CN110863051B

CN110863051B - 一种met基因扩增检测的引物、体系及试剂盒

Info

Publication number: CN110863051B
Application number: CN201911283683.5A
Authority: CN
Inventors: 闫文瑞; 林威; 唐同民; 蔡兴盛; 李梦真; 邓泱泱; 杨冬成
Original assignee: Guangzhou Mygene Medical Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Mygene Medical Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2020-10-23
Anticipated expiration: 2039-12-13
Also published as: CN110863051A

Abstract

本发明公开了一种用于MET基因扩增检测的引物组、试剂盒及相关的用药指导系统，其特点在于构建了用于校正引物、扩增体系误差的校准质粒和标准质粒，提高了试剂盒的准确性，采用2‑△△Ct方法，不仅适用于2倍体动物的基因拷贝数检测，也适用于多倍体的动物、植物、微生物等确定某一个基因的拷贝数，从而解决了PCR法不容易检测基因拷贝数的难题，且本方法简单、容易操作、容易判读结果，为其他检测基因拷贝数(如基因扩增、染色体结构变异)的应用提供了非常有益的思路。

Description

一种MET基因扩增检测的引物、体系及试剂盒

技术领域

本发明生物技术领域，涉及一种用于MET基因扩增检测的引物组、体系及试剂盒。

背景技术

肺癌在世界范围内和我国的发病率和死亡率均居恶性肿瘤第一位，是癌症相关死亡的主要原因。约85％～90％的肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)，对于发生了EGFR突变的非小细胞肺癌(NSCLC)患者，表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)是治疗该类型肺癌的有效药物。

研究表明，尽管在EGFR突变的非小细胞肺癌(NSCLC)中，EGFR TKIs具有巨大的益处，但患者最终都对吉非替尼和厄洛替尼产生了耐药性(称为“获得性耐药性”)。

获得性耐药的两种机制已得到验证。第一种机制是在50％的耐药病例中观察到EGFR的继发突变，包括EGFR T790M耐药突变；第二种机制是在20％的耐药病例中观察到MET癌基因的扩增。这两种耐药机制均导致ERBB3/PI3K/AKT信号传导的持续激活，而导致肿瘤细胞对吉非替尼耐药。

研究发现，由于MET扩增导致的EGFR-TKIs耐药反应，可以通过EGFR和MET抑制剂联合使用而极大改善耐药反应的发生，表明MET扩增检测对EGFR突变型的非小细胞肺癌患者治疗方案的选择具有重要意义。

MET原癌基因，位于染色体7q31.2位置，包含21个外显子，编码跨膜受体蛋白细胞间质-上皮转换因子(Cellular-mesenchymal to epithelial transition factor，c-MET)。c-MET属于酪氨酸激酶受体，是肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)的膜受体。

c-MET与其配体HGF结合后，可被诱导二聚体化并进入激活状态，进而将其底物磷酸化，激活细胞多种下游信号通路。c-MET参与的信号通路包括PI3K-AKT-mTOR途径以及RAS-RAF-MEK-ERK途径(即MAPK/ERK通路)。PI3K-AKT-mTOR途径参与细胞存活，而RAS-RAF-MEK-ERK途径参与细胞增殖。在正常生理条件下，c-MET在细胞存活、增殖、迁移和胚胎发育过程中具有重要作用。在恶性肿瘤中，发生致病性突变的MET基因将编码出异常的MET受体，通过传递异常信号促进细胞生长、生存、侵袭、转移、血管生成等。持续的信号传递会造成细胞过度增殖，因此导致肿瘤的发生与进展。

在患有非小细胞肺癌人群的不同地区中，MET基因扩增的发生频率为1.4％-11.1％。MET扩增与晚期结直肠癌及其肝转移具有一定联系，MET基因扩增对晚期CRC肝转移进展具有重要意义。在晚期CRC治疗过程中，需要重视MET扩增的检测。

目前MET扩增的检测方法主要有二代测序NGS，荧光原位杂交(FISH)和Southern印迹杂交，以及数字PCR的方法。二代测序方法能够同时对多个样本同时检测，且可以对多个基因位点检测，但成本较高、实验周期较长，且数据分析复杂；荧光原位杂交(FISH)技术检测MET扩增特异性高，但是样本处理周期长，成本高(探针价格昂贵)，且无法高通量的检测，结果判读主观性和专业性较强；Southern印迹杂交技术也可以检测MET扩增，但操作步骤繁琐，且容易造成假阳性，临床应用不易推广。数字PCR虽然理论上可以实现对核酸分子的绝对定量，实现单分子检测，但是成本较高、操作繁琐。

发明内容

考虑到部分非小细胞肺癌(NSCLC)患者无法获取组织标本，因此液体活检用于检测将会对患者带来巨大的益处，而且可以持续性检测其基因突变状态。因此，一款不仅可以检测组织标本，还可以使用外周血提取的游离DNA(cfDNA)检测基因突变的试剂盒尤为重要，从而为临床用药指导、改善患者的预后提供很大帮助。而且，本发明中的定量方法不仅适用于2倍体动物的基因拷贝数检测，也适用于多倍体的动物、植物、微生物等确定某一个基因的拷贝数，从而解决了PCR法不容易检测基因拷贝数的难题，且本方法简单、容易操作、容易判读结果，对比其他方法具有非常明显的优势，为其他检测基因拷贝数(如基因扩增、染色体结构变异)的应用提供了非常有益的思路。

本发明所采取的技术方案是：

MET检测试剂在制备非小细胞肺癌检测试剂中的应用。

上述MET检测试剂包括MET引物组、内参引物组、PCR试剂。

在一些实例中，MET引物组序列如下：

F1：5’-ATGCTTTACTGTGTATCCTAGTT-3’(SEQ ID NO:1)；

R1：5’-CAGGGGACTGATACTTTAC-3’(SEQ ID NO:2)。

作为上述试剂盒的进一步改进，内参引物为GAPDH引物，其引物序列如下：

F2：5’-CTTCTAGGTATGACAACGAATT-3’(SEQ ID NO:3)；

R2：5’-CAGTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3’(SEQ ID NO:4)。

在一些实例中，PCR试剂包括：PCR反应缓冲液、热启动Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、SYBR Green I荧光染料。

在一些实例中，所述MET检测试剂还包括阳性对照，所述阳性对照为含有MET扩增引物组的质粒载体。

一种指导非小细胞肺癌用药的系统，包括监测装置和管理分析装置，其特征在于：

所述监测装置用于监测样本中MET基因的表达量；

所述管理分析装置用于判断样本中MET基因的拷贝数是否发生扩增而对临床用药提供参考。

在一些实例中，所述监测装置包括上述的MET检测试剂。

在一些实例中，所述监测装置中确定MET基因的表达量的定量方法为：

1)分别用MET引物和内参引物对待测样本进行扩增，计算所得到的两个基因的Ct值的差值，两个基因的Ct值差值记为△Ct1，Ct(M,S)表示该样本中对MET基因扩增得到的Ct值，Ct(G,S)表示该样本中扩增内参基因的Ct值，公式为△Ct1＝Ct(M,S)-Ct(G,S)；

2)分别用MET引物和内参引物对校准质粒进行扩增，计算所得到的两个基因的Ct值的差值，△Ct2表示校准质粒中MET基因与内参基因的Ct差值，Ct(M,C)表示校准质粒中对MET基因进行扩增得到的Ct值，Ct(G,C)表示校准质粒中对内参基因扩增得到的Ct值，公式为：△Ct2＝Ct(M,C)-Ct(G,C)；

3)用待测样本中得到的△Ct1值减去△Ct2就得到待测样本的校正△Ct值，co△Ct表示待测样本中经校正后得到的MET基因与内参基因的Ct差值，公式为co△Ct＝△Ct1-△Ct2；

4)根据PCR每一轮扩增得到的分子数是扩增前的2倍，计算待测样本中MET基因与内参基因的拷贝数比率CNR，公式为：CNR＝2-co△Ct。

本发明的有益效果是：

1)实验操作简便，极大的缩短实验周期。

本试剂盒在荧光定量PCR扩增后不需要琼脂糖凝胶电泳，可以直接上机检测，减少操作时间，降低样本交叉污染的可能，而且实验操作周期短，收到标本后，实验操作与上机检测、数据分析，仅需要两个小时就可以完成，极大的提高了样本的检测效率，缩短了整个检测的实验周期。

2)结果容易判读，灵敏度高。

本试剂盒的重点是使用了2-△△Ct方法，通过构建校准质粒，用于校准引物、PCR扩增体系造成的误差，可以提高MET扩增检测的准确性。同时，构建了两种质粒，标准质粒1和标准质粒2，对PCR的过程进行质控，进一步保证了检测的准确性。相比现有技术，本试剂盒可以对10ng的核酸样本准确检测，且结果容易计算，容易判读。

3)低成本，高品质。

本试剂盒经优化后的体系，成本小，收益高，在临床检测中容易推广。而且，本试剂盒通过熔解曲线分析，对扩增产物进行质控，对MET基因和GAPDH基因的Tm值质控，可以避免非特异扩增造成的不准确。对于临床未满足的MET基因扩增单基因检测提供了很好的选择。

附图说明

图1为校准质粒(Calibrator)的示意图。

图2为标准质粒1的示意图。

图3为标准质粒2的示意图。

图4为校准质粒的MET基因和GAPDH基因以及阴性质控的扩增曲线。

图5为校准质粒的MET基因和GAPDH基因的融解曲线。

图6为6例临床标本的MET基因扩增曲线。

图7为6例临床标本的GAPDH基因扩增曲线。

图8为6例临床标本的MET基因和GAPDH基因融解曲线。

具体实施方式

本试剂盒需要通过设计MET基因的引物和内参基因的引物，采用相对定量2-△△Ct方法，构建三种质粒，一种作为校准质粒，另外两种是标准质粒。以MET基因和内参基因的扩增Ct值代入公式，计算MET基因的拷贝数。

由于人基因组是二倍体，MET基因的拷贝数在正常细胞的基因组中是2，如果检测的结果大于2，说明存在MET基因的扩增，并且可以计算出具体的拷贝数。以此检测MET基因是否有扩增。

1.引物设计

本实验对MET基因和内参基因设计多对引物，从中筛选出优选的引物组合。选择一个内参基因，作为体系是否正常扩增的参照。扩增产物的长度在120bp左右，不大于150bp。

扩增产物的长度在150bp以内，可以用于血浆游离DNA的检测。

MET基因和内参基因的部分序列如下：

MET基因扩增检测的引物序列如下表：

GAPDH基因检测的引物序列如下表：

2.构建质粒

本试剂盒检测MET基因扩增的方法，需要构建三种质粒，这三种质粒分别是校准质粒(Calibrator)、标准质粒1、标准质粒2，具体构建过程如下：

1)校准质粒(Calibrator)：

校准质粒(Calibrator)的示意图如图1所示。

首先使用MET基因的引物F1和R1,以正常人基因组为模板扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后与pGEM-T-easy Vector载体连接、转化，将一个片段的MET靶基因片段插入T载体。

其次，使用GAPDH内参基因的包含酶切位点ApaI和NcoI的引物F5和R5，以正常人基因组为模板扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后，使用ApaI和NcoI内切酶双酶切该产物。

再次，将已经插入MET目的基因的T载体也使用ApaI和NcoI内切酶双酶切。

然后将GAPDH对照基因片段连接至经ApaI和NcoI双酶切的T载体。因此，在校准质粒(Calibrator)中，MET基因与GAPDH内参基因基因的拷贝数比值为1：1。

2)标准质粒1：

标准质粒1的示意图如图2所示。

首先使用MET基因的含有SalI和NsiI酶切位点的引物F2和R2，以正常人基因组为模板扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后，使用SalI和NsiI内切酶双酶切该产物。

其次，将校准质粒(Calibrator)也使用SalI和NsiI内切酶双酶切。

然后将经SalI和NsiI双酶切的MET基因片段连接至经SalI和NsiI双酶切的校准质粒(Calibrator)。

因此，在标准质粒1中，MET基因与GAPDH内参基因的拷贝数比值为2：1。

3)标准质粒2：

标准质粒2的示意图如图3所示。

首先使用GAPDH基因的含有SalI和NsiI酶切位点的引物F4和R4，以正常人基因组为模板扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后，使用SalI和NsiI内切酶双酶切该产物。

其次，将标准质粒1也使用SalI和NsiI内切酶双酶切。

然后将经过SalI和NsiI双酶切的GAPDH基因片段连接至经SalI和NsiI双酶切的标准质粒1。

因此，在标准质粒2中，MET基因与GAPDH内参基因的拷贝数为比值1：2。

3.计算分析

用MET基因的引物F1、R1，和GAPDH内参基因的引物F3、R3，分别对待测样本进行扩增，所得到的两个基因的Ct值差值记为△Ct1。

公式1为：△Ct1＝Ct_(M,S)-Ct_(G,S)。

(M：MET基因；G：GAPDH内参基因；S：待测样本sample)。

公式1中，△Ct1表示单个待测样本中MET基因与GAPDH内参基因的Ct差值，Ct_(M,S)表示该样本中对MET基因扩增得到的Ct值，Ct_(G,S)表示该样本中扩增GAPDH内参基因的Ct值。

用MET基因的引物F1、R1，和GAPDH内参基因的引物F3、R3，对校准质粒(Calibrator)进行扩增，得到两个基因的Ct值的差值记为△Ct2。

公式2为：△Ct2＝Ct_(M,C)-Ct_(G,C)。

(M：MET基因；G：GAPDH内参基因；C：校准质粒(Calibrator))。

公式2中，△Ct2表示校准质粒(Calibrator)中MET基因与GAPDH内参基因的Ct差值，Ct_(M,C)表示校准质粒(Calibrator)中对MET基因进行扩增得到的Ct值，Ct_(G,C)表示校准质粒(Calibrator)中对GAPDH内参基因扩增得到的Ct值。

本试剂盒的引物经系统优化，扩增效率均在90％-105％之间，因此△Ct2值可认为是由于不同序列的引物扩增效率等系统误差造成的。将这一值作为本底，用待测样本中得到的△Ct1值减去△Ct2就得到了待测样本的校正△Ct值(Corrected△Ct，记为co△Ct)。

公式3为：co△Ct＝△Ct1-△Ct2。

公式3中，co△Ct表示待测样本中经校正后得到的MET基因与GAPDH内参基因的Ct差值，△Ct1表示单个待测样本中MET基因与GAPDH内参基因的Ct差值，△Ct2表示校准质粒(Calibrator)中MET基因与GAPDH内参基因的Ct差值。

由于在校准质粒(Calibrator)中MET基因与GAPDH内参基因的拷贝数为1:1，因此，co△Ct可以理解为在待测样本中，MET基因与GAPDH内参基因的起始拷贝数的不同所造成的。由于PCR扩增的过程遵循指数扩增的原理，即每次扩增得到的分子数是扩增前的2倍，可以计算出在待测样本中MET基因与GAPDH内参基因的拷贝数比率(copy number ratio，CNR)。

公式4为：CNR＝2^-co△Ct

公式4中，CNR表示待测样本中MET基因与GAPDH内参基因的拷贝数比值，co△Ct表示该样本中经修正后得到的MET基因与GAPDH内参基因的Ct差值。

本试剂盒选取的GAPDH内参基因在人类的二倍体基因组中是以稳定的两个拷贝形式存在，因此，待测样本中MET基因的实际基因拷贝数是CNR的数值2倍。

4.试剂盒内容

1)MET基因检测相关的引物F1、R1；F2、R2；

2)GAPDH内参基因检测相关的引物F3、R3；F4、R4；F5、R5；

3)试剂盒还包含阴性对照品：无模板对照ddH2O；

4)校准质粒(Calibrator)，标准质粒1和标准质粒2；

5)本试剂盒还包含DNA聚合酶、dNTP以及实时荧光PCR反应缓冲液、SYBR GREEN I荧光染料。

5.试剂盒检测

1)从样品中提取DNA，并经qubit定量；

2)以DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应并收集荧光信号；

荧光定量PCR的扩增反应体系分两个，分别是MET基因扩增体系和GPDH内参基因扩增体系。

实时荧光PCR反应的两个体系中各成分的终浓度如下：PCR反应缓冲液：1×、热启动Taq DNA聚合酶：0.8～1.2U、dNTP：0.08～0.12mM、MgCl₂：0.3～3mM、SYBR Green I荧光染料：(0.2～1)×、ROX Reference Dye：0.1～1μM、正向引物：0.1～1μM、反向引物：0.1～1μM、DNA的加入量10-100ng，无核酶水加至22～27μL。

实时荧光PCR反应的条件是：94～95℃预变性5～15min；94～95℃、10～15s，58～63℃、30～40s、期间实时采集荧光信号，共35～45个循环；融解曲线阶段：95℃、15s，60℃、60s，95℃、15s，并持续采集荧光信号。

由于标准质粒1带有两个拷贝的MET基因片段和一个拷贝的GAPDH内参基因片段，因此标准质粒1的MET基因与GAPDH内参基因的CNR为2。

由于标准质粒2带有一个拷贝的MET基因片段和两个个拷贝的GAPDH内参基因片段，因此标准质粒2的MET基因与GAPDH内参基因的CNR为0.5。

每次定量PCR的Ct值代入CNR公式计算的结果，只有当标准质粒1中的CNR值为2，并且标准质粒2中的CNR值为0.5时；同时，不含模板的阴性对照体系无扩增；待测样本与校准质粒(Calibrator)的MET基因和GAPDH内参基因的Tm值差值小于1，说明定量结果有效。

将待测样本的MET基因和GAPDH内参基因的Ct值代入CNR公式计算，并将结果乘以2，即得到待测样本的MET基因拷贝数,。如果CNR等于2，说明MET基因没有扩增；如果CNR大于2，说明MET基因扩增。

6.临床样本检测

使用6例临床标本经本试剂盒检测，CNR计算结果如下表1：

表1：6例临床标本使用本试剂盒检测结果

由表1可知，标准质粒1的CNR为0.55，2×CNR为1.10，表明标准质粒1中，MET基因与GAPDH基因的拷贝数是1:2，质控正常；标准质粒2的CNR为2.08，2×CNR为4.16，表明标准质粒2中，MET基因与GAPDH基因的拷贝数是2:1，质控正常。

阴性NTC无扩增，阴性质控正常。临床样本有扩增曲线，MET基因的Tm值与校准质粒的MET基因的Tm值差值<1℃；GAPDH基因的Tm值与校准质粒的GAPDH基因的Tm值差值<1℃；说明融解曲线质控正常。

本试剂盒检测结果与NGS的检测结果对比，见下表2：

表2：本试剂盒检测结果与NGS的检测结果对比

注：NGS检测结果基因的检测乘数大于2×，表示存在MET扩增。

由表2可知，6例标本中有4例与NGS的检测结果一致，这4例标本有3例是MET扩增，1例标本MET没有扩增。其余两例标本，序号3是血液标本，为血浆游离DNA，NGS没有检测到MET扩增，本试剂盒检测到MET扩增。序号4为组织标本，NGS没有检测到MET扩增，本试剂盒检测发现MET拷贝数减少，这在肿瘤细胞中可能的，因为肿瘤细胞复制过程中可能存在染色体结构的变异，而造成MET拷贝数的异常。说明本试剂盒不仅可以检测MET扩增，也可以对MET的拷贝数进行准确检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州迈景基因医学科技有限公司

<120> 一种MET基因扩增检测的引物、体系及试剂盒

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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atgctttact gtgtatccta gtt 23

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<212> DNA

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<400> 2

caggggactg atactttac 19

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<212> DNA

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cttctaggta tgacaacgaa tt 22

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<211> 22

<212> DNA

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<400> 4

cagtgagggt ctctctcttc ct 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aagccagctt aaacagagga tgcatagccc cagatagcgg aaattgattt ttgttgaact 60

tcgctgtttt tcttagatgc tttactgtgt atcctagttc tctattacct cagtggtggg 120

atatatgagt tttgtgtgct aacctagctc atttaagaat gaaaaagtaa agtatcagtc 180

ccctgtcatg ctctcccata aaactgagta tcgctaatca gttgacaagc gaagattggt 240

gattgcttgg gtagttaatt agcatacttc atttagcaac caaagtaaac ccacagggga 300

gacagcctta ctactgcaga tctacattaa agcaaaaagg actttcttat gccatacaat 360

tcatgatctc tttcctcagc ctgttgaatt ggcaatgtca atgtcaagca tttttattca 420

agaattctgt tgtaatttag tgttagtcaa tagaggccag atgaaatact tccttcagaa 480

gttatggatt tcaaatactg aagccacttg tttaatctgt agatattcag catcattgta 540

aattattcta tttcagccac gggtaataat ttttgtcctt tctgtaggct ggatgaaaaa 600

ttcacagtca aggttgctga ttttggtctt gc 632

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggctgcgtgc aaccctgggg ttgggggttc tggggactgg ctttcccata atttcctttc 60

aaggtgggga gggaggtaga ggggtgatgt ggggagtacg ctgcagggcc tcactccttt 120

tgcagaccac agtccatgcc atcactgcca cccagaagac tgtggatggc ccctccggga 180

aactgtggcg tgatggccgc ggggctctcc agaacatcat ccctgcctct actggcgctg 240

ccaaggctgt gggcaaggtc atccctgagc tgaacgggaa gctcactggc atggccttcc 300

gtgtccccac tgccaacgtg tcagtggtgg acctgacctg ccgtctagaa aaacctgcca 360

aatatgatga catcaagaag gtggtgaagc aggcgtcgga gggccccctc aagggcatcc 420

tgggctacac tgagcaccag gtggtctcct ctgacttcaa cagcgacacc cactcctcca 480

cctttgacgc tggggctggc attgccctca acgaccactt tgtcaagctc atttcctggt 540

atgtggctgg ggccagagac tggctcttaa aaagtgcagg gtctggcgcc ctctggtggc 600

tggctcagaa aaagggccct gacaactctt ttcatcttct aggtatgaca acgaatttgg 660

ctacagcaac agggtggtgg acctcatggc ccacatggcc tccaaggagt aagacccctg 720

gaccaccagc cccagcaaga gcacaagagg aagagagaga ccctcactgc tggggagtcc 780

ctgccacact cagtccccca ccacactgaa tctcccctcc tcacagttgc catgtagacc 840

ccttgaagag gggaggggcc tagggagccg caccttgtca tgtaccatca ataaagtacc 900

ctgtgctcaa cca 913

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<212> DNA

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cgtcgacatg ctttactgtg tatcctagtt 30

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<212> DNA

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tgggcccctt ctaggtatga caacgaatt 29

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gccatggcag tgagggtctc tctcttcct 29

Claims

1.用于非小细胞肺癌检测的MET检测试剂；

所述MET检测试剂包括MET引物组、内参引物组、PCR试剂、校准质粒、标准质粒；

所述MET引物组序列如下：

F1：5’-ATGCTTTACTGTGTATCCTAGTT-3’；

R1：5’-CAGGGGACTGATACTTTAC-3’；

其中，所述MET引物组序列F1和R1不含酶切位点；

使用所述MET检测试剂确定MET基因的拷贝数的定量方法为：

1)分别用所述MET引物组和所述内参引物组对待测样本进行扩增，计算所得到的两个基因的Ct值的差值，两个基因的Ct值差值记为△Ct1，Ct_(M,S)表示该样本中对MET基因扩增得到的Ct值，Ct_(G,S)表示该样本中扩增内参基因的Ct值，公式为△Ct1＝Ct_(M,S)-Ct_(G,S)；

2)分别用所述MET引物组和所述内参引物组对校准质粒进行扩增，计算所得到的两个基因的Ct值的差值，△Ct2表示校准质粒中MET基因与内参基因的Ct差值，Ct_(M,C)表示校准质粒中对MET基因进行扩增得到的Ct值，Ct_(G,C)表示校准质粒中对内参基因扩增得到的Ct值，公式为：△Ct2＝Ct_(M,C)-Ct_(G,C)；

4)根据PCR每一轮扩增得到的分子数是扩增前的2倍，计算待测样本中MET基因与内参基因的拷贝数比率CNR，公式为：CNR＝2^-co△Ct。

2.根据权利要求1所述的MET检测试剂，其特征在于，内参引物为GAPDH引物，其引物序列如下：

F2：5’-CTTCTAGGTATGACAACGAATT-3’；

R2：5’-CAGTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3’。

3.根据权利要求1所述的MET检测试剂，其特征在于，PCR试剂包括：PCR反应缓冲液、热启动Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂、SYBR Green I荧光染料。

4.根据权利要求1所述的MET检测试剂，其特征在于，所述MET检测试剂还包括阳性对照，所述阳性对照为含有MET扩增引物组的质粒载体。