的特异性引物探针组合物及试剂盒和检测方法，试剂盒针对EGFR基因T790M突变设计了相应特定序列的引物对和特定序列的Taqman MGB探针，在优化的反应体系中通过Raindrop digital PCR平台实现对EGFR基因T790M突变的高灵敏度检测，并且在检测T790M突变的阴阳性的同时还可以获得样本中突变的比例，从而为EGFR靶向治疗提供参考；本发明可检测的样本来源多样，既可以是肿瘤组织，也可以是ctDNA，扩大了该试剂盒、反应体系和方法的使用范围。

本发明的具体技术方案如下：一种检测EGFR基因T790M位点的特异性引物探针组合物，包括一对特异性引物和一对特异性探针，

引物为：

上游引物：5'-CGTGTGCCGCCTGCTGGGCA-3' SEQ ID NO:1

下游引物：5'-ACTATGTCCGGGAACACAAA-3' SEQ ID NO:2

探针为：

野生型探针VIC：5'-CACGCAGCTCATGCCCT-3' SEQ ID NO:3

突变型探针FAM：5'-ATCATGCAGCTCATGCCC-3' SEQ ID NO:4。

上述检测EGFR基因T790M位点的特异性引物探针组合物的检测EGFR基因T790M位点的试剂盒。

检测T790M突变的Taqman MGB荧光探针5’端连接有荧光报告基团，检测T790M突变的荧光探针3’端连接有淬灭基团；检测野生型的Taqman MGB荧光探针5’端连接有荧光报告基团，且该荧光报告基团不同于检测T790M突变的荧光探针中的荧光报告基团，检测野生型的荧光探针3’端连接有淬灭接团。

检测T790M突变的Taqman MGB荧光探针5’端连接有荧光报告基团VIC，检测T790M突变的荧光探针3’端连接有淬灭基团MGB；检测野生型的Taqman MGB荧光探针5’端连接有荧光报告基团FAM，检测野生型的荧光探针3’端连接有淬灭接团MGB。

所述上游引物、下游引物、检测T790M突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针均以引物探针混合液的形式存在，均溶解在同一TE缓冲液中。

所述上游引物的工作浓度为0.5μM，下游引物的工作浓度为0.5μM，野生型探针的工作浓度为0.2μM，突变型探针的工作浓度为0.2μM。

试剂盒还包括数字PCR反应预混液、阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品通过以下方式制备获得：将EGFR T790M突变基因组DNA与野生型基因组DNA分别进行合成并构建质粒，然后按照突变型：野生型比例为1:1000进行混合，再将混合质粒打断为与ctDNA片段长度接近的170bp左右的片段化DNA；所述阴性质控品通过以下方式制备获得：将EGFRT790M野生型的DNA质粒进行打断，大小为ctDNA片段长度接近的170bp左右的片段化DNA。

质粒DNA打断的方式为将质粒DNA稀释液加到Covaris超声打断管中并进行超声处理。

上述检测EGFR基因T790M位点的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的提取DNA，作为数字PCR扩增的基因模板；

(2)制备ddPCR反应液，其中2×dd PCR专用Master Mix 25μl，10μM上游引物2.5μl，10μM下游引物2.5μl，5μM的野生型探针2μl，5μM的突变型探针2μl，模板15μl，Stabilize1μl，共50μl；

(3)按照Raindrop Source芯片的操作说明，将步骤(2)配制好的PCR反应体系的混合液加样至Raindrop Source芯片中，放置于96孔PCR仪中进行扩增；

(4)扩增结束后，放到Raindrop Sence仪器所指定的位置，开始进行微滴读取，通过Raindropanalyst软件进行荧光信号计算出突变比例。

所述PCR扩增的程序包括：95℃10分钟；94℃30秒，60℃1分钟，共40个循环；98℃10分钟；4℃持续,升降温速率均为0.5℃/S；所述核酸为血液循环游离核酸。

与其他技术相比，本发明具有如下效果：

1.本发明根据EGFR T790M位点设计了特异性的引物和探针，使得在Raindrop数字PCR平台上检测灵敏度达到100000分之一，与ARMS-PCR技术相比，灵敏度极大提高，并且在检测T790M突变的阴阳性的同时还可以获得样本中该突变的比例，可以更好的进行靶向药物的选择，病情监测和预后评估等。

2.该数字PCR可以扩增100bp左右大小的片段，因此既可用于肿瘤组织提取的DNA，也可以用于ct DNA的扩增。

3.与芯片式数字PCR(digital droplet PCR)相比，微滴式数字PCR可以产生更多的独立拷贝，可以更大概率的将单个样本拷贝分离，灵敏度提高至少10倍，性能更强；且整体反应均为闭管式操作，不是开放式操作，对于反应特异性更有所提高，不容易造成气溶胶污染。

4.与NGS ctDNA测序对比，周期短，速度快，准确性高。

附图说明

图1是本发明实施例3中EGFR基因T790M突变比例0.1％的样品的检测结果图(其中突变拷贝(区域2)为124个，野生型拷贝(区域3)为115056个，突变拷贝：野生型拷贝≈0.1％)；

图2是本发明实施例3中EGFR基因T790M突变比例0.01％的样品的检测结果图(其中突变拷贝(区域2)为15个，野生型拷贝(区域3)为108325个，突变拷贝：野生型拷贝≈0.01％)；

图3是本发明实施例3中EGFR基因T790M突变比例0.001％的样品的检测结果图(其中突变拷贝(区域2)为6个，野生型拷贝(区域3)为708568个，突变拷贝：野生型拷贝≈0.001％)；

图4是本发明中EGFR基因无T790M突变的野生型样品进行检测的检测结果图(此结果为中突变型拷贝区域(区域2)未见明显液滴，故判断为图T790M突变拷贝)。

具体实施方式

本发明检测EGFR基因T790M位点的特异性试剂盒，包括：具有如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、具有如SEQ ID NO:3所示序列的检测T790M突变的荧光探针和具有如SEQ ID NO:4所示序列的检测野生型的荧光探针。上游引物SEQ ID NO:1的序列为CGTGTGCCGCCTGCTGGGCA,下游引物SEQ ID NO:2的序列为ACTATGTCCGGGAACACAAA。检测T790M突变的荧光探针序列SEQ ID NO:3为ATCATGCAGCTCATGCCC，检测野生型的荧光探针序列SEQ ID NO:4为CACGCAGCTCATGCCCT。检测T790M突变的Taqman MGB荧光探针5’端连接有荧光报告基团，优选为VIC，检测T790M突变的荧光探针3’端连接有淬灭基团，优选为MGB；检测野生型的Taqman MGB荧光探针5’端连接有荧光报告基团，且该荧光报告基团不同于检测T790M突变的荧光探针中的荧光报告基团，优选为FAM，检测野生型的荧光探针3’端连接有淬灭接团，优选为MGB。

上述试剂盒在另一种实现方式中，所述上游引物、下游引物、检测T790M突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针等均以引物探针混合液的形式存在，即所述上游引物、下游引物、检测T790M突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针均溶解在同一TE缓冲液中。可选的，所述上游引物在引物探针混合液中的浓度为0.5μM，所述下游引物在引物探针混合液中的浓度为0.5μM，所述检测T790M突变的荧光探针在引物探针混合液中的浓度为0.2μM，所述检测野生型的荧光探针在引物探针混合液中的浓度为0.2μM。

上述试剂盒在另一种组合方式中，还包括数字PCR反应预混液，优选CWBIOGoldStar TaqMan Mixture。

上述试剂盒在另一种组合方式中，还包括阳性质控品，所述阳性质控品通过以下方式制备获得：将EGFR T790M突变基因组DNA与野生型基因组DNA分别进行合成并构建质粒，然后按照突变型：野生型比例为1:1000进行混合，再将混合质粒打断为与ctDNA片段长度接近的170bp左右的片段化DNA。

上述试剂盒在另一种组合方式中，还包括阴性质控品，所述阴性质控品通过以下方式制备获得：将EGFRT790M野生型的DNA质粒进行打断，大小为ctDNA片段长度接近的170bp左右的片段化DNA。

本发明中质粒DNA打断的方式为将质粒DNA稀释液加到Covaris超声打断管中并进行超声处理。

一种基于Raindrop微滴式数字PCR检测EGFR基因T790M位点突变的PCR反应体系，包括：

2×dd PCR专用Master Mix 25μl，10μM上游引物2.5μl，10μM下游引物2.5μl，5μM的野生型探针2μl，5μM的突变型探针2μl，模板15μl，Stabilize1μl，共50μl。

其中所述引物探针混合液中包括具有如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、具有如SEQ ID NO:3所示序列的检测T790M突变的荧光探针、具有如SEQ ID NO:4所示序列的检测野生型的荧光探针；上游引物、下游引物检测T790M突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针在PCR反应体系的终浓度分别为500nM、500nM、200nM和200nM。

上述PCR反应体系在另一种组合方式中，所述DNA模板的来源为肿瘤组织中提取的DNA或血浆游离DNA。

一种基于Raindrop微滴式数字PCR检测EGFR基因T790M位点突变的方法，包括以下步骤：

1.制备ddPCR反应液，包括2×dd PCR专用Master Mix 25μl，10μM上游引物2.5μl，10μM下游引物2.5μl，5μM的野生型探针2μl，5μM的突变型探针2μl，模板15μl，Stabilize1μl，共50μl；

2.将1中的反应液加入Raindrop Source芯片相对应的反应孔中，放置于RaindropSource仪器中进行芯片生成，产生的液滴收集在提前放置于Raindrop Source仪器中的8连管中；

3.Source结束后将8连管盖好并放置在96孔PCR仪内进行扩增反应，升降温速度为0.5℃/Sec；

4.将完成PCR反应的8连管盖好相应的乳胶盖之后放置于Raindrop Sence仪器中，再将Raindrop Sence芯片放置于相应位置，进行液滴读取反应；

5.打开Raindrop Analyst软件进行检测和定量分析。

上述芯片式数字PCR方法的PCR扩增程序为：(1)95℃，10min；(2)再进行40个循环，每个循环包括95℃进行15sec，然后60℃进行60sec；(3)40个循环之后98℃进行10min并在15℃下保持10min。

微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成10000000个皮升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

以下结合相应结果图，对本发明的具体实施方式进行描述，但应当理解本发明的保护范围不受相应限制。

实施例1检测人类EGFR基因T790M突变的试剂盒的组成

一种检测人类EGFR基因T790M突变的试剂盒，包括：引物探针混合液和数字PCR反应预混液，其中：引物探针混合液是在TE缓冲液中溶解有具有如SEQ ID NO:1所示序列的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示序列的下游引物、具有如SEQ ID NO:3所示序列的检测T790M突变的荧光探针和具有如SEQ ID NO:4所示序列的检测野生型的荧光探针。检测T790M突变的荧光探针5’端连接有荧光报告基团，为VIC，检测T790M突变的荧光探针3’端连接有淬灭基团，为MGB；检测野生型的荧光探针5’端连接有荧光报告基团，为FAM,检测野生型的荧光探针3’端连接有淬灭接团，为MGB。其中：上游引物和下游引物在引物探针混合液中的浓度均为0.5μM，检测T790M突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针在引物探针混合液中的浓度均为0.2μM，引物探针混合液的配制方法为：将上游引物、下游引物、检测T790M突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针四种成分的干粉分别用TE缓冲液稀释到100μM，然后按照上游引物：下游引物：检测T790M突变的荧光探针：检测野生型的荧光探针＝25：25：1：1体积比混合，混合后的产物即为引物探针混合液；数字PCR反应预混液为CWBIOGoldStar TaqMan Mixture。

检测人类EGFR基因T790M突变的试剂盒还可以包括：阳性质控品和阴性质控品，阳性质控品通过以下方式制备获得：将EGFR T790M突变基因组DNA与野生型基因组DNA进行合成并构建质粒，然后按照突变型：野生型比例为1:1000进行混合，再将混合质粒打断为与ctDNA片段长度接近的170bp左右的片段化DNA；阴性质控品通过以下方式制备获得：将EGFRT790M野生型的DNA质粒进行打断，大小为ctDNA片段长度接近的170bp左右的片段化DNA。

实施例2检测人类EGFR基因T790M突变的方法

1.采用实施例1所述试剂盒；

2.按下表配制PCR反应体系：

2×dd PCR专用Master Mix 25μl，引物探针混合液9μl，模板15μl，Stabilize1μl，共50μl；解释：上面已经有相应的混合液配制过程。

3.按照Raindrop Source芯片的操作说明，将步骤2配制好的PCR反应体系的混合液加样至Raindrop Source芯片中，并准备一个新的8连管放置于仪器指示位置；

4.进行微滴生成之后，将盛有微滴的8连管盖上乳胶盖，放置于96孔PCR仪中进行扩增；

95℃，10min；再进行40个循环，每个循环包括95℃进行15sec，然后60℃进行60sec；

40个循环之后98℃进行10min并在15℃下保持10min；

5.扩增结束后，从PCR仪中取出8连管并盖好乳胶盖子，与Raindrop Sence芯片一起放到Raindrop Sence仪器所指定的位置，开始进行微滴读取；

6.通过Raindropanalyst软件进行荧光信号计算出突变比例。

实施例3使用实施例2中的方法对标准品进行检测

突变比例分别为0.1％、0.01％和0.001％的标准品的检测结果如图1-图3所示，野生型标准品的检测结果如图4所示，其中：含突变的标准品是通过以下方式获得的：将EGFRT790M突变基因组DNA与野生型基因组DNA进行合成并构建质粒，然后按照突变型：野生型比例为1:1000、1:10000、1:100000进行混合，再将混合质粒打断为与ctDNA片段长度接近的170bp左右的片段化DNA；阴性质控品通过以下方式制备获得：将EGFR T790M野生型的DNA质粒进行打断，大小为ctDNA片段长度接近的170bp左右的片段化DNA。

将按照上述方法获得的突变比例分别为0.1％、0.01％和0.001％的标准品，用实施例2中的方法进行检测、计算后得出EGFR基因T790M突变比例分别为：0.11％、0.013％和0.0008％。检测方法的准确性符合预期。

从图3中可以看出使用本申请试剂盒和检测方法，检测EGFR基因T790M突变的灵敏度可达到0.001％。

图1-图4中，显示的每个区域对应反应中呈现不同性质的液滴，其中：第一区域的液滴既没有FAM荧光信号也没有VIC荧光信号的液滴，这些液滴没有样本拷贝，所以无PCR扩增，因此没有任何荧光信号(即：区域1)，该区域必须超过总体液滴数的90％；第二区域为有VIC荧光信号但没有FAM荧光信号的点(即：区域2)代表该微孔进入了含T790M突变DNA拷贝的PCR反应体系，T790M突变DNA模板扩增，因此有VIC荧光信号产生；第三区域为有FAM荧光信号但没有VIC荧光信号的点(即：区域3)代表该微孔进入了含野生型模板但没有突变型模板的PCR反应体系，因此有FAM荧光信号。其中每一区域旁的数字为该区域液滴的数量，可以根据第二区域与第三区域的比值得出样本中T790M突变拷贝与T790M野生拷贝的比值，从而推算出突变丰度。

实施例4使用实施例2中的方法对实际样品进行检测。

使用实施例2中的方法对5例临床为非小细胞肺癌并经过EGFR-TKI治疗6个月左右的病人的血液样本进行检测，采血量为10mL。T790M突变在经过EGFR-TKI治疗之前比例较低，经过EGFR-TKI治疗治疗之后比例明显升高。

一、血样中ctDNA的检测：

1.混匀保存在streck抗凝管中的全血样本10ml(样本采集不超过72小时)，1600g、4℃离心10min，取澄清的血浆；

2.将血浆分装到1.5ml管中，放置于4℃离心机中设置转速为16000g离心15min，取澄清血浆；

3.用ctDNA提取试剂盒(TIANGEN Serum/Plasma Circulating DNA Kit)，按照说明书操作提取ctDNA；

4.ctDNA经质检及Qubit3.0定量后确认总量不少于50ng，按照实施例2中的检测方法进行检测。

二、检测结果如下：

样本编号1：ctDNA T790M检测结果：阴性；样本编号2：ctDNA T790M检测结果：0.91％；

样本编号3：ctDNA T790M检测结果：阴性；样本编号4：ctDNA T790M检测结果：阴性；

样本编号5：ctDNA T790M检测结果：0.1825％；

结果显示，5例ctDNA样本中成功的检测到了2例EGFR-TKI治疗后出现EGFR T790M阳性的样本。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 中源协和基因科技有限公司

<120> 检测EGFR基因T790M位点的特异性引物探针组合物及试剂盒和检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtgtgccgc ctgctgggca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2

actatgtccg ggaacacaaa 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 3

cacgcagctc atgccct 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 4

atcatgcagc tcatgccc 18

Claims (10)

1.一种检测EGFR基因T790M位点的特异性引物探针组合物，其特征在于，包括一对特异性引物和一对特异性探针，

引物为：

上游引物：5'-CGTGTGCCGCCTGCTGGGCA-3'SEQ ID NO:1

下游引物：5'-ACTATGTCCGGGAACACAAA-3'SEQ ID NO:2

探针为：

野生型探针VIC：5'-CACGCAGCTCATGCCCT-3'SEQ ID NO:3

突变型探针FAM：5'-ATCATGCAGCTCATGCCC-3'SEQ ID NO:4。

2.含有权利要求1所述检测EGFR基因T790M位点的特异性引物探针组合物的检测EGFR基因T790M位点的试剂盒。

3.根据权利要求2所述检测EGFR基因T790M位点的试剂盒，其特征在于，检测T790M突变的Taqman MGB荧光探针5’端连接有荧光报告基团，检测T790M突变的荧光探针3’端连接有淬灭基团；检测野生型的Taqman MGB荧光探针5’端连接有荧光报告基团，且该荧光报告基团不同于检测T790M突变的荧光探针中的荧光报告基团，检测野生型的荧光探针3’端连接有淬灭接团。

4.根据权利要求3所述检测EGFR基因T790M位点的试剂盒，其特征在于，检测T790M突变的Taqman MGB荧光探针5’端连接有荧光报告基团VIC，检测T790M突变的荧光探针3’端连接有淬灭基团MGB；检测野生型的Taqman MGB荧光探针5’端连接有荧光报告基团FAM，检测野生型的荧光探针3’端连接有淬灭接团MGB。

5.根据权利要求3所述检测EGFR基因T790M位点的试剂盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物、检测T790M突变的荧光探针和检测野生型的荧光探针均以引物探针混合液的形式存在，均溶解在同一TE缓冲液中。

6.根据权利要求2或5所述检测EGFR基因T790M位点的试剂盒，其特征在于，所述上游引物的工作浓度为0.5μM，下游引物的工作浓度为0.5μM，野生型探针的工作浓度为0.2μM，突变型探针的工作浓度为0.2μM。

7.根据权利要求2所述检测EGFR基因T790M位点的试剂盒，其特征在于，还包括数字PCR反应预混液、阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品通过以下方式制备获得：将EGFRT790M突变基因组DNA与野生型基因组DNA分别进行合成并构建质粒，然后按照突变型：野生型比例为1:1000进行混合，再将混合质粒打断为与ctDNA片段长度接近的170bp左右的片段化DNA；所述阴性质控品通过以下方式制备获得：将EGFRT790M野生型的DNA质粒进行打断，大小为ctDNA片段长度接近的170bp左右的片段化DNA。

8.根据权利要求7所述检测EGFR基因T790M位点的试剂盒，其特征在于，质粒DNA打断的方式为将质粒DNA稀释液加到Covaris超声打断管中并进行超声处理。

9.如权利要求2所述检测EGFR基因T790M位点的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的提取DNA，作为数字PCR扩增的基因模板；

(2)制备ddPCR反应液，其中2×dd PCR专用Master Mix 25μl，10μM上游引物2.5μl，10μM下游引物2.5μl，5μM的野生型探针2μl，5μM的突变型探针2μl，模板15μl，Stabilize1μl，共50μl；

(3)按照Raindrop Source芯片的操作说明，将步骤(2)配制好的PCR反应体系的混合液加样至Raindrop Source芯片中，放置于96孔PCR仪中进行扩增；

(4)扩增结束后，放到Raindrop Sence仪器所指定的位置，开始进行微滴读取，通过Raindropanalyst软件进行荧光信号计算出突变比例。

10.根据权利要求9所述检测EGFR基因T790M位点的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：95℃10分钟；94℃30秒，60℃1分钟，共40个循环；98℃10分钟；4℃持续,升降温速率均为0.5℃/S；所述核酸为血液循环游离核酸。