CN113718020A - 人白血病flt3基因内部串联重复突变检测的引物探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人白血病FLT3基因内部串联重复突变检测的引物探针组合、试剂盒及应用。引物探针组合中，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；探针序列如SEQ ID NO.3所示。试剂盒为微滴式数字PCR检测试剂盒，包含FLT3基因的引物探针组合和内参基因RPP30的引物探针组成的检测混合液、反应预混液、阴性质控品、空白对照。本发明的引物探针组合及试剂盒用于检测人白血病FLT3基因内部串联重复突变，具有检测过程简单高效、绝对定量、灵敏度和准确性高等优点，对于携带FLT3‑ITD突变的AML患者持续监控治疗效果、指导用药和预测疾病进展具有潜在的应用价值。

Description

人白血病FLT3基因内部串联重复突变检测的引物探针组合、 试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种人白血病FLT3基因内部串联重复突变检测的引物探针组合、试剂盒及应用。

背景技术

FLT3基因位于染色体13q12.2，有24个外显子，编码的蛋白属于III型受体酪氨酸激酶家族成员之一，全称是FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3)，在造血细胞存活、增殖和分化中起重要作用。据2015年中国肿瘤统计报告，中国白血病发病人数为75300/年，死亡人数为53400/年，其中成人急性髓系白血病(AML)约占成人白血病的65％，儿童AML约占儿童白血病的25％。而在约三分之一的AML患者中存在FLT3基因内部串联重复(ITD)突变，该突变主要发生在FLT3基因13-15号外显子区域，而重排断裂末端位置主要位于在14号外显子上，插入的重复突变序列长度可以从几bp到几百bp，是激活突变最常见的类型(Leukemia Research 36(2012)316–323)。在临床上，FLT3基因内部串联重复(FLT3-ITD)突变是AML患者预后不良的独立指标 (Med Oncol,2017,34(6):114)。

近年来，AML的治疗效果随化疗方案的不断改进和分子靶向药物的开发而取得很大提高。国内靶向治疗药物吉瑞替尼(gilteritinib)通过中国国家药品监督管理局(NMPA)审批，用于治疗FLT3突变阳性的复发或难治性急性髓系白血病。但在患者治疗过程中，微小残留病变(minimal residual disease,MRD)仍然是影响AML预后的一大难题。微小残留后，怎样准确检出混杂在正常造血细胞中的微量的白血病细胞是问题的关键。因此，在携带FLT3-ITD突变AML患者中，检测其突变水平可以作为MRD的重要指标之一，对持续跟踪患者治疗效果和预测疾病的进展、指导用药和预后有着重要的意义。

目前国内外针对FLT3-ITD突变检测主要有毛细管电泳法(Sanger测序)和高通量二代测序法(NGS)。但这些检测方法均存在一些缺点，例如，毛细管电泳法(Sanger测序)虽然能够比较全面检测FLT3-ITD突变的类型，但步骤繁琐，检测通量低，灵敏度在0.5％～10％，而且当检测突变率低时，检测的灵敏度受到很大影响。而NGS的检测虽然通量大，检测灵敏度相对毛细管电泳法有很大提升，但NGS方法成本昂贵，数据分析复杂，灵敏度只有1％左右，检测周期也长，不适合治疗的持续跟踪检测。

数字PCR(digital PCR)是近年来新出现的技术，它的原理是将一个标准 PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”，PCR扩增后，经生物芯片分析仪进行荧光强度检测。与阴性微滴相比，包含核酸分子的阳性微滴的荧光信号强度增加，根据泊松分布的原理，通过阳性微滴比例计算目标核酸分子的绝对拷贝数。整个过程不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测样本获得目标序列的拷贝数，因此，较为适合用于检测FLT3-ITD突变。

但是，FLT3-ITD突变类型复杂，突变序列插入具体上下游位点和插入的序列长度都不确定，可以在14号外显子上的多个区域不确定插入，插入的序列长度可以从几个bp到几百bp，需要根据FLT3-ITD基因插入不同片段长度而专门针对个体设计的引物。

因此，需要一种能够更加灵敏、简便、准确地检测FLT3-ITD突变的方法。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人白血病 FLT3基因内部串联重复突变(ITD)检测的引物探针组合。

本发明的另一目的在于提供包含上述引物探针组合的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供上述引物探针组合或其试剂盒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种人白血病FLT3基因内部串联重复突变检测的引物探针组合，序列如下：

FLT3-Exon14-CF:5’-GTACGTGCATTTTAAAGATTTTCCAA-3’(SEQ ID NO.1)；

FLT3-Exon15-R1:5’-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’(SEQ ID NO.2)；

FLT3-Intron14-Probe:5’-CTGCAGAAACATTTGGCACATTCCATTCT-3’ (SEQ IDNO.3)。

一种人白血病FLT3基因内部串联重复突变的检测试剂盒，包含上述引物探针组合。

优选地，所述试剂盒为微滴式数字PCR检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括内参基因RPP30的引物探针。

所述内参基因RPP30的引物探针序列如下：

RPP30-F:5’-GATTTGGACCTGCGAGCG-3’(SEQ ID NO.4)；

RPP30-R:5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’(SEQ ID NO.5)；

RPP30-Probe:5’-CTGACCTGAAGGCTCT-3’(SEQ ID NO.6)。

优选地，所述FLT3基因的引物探针组合、内参基因RPP30的引物探针以混合液的形式存在：FLT3基因检测混合液A，由所述SEQ ID NO.1-6的引物和探针组成；FLT3-ITD突变检测混合液B，由所述SEQ ID NO.2-6的引物和探针组成。

优选地，所述FLT3基因检测混合液A、FLT3-ITD突变检测混合液B中，引物、探针的浓度分别为900nM、250nM。

优选地，所述试剂盒还包括反应预混液，由buffer、0.2mMdNTPs、2Utaq酶、0.2UUDG酶组成。

优选地，所述试剂盒还包括阴性质控品，为野生型FLT3序列的重组质粒和内参基因RPP30重组质粒的混合物。

所述野生型FLT3序列如SEQ ID NO.7所示。

所述内参基因RPP30序列如SEQ ID NO.8所示。

优选地，所述野生型FLT3序列的重组质粒和内参基因RPP30重组质粒的采用的质粒为pUC57。

优选地，所述野生型FLT3序列的重组质粒和内参基因RPP30重组质粒的的摩尔比为10％。

优选地，所述引物探针组合中的探针和内参基因RPP30的探针连接荧光标记基团；更优选地，引物探针组合中的探针采用FAM、BHQ1标记，内参基因 RPP30的探针采用VIC、MGB标记。

优选地，所述试剂盒还包括空白对照，为无核酶水。

上述引物探针组合或其试剂盒在检测人白血病FLT3基因内部串联重复突变中的应用。

一种检测人白血病FLT3基因内部串联重复突变的方法，为采用上述试剂盒进行微滴式数字PCR检测，具体包括以下步骤：

(1)突变区的上游突变引物设计：根据患者初诊后的FLT3-ITD突变序列设计位于FLT3基因14号至15号外显子突变区的上游引物并合成；

(2)配制PCR反应体系：将同一个患者来源DNA样本分为A、B两个PCR 反应体系；A反应体系包括反应预混液、FLT3基因检测混合液A、DNA模板、无核酶水；B反应体系包括反应预混液、步骤(1)所述位于突变区的上游突变引物、FLT3-ITD突变检测混合液B、DNA模板、无核酶水；同时配制阴性质控品和空白对照，分别替换所述PCR反应体系中DNA模板即得到；

(3)微滴制备、PCR扩增：将步骤(2)所述A、B两个PCR反应体系进行微滴式数字PCR芯片微滴制备，将得到的微滴进行扩增；

(4)微滴荧光检测：采用生物芯片分析仪对步骤(3)扩增后的微滴进行荧光检测，获得拷贝数，分析结果，从A反应检测获得的总FLT3基因拷贝数和 B反应检测获得的突变型FLT3-ITD拷贝数比值计算得到患者FLT3-ITD突变水平。

优选地，步骤(1)所述上游突变引物为根据等位基因特异性PCR(AS-PCR) 设计的引物，位于人基因组DNA负链，和所述探针位于同一条DNA链；所述上游突变引物的3’端引入3-6个突变碱基，5’端则和人基因组DNA野生型序列一致；所述上游突变引物的退火温度和试剂盒中下游引物退火温度58℃相差不超过±2℃。

优选地，步骤(1)所述上游引物使用时采用1×TE稀释至浓度为20μM。

优选地，步骤(2)所述DNA模板为全血或骨髓液中提取的DNA。

优选地，步骤(2)所述PCR反应体系中DNA模板的加入量一致，均为 40-300ng。

步骤(2)中，A反应体系检测总FLT3基因，B反应体系检测突变型FLT3-ITD。

优选地，步骤(2)所述A PCR反应体系为20μL：反应预混液10μL、FLT3 基因检测混合液A2μL、DNA模板7μL、无核酸酶水补足至20μL；

步骤(2)所述BPCR反应体系为20μL：反应预混液10μL、上游突变引物 20μM 0.9μL、FLT3-ITD突变检测混合液B 2μL、DNA模板7μL、无核酸酶水水补足至20μL；

优选地，步骤(3)所述扩增的程序为：50℃反应2min；95℃反应10min； 95℃反应30sec，60℃反应60sec，45个循环；98℃反应10min；16℃终止；每步设置1℃/sec的升降温速度。

步骤(4)中，A、B两个PCR反应体系检测的FAM荧光通道的拷贝数比值，即为患者FLT3-ITD突变水平。

优选地，所述与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)技术为依托，开发绝对定量检测FLT3基因内部串联重复(ITD)突变的试剂盒及检测方法，并证实了其检测的灵敏度和准确性。和目前其他检测FLT3-ITD突变的技术相比，本发明简化了检测的步骤，具有检测过程简单高效、绝对定量、灵敏度和准确性高等优点，对于携带FLT3-ITD突变的AML患者持续监控治疗效果、指导用药和预测疾病进展具有潜在的应用价值。

附图说明

图1是试剂盒检测重组质粒配制的0.01％～10％突变比水平参考品结果图。

图2-7分别是针对不同突变临床样本设计合成的上游突变引物SF8-f3、 SF8-r4、SF9-f1、SF9-r1、SF13-f1、SF13-r2进行数字PCR检测的测序结果图。

图8是健康人外周血的A管和B管检测二维图；其中，从上至下依次是A 管反应检测野生型FLT3获得的FAM通道1荧光微滴、B管反应不加突变上游引物的检测结果、内参基因VIC通道2荧光微滴分布；二维图中不含FAM荧光通道1微滴信号群，内参基因VIC通道2荧光微滴分布和A管一致。

图9是1号病人5个时期样本的B管检测二维图；其中从上至下5张图依次为样本1-1、1-2、1-3、1-4、1-5。

图10是1号病人5个时期样本的A管检测二维图；其中从上至下5张图依次为样本1-1、1-2、1-3、1-4、1-5。

图11是6号病人3个时期样本的B管检测二维图；其中从上至下3张图依次为样本6-17、6-19、6-20。

图12是6号病人3个时期样本的A管检测二维图；其中从上至下3张图依次为样本6-17、6-19、6-20。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一、一种人白血病FLT3基因内部串联重复(ITD)突变微滴式数字PCR检测试剂盒，该试剂盒含有：

(1)微滴式数字PCR用反应预混液：包括buffer、dNTPs(0.2mM)、taq 酶(2U)、UDG酶(0.2U)(广东永诺医疗科技有限公司产品，货号S02000301，与MicroDrop-100微滴式数字PCR系统配套使用)。

(2)FLT3基因检测混合液A：由检测野生型FLT3基因的一对引物和一条探针、检测内参基因RPP30的一对引物和一条探针组成；用去离子水将引物的浓度调节至900nM、探针的浓度调节至250nM；

野生型FLT3的引物、探针序列如SEQ ID NO.1-3所示：

FLT3-Exon14-CF:5’-GTACGTGCATTTTAAAGATTTTCCAA-3’(SEQ ID N O.1)；

FLT3-Exon15-R1:5’-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’(SEQ ID NO.2)；

FLT3-Intron14-Probe:5’-FAM-CTGCAGAAACATTTGGCACATTCCATTCT- BHQ1-3’(SEQID NO.3)。

内参基因RPP30引物、探针序列如SEQ ID NO.4-6所示：

RPP30-F:5’-GATTTGGACCTGCGAGCG-3’(SEQ ID NO.4)；

RPP30-R:5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’(SEQ ID NO.5)；

RPP30-Probe:5’-VIC-CTGACCTGAAGGCTCT-MGB-3’(SEQ ID NO.6)。

(3)FLT3-ITD突变检测混合液B：由检测野生型FLT3基因的下游引物和探针及检测内参基因RPP30的引物和探针组合，所以除了不含上游引物 FLT3-Exon14-CF，其他成分和FLT3基因检测混合液A成分一样；用去离子水将引物的浓度调节至900nM，探针的浓度调节至250nM；

(4)FLT3-ITD阴性质控品：为含有商业合成的野生型FLT3序列(SEQ ID NO.7)的重组质粒和内参基因RPP30(SEQ ID NO.8)的重组质粒(载体均为 pUC57)的混合物，是将2种重组质粒用1*TE稀释至10³copy/uL后按比例混合得到，野生型FLT3序列的重组质粒占摩尔比10％。

(5)空白对照：用商业化的无核酶水分装获得，用于监控检测试剂是否被污染。

二、人白血病FLT3基因内部串联重复(ITD)突变的微滴式数字PCR检测方法：

(1)样本：适用样本类型为全血。

(2)样本处理和核酸提取(样本处理区)

购买商业化的核酸提取试剂盒(美基生物IVD3301-50)，按核酸提取试剂盒说明书对样本进行DNA提取，将提取的DNA溶液用Nano-Drop进行核酸浓度测定。

(3)试剂配制(试剂准备区)

a.配制FLT3-ITD阴性质控品和空白对照。

b.配制野生型FLT3 A管和突变型FLT3-ITD B管

1)将所有组分解冻至室温，各组分充分溶解后振荡混合均匀，短暂离心；

2)确定反应数N，N＝待检样本数(n)+质控数(2)+1。计算加到反应混合物中的各试剂的量，计算如表1和表2。

表1

野生型FLT3 A管检测组分	体积(N)
		微滴式数字PCR用反应预混液	10×NμL
FLT3基因检测混合液A	2×NμL
		无核酸酶水	1×NμL

表2

突变型FLT3-ITD B管检测组分	体积(N)
		微滴式数字PCR用反应预混液	10×NμL
FLT3-ITD突变检测混合液B	2×NμL
		无核酸酶水	1×NμL

3)取1.5mL无菌离心管配制反应体系，试剂加入后震荡混匀，离心数秒。

4)然后将上述混合液13μL/管分装至0.2mL PCR反应管中。

c.加样(样本制备区)

取空白对照、阴性质控品、样本DNA各7μL(加入量为100ng)，分别加入至上述0.2mLPCR反应管中，盖紧管盖，震荡混合均匀，短暂离心将管壁上的液体全部甩至管低(避免产生气泡)，得到加入样本的PCR反应体系。

d.制备微液滴(样本制备区)

取上述反应管中的20μL混合液，进行微滴的生成，具体操作步骤按照生物芯片分析仪说明书指引进行。

e.PCR扩增(扩增检测区)

将已封膜的96孔PCR反应板进行PCR反应扩增，扩增程序为：50℃反应2min；95℃反应10min；95℃反应30sec，60℃反应60sec，45个循环；98℃反应10min；16℃终止；每步都设置1℃/sec的升降温速度。

(4)微液滴检测和结果分析

a.PCR扩增后，将检测板置于生物芯片分析仪中，启动QuantDrop软件，实验详细步骤按照说明书指引进行检测。

b.检测完成后，单击“分析”以打开并分析数据。单击“二维图”显示二维图，根据阳性对照信号荧光值划分样本野生型和突变型微滴分群；

c.点击“浓度”可显示各孔加入的DNA拷贝数，单位copies/μL；通过计算突变型拷贝数/(突变型+野生型拷贝数)比值而获得突变水平结果。

(5)检测结果判定

a.微滴生成有效性判断：每个反应管的总微滴数≥50000，若总微滴数＜50000，该反应孔的微滴生成不理想，需重新进行微滴生成；

b.空白对照有效性判断：落在“通道2+”区的阳性微滴＜3个，落在“通道 1+，通道2+”区的阳性微滴＜3个；

c.阴性质控品有效性判断：通道1+、通道2+拷贝数都在10³copy/μL；

d.样本A管检测孔落在“通道1+和2+”区之间的是微滴群，微滴数需≥3 个，否则检测无效，需重检。

e.若样本B管检测在“通道1+”区的阳性微滴≥3，判定FLT3基因有ITD 突变；反之判定为低于最低检测限或阴性；

f.根据同一样本A管检测的“通道1+”FLT3基因总拷贝数和B管检测 FLT3-ITD突变型“通道1+”拷贝数比值，计算获得定量突变水平结果。

g.试剂盒的检测限与加入体系的总DNA量相关。当进入体系的总拷贝数在≥10000copies时，即加入人基因组DNA>40ng进行检测，本试剂盒能检出万分之一突变水平的FLT3-ITD突变基因。

三、采用上述试剂盒检测重组质粒配制的突变比例线性参考品。

采用上述人白血病内部串联重复(ITD)突变的微滴式数字PCR检测试剂盒和检测方法对重组质粒配制的线性参考品样本进行检测，具体的检测方法为：

(1)用上述实施例1中试剂盒中的阴性质控品(野生型FLT3 exon13-15 WT 重组质粒和内参基因RPP30重组质粒的混合物)作为母液对突变型FLT3-ITD 重组质粒(也是采用同样的载体pUC57得到)进行梯度稀释，获得4个突变比例线性参考品样本：FLT3-ITD/FLT3exon13-15 WT％：0.01％、0.1％、1％、10％。

(2)根据上述检测方法中的步骤进行试剂配制。

(3)根据上述检测方法中的步骤对突变比线性参考品进行数字PCR检测，结果见表3和图1。

表3

(4)检测结论：采用本发明的试剂盒检测0.01％～10％突变比水平参考品，结果呈线性，相关系数R2>0.99，证明试剂盒能够准确检测到0.01％突变比水平样本(图1)。

实施例2验证试剂盒、检测方法、AS-PCR突变引物的有效性

一、采用实施例1中的人白血病FLT3基因内部串联重复(ITD)突变的微滴式数字PCR检测试剂盒和检测方法，以对实际突变临床样本为对象，测试试剂盒和检测方法、突变引物的有效性，具体的测试过程为：

(1)临床样本：由301医院提供携带FLT3-ITD突变的3个病人DNA样本，医院已经用毛细管电泳法检测了这些DNA样本的FLT3-ITD突变水平情况，见表4。

表4

病人样本	样本1	样本2	样本3
				FLT3-ITD突变	强阳	强阳	强阳

(2)首先对病人的DNA样本进行FLT3基因14号至15号外显子区DNA sanger测序，以获得突变的序列，使用下面的引物进行双端测序：

上游测序引物FLT3-Exon14-F:5’-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’；

下游测序引物FLT3-Exon15-R:5’-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3’。

(3)对测序的结果进行分析，根据样本突变区设计两条引物，一条是采用等位基因特异性PCR引物设计方法(AS-PCR)，即在3’端引入突变碱基，命名用“f”标记，还设计一条全都包含突变碱基序列的引物，命名用“r”标记，两条引物都和测序上游引物位于同一条DNA链上；商业合成后，每条稀释为 20μM的浓度使用。采用设计的引物对FLT3-ITD突变病人DNA样本进行数字 PCR测试，方法如实施例1，将0.9μL浓度为20μM的引物加入表2的的反应体系中，调整无核酸酶水用量至反应体系为20μL。

设计的突变上游引物：

样本1的引物SF8-f3:5’-CAAATGGGAGTTTCCAAGAGACTAC-3’；

样本1的引物SF8-r4:5’-GAATTCTGCACACACATT-3’；

样本2的引物SF9-f1:5’-GAGAAAATTTAGAGTTTGTTG-3’；

样本2的引物SF9-r1:5’-AGATAATGAGTTGCAATTT-3’；

样本3的引物SF13-f1:5’-GAATATGATCTCAATGAAAG-3’；

样本3的引物SF13-r2:5’-GAGAATATGTGCAATTTAGG-3’。

(4)结果与分析

表5

采用引物SF8-f3、SF8-r4、SF9-f1、SF9-r1、SF13-f1、SF13-r2针对突变临床样本进行数字PCR检测的测序结果见图2-7及表5。结果表明，人白血病FLT3 基因内部串联重复(ITD)突变数字PCR检测试剂盒采用等位基因特异性PCR 设计特异的突变检测引物比普通设计的突变引物更有效，检测结果的特异性及准确性更高。

二、采用实施例1中的人白血病FLT3基因内部串联重复(ITD)突变的微滴式数字PCR检测试剂盒和检测方法，检测健康人外周血DNA样本，结果如图8所示，说明本试剂盒在不加突变引物时不会产生非特异的通道1，即FAM 探针信号微滴，证明本试剂盒的特异性强。

实施例3采用试剂盒检测实际临床样本

本实施例采用实施例1人白血病内部串联重复(ITD)突变的微滴式数字 PCR检测试剂盒和检测方法对实际临床样本进行检测，具体的检测方法为：

(1)收集临床样本：由301医院提供携带FLT3-ITD突变的6个病人分别在治疗不同时期提取血液DNA样本，医院已经用毛细管电泳法检测了这些DNA 样本的FLT3-ITD突变水平情况，见下表6。

表6

(2)首先对6个病人病情不同治疗时期的DNA样本进行FLT3基因14号至15号外显子区DNA sanger测序，获得突变的序列，共18条。使用下面的引物进行双端测序：

上游测序引物FLT3-Exon14-F:5’-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’；

下游测序引物FLT3-Exon15-R:5’-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3’。

(3)对测序的结果进行分析，根据突变区设计等位基因特异性PCR引物，引物和测序上游引物位于同一条DNA链，商业合成，每条稀释为20μM的浓度使用。采用设计的引物对FLT3-ITD突变病人DNA样本进行数字PCR测试，方法如实施例1。

根据病人测序结果设计的突变检测引物：

1号病人的引物SF1-f2:5’-ATTTAGAGTTTGACCCGT-3’；

2号病人的引物SF8-f3:5’-CAAATGGGAGTTTCCAAGAGACTAC-3’；

3号病人的引物SF9-f1:5’-GAGAAAATTTAGAGTTTGTTG-3’；

4号病人的引物SF13-f1:5’-GAATATGATCTCAATGAAAG-3’；

5号病人的引物SF16-f2:5’-GAATATGAATATGATCTGGAT-3’；

6号病人的引物SF17-r1:5’-ATTTCAGAGAATCGGCCCTCG-3’。

(4)结果与分析

a.1号病人和6号病人的检测二维图见图9、10、11、12。

b.检测样本的突变水平结果见表7。

表7

c.结果分析：

人白血病FLT3基因内部串联重复(ITD)突变的数字PCR法检测试剂盒检测6个FLT3-ITD突变病人病情治疗不同时期的样本，共18例，结果和临床毛细管电泳法检测结果符合率100％。而且，在临床阴或弱阳不明确结果的样本中，本发明试剂盒也能给出一个具体的突变率水平，进一步提高了阴性检测结果的准确性和灵敏性。

因此，和目前临床使用的监测FLT3-ITD突变的技术相比，本发明试剂盒具有绝对定量、灵敏度和准确性高等优点，为携带FLT3-ITD突变的AML患者持续监控治疗效果、指导用药和预测疾病的进展，具有潜在的应用价值。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东永诺医疗科技有限公司

<120> 人白血病FLT3基因内部串联重复突变检测的引物探针组合、试剂盒及应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FLT3-Exon14-CF

<400> 1

gtacgtgcat tttaaagatt ttccaa 26

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FLT3-Exon15-R1

<400> 2

gcaatttagg tatgaaagcc agc 23

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FLT3-Intron14-Probe

<400> 3

ctgcagaaac atttggcaca ttccattct 29

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RPP30-F

<400> 4

gatttggacc tgcgagcg 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RPP30-R

<400> 5

gagcggctgt ctccacaagt 20

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RPP30-Probe

<400> 6

ctgacctgaa ggctct 16

<210> 7

<211> 449

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FLT3野生型序列FLT3 exon13-15 WT

<400> 7

cttttccaaa agcacctgat cctagtacct tccctgcaaa gacaaatggt gagtacgtgc 60

attttaaaga ttttccaatg gaaaagaaat gctgcagaaa catttggcac attccattct 120

taccaaactc taaattttct cttggaaact cccatttgag atcatattca tattctctga 180

aatcaacgta gaagtactca ttatctgagg agccggtcac ctgtaccatc tgtagctggc 240

tttcatacct aaattgcttc agagatgaaa tgatgagtca gttaggaata ggcagttctg 300

cagatagagg aaagaataat gaatttttac ctttgctttt acctttttgt acttgtgaca 360

aattagcagg gttaaaacga caatgaagag gagacaaaca ccaattgttg catagaatga 420

gatgttgtct tggatgaaag ggaaggggc 449

<210> 8

<211> 295

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RPP30序列

<400> 8

atgggacttc agcatggcgg tgtttgcaga tttggacctg cgagcgggtt ctgacctgaa 60

ggctctgcgc ggacttgtgg agacagccgc tcaccgtgag ttgccccggc ttcgcgcctg 120

gccaacctca tgccacccag accatcgggc cacactccgg agtaactatt tcctgatggg 180

tctcggtcag gtctcccaga gtctctggga tgtccctgga ggctgatgcc cgccgaggtg 240

ttggtctgat tcctagcgcg ggaaactcga aggttctggg ggttgttatc tggtt 295

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FLT3-Exon14-F

<400> 9

gcaatttagg tatgaaagcc agc 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FLT3-Exon15-R

<400> 10

ctttcagcat tttgacggca acc 23

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SF8-f3

<400> 11

caaatgggag tttccaagag actac 25

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SF8-r4

<400> 12

gaattctgca cacacatt 18

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SF9-f1

<400> 13

gagaaaattt agagtttgtt g 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SF9-r1

<400> 14

agataatgag ttgcaattt 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SF13-f1

<400> 15

gaatatgatc tcaatgaaag 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SF13-r2

<400> 16

gagaatatgt gcaatttagg 20

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FLT3-Exon14-F

<400> 17

gcaatttagg tatgaaagcc agc 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FLT3-Exon15-R

<400> 18

ctttcagcat tttgacggca acc 23

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SF1-f2

<400> 19

atttagagtt tgacccgt 18

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SF8-f3

<400> 20

caaatgggag tttccaagag actac 25

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SF9-f1

<400> 21

gagaaaattt agagtttgtt g 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SF13-f1

<400> 22

gaatatgatc tcaatgaaag 20

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SF16-f2

<400> 23

gaatatgaat atgatctgga t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SF17-r1

<400> 24

atttcagaga atcggccctc g 21

Claims (10)

1.一种人白血病FLT3基因内部串联重复突变检测的引物探针组合，其特征在于，所述FLT3基因的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述探针序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种人白血病FLT3基因内部串联重复突变的检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物探针组合；

所述试剂盒还包括内参基因RPP30的引物探针；

所述试剂盒为微滴式数字PCR检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述人白血病FLT3基因内部串联重复突变的检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因RPP30的引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ IDNO.6所示。

4.根据权利要求2或3所述人白血病FLT3基因内部串联重复突变的检测试剂盒，其特征在于，所述FLT3基因的引物探针组合、内参基因RPP30的引物探针以混合液的形式存在：FLT3基因检测混合液A，由所述SEQ ID NO.1-6的引物和探针组成；FLT3-ITD突变检测混合液B，由所述SEQ ID NO.2-6的引物和探针组成；

所述引物探针组合中的探针和内参基因RPP30的探针连接荧光标记基团。

5.根据权利要求4所述人白血病FLT3基因内部串联重复突变的检测试剂盒，其特征在于，

所述FLT3基因检测混合液A、FLT3-ITD突变检测混合液B中，引物、探针的浓度分别为900nM、250nM；

引物探针组合中的探针采用FAM、BHQ1标记，内参基因RPP30的探针采用VIC、MGB标记。

6.根据权利要求4所述人白血病FLT3基因内部串联重复突变的检测试剂盒，其特征在于，

所述试剂盒还包括反应预混液，由buffer、0.2mMdNTPs、2Utaq酶、2UUDG酶组成；

所述试剂盒还包括阴性质控品，为野生型FLT3序列的重组质粒和内参基因RPP30重组质粒的混合物；

所述试剂盒还包括空白对照，为无核酶水。

7.根据权利要求6所述人白血病FLT3基因内部串联重复突变的检测试剂盒，其特征在于，

所述野生型FLT3序列如SEQ ID NO.7所示；

所述内参基因RPP30序列如SEQ ID NO.8所示；

所述野生型FLT3序列的重组质粒和内参基因RPP30重组质粒的采用的质粒为pUC57；

所述野生型FLT3序列的重组质粒和内参基因RPP30重组质粒的的摩尔比为10％。

8.权利要求1所述引物探针组合、2-7任一项所述试剂盒在检测人白血病FLT3基因内部串联重复突变中的应用。

9.一种检测人白血病FLT3基因内部串联重复突变的方法，采用权利要求4-7任一项所述试剂盒进行微滴式数字PCR检测，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)突变区的上游突变引物设计：根据患者初诊后的FLT3-ITD突变序列设计位于FLT3基因14号至15号外显子突变区的上游突变引物并合成；

(2)配制PCR反应体系：将同一个患者来源DNA样本分为A、B两个PCR反应体系；A反应体系包括反应预混液、FLT3基因检测混合液A、DNA模板、无核酶水；B反应体系包括反应预混液、步骤(1)所述位于突变区的上游突变引物、FLT3-ITD突变检测混合液B、DNA模板、无核酶水；同时配制阴性质控品和空白对照，分别替换所述PCR反应体系中DNA模板即得到；

(3)微滴制备、PCR扩增：将步骤(2)所述A、B两个PCR反应体系进行微滴式数字PCR芯片微滴制备，将得到的微滴进行扩增；

(4)微滴荧光检测：采用生物芯片分析仪对步骤(3)扩增后的微滴进行荧光检测，获得拷贝数，分析结果，从A反应检测获得的总FLT3基因拷贝数和B反应检测获得的突变型FLT3-ITD拷贝数比值计算得到患者FLT3-ITD突变水平；

步骤(1)所述上游突变引物为根据等位基因特异性PCR设计的引物，位于人基因组DNA负链，和所述探针位于同一条DNA链；所述上游突变引物的3’端引入3-6个突变碱基，5’端则和人基因组DNA野生型序列一致；所述上游突变引物的退火温度和试剂盒中下游引物退火温度58℃相差不超过±2℃。

10.权利要求9所述检测人白血病FLT3基因内部串联重复突变的方法，其特征在于，

步骤(1)所述上游突变引物使用时采用1×TE稀释至浓度为20μM；

步骤(2)所述DNA模板为全血或骨髓液中提取的DNA；

步骤(2)所述A、B两个PCR反应体系中DNA模板的加入量一致，均为40-300ng；

步骤(2)所述A PCR反应体系为20μL：反应预混液10μL、FLT3基因检测混合液A2μL、DNA模板7μL、无核酸酶水补足至20μL；

步骤(2)所述BPCR反应体系为20μL：反应预混液10μL、上游突变引物20μM 0.9μL、FLT3-ITD突变检测混合液B 2μL、DNA模板7μL、无核酸酶水水补足至20μL；

步骤(3)所述扩增的程序为：50℃反应2min；95℃反应10min；95℃反应30sec，60℃反应60sec，45个循环；98℃反应10min；16℃终止；每步设置1℃/sec的升降温速度；

步骤(4)中，A、B两个PCR反应体系检测的FAM荧光通道的拷贝数比值，即为患者FLT3-ITD突变水平。

Images