CN110438226B - 一种检测顺反式突变的试剂盒、样品处理方法及判定方法 - Google Patents

一种检测顺反式突变的试剂盒、样品处理方法及判定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测顺反式突变的试剂盒、样品处理方法及判定方法，所述试剂盒包括内控引物和突变检测引物。样品处理方法，包括获取待测样本、样本制备、检测、获得处理后的样本4步。判定方法，包括阳性结果判定、T790M‑C797S顺反式判断和质量控制。有益效果：1、高灵敏度；2、适用样本范围广；3、低成本；4、操作方便。

Description

一种检测顺反式突变的试剂盒、样品处理方法及判定方法
技术领域
本发明涉及一种检测材料，尤其涉及一种检测顺反式突变的试剂盒、样品处理方法及判定方法。本发明可用于对肺癌EGFR基因T790M、C797S及T790M-C797S顺反式突变情况的检测。本发明仅用于肺癌病人用药指导的辅助检测，而非疾病诊断试剂。
背景技术
研究表明，癌症是环境因素与细胞遗传物质相互作用的结果，是多因素、多阶段与多基因作用的结果，是基因突变累积的结果，因此癌症是基因病。在人类众多的基因中，原癌基因和抑癌基因与癌症的发生发展密切相关。原癌基因和或抑癌基因的突变可引起细胞癌变。癌症在形成实性肿块以前，与癌症相关的基因突变的过程已经发生，而且这个过程可能已长达十余年、甚至更长时间。在这期间，癌细胞还没有形成明显的肿块，但已有微量肿瘤DNA释放到循环血液中。通过测序，PCR等基因检测技术检测循环血液中这些基因的突变，可以筛查早期或超早期癌症，评估放化疗的疗效，预测靶向药物的疗效，监测术后早期复发等；对肿瘤组织进行基因突变检测，有助于了解肿瘤的产生、发展过程，判断肿瘤的类型和预后；有助于预测原癌基因相关抗肿瘤药物的疗效。基因突变常表现为杂合突变、缺失或插入突变等，突变检测对测序的质量要求很高。通过应用基因分析仪进行突变分析，可准确判断出杂合、缺失、插入突变等各种突变类型，结果准确客观。
EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一。HER家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4四个分子构成，在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥重要的调节作用。
EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体激酶域激活与癌细胞增殖、转移和凋亡等多种信号传导通路有关。肺腺癌患者EGFR基因敏感突变的亚裔人群阳性率要高于高加索人群。EGFR突变主要发生在胞内酪氨酸激酶(TK)区域的前四个外显子上(18～21)，目前发现的TK区域突变有30多种。缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是del E746-A750，替代突变最常见的是发生在外显子21上的L858R，复制或插入突变发生在外显子20上。其中外显子20上的T790M替代突变为一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine KinaseInhibitor，TKI)的耐药突变。此外，还有许多类型的突变临床意义尚不明确。EGFR作为癌症治疗的分子靶标受到普遍关注，并已陆续开发出了吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)和埃克替尼(Icotinib)等TKI。
ARMS-PCR(Amplification Refractory Mutation System)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。其核心原理是根据PCR过程中DNA聚合酶引导的引物延伸从引物的3’末端开始，而引物3’末端的碱基与模板的互补配对程度强烈影响聚合酶的识别作用和PCR反应的进行：若这个碱基与模板正常互补配对(A-T，G-C)，则引物可以不间断延伸，PCR得以高效进行，得到完整的产物；反之，若这个碱基与模板非正常配对，则引物的延伸受到阻滞，PCR效率大大降低。常规的ARMS-PCR技术操作简便，检测时间较短，检测灵敏度一般在1％左右，在检测血液样本时，敏感性较低，检出率明显低于相应的肿瘤组织样本，同时检测通量也不如测序方法。
测序技术是对核酸的序列直接进行测定来检测基因突变的情况，测序技术近年来发展迅速，从第一代的sanger测序法，到第二代高量测序，再到最新一代的单分子测序，检测通量及灵敏度有了大幅提高。Sanger测序法利用在DNA合成反应体系中，混入一定比例带有同位素标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，使DNA合成延伸终止在不同的核苷酸上，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和显影获得待测DNA的碱基序列。二代测序技术又称为高通量测序技术，各家公司的测序技术原理有一定差异。高通量测序一次能够并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，测序深度远高于一代测序技术，但测序的片段长度较短。但高通量测序的检测过程繁琐，耗时需要几天，成本也较高。
数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法，光度法基于核酸分子的吸光度来定量；实时荧光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值，Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数；数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。该方法的仪器和试剂成本较高，操作繁琐，通量也有限，目前市场上很难推广。
现有技术的不足与缺点：
常规的ARMS-PCR技术操作简便，检测时间较短，检测灵敏度一般在1％左右，在检测血液样本时，敏感性较低，检出率明显低于相应的肿瘤组织样本，同时检测通量也不如测序方法。Sanger测序技术的检测特异性和通量均较高，但是方法本身灵敏度不高，也不能检测大片段缺失重排，且需预先PCR和电泳才可以测序，耗时耗力，不适合大规模的应用。二代测序技术在测序深度上有了很大的提高，因此敏感性比一代测序有了提升，但检测成本、灵敏度及操作的方便性等方面均不如ARMS-PCR技术。数字PCR应用于肿瘤基因突变检测，其技术原理决定了其有着极高的检测灵敏度和特异性。主要劣势是成本高、操作繁琐，通量也较低，一个反应只能检测一个突变位点。
发明内容
本发明用于定性检测肺癌福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本DNA及血液游离DNA中人EGFR基因第20外显子上的T790M及C797S基因突变，及T790M-C797S顺式突变。
奥希替尼第三代靶向EGFR-TKI，针对T790M突变导致的耐药有较好的响应率，对于T790M阳性的患者的客观应答率(ORR)约为57％～61％。但有患者表现出对该药的耐药，经过基因组测序发现，主要的突变位点是EGFR基因上的C797S。如果C797S和T790M在不同的染色体上(称为反式构型)，患者可以使用一代和三代EGFR-TKI联合去控制(如特罗凯联合奥希替尼)，但是如果患者检测的基因突变显示C797S和T790M在同一染色体上(称为顺式构型)，则目前没有任何靶向药物可以控制，患者可以穿插化疗、抗血管生成的靶向药物，以及适当空窗，等耐药基因丢失后，寄希望之前耐药的靶向药物可以重新复敏。
本发明提供一种检测顺反式突变的试剂盒，包括内控引物和突变检测引物；其中，内控引物包括TBP F7253引物；所述TBP F7253引物的序列5'-3'为：TTTCTTCATGTTTATCCACTGTGTGGTAT；突变检测引物包括T790M&C797S-Pb引物；所述T790M&C797S-Pb引物的序列5'-3'为：FAM-CAGCTCATGCCCTTCG-MGB。
进一步说，内控引物还包括TBP R7334引物和TBP-Pb7288R引物；其中，TBP R7334引物的序列5'-3'为：AAACATTAATTACGGAAGAACCAGCTAT；TBP-Pb7288R引物的序列5'-3'为：VIC-TCTTATACACATTGCTTTCT-MGB。
进一步说，突变检测引物还包括T790M-Pb引物和C797S-Pb引物；其中，T790M-Pb引物的序列5'-3'为：FAM-CATGCCCTTCGGCTGCCTCC-BHQ1；C797S-Pb引物的序列5'-3'为：FAM-CACGCAGCTCATGCCCTTCGG-BHQ1。
进一步说，，突变检测引物还包括T790M-F引物、C797S-R引物、EGex20-R引物和EGex20-F引物；其中，T790M-F引物的序列5'-3'为：CACCGTGCAGCTCATCAT；C797S-R引物的序列5'-3'为：CATAGTCCAGGAGGG；EGex20-R引物的序列5'-3'为：CAATATTGTCTTTGTGTT；EGex20-F引物的序列5'-3'为：ACCTCCACCGTGCAG。
进一步说，突变检测引物还包括TBP R7334引物和TBP-Pb7288R引物；其中，TBPR7334引物的序列5'-3'为：AAACATTAATTACGGAAGAACCAGCTAT；TBP-Pb7288R引物的序列5'-3'为：VIC-TCTTATACACATTGCTTTCT-MGB。优选的方案是，本发明的内控引物仅由TBP F7253引物、TBP R7334引物和TBP-Pb7288R引物构成；突变检测引物仅由T790M&C797S-Pb引物、T790M-Pb引物、C797S-Pb引物、T790M-F引物、C797S-R引物、EGex20-R引物和EGex20-F引物构成。
进一步说，试剂盒含有3个反应管，依次命名为1号管、2号管和3号管，其中，在命名为1号管的反应管中，设有TBP F7253引物、TBP R7334引物、TBP-Pb7288R引物、T790M&C797S-Pb引物、T790M-F引物、C797S-R引物；在命名为2号管的反应管中，设有TBP F7253引物、TBP R7334引物、TBP-Pb7288R、790M-F、T790M-Pb引物、EGex20-R引物；在命名为3号管的反应管中，设有TBP F7253引物、TBP R7334引物、TBP-Pb7288R引物、C797S-R引物、C797S-Pb引物、EGex20-F引物。
进一步说，反应管为4联荧光PCR管；每个反应管内配有试剂：Taq酶和PCR反应缓冲液。
进一步说，本试剂盒具有：灵敏度高、适用样本范围广、成本低、操作方便的特点；其中：1)灵敏度高：在25ng DNA背景下的检测灵敏度最高可达到0.1％；2)适用样本范围广：可用于新鲜组织，FFPE，冰冻组织、血液、尿液的检测；3)成本低：检测成本不及数字PCR的30％；4)操作方便：只需在反应管内加入DNA模板，即可上机完成检测；人工操作少；不包括核酸纯化过程的整个检测过程不超过2小时。
进一步说，试剂盒由EGFR 4联PCR反应条、EGFR阳性对照组成；反应条每孔的基本组成为：1×PCR Buffer,2～8pmol dNTPs,1.5～4.0mM MgCl2,，0.5～2U HS Taq,0.1～1UUNG酶。按表1)在4联管中依次加入各引物探针，终浓度为100～400nM。
进一步说，本发明所述的一种检测顺反式突变的试剂盒的检测仪器，是由ABI7500、高速离心机、低速离心机、恒温干浴器、漩涡震荡仪、冰箱组成。
进一步说，本发明所述的一种检测顺反式突变的试剂盒的样品处理方法，包括如下步骤：
获取待测样本：将样本采集并存入本试剂盒的反应管内；
样本制备：使用cfDNAkit提取本试剂盒内样本的DNA；
检测：在4联条每个反应孔内加入20μl待测样本，盖好4联条的管盖，按以下程序上机检测：
(1)95℃，2～10min；
(2)95℃，5～16sec，62℃，40～60sec，72℃，30～60sec；共计15个循环；
(3)95℃，5～16sec，60℃，40～60sec，72℃，30～60sec(收集FAM、VIC、ROX和Cy5荧光信号)；共计25个循环；
(4)获得处理后的样本。
进一步说，本发明所述的一种检测顺反式突变的试剂盒的样品处理方法的判定方法，其结果判定包括：阳性结果判定、T790M-C797S顺反式判断和质量控制；其中，
阳性结果判定：根据荧光PCR扩增曲线的拐点设置阈值，1～3号反应管，FAM通道Ct值在20以内为阳性结果，Ct值在20至22之间的为灰区，Ct值大于22的为阴性；
T790M-C797S顺反式判断：(1)1～3管均为阳性，突变类型为T790M-C797S顺式；(2)1号管为阴性，2,3管为阳性，突变类型为T790M-C797S反式；
质量控制：VIC通道为内控信号，FAM与VIC均无扩增信号的为无效结果。
本发明技术方案带来的有益效果：
1、高灵敏度：检测灵敏度最高可达到0.1％(25ngDNA背景)，远高于传统检测技术，与数字PCR相当。
2、适用样本范围广：可用于肿瘤组织样本(新鲜组织，FFPE，冰冻组织等)，体液样本(如血液、尿液等)。
3、低成本：检测成本不及数字PCR的30％，性价比高。
4、操作方便：只需在反应管内加入DNA模板，即可上机完成检测，人工操作少，整个检测过程不超过2小时(不包括核酸纯化过程)。快速检测样本中T790M和C797S突变及顺反式类型。
具体实施方式
实施例1：
实施例一：
一、引物序列设计，详见表1：
Figure BDA0002143847660000061
Figure BDA0002143847660000071
二、样本制备
使用cfDNAkit提取试剂盒病人的血浆DNA。
三、仪器
ABI7500、高速离心机、低速离心机、恒温干浴器、漩涡震荡仪、冰箱。
四、试剂盒的组成
试剂盒由EGFR 4联PCR反应条、EGFR阳性对照组成。
反应条每孔的基本组成为：1×PCR Buffer,2～8pmol dNTPs,1.5～4.0mMMgCl2,，0.5～2U HS Taq,0.1～1U UNG酶。按表1)在4联管中依次加入各引物探针，终浓度为100～400nM。
五、检测过程
在4联条每个反应孔内加入20μl待测样本，盖好4联条的管盖，按以下程序上机检测。
95℃，2～10min；
95℃，5～16sec，62℃，40～60sec，72℃，30～60sec；共计15个循环。
95℃，5～16sec，60℃，40～60sec，72℃，30～60sec(收集FAM、VIC、ROX和Cy5荧光信号)；共计25个循环。
六、结果判定
阳性结果判定：根据荧光PCR扩增曲线的拐点设置阈值，1～3号反应管，FAM通道Ct值在20以内为阳性结果，Ct值在20至22之间的为灰区，Ct值大于22的为阴性。
T790M-C797S顺反式判断：1～3管均为阳性，突变类型为T790M-C797S顺式；1号管为阴性，2,3管为阳性，突变类型为T790M-C797S反式。
质量控制：VIC通道为内控信号，FAM与VIC均无扩增信号的为无效结果。
更进一步强调的是，本发明的技术关键点为引物的序列，具体详见下表：(按重要性依次排列)
引物序列
Figure BDA0002143847660000072
Figure BDA0002143847660000081
本发明的辅助材料包括：试剂与耗材，其中，试剂：Taq酶，PCR反应缓冲液；耗材：4联荧光PCR管。
本发明是用于对特定DNA的定性和/或定量检测之用，并非医学上的临床诊断。在正常人体内存在合理尺度范围内的病菌、病变、敏感基因等。换言之，任何疾病的发生，是量变积累的过程，需要医生结合相关检验数据、病例表征进行综合判断。

Claims (3)

1.一种检测顺反式突变的试剂盒，其特征在于，试剂盒含有3组引物，依次命名为第一组引物、第二组引物和第三组引物，其中，
第一组引物包括：TBP F7253引物、TBP R7334引物、TBP-Pb7288R引物、T790M&C797S-Pb引物、T790M-F引物、C797S-R引物；其中：
TBP F7253引物的序列5'-3'为：TTTCTTCATGTTTATCCACTGTGTGGTAT；
TBP R7334引物的序列5'-3'为：AAACATTAATTACGGAAGAACCAGCTAT；
TBP-Pb7288R引物的序列5'-3'为：VIC-TCTTATACACATTGCTTTCT-MGB；
T790M&C797S-Pb引物的序列5'-3'为：FAM-CAGCTCATGCCCTTCG-MGB；
T790M-F引物的序列5'-3'为：CACCGTGCAGCTCATCAT；
C797S-R引物的序列5'-3'为：CATAGTCCAGGAGGG；
第二组引物包括：TBP F7253引物、TBP R7334引物、TBP-Pb7288R、790M-F、T790M-Pb引物、EGex20-R引物；其中：
T790M-Pb引物的序列5'-3'为：FAM-CATGCCCTTCGGCTGCCTCC-BHQ1；
EGex20-R引物的序列5'-3'为：CAATATTGTCTTTGTGTT；第三组引物包括：TBP F7253引物、TBP R7334引物、TBP-Pb7288R引物、C797S-R引物、C797S-Pb引物、EGex20-F引物；其中：
C797S-Pb引物的序列5'-3'为：FAM-CACGCAGCTCATGCCCTTCGG-BHQ1；
EGex20-F引物的序列5'-3'为：ACCTCCACCGTGCAG。
2.根据权利要求1所述的一种检测顺反式突变的试剂盒，试剂盒内配有反应管；其特征在于，反应管为4联荧光PCR管；每个反应管内配有试剂：Taq酶和PCR反应缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种检测顺反式突变的试剂盒，其特征在于，试剂盒由EGFR 4联PCR反应条、EGFR阳性对照组成；反应条每孔的组成为：1×PCR Buffer,2～8pmol dNTPs,1.5～4.0mM MgCl2,，0.5～2U HS Taq,0.1～1U UNG酶；在4联管中依次加入各引物，终浓度为100～400nM.。
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