CN103740835B - 一种白血病融合基因荧光pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种白血病融合基因荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包含PCR反应液，所述PCR反应液中包含白血病融合基因BCR/ABL的引物和探针序列如下，BCR/ABL上游引物：CGAGTAACATGTCCAGGGACTGGCTG，BCR/ABL下游引物：GGAAAGGAGTCTACATGCGTTCCTT，BCR/ABL探针：CCGACAACAAAGGCTACCAGTGCGCTTCTA。优选所述试剂盒中还包含另两种PCR反应液，所述另两种PCR反应液中的一种包含白血病融合基因TEL／AML1的引物探针序列和另一种包含白血病融合基因AML1／ETO的引物探针序列。应用本发明提供的操作快速、方法简便、检测效果好的试剂盒，可以对患者骨髓组织中的BCR/ABL、TEL／AML1、AML1／ETO这三种融合基因的阴阳性进行分别的定性检测，从而为白血病的临床诊断和后续用药提供帮助。

Description

一种白血病融合基因荧光PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种白血病融合基因荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

白血病（leukemia）是起源于造血系统的一类全身性恶性肿瘤，具有高度的异质性，但其共同的特点为骨髓中产生和积聚大量幼稚或异常的血细胞。与相对应的正常血细胞比较，这些异常的细胞具有不同的生物学特性，往往表现为增殖能力增高、分化障碍或凋亡减少，并且还可以表达一些细胞表面分子或分泌一些可溶性介质从而发挥其恶性特征。随着这些异常细胞的增多，可以引起骨髓正常造血功能和宿主免疫功能的抑制或衰竭，并且可以进入血液循环和侵犯其他任何组织和器官，最终导致贫血、感染、出血和器官浸润引起的各种临床症状和体征。临床出现不同程度的贫血、出血、发热及肝脾、淋巴结肿大，可危及生命。

白血病融合基因(fusiongene)，是白血病的分子生物学特异性标志。近年来，由于分子生物学技术的发展，对白血病细胞分子遗传学改变的了解也不断深入。迄今报道白血病涉及至少数十种融合基因.已经认识到大部分的白血病中存在着染色体结构畸变，包括缺失、重复、倒位、易位等，导致原癌基因及抑癌基因结构变异，原癌基因激活或抑癌基因失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。有些基因是调控细胞增殖、分化和凋亡的转录因子，当基因发生变异，直接影响了下游信号传递途径，导致细胞增殖能力增强、凋亡障碍，分化障碍等，产生白血病表型。

融合基因检测对白血病的诊断有着极其重要的意义。通过临床实践发现单纯细胞形态学分型，检测者的主观成分较大，相互间的符合率及正确率有一定限制。随着细胞和分子生物学技术的迅速发展及对白血病发病机制研究的不断深入，认识到白血病发病过程中的基因和表型变化对各类白血病的诊断与治疗具有重要意义，因此提出了白血病MICM分型。近两年白血病分子特征的研究取得了明显进展，尤其是对染色体易位形成融合基因，有一些已作为诊断不同类型白血病的分子生物学特异性标志和确定诊断的唯一依据。白血病融合基因可以通过逆转录PCR(RT-PCR)技术加以检出，有助于评价白血病的急性程度、克隆特性及分型，使白血病的诊断分型更加科学化和规范化。2007年卫生部颁布的《医疗机构临床检验项目目录》，其中有要求利用RT-PCR或real-timePCR技术的白血病融合基因检查，主要涉及6种融合基因的检查，包括BCR／ABL、PML／RARа、AML1／MPSI／EV11、DEK／CAN、AML1／MTG8、E2A／PBX1。RT-PCR可比传统的细胞学方法及临床症状出现早5～8个月，可检出1×10⁶个有核细胞中的一个白血病细胞，在白血病的早期诊断方面有着其它方法无可比拟的特异性和敏感性。

融合基因捡测对白血病治疗和预后判断也有着很重要的作用。细胞遗传学分型与疾病的预后关系密切，对于指导临床个性化治疗方案的选择和判断预后具有十分重要的意义。急性白血病有PML／RARа，CBFB／MYH11，AML1／ETO融合基因预后较好，化疗完全，缓解率高，可长期缓解或治愈，不主张早期做造血干细胞移植；而对于有MLL异常（融合基因中含MLL基因），或含AML（急性髓细胞白血病）中的MYC／IgH融合基因，或含ALL（急性淋巴细胞白血病）中的BCR／ABL融合基因，则病人对化疗反应差，复发率高，建议其有条件则积极行造血干细胞移植。有了融合基因的检测，初治时可指导科学合理地选择长期治疗方案，避免不必要的治疗不足或过度治疗。

融合基因检测常用的方法主要包括白血病细胞染色体核型分析、染色体荧光原位杂交(FluorescentInSituHybridazation,FISH)技术和聚合酶链式反应技术（PolymeraseChainReaction,PCR）。

染色体G显带核型分析技术的阳性率主要依赖于待检白血病细胞的增生率，常常受到检测技术条件和人为操作因素的影响，每份检测标本需要至少分析10～30个分裂中期细胞，而且由于样本中的细胞也并非都是均一的肿瘤细胞，因此当细胞量过少时则不能进行核型分析，同时某些复杂性染色体易位的辨认在技术上存在一定的困难。但核型分析技术在检测缺失和数目畸变等染色体异常方面具有优势，是检测ALL患者染色体异常必不可少的手段。

染色体荧光原位杂交是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。用荧光标记的已知单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行杂交，形成可被检测的杂交双链核酸，以确定与探针互补的核酸序列在染色体上的位置和分布。荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点。用生物素或地高辛标记的DNA探针可对间期或分裂早中期的肿瘤细胞进行原位杂交检测，不仅能对分裂中期的染色体进行检测，而且也能敏感地测定分裂间期细胞的异常核型(包括染色体易位)并进行定性、定量以及定位分析。但由于价格昂贵，临床应用受到一定限制。

PCR是检测白血病相关融合基因较为有效且敏感的方法，除常规PCR方法外，巢氏RT-PCR（nestedreversetranscriptionPCR)、实时荧光定量PCR(realtimequantitativePCR，RQ-PCR)已应用于白血病相关融合基因的定性及定量检测。实时荧光定量PCR技术(realtimequantitativePCR，RQ-PCR)不但能确定白血病细胞是否表达融合基因，而且在治疗的不同阶段，还能检测出融合基因表达水平的变化，即MRD水平。目前该技术在科研和临床上已得到了广泛的应用，也为白血病的分子生物学研究提供了新的手段，已有很多临床和实验室研究人员应用该技术在白血病融合基因检测及其临床应用进行了大量的研究报道。参阅国内外文献，应用RQ-PCR检测白血病融合基因，其实都是检测其RNA的表达，大多采用的是Taqman水解探针、杂交探针及DNA染料的结合的RQ-PCR技术，其中使用最多的为水解探针技术。各检测技术虽然在原理上有差异，但其使用的仪器（实时荧光定量PCR仪）和建立的检测方法大同小异。

国内已有多种基于实时荧光定量PCR技术检测白血病融合基因的试剂盒应用于临床检测中，但受限于其引物探针序列，本领域还需开发出一种检测白血病融合基因特异性好且综合性能优良的PCR检测试剂盒。另外，这些试剂盒还因没有设置阳性内对照（即内标），无法监控假阴性；和一般没有预防PCR产物污染的措施。

发明内容

本发明首先提供一种白血病融合基因荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包含PCR反应液，所述PCR反应液中包含白血病融合基因BCR/ABL的引物和探针序列如下，

BCR/ABL上游引物：CGAGTAACATGTCCAGGGACTGGCTG，

BCR/ABL下游引物：GGAAAGGAGTCTACATGCGTTCCTT，

BCR/ABL探针：CCGACAACAAAGGCTACCAGTGCGCTTCTA。

优选的，所述试剂盒中还含有检测白血病融合基因的内标，且所述PCR反应液中还包含内标的引物和探针序列如下，

内标序列：TAGGACTTAAATCCTATTGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTAGCTGACTCACGTATTCGTAGCCACCCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAGG，

内标上游引物：AATCCTATTGTTCCAGCTCTGTCAT，

内标下游引物：TCCAGAAGGGTGGCTACGAA，

内标探针：CAGTTAGCTGACTCACG。

在本发明的一种具体实施方式中，所述PCR反应液中还包含融合基因TEL／AML1的引物探针序列和/或融合基因AML1／ETO的引物探针序列，其序列如下，

TEL／AML1上游引物：TGTGTAACATGTCCAAAGACTGGTTC，

TEL／AML1下游引物：AAGAGGAGGAGTACATGCAAGTCCTT，

TEL／AML1探针：ACTACTTCATTTTGGCTACCAGGGCTTCTA；

AML1／ETO上游引物：GGTGTAGACATGATTAAAGACTGGAAC，

AML1／ETO下游引物：AAGAAGGGAGTACTTGCGCTCCTT，

AML1／ETO探针：ACTTCAACATTGGTTACCAGAACTTCTA。

在该具体的实施方案中，一种情况是所述PCR反应液中包含BCR/ABL的引物探针序列和TEL／AML1的引物探针序列，该试剂盒可检测待测样本中是否含有这两种融合基因，当待测样本中不含这两种融合基因时，检测结果为阴性，而当待测样本中含有这两者中的任意一种或两种时，检测结果为阳性。第二种情况是所述PCR反应液中包含BCR/ABL的引物探针序列和AML1／ETO的引物探针序列，同样的，当待测样本中不含这两种融合基因时，检测结果为阴性，而当待测样本中含有这两者中的任意一种或两种时，检测结果为阳性。而第三种情况是所述PCR反应液中包含BCR/ABL的引物探针序列、TEL／AML1的引物探针序列和AML1／ETO的引物探针序列，相应的，当待测样本中不含这三种融合基因时，检测结果为阴性，而当待测样本中含有这三者中的任意一种或多种时，检测结果为阳性。

在本发明的另一种具体实施方式中，所述试剂盒中还包含另一种PCR反应液，所述另一种PCR反应液中包含白血病融合基因TEL／AML1的引物探针序列或融合基因AML1／ETO的引物探针序列，其序列如上所示。容易理解的，使用本发明所述试剂盒，从待测样本的检测结果中可以清楚地得知待测样本中是否含有这两种融合基因中（BCR/ABL和TEL／AML1，或BCR/ABL和AML1／ETO）的任意一种，也就是说该试剂盒能分别判断这两种融合基因的阴性和阳性。

在本发明的另一种具体实施方式中，所述试剂盒中还包含另两种PCR反应液，所述另两种PCR反应液中的一种包含白血病融合基因TEL／AML1的引物探针序列和另一种包含白血病融合基因AML1／ETO的引物探针序列，其序列如上所示。容易理解的，该试剂盒能分别判断这三种融合基因的阴性和阳性。应用本发明提供的操作快速、方法简便、检测效果好的试剂盒，可以对患者骨髓组织中的BCR/ABL、TEL／AML1、AML1／ETO融合基因的RNA进行定性检测，从而为白血病的临床诊断和后续用药提供帮助。

在该具体实施方式中，优选的，所述试剂盒中还包含内标，且试剂盒中的每一种PCR反应液中均包含内标的引物和探针序列，内标序列和内标的引物探针序列如上所示。

在另一种具体实施方式中，所述试剂盒中包括内标、1～3种PCR反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照。

具体实施方式

本发明中以下述实施例具体说明本发明，但这些实施例并不用来限制本发明。

实施例1

本实施例提供一种白血病融合基因BCR/ABL、TEL／AML1、AML1／ETO的PCR检测试剂盒。

①内标（阳性内对照）：为插入pUC18T载体的一段长为100碱基对的人工合成DNA序列的重组体，即质粒，浓度为1.00E+04copies/ml～5.00E+04copies/ml，作为PCR扩增体系中的阳性内对照，预防由于样本中可能存在的PCR干扰物质导致的假阴性；100碱基对的序列如下所示：5’-TAGGACTTAAATCCTATTGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTAGCTGACTCACGTATTCGTAGCCACCCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAGG-3’；

②PCR反应液：10×PCR反应缓冲液5μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针，0.2μmol/L～0.4μmol/L的用于内标片段扩增的上下游引物，0.1μmol/L～0.2μmol/L的用于检测内标的探针。所述10×PCR反应缓冲液包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2%(体积/体积)曲拉通溶液和10%(体积/体积)甲酰胺溶液；所述脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dUTP、dGTP或dTTP；所述用于检测BCR/ABL、TEL／AML1、AML1／ETO的引物和探针序列分别为：

BCR/ABL上游引物：5’-CGAGTAACATGTCCAGGGACTGGCTG-3’；

BCR/ABL下游引物：5’-GGAAAGGAGTCTACATGCGTTCCTT-3’；

BCR/ABL探针：5’-CCGACAACAAAGGCTACCAGTGCGCTTCTA-3’。

TEL／AML1上游引物：5’-TGTGTAACATGTCCAAAGACTGGTTC-3’；

TEL／AML1下游引物：5’-AAGAGGAGGAGTACATGCAAGTCCTT-3’；

TEL／AML1探针：5’-ACTACTTCATTTTGGCTACCAGGGCTTCTA-3’。

AML1／ETO上游引物：5’-GGTGTAGACATGATTAAAGACTGGAAC-3’；

AML1／ETO下游引物：5’-AAGAAGGGAGTACTTGCGCTCCTT-3’；

AML1／ETO探针：5’-ACTTCAACATTGGTTACCAGAACTTCTA-3’。

所述的用于检测内标的引物探针序列分别为：

内标上游引物：5’-AATCCTATTGTTCCAGCTCTGTCAT-3’；

内标下游引物：5’-TCCAGAAGGGTGGCTACGAA-3’；

内标探针的序列为：5’-CAGTTAGCTGACTCACG–3’；

③酶混合液：耐热DNA聚合酶（Taq酶）1U/μl～5U/μl，尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶）0.5U/μl～2U/μl；其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用；

④阳性对照：为强阳性质粒，其浓度为1.00～5.00E+05copies/ml；

⑤阴性对照：为灭菌生理盐水；

实施例2

本实施例提供实施例1中的白血病融合基因BCR/ABL、TEL／AML1、AML1／ETO检测试剂盒用于检测如患者骨髓组织等未知样本的操作步骤。

一、试剂准备：

根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例取相应量的PCR反应液（38μl/人份）、酶混合液（2μl/人份）及内标（0.5μl/人份），充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。

二、样本处理与加样

1）在不同的5个PCR反应管中加入同一待测样本、阴性对照、阳性对照各5μl；

2）静置10分钟后，每管加入PCR-mix45μl，吸打混匀2-3次，盖上管盖（去除气泡后），2000rpm离心30秒。

三、在荧光定量PCR扩增仪上进行PCR扩增

1）将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。

2）荧光检测通道选择：选择FAM通道（Reporter:FAM,Quencher:None）检测融合基因；选择HEX或VIC通道（Reporter:VIC,Quencher:None）检测内标；参比荧光（PassiveReference）设置为none。

3）荧光定量PCR反应条件为：

表1

4）结果分析

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析（也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析），然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct（即cyclethreshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值）；如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且Ct≤39，可以判为白血病融合基因（BCR/ABL、TEL／AML1、AML1／ETO三者中任意一个或多个）阳性；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示（Undet）显示，可以判为白血病融合基因（BCR/ABL、TEL／AML1和AML1／ETO三者）阴性。

实施例3

本实施例提供另一种白血病融合基因BCR/ABL、TEL／AML1、AML1／ETO的PCR检测试剂盒，使用该试剂盒可具体区分上述三种融合基因中的每一种为阴性还是阳性。

该试剂盒的组分①～⑤中除了组分②以外，其余组分与实施例1中的组分相同。

本实施例中的组分②PCR反应液为三种PCR反应液，具体的，在第一种PCR反应液中含有白血病融合基因BCR/ABL的引物和探针序列以及内标的引物探针序列，在第二种PCR反应液中含有白血病融合基因TEL／AML1的引物和探针序列以及内标的引物探针序列，而在第三种PCR反应液中含有白血病融合基因AML1／ETO的引物和探针序列以及内标的引物探针序列。

实施例4

本实施例提供实施例3所述试剂盒用于检测如患者骨髓组织等未知样本的操作步骤。

一、试剂准备：

根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例取相应量的PCR反应液（38μl/人份）、酶混合液（2μl/人份）及内标（0.5μl/人份），充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。其中，相应于每份待测样本均根据三种不同的PCR反应液配制三管（3根PCR反应管）不同的PCR-mix，阴性对照和阳性对照也各自配制三管不同的PCR-mix。

二、样本处理与加样

1）在不同的PCR反应管中加入待测样本、阴性对照、阳性对照各10μl；

2）静置10分钟后，每管加入其相应的PCR-mix各40～45μl，吸打混匀2-3次，盖上管盖（去除气泡后），2000rpm离心30秒。

三、在荧光定量PCR扩增仪上进行PCR扩增

1）将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。

2）荧光检测通道选择：选择FAM通道（Reporter:FAM,Quencher:None）检测融合基因BCR/ABL、TEL／AML1和AML1／ETO；选择HEX或VIC通道检测内标；参比荧光（PassiveReference）设置为none。

3）荧光定量PCR反应条件如表1所述。

4）结果分析

反应结束后，如果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且Ct≤39，可以判为相应的白血病融合基因（BCR/ABL、TEL／AML1或AML1／ETO）阳性；如果样本扩增曲线平直，无Ct值显示（Undet）显示，可以判为相应的白血病融合基因（BCR/ABL、TEL／AML1或AML1／ETO三者）呈阴性。

本发明通过荧光定量PCR融合基因检测来诊断白血病，为临床白血病快速检测开辟新的、简洁方便的检测途径。另外，对PCR反应体系进行了优化组合，利用UNG酶可以降解含dU的DNA链的特点，在PCR体系中添加了UNG酶和dUTP，可以预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性；在样本提取过程中增加了内标，利用内标监控DNA提取和PCR反应过程，监控反应体系是否有效，防止样本检测假阴性。检测结果可用于白血病的辅助诊断及后续治疗效果判定，为临床诊断和治疗提供分子诊断依据。使用本发明的试剂盒检测企业工作参考品，阴阳性参考品符合率为100%。且精密度试验表明：批内和批间重复性好，检测结果Ct值的变异系数<10%，浓度变异系数<50%。本发明试剂盒为定性检测试剂盒。

Claims (8)

1.一种白血病融合基因荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含PCR反应液，所述PCR反应液中包含白血病融合基因BCR/ABL的引物和探针序列如下，

BCR/ABL上游引物：CGAGTAACATGTCCAGGGACTGGCTG，

BCR/ABL下游引物：GGAAAGGAGTCTACATGCGTTCCTT，

BCR/ABL探针：CCGACAACAAAGGCTACCAGTGCGCTTCTA；

所述试剂盒中还含有检测白血病融合基因的内标，且所述PCR反应液中还包含内标的引物和探针序列如下，

内标序列：TAGGACTTAAATCCTATTGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTAGCTGACTCACGTATTCGTAGCCACCCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAGG，

内标上游引物：AATCCTATTGTTCCAGCTCTGTCAT，

内标下游引物：TCCAGAAGGGTGGCTACGAA，

内标探针：CAGTTAGCTGACTCACG。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中还包含融合基因TEL/AML1的引物探针序列和/或融合基因AML1/ETO的引物探针序列，其序列如下，

TEL/AML1上游引物：TGTGTAACATGTCCAAAGACTGGTTC，

TEL/AML1下游引物：AAGAGGAGGAGTACATGCAAGTCCTT，

TEL/AML1探针：ACTACTTCATTTTGGCTACCAGGGCTTCTA；

AML1/ETO上游引物：GGTGTAGACATGATTAAAGACTGGAAC，

AML1/ETO下游引物：AAGAAGGGAGTACTTGCGCTCCTT，

AML1/ETO探针：ACTTCAACATTGGTTACCAGAACTTCTA。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含另一种PCR反应液，所述另一种PCR反应液中包含白血病融合基因TEL/AML1的引物探针序列或融合基因AML1/ETO的引物探针序列，其序列如权利要求2所示。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含另两种PCR反应液，所述另两种PCR反应液中的一种包含白血病融合基因TEL/AML1的引物探针序列和另一种包含白血病融合基因AML1/ETO的引物探针序列，其序列如权利要求2所示。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，含有所述TEL/AML1的引物探针序列的PCR反应液或含有所述AML1/ETO的引物探针序列的PCR反应液中包含内标的引物和探针序列，且内标序列和内标的引物探针序列为权利要求1中所示的序列。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，含有所述TEL/AML1的引物探针序列的PCR反应液和含有所述AML1/ETO的引物探针序列的PCR反应液中均包含内标的引物和探针序列，且内标序列和内标的引物探针序列为权利要求1中所示的序列。

7.根据权利要求1～4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括酶混合液、阳性对照和阴性对照。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括酶混合液、阳性对照和阴性对照。