CN104673891A - 一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法及试剂盒及其应用。所述的检测方法包括步骤：提取检测对象的全基因组DNA；采用PCR引物对Ⅰ、PCR引物对Ⅱ、PCR引物对Ⅲ和PCR引物对Ⅳ对得到的全基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对得到的PCR扩增产物进行分析，判断待检测的样本全基因组DNA中的脊髓性肌萎缩症相关基因的四个位点是否存在突变；所述的试剂盒包括PCR引物对Ⅰ、PCR引物对Ⅱ、PCR引物对Ⅲ和PCR引物对Ⅳ；本发明的检测方法及试剂盒设计巧妙，在节约样本的同时可对三种基因进行检测，且检测快速、准确、简便，从而可作为医师诊断、治疗和用药的参考依据，适于大规模推广应用。

Description

一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别涉及一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法及试剂盒及其应用。

背景技术

进行性脊髓性肌萎缩症(SMA)又称脊髓性肌萎缩、脊肌萎缩症，是一类由脊髓前角运动神经元和脑干运动神经核变性导致肌无力、肌萎缩的疾病。脊髓性肌萎缩症是一种常见的神经系统常染色体隐性遗传病，居致死性常染色体隐性遗传病的第二位，活产婴儿中患者发生率为1/6000-1/10000，该疾病的基因携带者频率为1：40-1：60。SMA可分为3型：SMAI型，又称婴儿重型、Werdnig-Hoffmann病，患儿出生后6个月内发病，全身性严重肌无力及肌张力减低，无倚托不能坐，常在2岁前死于呼吸肌麻痹；SMAII型，又称中间型，婴儿于出生后6-18个月发病，能坐，但不能无扶助站立，其生存时间依赖于呼吸肌受累麻痹的程度；SMAIII型，亦即慢性型，又称Kugebug-Welander病，多于出生18个月后发病，婴儿可独立行走，病情进展缓慢，可存活至成年。共同特点是脊髓前角细胞变性，临床表现为进行性、对称性，肢体近端为主的广泛性弛缓性麻痹与肌萎缩。智力发育及感觉均正常各型区别是根据起病年龄，病情进展速度，肌无力程度及存活时间长短而定至今本病尚无特异的有效治疗，主要治疗措施为预防或治疗各种严重肌无力产生的并发症如肺炎、营养不良、骨骼畸形行动障碍和精神社会性问题等。脊肌萎缩症目前临床上尚无有效的治疗办法。

脊髓性肌萎缩症的致病基因为SMN基因，该基因定位于5q13，5q13区域 共包含SMN基因、神经元凋亡抑制蛋白(NAIP)，编码基本转录因子IIH亚单位2号多肽(GTF2H2)和H4F5基因，经研究发现，SMN基因为脊髓性肌萎缩症的致病基因，其余3种基因均为修饰基因。如NAIP基因全长70kb，包括16个外显子和15个内含子，编码的NAIP蛋白通过阻断细胞信号转导通路中的caspase-3和caspase-7的激活抑制神经细胞凋亡，NAIP蛋白功能缺失，使前角运动细胞凋亡过度，导致运动神经元受损，引起继发性肌肉萎缩，加重SMA病情。目前，SMN1基因c.840位点C>T纯合突变已经广泛应用于SMA疾病的临床诊断。近年来研究发现NAIP和GTF2H2基因的部分外显子缺失如NAIP的第4和第5外显子，GTF2H2的第10外显子的缺失与SMA患者的预后密切相关，SMN1基因突变导致SMN蛋白功能丧失为SMA确诊指标，NAIP和GTF2H2基因功能状态影响疾病临床表型的严重程度，检测NAIP和GTF2H2基因是否存在外显子缺失对指导临床治疗改善患儿预后有积极的意义。所以同时检测SMN、NAIP和GTF2H2三个基因目的片段的缺失或多拷贝的数量不仅可以准确诊断SMA，并且对分析估测SMA的临床表型十分必要。

SMA疾病常用的检测方法有多重连接探针扩增法(Multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)和基因序列测序法(SangerSequencing)。多重连接探针扩增法为SMA实验室诊断的金标准，但DNA模板量需要比较大(总量在250ng以上)，检测周期比较长(一般5-7天)，且实验需要专业昂贵的仪器，不适合大范围推广作为临床常规检测。基因序列测序法主要检测SMN基因c.840位点是否存在C>T纯合突变来判断SMN基因是否能在后期生理过程中发挥功能，但基因测序方法检测周期比较长(一般5-7天)，且实验需要专业昂贵的仪器，不适合大范围推广作为临床常规检测。

核酸检验作为一种医学检验技术已经在遗传性疾病诊断中体现出了巨大的优势和作用。现有SMA的检测大多采用多重连接探针扩增法或基因测序的方法，均存在检测周期长，所需仪器昂贵等缺点，且不能通过一次检测对疾病及 其预后做出判断。因此，研发准确可靠、简单实用、能够实现自动化和标准化、适合大规模人群筛查和常规分子诊断的高通量同时快速检测SMN、NAIP和GTF2H2基因状态，从而确诊SMA的新型分子诊断试剂盒为当前迫切之需，对诊断SMA疾病以及预测SMA患者预后有着积极的意义。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测方法及检测试剂盒、以及相关应用，该检测方法设计巧妙，在节约样本的同时可对三种基因进行检测，且检测快速、准确、简便，从而可作为医师诊断、治疗和用药的参考依据，适于大规模推广应用。

为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法，包括如下进行的步骤：

(1)取待检测的样本，提取全基因组DNA；

(2)采用PCR引物对Ⅰ、PCR引物对Ⅱ、PCR引物对Ⅲ和PCR引物对Ⅳ对所述步骤(1)中得到的全基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述PCR引物对Ⅰ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述PCR引物对Ⅱ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，所述PCR引物对Ⅲ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，所述PCR引物对Ⅳ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；

(3)对所述步骤(2)中得到的PCR扩增产物进行分析，判断待检测的样本全基因组DNA中的脊髓性肌萎缩症相关基因的四个位点是否存在突变。

本发明的检测方法，检测的脊髓性肌萎缩症相关基因突变为：SMN(c.840)、NAIP(exon4)、NAIP(exon5)、GTF2H2(exon10)。PCR引物对Ⅰ对应检测SMN(c.840)的突变，PCR引物对Ⅱ对应检测NAIP(exon4)的突变，PCR引物对Ⅲ对应检测NAIP(exon5)的突变，PCR引物对Ⅳ对应检测GTF2H2(exon10)的突变。

优选的，所述步骤(2)中，所述PCR扩增在两个PCR反应体系中进行，所述PCR引物对Ⅰ和PCR引物对Ⅲ在PCR反应体系Ⅰ中对全基因组DNA进行PCR扩增，所述PCR引物对Ⅱ和PCR引物对Ⅳ在PCR反应体系Ⅱ中对全基因组DNA进行 PCR扩增。在PCR反应体系Ⅰ中，PCR引物对Ⅰ和PCR引物对Ⅲ可针对同一模板DNA进行检测，相互不干扰，在PCR反应体系Ⅱ中，PCR引物对Ⅱ和PCR引物对Ⅳ可针对同一模板DNA进行检测，相互不干扰，这样既可以节约样本，又减少了检测程序，检测快速且结果准确。

优选的，本发明的一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法，所述步骤(2)中，还包括采用内参引物PCR引物对Ⅴ对所述步骤(1)中得到的全基因组DNA进行PCR扩增；所述PCR引物对Ⅴ在PCR反应体系Ⅱ中对全基因组DNA进行PCR扩增；所述PCR引物对Ⅴ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

本发明的检测方法中，得到的PCR扩增产物进行分析，可以用直接测序的方法来检测是否存在已被确定的突变，也可以采用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的CYP4V2基因核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素、发色物质或荧光物质标记，尤其是可利用等位基因特异探针。

优选的，本发明的一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法，所述PCR反应体系Ⅰ和PCR反应体系Ⅱ中还包括荧光探针；所述反应体系Ⅰ中包括荧光探针Ⅰ和/或荧光探针Ⅰ’，荧光探针Ⅲ；所述反应体系Ⅱ中包括荧光探针Ⅱ，荧光探针Ⅳ和内参荧光探针Ⅴ；所述荧光探针Ⅰ序列如SEQ ID NO：11所示，所述荧光探针Ⅰ’序列如SEQ ID NO：12所示，所述荧光探针Ⅱ序列如SEQ ID NO：13所示，所述荧光探针Ⅲ序列如SEQ ID NO：14所示，所述荧光探针Ⅳ序列如SEQ ID NO：15所示，所述内参荧光探针Ⅴ序列如SEQ ID NO：16所示。荧光探针Ⅰ、荧光探针Ⅰ’对应检测SMN(c.840)，荧光探针Ⅰ与野生型即正常的SMN基因核苷酸序列杂交，荧光探针Ⅰ’与突变型即突变的SMN基因核苷酸序列杂交，荧光探针Ⅱ对应检测NAIP(exon4)，与野生型即正常的基因核苷酸序列杂交，荧光探针Ⅲ对应检测NAIP(exon5)，与野生型即正常的基因核苷酸序列杂 交，荧光探针Ⅳ对应检测GTF2H2(exon10)，与野生型即正常的基因核苷酸序列杂交，内参荧光探针Ⅴ对应检测人GAPDH基因，与野生型即正常的人GAPDH基因核苷酸序列杂交。

本发明所述的扩增引物和荧光探针可以由本领域常用的方法合成。

优选的，本发明的一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法，所述PCR扩增程序为：50℃处理2分钟，95℃预变性2分钟；然后按照95℃变性15秒，55℃退火40秒为一个循环，共进行40个循环。

在本发明的第二方面，提供了一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测的试剂盒，包括PCR引物对Ⅰ、PCR引物对Ⅱ、PCR引物对Ⅲ和PCR引物对Ⅳ；所述PCR引物对Ⅰ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述PCR引物对Ⅱ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，所述PCR引物对Ⅲ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，所述PCR引物对Ⅳ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

优选的，所述的试剂盒还包括内参引物PCR引物对Ⅴ，所述PCR引物对Ⅴ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

更优选的，所述的试剂盒还包括荧光探针Ⅰ和/或荧光探针Ⅰ’，荧光探针Ⅱ，荧光探针Ⅲ和荧光探针Ⅳ；所述荧光探针Ⅰ序列如SEQ ID NO：11所示，所述荧光探针Ⅰ’序列如SEQ ID NO：12所示，所述荧光探针Ⅱ序列如SEQ ID NO：13所示，所述荧光探针Ⅲ序列如SEQ ID NO：14所示，所述荧光探针Ⅳ序列如SEQ ID NO：15所示。

更优选的，所述的试剂盒还包括内参荧光探针Ⅴ，所述内参荧光探针Ⅴ序列如SEQ ID NO：16所示。

在本发明的第三方面，提供了上述的脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测的试剂盒在检测脊髓性肌萎缩症相关基因突变中的应用。

本发明的有益效果：本发明的创新点在于通过设计特异性引物检测待检对象(主要是正常人或患者)的基因组DNA中的脊髓性肌萎缩症的三个相关基因SMN，NAIP和GTF2H2基因的4个位点是否存在突变，设计巧妙，在节约样本的同时可对4个位点进行检测，且检测快速、准确、简便，从而可作为临床分子诊断、治疗和用药的参考依据，适于大规模推广应用。

附图说明

图1为荧光探针PCR扩增曲线(A为I管SMN c.840 C>T杂合突变的检测结果图，其中1线为NAIP基因的exon5位点扩增曲线，2线为SMN(c.840)突变位点的扩增曲线，3线为SMN(c.840)位点的扩增曲线；B为II管正常无突变的检测结果图，其中1线为GTF2H2基因的exon10位点扩增曲线，2线为内参人GAPDH基因的扩增曲线，3线为NAIP基因的exon4位点的扩增曲线)。

图2为荧光探针PCR扩增曲线(A为I管SMN c.840 C>T纯合突变的检测结果图，其中1线为NAIP基因的exon5位点扩增曲线，3线为SMN(c.840)位点的扩增曲线；B为II管NAIP基因4号外显子缺失的检测结果图，其中1线为GTF2H2基因的exon10位点扩增曲线，3线为NAIP基因的exon4位点的扩增曲线)。

图3为I管正常无突变但内参无曲线的检测结果图(其中1线为NAIP基因的exon5位点扩增曲线，2线为SMN(c.840)突变位点的扩增曲线)。

图4为II管GTF2H2基因10号外显子缺失的检测结果图(2线为内参人GAPDH基因的扩增曲线，3线为NAIP基因的exon4位点的扩增曲线)。

图5为I管SMN c.840 C>T纯合突变并且NAIP基因5号外显子缺失的检测结果图(其中3线为SMN(c.840)位点的扩增曲线)。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

本发明中，人SMN基因7号外显子及其上下游180bp内含子序列如SEQ ID NO：17所示；人NAIP基因4号外显子及其上下游180bp内含子序列如SEQ ID NO：18所示；人NAIP基因5号外显子及其上下游180bp内含子序列如SEQ ID NO：19所示；人GTF2H2基因10号外显子及其上下游180bp内含子序列如SEQ ID NO：20所示；人GAPDH基因5号和6号外显子及其上下游内含子序列如SEQ ID NO：21所示。

PCR引物对Ⅰ对应检测SMN(c.840)的突变，PCR引物对Ⅱ对应检测NAIP(exon4)的突变，PCR引物对Ⅲ对应检测NAIP(exon5)的突变，PCR引物对Ⅳ对应检测GTF2H2(exon10)的突变，内参引物PCR引物对Ⅴ对应检测人GAPDH基因。荧光探针Ⅰ、荧光探针Ⅰ’对应检测SMN(c.840)，荧光探针Ⅰ与野生型即正常的SMN基因核苷酸序列杂交，荧光探针Ⅰ’与突变型即突变的SMN基因核苷酸序列杂交，荧光探针Ⅱ对应检测NAIP(exon4)，与野生型即正常的基因核苷酸序列杂交，荧光探针Ⅲ对应检测NAIP(exon5)，与野生型即正常的基因核苷酸序列杂交，荧光探针Ⅳ对应检测GTF2H2(exon10)，与野生型即正常的基因核苷酸序列杂交，内参荧光探针Ⅴ对应检测人GAPDH基因，与野生型即正常的人GAPDH基因核苷酸序列杂交。

在本发明实施例中，PCR引物对Ⅰ的上游引物命名为SMN-7F，下游引物命名为SMN-7R，荧光探针Ⅰ命名为SMN-W，荧光探针Ⅰ’命名为SMN-M；PCR引物对Ⅱ的上游引物命名为NA-4F，下游引物命名为NA-4R，荧光探针Ⅱ命名为NA-4P；PCR引物对Ⅲ的上游引物命名为NA-5F，下游引物命名为NA-5R，荧光 探针Ⅲ命名为NA-5P；PCR引物对Ⅳ的上游引物命名为GT-10F，下游引物命名为GT-10R，荧光探针Ⅳ命名为GT-10P；内参引物PCR引物对Ⅴ的上游引物命名为GA-F，下游引物命名为GA-R，内参荧光探针Ⅴ命名为GA-P。

本发明所述的荧光探针中，HEX指六氯-6-甲基荧光素，FAM指羧基荧光素，CY5是指花青染料分子5，TAMRA和BHQ3是指荧光淬灭基团。

优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。本发明所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售购买产品。

另外，实施例中所涉及的核苷酸序列的书写顺序默认为从5’端至3’端。

实施例1引物和探针的设计

根据SMN、NAIP、GTF2H2和内参基因GAPDH的基因序列设计引物与探针，保证上下游引物浓度一致通过PCR反应产生双链DNA；探针在PCR反应的退火期与PCR扩增的目标互补单链DNA杂交，并被Taq DNA聚合酶的5’核酸外切酶活性水解，水解后FAM荧光素远离3’淬灭基团，FAM荧光素在激发光作用下产生荧光信号。设计的引物和探针的序列如表1所示，并委托中国Invitrogen公司合成。

表1引物和探针的序列

实施例2待检样本的全基因组DNA的提取

使用TIANGEN“全血基因组DNA抽提试剂盒”提取全血DNA。

提取的DNA终体积为100ul，浓度在30ng/ul以上；OD260/280在1.8-2.0之间。

实施例3脊髓性肌萎缩症的三个相关基因SMN，NAIP和GTF2H2基因的4个位点的检测

(1)PCR反应体系的建立

取实施例1合成的引物和探针，取实施例2中提取的全基因组DNA为模板，按照表2所示的数据建立PCR反应体系Ⅰ和PCR反应体系Ⅱ。

表2 PCR反应体系

上述体系中，进行PCR试验时，往往要向PCR管中加入buffer、dNTP、DNA酶、引物、模板、水等各种PCR反应所需的试剂，而在加入这些试剂时如果操作不规范很容易造成污染，导致PCR结果不准确，因此，为了简化反复添加各种试剂便将buffer、dNTP、DNA Polymerase等试剂先混合到一起，即配 制成Master-mix然后再使用，即简化了PCR操作步骤，也减少了污染的途经。本实施例中PCR扩增试剂采用北京天根生物公司的Master-mix(具体成分包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液、PCR反应的增强剂，浓度为2.5×)。

(2)PCR扩增程序

PCR反应在ABI9700热循环仪上进行完成，两个PCR反应体系的扩增程序相同：50℃处理2分钟，95℃预变性2分钟；

95℃变性15秒，55℃退火40秒，共40循环。

(3)结果分析

请参见图1-图5，图1为I管SMN c.840 C>T杂和突变，II管正常无突变的检测结果图；图2为I管SMN c.840 C>T纯和突变，II管NAIP基因4号外显子缺失的检测结果图；图3为I管正常无突变但内参无曲线的检测结果图；图4为II管GTF2H2基因10号外显子缺失的检测结果图；图5为I管SMN c.840C>T纯和突变并且NAIP基因5号外显子缺失的检测结果图。

对比实施例

取现有的检测SMA的试剂盒与本发明的方法进行比较。

对比试剂盒为：SALSA MLPA KIT，MRC-Holland，Cat.#P021-A1。

按照对比试剂盒的说明书进行操作，基本程序为：DNA变性→杂交反应→连接反应→PCR→毛细管电泳→读取结果。

对比试剂盒检测结果与本发明方法的检测结果见表3。由表3可见，对比核酸检测试剂盒检测结果与本发明方法无统计学差异，证明本发明方法可以替代对比核酸检测试剂盒进行临床诊断。

表3本发明方法与比对试剂盒检测结果比较

*:McNemar test

实施例4检测脊髓性肌萎缩症的三个相关基因SMN，NAIP和GTF2H2的4个位点的试剂盒及其应用

1、试剂盒的组成

(1)引物

PCR引物对Ⅰ： 

上游引物(SMN-7F):5’-acttcctttattttcctt-3’

下游引物(SMN-7R):5’-atgctggcagacttactc-3’；

PCR引物对Ⅱ： 

上游引物(NA-4F):5’-cacaatttgctgccagag-3’

下游引物(NA-4R):5’-cggcaccaaagaggatta-3’；

PCR引物对Ⅲ： 

上游引物(NA-5F):5’-cactgccaggcaatctaa-3’

下游引物(NA-5R):5’-catctccttcttcccaat-3’；

PCR引物对Ⅳ： 

上游引物(GT-10F):5’-ttcttctttcctaaaactat-3’

下游引物(GT-10R):5’-accagtttcacgagcaag-3’；

内参引物PCR引物对Ⅴ：

上游引物(GA-F):5’-catgagaagtatgacaacagc-3’

下游引物(GA-R):5’-agtccttccacgataccaaag-3’。

(2)探针

荧光探针Ⅰ：

野生型(SMN-W):HEX-5’-agggtttcagacaaa-3’-TAMRA；

荧光探针Ⅰ’：

突变型(SMN-M):FAM-5’-agggttttagacaaa-3’-TAMRA；

荧光探针Ⅱ：

野生型(NA-4P)：HEX-5'-tacagcagaagcact-3'-TAMRA；

荧光探针Ⅲ：

野生型(NA-5P)：Cy5-5’-tcctaaacatccacc-3’-BHQ3；

荧光探针Ⅳ：

野生型(GT-10P)：Cy5-5’-acagtgcaaacgcga-3’-BHQ3；

内参荧光探针Ⅴ：

野生型(GA-P)：FAM-5’-atcatcagcaatgcctcct-3’-TAMRA。

PCR引物对Ⅰ对应检测SMN(c.840)的突变，PCR引物对Ⅱ对应检测NAIP(exon4)的突变，PCR引物对Ⅲ对应检测NAIP(exon5)的突变，PCR引物对Ⅳ对应检测GTF2H2(exon10)的突变，内参引物PCR引物对Ⅴ对应检测人GAPDH基因。荧光探针Ⅰ、荧光探针Ⅰ’对应检测SMN(c.840)，荧光探针Ⅰ与野生型即正常的SMN基因核苷酸序列杂交，荧光探针Ⅰ’与突变型即突变的SMN基因核苷酸序列杂交，荧光探针Ⅱ对应检测NAIP(exon4)，与野生型即正常的基因核苷酸序列杂交，荧光探针Ⅲ对应检测NAIP(exon5)，与野生型即正常的基因核苷酸序列杂交，荧光探针Ⅳ对应检测GTF2H2(exon10)，与野生型即正常的基因核苷酸序列杂交，内参荧光探针Ⅴ对应检测人GAPDH基因，与野生型即正常的人GAPDH基因核苷酸序列杂交。

本试剂盒中的引物和探针可以是固体粉末也可以是液体的。

2、使用方法 

主要包括如下步骤：

(1)取待检测的样本，提取全基因组DNA；

(2)分别取PCR引物对Ⅰ、PCR引物对Ⅱ、PCR引物对Ⅲ、PCR引物对Ⅳ和内参引物PCR引物对Ⅴ，荧光探针Ⅰ和/或荧光探针Ⅰ’，荧光探针Ⅱ，荧光探针Ⅲ，荧光探针Ⅳ和内参荧光探针Ⅴ及步骤(1)得到的全基因组DNA，按照表2所示建立PCR反应体系，在ABI9700热循环仪上进行实时荧光定量PCR检测，两个PCR反应体系的扩增程序相同：50℃处理2分钟，95℃预变性2分钟；然后按照95℃变性15秒，55℃退火40秒为一个循环，共进行40个循环。

(3)对所述步骤(2)中得到的PCR扩增产物进行分析，判断待检测的样本全基因组DNA中的脊髓性肌萎缩症相关基因的四个位点是否存在突变。

具体方法参见实施例1、2、3、4。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法，所述的方法为非诊断和治疗目的的方法，其特征在于，包括如下进行的步骤：

(1)取待检测的样本，提取全基因组DNA；

(2)采用PCR引物对Ⅰ、PCR引物对Ⅱ、PCR引物对Ⅲ和PCR引物对Ⅳ对所述步骤(1)中得到的全基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述PCR引物对Ⅰ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述PCR引物对Ⅱ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，所述PCR引物对Ⅲ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示，所述PCR引物对Ⅳ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；

(3)对所述步骤(2)中得到的PCR扩增产物进行分析，判断待检测的样本全基因组DNA中的脊髓性肌萎缩症相关基因的四个位点是否存在突变。

2.根据权利要求1所述的一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述PCR扩增在两个PCR反应体系中进行，所述PCR引物对Ⅰ和PCR引物对Ⅲ在PCR反应体系Ⅰ中对全基因组DNA进行PCR扩增，所述PCR引物对Ⅱ和PCR引物对Ⅳ在PCR反应体系Ⅱ中对全基因组DNA进行PCR扩增。

3.根据权利要求2所述的一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，还包括采用内参引物PCR引物对Ⅴ对所述步骤(1)中得到的全基因组DNA进行PCR扩增；所述PCR引物对Ⅴ在PCR反应体系Ⅱ中对全基因组DNA进行PCR扩增；所述PCR引物对Ⅴ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

4.根据权利要求3所述的一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系Ⅰ和PCR反应体系Ⅱ中还包括荧光探针；所述反应体系Ⅰ中包括荧光探针Ⅰ和/或荧光探针Ⅰ’，荧光探针Ⅲ；所述反应体系Ⅱ中包括荧光探针Ⅱ，荧光探针Ⅳ和内参荧光探针Ⅴ；所述荧光探针Ⅰ序列如SEQ ID NO：11所示，所述荧光探针Ⅰ’序列如SEQ ID NO：12所示，所述荧光探针Ⅱ序列如SEQ ID NO：13所示，所述荧光探针Ⅲ序列如SEQ ID NO：14所示，所述荧光探针Ⅳ序列如SEQ ID NO：15所示，所述内参荧光探针Ⅴ序列如SEQ ID NO：16所示。

5.根据权利要求1-4任一项所述的一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：50℃处理2分钟，95℃预变性2分钟；然后按照95℃变性15秒，55℃退火40秒为一个循环，共进行40个循环。

6.一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测的试剂盒，其特征在于，包括PCR引物对Ⅰ、PCR引物对Ⅱ、PCR引物对Ⅲ和PCR引物对Ⅳ；所述PCR引物对Ⅰ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述PCR引物对Ⅱ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，所述PCR引物对Ⅲ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，所述PCR引物对Ⅳ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8所示。

7.根据权利要求6所述的一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测的试剂盒，其特征在于，还包括内参引物PCR引物对Ⅴ，所述PCR引物对Ⅴ的上游引物和下游引物序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

8.根据权利要求7所述的一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测的试剂盒，其特征在于，还包括荧光探针Ⅰ和/或荧光探针Ⅰ’，荧光探针Ⅱ，荧光探针Ⅲ和荧光探针Ⅳ；所述荧光探针Ⅰ序列如SEQ ID NO：11所示，所述荧光探针Ⅰ’序列如SEQ ID NO：12所示，所述荧光探针Ⅱ序列如SEQ ID NO：13所示，所述荧光探针Ⅲ序列如SEQ ID NO：14所示，所述荧光探针Ⅳ序列如SEQ IDNO：15所示。

9.根据权利要求8所述的一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测的试剂盒，其特征在于，还包括内参荧光探针Ⅴ，所述内参荧光探针Ⅴ序列如SEQ IDNO：16所示。

10.权利要求6-9任一项所述的一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变检测的试剂盒在检测脊髓性肌萎缩症相关基因突变中的应用。