CN111621557A - 鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111621557A
CN111621557A CN202010402285.7A CN202010402285A CN111621557A CN 111621557 A CN111621557 A CN 111621557A CN 202010402285 A CN202010402285 A CN 202010402285A CN 111621557 A CN111621557 A CN 111621557A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
adma
taking
reverse
cocktail
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010402285.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111621557B (zh
Inventor
谢子昂
秦安
吴奕征
范顺武
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Affiliated Sir Run Run Shaw Hospital of School of Medicine Zhejiang University
Original Assignee
Affiliated Sir Run Run Shaw Hospital of School of Medicine Zhejiang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Affiliated Sir Run Run Shaw Hospital of School of Medicine Zhejiang University filed Critical Affiliated Sir Run Run Shaw Hospital of School of Medicine Zhejiang University
Priority to CN202010402285.7A priority Critical patent/CN111621557B/zh
Publication of CN111621557A publication Critical patent/CN111621557A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111621557B publication Critical patent/CN111621557B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/045—Standards internal
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/108—Osteoporosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒及其使用方法。现有技术无法对骨质疏松症的易感基因进行识别和检测。本发明鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒，包括TaqMan探针、PCR正反向引物和ADMA‑D7。本发明通过检测rs150767365 del/ins标记、Ddah1的基因表达及其代谢物ADMA的水平，实现组合式检测骨质疏松症易感基因，能够为骨质疏松症易感人群的区分提供一定依据，从而达到定向预防的技术效果；此外，本发明具有操作步骤简易、准确率高、特异性强的优点。“鸡尾酒式”的协同检测，提升了早期检测的准确性。

Description

鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于基因检测及代谢物检测技术领域，具体涉及一种“鸡尾酒式”检测骨质疏松症易感基因的引物、探针和靶向代谢物的试剂盒及其使用方法(使用方法仅用于骨质疏松症易感基因的检测，并非骨质疏松症的诊断，且根据骨质疏松症易感基因无法直接得到是否患有骨质疏松症的诊断结果)。
背景技术
骨质疏松症是一种以骨量减少、骨微结构破坏、骨力学性能降低为特征的代谢性骨病，其发生发展会使骨脆性增加及骨折风险增加。根据2018年国家卫生健康委员会发布的首个中国骨质疏松流行病学调查显示，我国65岁以上人群中骨质疏松患病率达32％，其中男性10.7％，女性为51.6％。预计在2050年，治疗骨质疏松的相关医疗费用将高达1630亿元。骨质疏松严重危害国人健康，给社会发展带来严重负担。
现有技术中能够通过实验室检查指标和影像学辅助检测等方法对骨质疏松症进行诊断检测，但无法对骨质疏松症的易感基因进行识别和检测，也无法实现对易感骨质疏松症的人群进行鉴别和筛查，无法起到针对性提前预防效果。骨密度主要受遗传因素决定，遗传因素占骨密度变化的比重高达50％-80％。因此，通过遗传诊断和生化指标检测等方法，形成“鸡尾酒式”的检测策略，有助于骨质疏松症易感人群的筛查。通过研究表明，编码二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(DDAH1)的rs150767365突变及其靶向代谢产物非对称性二甲基精氨酸(ADMA)与骨骼健康有着非常密切的关系。二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)是一类水解酶，其包括两种亚型，即DDAH1和DDAH2。两者具有63％的同源性，但是具有不同的组织分布形式。目前认为，DDAH1降解ADMA是DDAH发挥功能的最主要形式，且DDAH2的单一作用并不能发挥降解ADMA的作用。还有研究表明，ADMA在绝经妇女血液中的水平较高，且ADMA与成骨细胞代谢相关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Ddah1基因核苷酸多态性、基因表达及其靶向代谢分子ADMA的“鸡尾酒式”检测试剂盒及其在骨质疏松症易感基因检测的应用。
本发明鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒，包括TaqMan探针、PCR正反向引物和ADMA-D7。
所述的TaqMan探针分为FAM部分和HEX部分；FAM部分SEQ ID No.1的序列为4Ndel,FAM-CGCAGGTGCACACCTCCCATC-BHQ；HEX部分SEQ ID No.2的序列为4N ins，HEX-CGCAGGTGCACGCACACCTC-BHQ。所述的PCR正反向引物的正向扩增引物序列SEQ ID No.3为5’-CAGGTAAAGACCAGGAAGCCC-3’，PCR正反向引物的反向扩增引物序列SEQ ID No.4为5’-GGACCTCGGCGAAAAGC-3’。
作为优选，本发明鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒还包括2×PremixEx Taq、RNase-free水、无菌超纯水、5×HiFi Buffer、反转录引物、反转录酶、2×qPCRSYBR Green Master Mix、甲酸、乙腈、甲醇和超纯去离子水。
作为优选，本发明鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒还包括qPCR引物。所述的qPCR引物包含Ddah1基因引物和管家基因引物；其中Ddah1基因引物的正向扩增引物SEQ ID No.5的序列为5’-AACCACATTTCTGACACATCTTTG-3’；Ddah1基因引物的反向扩增引物SEQ ID No.6的序列为5’-GTAGCACAGTGGCACAGTAGATTG-3’；管家基因引物的正向扩增引物SEQ ID No.7的序列为5’-TGGAAGGACTCATGACCACAGT-3’，管家基因引物的反向扩增引物序列SEQ ID No.8的序列为5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’。
该试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：
步骤1、采集被测者的血液样本，分离提取DNA核酸和血清；
步骤2、以DNA核酸为模板，加入TaqMan探针、PCR正反向引物，进行PCR反应。用TaqMan探针的荧光强度判断被测者的DNA核酸基因型
步骤3、以血清为样品进行代谢物ADMA的分析，得到血清中的ADMA浓度。
作为优选，步骤2中PCR反应的具体过程如下：取DNA核酸样品2μL，2×Premix ExTaq试剂10μL，TaqMan探针0.8μL，超纯去离子水.4μL，PCR正反向引物0.4μL，混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃30秒钟；95℃5秒钟，60℃30秒钟，循环40次；50℃30秒钟。
作为优选，根据TaqMan探针的FAM部分和HEX部分不同的荧光强度，分析DNA核酸样品的核酸基因型；DNA核酸基因型分为Allele X、Allele Y和BothAlleles三种类型。AlleleX的荧光情况为FAM，del/del；Allele Y的荧光情况为HEX，ins/ins；Both Alleles的荧光情况为FAM/HEX，del/ins。
作为优选，代谢物ADMA的分析方法具体如下：取血清50μL，加入已置有200μL甲醇的EP管中，涡旋振荡1分钟，离心，取上清液50μL，加入等量含ADMA-D7内标的50ng/mL的纯水溶液，混匀后上机检测，得到血清中ADMA对应的标准品峰面积与内标峰面积之比；根据标准品峰面积与内标峰面积之比，在标准曲线上确定对应的ADMA浓度。
作为优选，所述标准曲线的配置过程如下：取ADMA标准品储备液，加入纯水逐级稀释成2ng/mL，6ng/mL，20ng/mL，60ng/mL，200ng/mL，600ng/mL的线性标准品溶液。取各浓度梯度标准品溶液100μL，加入等量含ADMA-D7内标的50ng/mL的纯水溶液，混匀，得到浓度为1ng/mL，3ng/mL，10ng/mL，30ng/mL，100ng/mL，300ng/mL的标准曲线溶液。取上述各浓度梯度的标准曲线溶液；色谱质谱方法进行测定，以标准品浓度为横坐标X，以标准品峰面积与内标峰面积之比作为纵坐标Y绘制标准曲线。
作为优选，步骤1中还提取被测者的血液样本中的RNA核酸。以RNA核酸为模板进行反转录反应，得到cDNA产物；以cDNA为模板，加入qPCR引物，进行qPCR反应。所述的qPCR引物包含Ddah1基因引物和管家基因引物；其中Ddah1基因引物的正向扩增引物SEQ ID No.5的序列为5’-AACCACATTTCTGACACATCTTTG-3’；Ddah1基因引物的反向扩增引物SEQ ID No.6的序列为5’-GTAGCACAGTGGCACAGTAGATTG-3’；管家基因引物的正向扩增引物SEQ ID No.7的序列为5’-TGGAAGGACTCATGACCACAGT-3’，管家基因引物的反向扩增引物序列SEQ ID No.8的序列为5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’。
作为优选，以RNA核酸为模板进行反转录反应的具体过程如下：取RNA核酸样品1ng-5μg，5×HiFi Buffer 4μL，反转录引物溶液1μL，反转录酶2μL，RNase Free水补齐至20μL，混匀后加入到96孔样品板上进行反转录，反应条件：25℃5分钟，42℃30分钟，85℃5分钟，4℃直至收取cDNA产物。
qPCR反应的具体过程如下：取RT产物2μL，2×qPCR SYBR Green Master Mix 5μL，Ddah1基因引物或管家基因引物的正、反向扩增引物各0.2μL，无菌超纯水2.6μL，混匀后加入到384孔样品板上进行qPCR反应，反应条件：95℃5分钟；95℃10秒钟，60℃20秒钟，72℃20秒钟，循环40次；72℃20秒钟。
本发明具有的有益效果是：
本发明通过检测rs150767365 SNP标记、Ddah1的基因表达及其代谢物ADMA的水平，实现组合式检测骨质疏松症易感基因，能够为骨质疏松症易感人群的区分提供一定依据，从而达到定向预防的技术效果；此外，本发明具有操作步骤简易、准确率高、特异性强的优点。“鸡尾酒式”的协同检测，提升了早期检测的准确性。
附图说明
图1为本发明步骤6中得到的ADMA标准曲线图；
图2为rs150767365位点基因型与Ddah1基因表达的关联分析图；
图3为rs150767365位点基因型与血清ADMA含量的关联分析图；
图4为血清ADMA含量与骨质疏松症的关联分析图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1
鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒，能够检测rs150767365(4N del/ins功能性突变、Ddah1基因的表达及其靶向代谢物ADMA的含量，从而综合判断被测试样中是否具有骨质疏松症易感基因，包括2×Premix Ex Taq(2×DNA聚合酶预混液)、TaqMan探针(Probe)、PCR正反向引物、RNase-free water水(无RNA酶超纯水)、无菌超纯水、5×HiFiBuffer(DNA高保真酶缓冲液)、反转录引物、反转录酶、2×qPCR SYBR Green Master Mix(实时荧光定量PCR荧光染料混合液)、qPCR引物(实时荧光定量PCR引物)、ADMA(非对称性二甲基精氨酸)粉末、ADMA-D7(非对称性二甲基精氨酸同位素标记内标)、甲酸、乙腈、甲醇和超纯去离子水。
TaqMan探针分为FAM部分和HEX部分；FAM部分SEQ ID No.1的序列为4N del,FAM-CGCAGGTGCACACCTCCCATC-BHQ；HEX部分SEQ ID No.2的序列为4N ins，HEX-CGCAGGTGCACGCACACCTC-BHQ。所述的PCR正反向引物的正向扩增引物序列SEQ ID No.3为5’-CAGGTAAAGACCAGGAAGCCC-3’，PCR正反向引物的反向扩增引物序列SEQ ID No.4为5’-GGACCTCGGCGAAAAGC-3’。
qPCR引物包含Ddah1基因引物和管家基因引物(分开存放)；其中Ddah1基因引物的正向扩增引物SEQ ID No.5的序列为5’-AACCACATTTCTGACACATCTTTG-3’；Ddah1基因引物的反向扩增引物SEQ ID No.6的序列为5’-GTAGCACAGTGGCACAGTAGATTG-3’；管家基因引物的正向扩增引物SEQ ID No.7的序列为5’-TGGAAGGACTCATGACCACAGT-3’，管家基因引物的反向扩增引物序列SEQ ID No.8的序列为5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’。
该试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：
步骤1、采集样本并提取核酸和血清，具体为：
采集被测者的血液样本，分离提取DNA核酸、RNA核酸和血清；
步骤2、以DNA核酸为模板进行PCR反应
取DNA核酸样品2μL，2×Premix Ex Taq试剂10μL，TaqMan探针0.8μL，超纯去离子水.4μL，PCR正反向引物0.4μL，混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃30秒钟；95℃5秒钟，60℃30秒钟，循环40次；50℃30秒钟。
步骤3、根据Probe探针荧光强度判断来自人群的DNA核酸基因型
根据TaqMan探针的FAM部分(465-510nm)和HEX部分(533-580nm)不同的荧光强度，分析DNA核酸样品的核酸基因型；DNA核酸基因型分为Allele X(其荧光情况为FAM，del/del)、Allele Y(其荧光情况为HEX，ins/ins)、BothAlleles(其荧光情况为FAM/HEX，del/ins)三种类型，由此判断人群中携带的不同核酸基因型。
步骤4、以RNA核酸为模板进行RT反应
取RNA核酸样品1ng-5μg，5×HiFi Buffer 4μL，反转录引物溶液1μL，反转录酶2μL，RNase Free水补齐至20μL，混匀后加入到96孔样品板上进行反转录，反应条件：25℃5分钟，42℃30分钟，85℃5分钟，4℃直至收取RT产物。
步骤5、以RT产物为模板，分别用Ddah1基因引物、管家基因引物进行qPCR反应，获得血液样本的Ddah1基因相对于管家基因的基因拷贝数。
qPCR反应的具体过程如下：取步骤4所得的RT产物2μL，2×qPCR SYBR GreenMaster Mix 5μL，Ddah1基因引物或管家基因引物的正、反向扩增引物各0.2μL，无菌超纯水2.6μL，混匀后加入到384孔样品板上进行qPCR反应，反应条件：95℃5分钟；95℃10秒钟，60℃20秒钟，72℃20秒钟，循环40次；72℃20秒钟。qPCR反应。
步骤6、以血清为样品进行代谢物ADMA的分析
取血清50μL，加入已置有200μL甲醇的EP管中，涡旋振荡1分钟，高速离心(离心条件为13000rpm，4℃，15min)，取上清液50μL，加入等量含ADMA-D7内标的50ng/mL的纯水溶液，混匀后上机检测，得到血清中ADMA对应的标准品峰面积与内标峰面积之比Y；根据标准品峰面积与内标峰面积之比Y，在标准曲线上确定对应的ADMA浓度。配置色谱柱(XBridge@BEH HILIC Column，2.5μm，2.1×100mm)。色谱条件：流动相，10mM甲酸铵-0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)；洗脱梯度，0-4min 70％B；流速，0.4mL/min；进样量，1μL；柱温，30℃。质谱条件：仪器参数：Gas Temp 350℃；Gas Flow 10L/min；Nebulizer 40Psi；SheathGasHeater 350℃；SheathGasFlow 11L/min；Capillary 4000V。
定量信息：
Figure BDA0002489949990000061
标准曲线的配置：取ADMA标准品储备液适量，加入纯水逐级稀释成2ng/mL，6ng/mL，20ng/mL，60ng/mL，200ng/mL，600ng/mL的线性标准品溶液。取各浓度梯度标准品溶液100μL，加入等量含ADMA-D7内标的50ng/mL的纯水溶液，混匀，得到浓度为1ng/mL，3ng/mL，10ng/mL，30ng/mL，100ng/mL，300ng/mL的标准曲线溶液工作液待用。取上述各浓度梯度的标准曲线溶液适量，按方法项下的色谱质谱方法进行测定，以标准品浓度为横坐标X，以标准品峰面积与内标峰面积之比作为纵坐标Y绘制标准曲线，以1/X加权计算；结果附表,ADMA样品对应的标注曲线图如图1所示，样品所测ADMA的相对浓度和LC-MS相对响应值成良好的线性关系，确保了检测的产物为ADMA且浓度数值的准确性。
QC质控溶液配置：取ADMA标准品储备液适量，加入纯水逐级稀释成1ng/mL(低浓度QC液)，10ng/mL(中间浓度QC液)，100ng/mL(高浓度QC液)。取三个浓度梯度标准品溶液100μL，加入等量含ADMA-D7内标的50ng/mL的纯水溶液，混匀，上机检测待用。
作为一种优选的技术方案，若检测结果同时满足以下条件，则判定被测者具有骨质疏松症易感性，相对容易患骨质疏松症。条件1：步骤3中DNA核酸基因型的检测结果Allele Y(即ins/ins)或BothAlleles(即del/ins)。条件2：步骤6中检测得到的血清中ADMA浓度应高于172.5ng/ml。
作为一种优选的技术方案，步骤五中检测到基因拷贝数约小，则认为被测者对骨质疏松症越易感。
实施例2：rs150767365 SNP标记的检测
1.样本的选择
本专利的rs150767365 SNP标记的检测所用样本来自于杭州和上海两地近1404名受试者。每个个体都使用DXA测定了腰椎骨密度，同时利用了TaqMan Probe探针进行了基因突变分型(del/del、del/ins、ins/ins)。
2.rs150767365 SNP标记与骨质疏松症的关联分析
根据骨密度对受试者进行诊断，分为正常骨量、骨量减少和骨质疏松三类病人，通过logistic回归分析，在校正性别、年龄和BMI等因素后，分析rs150767365 SNP标记与骨密度的关联。
表1 rs150767365结果数据。
Figure BDA0002489949990000071
发生比(Odds rations，ORS)and 95％置信区间(confidence intervals，CIS)通过logistic回归分析计算得出，根据性别(Sex)、年龄(Age)和体脂指数(BMI)进行了调整或者直接计算＊，p＜0.05；&，p＜0.01。
从表1的数据可以看出，针对rs150767365位点的del/ins和ins/ins突变，表现为骨质疏松的特性，并具有显著的统计学意义。因此，可以通过检测该位点基因型来检测骨质疏松症的易感性。
实施例3：基因表达检测及靶向代谢物ADMA的检测
1.样本的选择
本专利的基因表达检测及靶向代谢物ADMA的检测所用样本来自于上述样本中存留血清的样本。
2.rs150767365位点基因型与Ddah1基因表达的关联分析
在rs150767365位点基因型检测后，对Ddah1基因的表达进行检测，分析del/del、del/ins、ins/ins突变与基因表达的关联。图2是检测结果。从图2的数据可以看出，针对del/ins、ins/ins突变可以造成Ddah1基因的表达减少，具有显著的统计学意义。因此，可以认为该位点基因型突变是功能性突变。
3.rs150767365位点基因型与血清ADMA含量的关联分析
在rs150767365位点基因型检测后，对ADMA的含量进行检测，分析del/del、del/ins、ins/ins突变与血清ADMA含量的关联。图3是检测结果。从图3的数据可以看出，针对del/ins、ins/ins突变可以造成ADMA的含量增加，具有显著的统计学意义。因此，可以认为该位点基因型突变是能够引起靶向代谢物ADMA含量的增加。
4.血清ADMA含量与骨质疏松症的关联分析
在检测ADMA含量后，分析ADMA含量与骨质疏松症的关联。图4是检测结果。从图4的数据可以看出，ADMA的含量水平在骨质疏松症患者血清中明显增高，具有显著的统计学意义。因此，可以认为靶向代谢物ADMA含量的增加可以增加骨质疏松症的患病率。

Claims (10)

1.鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒，其特征在于：包括TaqMan探针、PCR正反向引物和ADMA-D7；所述的TaqMan探针分为FAM部分和HEX部分；FAM部分SEQ ID No.1的序列为4N del,FAM-CGCAGGTGCACACCTCCCATC-BHQ；HEX部分SEQ ID No.2的序列为4N ins，HEX-CGCAGGTGCACGCACACCTC-BHQ；所述的PCR正反向引物的正向扩增引物序列SEQ ID No.3为5’-CAGGTAAAGACCAGGAAGCCC-3’，PCR正反向引物的反向扩增引物序列SEQ ID No.4为5’-GGACCTCGGCGAAAAGC-3’。
2.根据权利要求1所述的鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒，其特征在于：还包括2×Premix Ex Taq、RNase-free water水、无菌超纯水、5×HiFi Buffer、反转录引物、反转录酶、2×qPCR SYBR Green Master Mix、甲酸、乙腈、甲醇和超纯去离子水。
3.根据权利要求1所述的鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒，其特征在于：还包括qPCR引物；所述的qPCR引物包含Ddah1基因引物和管家基因引物；其中Ddah1基因引物的正向扩增引物SEQ ID No.5的序列为5’-AACCACATTTCTGACACATCTTTG-3’；Ddah1基因引物的反向扩增引物SEQ ID No.6的序列为5’-GTAGCACAGTGGCACAGTAGATTG-3’；管家基因引物的正向扩增引物SEQ ID No.7的序列为5’-TGGAAGGACTCATGACCACAGT-3’，管家基因引物的反向扩增引物序列SEQ ID No.8的序列为5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’。
4.如权利要求1所述的鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤1、采集被测者的血液样本，分离提取DNA核酸和血清；
步骤2、以DNA核酸为模板，加入TaqMan探针、PCR正反向引物，进行PCR反应；用TaqMan探针的荧光强度判断被测者的DNA核酸基因型；
步骤3、以血清为样品进行代谢物ADMA的分析，得到血清中的ADMA浓度。
5.根据权利要求4所述的鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤2中PCR反应的具体过程如下：取DNA核酸样品2μL，2×Premix Ex Taq试剂10μL，TaqMan探针0.8μL，超纯去离子水.4μL，PCR正反向引物0.4μL，混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃30秒钟；95℃5秒钟，60℃30秒钟，循环40次；50℃ 30秒钟。
6.根据权利要求5所述的鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒的使用方法，其特征在于：根据TaqMan探针的FAM部分和HEX部分不同的荧光强度，分析DNA核酸样品的核酸基因型；DNA核酸基因型分为Allele X、Allele Y和BothAlleles三种类型；Allele X的荧光情况为FAM，del/del；Allele Y的荧光情况为HEX，ins/ins；BothAlleles的荧光情况为FAM/HEX，del/ins。
7.根据权利要求4所述的鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒的使用方法，其特征在于：代谢物ADMA的分析方法具体如下：取血清50μL，加入已置有200μL甲醇的EP管中，涡旋振荡1分钟，离心，取上清液50μL，加入等量含ADMA-D7内标的50ng/mL的纯水溶液，混匀后上机检测，得到血清中ADMA对应的标准品峰面积与内标峰面积之比；根据标准品峰面积与内标峰面积之比，在标准曲线上确定对应的ADMA浓度。
8.根据权利要求7所述的鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述标准曲线的配置过程如下：取ADMA标准品储备液，加入纯水逐级稀释成2ng/mL，6ng/mL，20ng/mL，60ng/mL，200ng/mL，600ng/mL的线性标准品溶液；取各浓度梯度标准品溶液100μL，加入等量含ADMA-D7内标的50ng/mL的纯水溶液，混匀，得到浓度为1ng/mL，3ng/mL，10ng/mL，30ng/mL，100ng/mL，300ng/mL的标准曲线溶液；取上述各浓度梯度的标准曲线溶液；色谱质谱方法进行测定，以标准品浓度为横坐标X，以标准品峰面积与内标峰面积之比作为纵坐标Y绘制标准曲线。
9.根据权利要求4所述的鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤1中还提取被测者的血液样本中的RNA核酸；以RNA核酸为模板进行反转录反应，得到cDNA产物；以cDNA为模板，加入qPCR引物，进行qPCR反应；所述的qPCR引物包含Ddah1基因引物和管家基因引物；其中Ddah1基因引物的正向扩增引物SEQ ID No.5的序列为5’-AACCACATTTCTGACACATCTTTG-3’；Ddah1基因引物的反向扩增引物SEQ ID No.6的序列为5’-GTAGCACAGTGGCACAGTAGATTG-3’；管家基因引物的正向扩增引物SEQ ID No.7的序列为5’-TGGAAGGACTCATGACCACAGT-3’，管家基因引物的反向扩增引物序列SEQ ID No.8的序列为5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’。
10.根据权利要求9所述的鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒的使用方法，其特征在于：以RNA核酸为模板进行反转录反应的具体过程如下：取RNA核酸样品1ng-5μg，5×HiFi Buffer 4μL，反转录引物溶液1μL，反转录酶2μL，RNase Free水补齐至20μL，混匀后加入到96孔样品板上进行反转录，反应条件：25℃5分钟，42℃30分钟，85℃5分钟，4℃直至收取RT产物；
qPCR反应的具体过程如下：取RT产物2μL，2×qPCR SYBR Green Master Mix 5μL，Ddah1基因引物或管家基因引物的正、反向扩增引物各0.2μL，无菌超纯水2.6μL，混匀后加入到384孔样品板上进行qPCR反应，反应条件：95℃5分钟；95℃10秒钟，60℃20秒钟，72℃20秒钟，循环40次；72℃20秒钟。
CN202010402285.7A 2020-05-13 2020-05-13 鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒及其使用方法 Active CN111621557B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010402285.7A CN111621557B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒及其使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010402285.7A CN111621557B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒及其使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111621557A true CN111621557A (zh) 2020-09-04
CN111621557B CN111621557B (zh) 2023-06-13

Family

ID=72268903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010402285.7A Active CN111621557B (zh) 2020-05-13 2020-05-13 鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒及其使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111621557B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112782292A (zh) * 2020-12-21 2021-05-11 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 一种代谢物adma在制备骨关节炎诊断试剂盒中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101240322A (zh) * 2007-02-06 2008-08-13 上海主健生物工程有限公司 一种检测女性骨质疏松症易感遗传风险的试剂盒
WO2013124478A1 (en) * 2012-02-24 2013-08-29 Universität des Saarlandes Symmetric dimethylarginine (sdma) modifies high density lipoprotein (hdl) to induce endothelial dysfunction

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101240322A (zh) * 2007-02-06 2008-08-13 上海主健生物工程有限公司 一种检测女性骨质疏松症易感遗传风险的试剂盒
WO2013124478A1 (en) * 2012-02-24 2013-08-29 Universität des Saarlandes Symmetric dimethylarginine (sdma) modifies high density lipoprotein (hdl) to induce endothelial dysfunction

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"rs150767365" *
JENNIFER K TRITTMANN 等: "A single nucleotide polymorphism in the dimethylarginine dimethylaminohydrolase gene is associated with lower risk of pulmonary hypertension in bronchopulmonary dysplasia" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112782292A (zh) * 2020-12-21 2021-05-11 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 一种代谢物adma在制备骨关节炎诊断试剂盒中的应用
CN112782292B (zh) * 2020-12-21 2023-04-07 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 一种代谢物adma在制备早期骨关节炎诊断试剂盒中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111621557B (zh) 2023-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108949990B (zh) 一种检测egfr基因突变的试剂盒及方法
CN110724741B (zh) 一种检测微小残留白血病相关融合基因的引物、探针及其试剂盒
CN111235272B (zh) 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用
WO2020048518A1 (zh) 一组用于髓母细胞瘤分子分型的基因及其应用
CN106319085A (zh) 脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒及其应用
CN113025701B (zh) 非酒精性脂肪性肝病易感基因的早筛方法及试剂盒
CN112048560B (zh) 一种多内参结合序贯概率比检验分析her2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法
CN104673891A (zh) 一种脊髓性肌萎缩症相关基因突变的检测方法及试剂盒
CN112226538A (zh) 用于新型冠状病毒检测的引物探针组合、试剂盒及方法
CN113718021A (zh) 一种定量检测bcr-abl1融合基因的引物、探针及其试剂盒
CN106498028B (zh) Egfr的t790m突变的诊断方法及试剂盒
CN106498029B (zh) 提高egfr的t790m突变的诊断效率的方法
CN107513577A (zh) 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒
CN110484625A (zh) 用于检测prky基因甲基化的引物探针组合物、试剂盒及检测方法
CN111621557A (zh) 鸡尾酒式检测骨质疏松症易感基因的试剂盒及其使用方法
CN109402259B (zh) 一种检测白血病融合基因和基因突变的试剂盒
CN109439704B (zh) 检测白血病相关基因变异的方法和试剂盒
CN108531598B (zh) Ros1基因融合检测引物、方法及试剂盒
CN108728538B (zh) Alk基因融合检测引物、方法及试剂盒
CN110396542A (zh) 一种LncRNA标记物及其在糖尿病中的应用
CN111850117A (zh) 检测人tert启动子突变的引物和探针、试剂盒和装置
CN113718020A (zh) 人白血病flt3基因内部串联重复突变检测的引物探针组合、试剂盒及应用
Ghaissani et al. Design and characterization of a SYBR Green I-based melting curve method for investigation of HER2I655V polymorphism in breast cancer
CN106811537A (zh) 一种检测表皮生长因子受体基因t790m低频突变引物及其应用
CN112831556A (zh) 基于as-pcr检测myd88 l265p突变的试剂盒及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant