CN112813167A - 标志物linc01977及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域和分子诊断技术领域，公开了标志物LINC01977及其应用。本发明提供的检测肺腺癌组织lncRNA的试剂盒，能够从组织中方便、准确地检测长链非编码RNA：LINC01977，有利于实验室及临床中提取肺腺癌组织LINC01977的分析和应用；提供的LINC01977检测方法和试剂盒，可快速检测LINC01977；早期易发生淋巴结转移的肺腺癌诊断试剂盒，快速检测LINC01977；通过实验证明，肺腺癌组织中LINC01977可以作为早期肺腺癌是否具备淋巴结转移倾向，并具有预后判断价值的新型标志物。本发明为肺腺癌的复发转移和预后评估等临床治疗提供帮助。

Description

标志物LINC01977及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域和分子诊断技术领域，涉及一种肺腺癌组织标志物LINC01977、检测方法以及应用。

背景技术

肺癌(lung cancer)是全球发病率和死亡率均位于首位的恶性肿瘤之一，已成为全球巨大医疗负担。我国是肺癌高发国家，其发病率均居我国恶性肿瘤首位，其中最为常见的病理类型是肺腺癌。目前肺腺癌的确诊依靠组织活检，早期肺腺癌患者经手术病理确诊，其预后尚佳。早期肺腺癌患者发生淋巴结转移，往往伴有更差的预后，易发生复发转移的肺腺癌在治疗上以手术切除和放化疗为主要手段。但放化疗对人体正常肺组织损伤较大。因此，建立一种微创、早期、灵敏和方便的检测手段是必要的。研究和探讨肿瘤标记物，可有效的判断肿瘤标记物升高或降低对肺癌的影响，对预后做出精确评价。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是指一类长度大于200nt的非编码RNA，有别于其他小分子非编码RNA，其可以通过顺式(in cis)或反式(in trans)作用的方式调节RNA代谢、蛋白质功能活性、组蛋白修饰以及染色质重塑等过程。在表观遗传学领域以及转录水平、转录后水平、蛋白修饰水平广泛参与细胞生物学过程。近年来，许多研究证实lncRNA不仅在维持机体正常生理功能及发育过程中发挥着重要的调控作用，其异常表达与疾病的发生发展尤其是肿瘤的恶性进展有着密切的联系。一个众所周知的致癌lncRNA参与肿瘤的发病机理为MALAT1(人肺腺癌转移相关转录本1)，它一直在易转移组织中被上调，确定为影响肺癌患者预后的标志物，影响多种人类肿瘤患者的生存率。近年来，lncRNA成为肿瘤发生发展研究热点，有很多研究显示，lncRNA在肺腺癌组织中高表达，现有证据表明lncRNA可作为理想的肺腺癌肿瘤标志物。虽然在以往的研究里，肺腺癌组织中的lncRNA已被广泛研讨，但LINC01977作为尚未被注释的一个新lncRNA在肺腺癌中的意义尚不明确。因此急需对此进行研究，并探讨其对肺腺癌的生物学效应，以获得用于诊断和肺腺癌基因治疗的潜在治疗靶点。

目前，急需开发一种简便且普遍适用的提取和检测组织lncRNA方法，既能保证提取lncRNA的方法统一，且lncRNA浓度和纯度适合后续诊断，又能保证简单可行的方法在基层医疗卫生单位可实施开展。

发明内容

1.解决的技术问题

目前针对组织lncRNA作为肿瘤诊断标志物的分析仅有少数报道，大多利用高通量测序技术对组织lncRNA进行表达谱分析，可用于复发转移和预后诊断肺腺癌的组织lncRNA分子尚不清楚。现有RNA提取试剂盒无法保证在珍贵组织样本中提取可供后续检测的lncRNA的浓度以及纯度。

本发明提供了一种生物标志物LINC01977，能为复发转移倾向和预后不良的肺腺癌患者的早期诊断提供新的检测方法，也能为发掘和分析更多组织lncRNA应用于肿瘤标志物提供帮助。本发明提供的组织lncRNA检测方法和产品，能够从样本中准确地检测肺腺癌组织LINC01977的表达量，为肺腺癌复发转移和预后情况提供方便可行的检测方法，为临床上合适的治疗方案的选择提供帮助。

2.技术方案

针对目前存在的问题，本发明提供了一种生物标志物LINC01977，该生物标志物LINC01977为长链非编码RNA，其是由17号染色体基因转录产生而来，本发明的长链非编码RNA在NCBI中的命名为LINC01977，其基因ID：105371919，LINC01977的转录本序列是Genbank登录号NR_146504.1。

所述LINC01977相应的DNA序列如SEQ ID NO:1所示(表1)。

本发明的LINC01977作为生物标志物、特别是生物组织标志物使用，其可用于癌症的复发转移及预后评估，在本申请中，若提到作为生物标志物使用，则它指在生物组织体的体外样品(即离体)如组织、器官中测定所述生物标志物。对于任何技术人员来说这明显意味只有这类生理存在的“LINC01977”分子将被测定，事实上它们可在这类样品中存在。在组织样品可能存在几种不同种类的基本上等同的长链非编码RNA，例如它们在长度和/或其存在方式和/或类型上有差别。

本发明中的LINC01977还包括显示出例如与LINC01977相应的DNA序列只有75％同源性、优选至少80％同源性、优选至少85％同源性、优选至少88％同源性、更优选至少90％同源性的更优选至少95％，优选至少96％同源性、优选至少97％同源性、优选至少98％同源性、优选至少99％同源性的长链非编码RNA序列。

本发明进一步的提供了生物标志物LINC01977在制备用于肿瘤复发转移及预后评估的产品中的应用。

进一步地，所述肿瘤或癌症包括鼻腔及鼻窦恶性肿瘤，鼻咽癌，口腔癌，喉癌，涎腺肿瘤，颅内肿瘤，甲状腺癌，舌癌，肺癌，食管癌，贲门癌，乳腺癌，纵膈肿瘤，胃癌，大肠癌，直肠癌，肝癌，肺腺癌、胰腺癌与壶腹周围癌，小肠恶性肿瘤，肾癌，前列腺癌，膀胱癌，子宫颈癌，卵巢癌，皮肤恶性黑色素瘤，淋巴瘤。

进一步地，所述癌症为肺腺癌。

本发明进一步的提供了检测生物标志物LINC01977的引物或探针在制备用于肿瘤复发转移及预后评估的产品中的应用。需要说明的是，本发明的检测试剂并不局限于引物或探针，任何能够检测该生物标志物含量的试剂均属于本发明的保护范围。

进一步地，所述引物或探针用于检测生物标志物LINC01977的表达含量，探针包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针。

进一步地，所述产品包括试剂、试纸、试剂盒或基因芯片。

进一步地，前面所述的产品包括但不限于试剂、试纸、试剂盒、基因芯片或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断肺腺癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的RNA表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的RNA表达谱，容易分析出哪个RNA的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知非LINC01977的异常与肺腺癌相关也属于LINC01977的用途，同样在本发明的保护范围之内。

进一步地，所述试剂包括实时定量PCR检测试剂或原位杂交检测试剂。

本发明还提供了一种评估肺腺癌复发转移及预后评估的方法，所述方法包括如下步骤：

1)获取受试者的样品；

2)检测受试者样品中LINC01977的表达水平；

3)将测得的LINC01977的表达水平与受试者的肿瘤转移及预后评估关联起来。

4)与对照相比，LINC01977的表达水平升高被判断为预后不良。

进一步地，检测受试者样品中LINC01977的表达水平包括组织RNA的提取、cDNA的制备及lncRNA的扩增。

进一步地，所述的样品cDNA的制备、lncRNA的扩增的具体步骤包括：

1)样品cDNA的制备：采用HiScript Reverse Transcriptase试剂盒将提取得到的RNA的样品进行cDNA的制备；

2)lncRNA的扩增：采用TAKARA SYBR Premix Ex TaqTM II荧光定量试剂盒，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。

进一步地，本发明提供了用于肺腺癌复发转移及预后评估的引物，引物序列如SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

进一步地，本发明提供了用于肺腺癌复发转移及预后评估的产品，所述产品中含有根据相应DNA序列为SEQ ID NO.1的生物标志物LINC01977的，用于实时定量PCR的特异性引物，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。所述产品包括但不限于试剂盒、试纸、基因芯片。

进一步地，所述产品含有内参基因为β-actin，其上下游引物如SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示。由于β-actin在组织和细胞中的表达相对恒定，因此选取β-actin作为PCR体系内参基因。

进一步地，所述产品还含有组织lncRNA提取试剂、逆转录试剂及荧光定量PCR试剂。

进一步地，本发明提供了一种用于肺腺癌复发转移及预后评估的试剂盒，所述试剂盒含有根据相应DNA序列为SEQ ID NO.1的长链非编码RNA设计的原位杂交探针及原位杂交检测试剂。

进一步地，本发明提供了用于肺腺癌复发转移及预后评估的试剂盒，含有组织lncRNA提取试剂、逆转录试剂、荧光定量PCR试剂、LINC01977的上下游引物及内参基因的β-actin的上下游引物，所述LINC01977的上下游引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，所述β-actin的上下游引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

附图说明

图1是本发明实施例提供的Nanodrop仪检测所分离的组织RNA的浓度和纯度示意图；

图2是本发明实施例提供的实时荧光定量PCR检测LINC01977和β-actin的扩增曲线及熔解曲线图；

图3是本发明实施例提供的PCR产物实验琼脂糖凝胶电泳示意图；

图4是本发明实施例提供的LINC01977在肺腺癌组织中和癌周正常组织中的表达差异示意图；

图5是本发明实施例提供的LINC01977表达量高低对于肺腺癌患者生存分析示意图；

图6是本发明实施例提供的LINC01977在肺腺癌组织原位杂交图。

3.有益效果

本发明公开了长链非编码RNA LINC01977，并将LINC01977的相应基因作为生物标志物在易发生复发转移的肺腺癌中进行应用，该发明首次发现LINC01977在肺腺癌组织中表达上调，且上调的LINC01977基因和肺腺癌的复发转移及预后紧密相关。高表达LINC01977的肺腺癌患者总生存时间比低表达LINC01977的肺腺癌患者更短，即LINC01977的高表达与肺腺癌患者不良预后正相关，组织芯片原位杂交显示LINC01977在伴有淋巴结转移的肺腺癌组织显著高表达，提示可以将LINC01977用于开发用于复发转移和预后评估的肺腺癌诊断试剂产品，为精准医疗的推行提供了理论和实践基础。

具体实施方式

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

任何方法或过程权利要求中所述的任何步骤可以以任何顺序执行，并且不限于权利要求中提出的顺序。

本发明人经过广泛而深入的研究，首次获得了LINC01977，将其用于肺腺癌复发转移及预后评估时，特异性和灵敏度均非常高，并且在大样本中验证了该LINC01977与肺腺癌具有高度的相关性，诊断准确性高。因此通过检测LINC01977，监测其治疗效果或对该罹患疾病的患者进行预后性判断。

非编码RNA(Non-codingRNAs)如本文所用，术语“非编码RNA”是指不编码蛋白质的RNA。在人类基因组中，大部分为非编码RNA。人类基因组中仅有2％产生的转录本是可编码RNA，剩余98％均为非编码RNA，它们是不能翻译成蛋白质的功能性RNA分子。这些非编码RNA广泛参与人体生理、病理活动，与众多肿瘤密切相关。

在非编码RNA中，根据大小的不同，具有调控作用的分子主要分为两类：短链非编码RNA(包括siRNA、miRNA、piRNA)和长链非编码RNA(Longnon-codingRNA，LncRNA)。这些ncRNA广泛参与人体几乎所有的生理、病理活动，包括参与、调控或介导众多肿瘤的发生、发展过程。

长链非编码RNA(LncRNA)是一类转录本长度大于200个核苷酸且自身不能编码蛋白的RNA分子。LncRNA最初被认为是RNA聚合酶II转录的伴随产物，归于基因组转录过程中的“噪音”，本身不具备相应的生物学功能。

近年来的研究发现，长链非编码RNA可通过影响X染色体沉默、基因组表达和修饰、转录的激活或干扰、核内外运输等多种机制，在多个层面上影响着基因的表达水平，然而，截止目前，大部分LncRNA的作用仍不清楚。

而LncRNA在肿瘤形成的阶段可能充当以下几种角色。(1)信号分子，LncRNA能够识别转录因子在信号通路中的连接位点进而调控靶基因的表达；(2)诱饵分子，LncRNA能够诱导转录因子、蛋白质分子等相关大分子化合物与其结合，阻断这些分子对靶基因的作用，间接影响到目标基因的转录；如DNA损伤活化P21相关长链非编码RNA与核转录因子Y-α结合后，通过负向调控凋亡相关基因的表达实现了抑制细胞凋亡的能力。如LncRNAGAS5，即生长因子特异性转录本5，能与与糖皮质激素受体接合，进而抑制了糖皮质激素受体介导的相关基因的调控表达。(3)增强或激活子，LncRNA通过调节靶基因启动子的增强和激活进而影响到靶基因的过表达。(4)引导分子，招募遗传物质修饰相关酶，同时能指导该蛋白复合物顺式或反式定位到相关调控位点；LncRNAXIST(失活X染色质特异性转录本)能引导多梳抑制复合物(PRC)2原位定位于X染色体，从而导致了X染色体失活。(5)支架分子，作为中央平台招募多种蛋白质分子并能与之形成核糖核蛋白复合物，影响了组蛋白修饰，实现了在表观遗传方面对靶基因进行调控。如LncRNAANRIL能募集并结合到PRC2复合物(H3K27三甲基化的抑制物)，进而致使目的基因的沉默，在全程中仅起到了支架作用。值得一提的是，上述lncRNA的作用模式是存在内在联系的，并非孤立存在。

如本文所用，术语“LncRNA”、“长链非编码RNA”、“Longnon-codingRNA”含义相同，互换使用，都是指一种由RNA聚合酶II转录、不编码蛋白的、一般长度大于200bp的RNA片段。

如本文所用，术语“预后”是指根据已有诊断性证据支持的对疾病发展情况的预测。

如本文所用，术语“内参基因”是指内部参照基因的相对表达含量，内参基因在各组织和细胞中的表达相对恒定，在利用PCR检测基因表达水平变化时常以此作为参照物，可以校正上样量和上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

如本文所用，术语“总生存期曲线”是指以总生存期为指标绘制的生存曲线。其中，总生存期是指从随机化开始至因任何原因引起死亡的时间(失访患者为最后一次随访时间；研究结束时仍然存活患者，为随访结束日)。生存曲线是用来对各组患者的生存状况进行描述的统计曲线，可以显示每个随访时间点上患者的生存率。

如本文所用，术语“无核酸酶水”是指完全去除核酸酶，不会污染非特异性的核酸内切酶，核酸外切酶和核糖核酸酶活性的水，常用于溶解DNA/RNA以及配置包含核酸的反应体系。

本发明提供了一种从肺腺癌组织中检测lncRNA的方法以及采用该方法检测lncRNA在肺腺癌诊断中的应用。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种从组织中提取和检测lncRNA的方法以及采用该方法提取lncRNA在检测肺腺癌诊断及淋巴结转移情况中的应用。

为了解决现有的技术问题，本发明提供了一种从肺腺癌组织中提取和检测lncRNA的方法以及采用该方法提取lncRNA在检测肺腺癌转移和预后评估中的应用。

本发明实施例提供的肺腺癌组织标志物，一种用于检测肺腺癌诊断及淋巴结转移情况的肺腺癌组织标志物LINC01977，其相应的DNA序列如SEQ ID NO:1所示(表1)。

表1 LINC01977序列

本发明实施例提供的肺腺癌组织标志物LINC01977的提取方法及试剂，用于提取包括LINC01977在内的多种组织内lncRNA。

本发明实施例提供的肺腺癌组织标志物LINC01977的提取方法，利用肺腺癌组织lncRNA的提取试剂盒，用于提取包括LINC01977在内的多种肺腺癌组织lncRNA。

本发明实施例提供的肺腺癌组织lncRNA提取试剂盒包括：

本发明实施例提供的肺腺癌组织lncRNA的提取试剂盒，能提取肺腺癌组织中包括LINC01977在内的多种lncRNA。

提取肺腺癌组织lncRNA所需试剂：TRIzolTM Reagent，购自赛默飞世尔公司，货号15596018；氯仿、异丙醇、无水乙醇购自西格玛奥德里奇公司，货号分别为C2432，W292907，443611。

本发明实施例提供的肺腺癌组织标志物LINC01977的检测方法，利用肺腺癌诊断试剂盒，用于肺腺癌组织LINC01977的检测和鉴定的方法。

本发明实施例提供的肺腺癌诊断试剂盒包括：(1)逆转录所需试剂：HiScriptReverse Transcriptase，购自诺唯赞公司，货号R101-01；(2)荧光定量PCR所需试剂：ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix购自诺唯赞公司，货号Q711-02；

本发明实施例提供的肺腺癌诊断试剂盒，能测定肺腺癌组织LINC01977含量。

本发明实施例提供的肺腺癌诊断试剂盒，含有检测LINC01977含量的PCR引物。其中包括LINC01977上下游引物及内参基因β-actin的上下游引物。

LINC01977上下游引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示(表2)；由于β-actin在组织和细胞中的表达相对恒定，因此选取β-actin作为PCR体系内参基因，β-actin上下游引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示(表3)。

表2 LINC01977上下游引物序列

表3 β-actin上下游引物序列

本发明实施例提供的肺腺癌诊断试剂盒，还包括其他特异性lncRNA引物，也可检测其他lncRNA。

本发明实施例提供了检测lncRNA标志物在组织及肺腺癌组织中表达量的试剂在制备肺腺癌诊断制剂中的应用。

下面具体实施例对本发明的应用原理进行进一步说明；若非特别指明。实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实例中所用的技术。

实施例1

肺腺癌组织RNA的提取，具体步骤如下：

(1)肺腺癌组织匀浆制备：用移液器吸取1mL无菌生理盐水，冲洗肺腺癌组织表面残血，用眼科剪将其剪碎为5mm大小组织块，放入预填充1mL Trizol Reagent的组织匀浆管。将组织匀浆管放置到匀浆机槽位内，100rpm，30s，取出置于冰上降温，重复上述操作直至无肉眼可见组织块。取下组织匀浆管放于冰上备用。

(2)氯仿萃取：将匀浆管内液体转移至1.5mL离心管内，向其中加入500uL，4℃预冷的氯仿，上下颠倒均匀后，室温放置5min。4℃，12000rpm离心15min，小心吸取上层无色透明层并转移至新1.5mL离心管。

(3)异丙醇沉淀：向1,5mL离心管内加入500μL，4℃预冷的异丙醇，上下颠倒混匀后，室温静置10min以充分沉淀RNA，在4℃，12000rpm离心10min。

(4)乙醇清洗：小心吸弃上清液，保留试管底部沉淀，加入1mL，4℃预冷的75％乙醇溶液，上下颠倒均匀后室温放置5min。4℃，7500rpm离心10min。

(5)RNA溶解：小心吸弃上清液，保留试管底部沉淀，将离心管倒置于操作台10min，充分晾干，并加入30μL无核酸酶水充分溶解沉淀，放于-80℃深低温冰箱备用。

(6)RNA浓度测定：冰上融化RNA溶液后，使用Nano-drop仪器检测提取的RNA浓度，测定OD260和OD280值。正常的RNA浓度范围500-1500ng/μL，OD260/OD280比值均在1.8-2.1左右，如图1所示OD260/OD280为2.06。RNA的浓度如图1所示1232.9ng/μL。

实施例2

肺腺癌组织LINC01977的检测和鉴定及临床诊断价值

(1)cDNA的制备

表4 cDNA的制备的反应体系

注：在此体系中RNA模版量不应超过2.5μg，否则会影响反应的结果。

逆转录反应条件如下：37℃，15min；85℃，5sec；4℃。

(2)实时荧光定量qPCR

应用QuantStudio^TM6Flex系统针对步骤1制备的cDNA进行qRT-PCR实验。反应体系如下：

分别配置含有LINC01977和β-actin上下游引物的qRT-PCR反应体系如表5所示。

表5 qRT-PCR反应体系

qRT-PCR反应条件如表6所示。

表6 qRT-PCR反应条件

PCR结果分析：qPCR结果显示的扩增曲线和溶解曲线如图2所示。其中左图为扩增曲线：该图左侧为β-actin扩增曲线，右侧为LINC01977扩增曲线，两者的扩增曲线均为S型，可见明显的四个时期，每组复孔CT值之间的差异小于0.5个CT值，符合扩增曲线标准。

右图为溶解曲线：溶解曲线用以判断扩增产物是否单一，两者的溶解曲线均为单峰，表示扩增产物单一；Tm值表示引物本身的解链温度，标准值为80℃-90℃，左侧为β-actin引物溶解曲线Tm值86℃，右侧为LINC01977引物溶解曲线Tm值89℃，符合引物设计要求。

(3)PCR实验产物琼脂糖电泳实验

Tris-硼酸电泳缓冲液(TBE)的贮存浓度为5xTBE缓冲液，其工作浓度为0.5xTBE缓冲液。5xTBE缓冲液的配方为：将54g Tris，27.5g硼酸，20ml pH为0.8的EDTA加入1000ml的蒸馏水中，搅拌至澄清即可。将5xTBE缓冲液稀释10倍即得到0.5xTBE缓冲液，取50ml贮存液加入450ml蒸馏水后即得到500ml工作液。

1％琼脂糖凝胶：使用电子天平称取0.5g的琼脂糖置于烧杯中，加入50ml 0.5xTBE缓冲液中搅拌，并使用微波炉加热煮沸至琼脂糖充分溶解，在溶液冷却至55度后加入EB终结者，充分溶解后铺入胶板，冷却30min。

加样后在0.5xTBE缓冲液中电泳，条件为：110V，40min。

PCR实验产物琼脂糖电泳示意图如图3所示。其中，最左侧为电泳指示剂DL2000，条带所指示值为DNA片段的大小，1号泳道为空白组，表示本反应体系中无外源性DNA污染，实验结果可靠；2、3、4号泳道为LINC01977的PCR产物大小，约为100bp，符合引物设计及PCR实验标准；5、6、7号泳道为β-actin的PCR产物大小，约为120bp，符合引物设计及PCR实验标准。

图4是利用上述实时定量PCR检测得到LINC01977在肺腺癌组织中和癌周正常组织中的表达差异示意图对比；图4可见早期肺腺癌淋巴结转移患者的肺腺癌组织中显著高表达LINC01977，差异具有统计学意义，P值小于0.001。统计98例患者的基本病理资料、术后生存时间和复发情况等预后随访信息，选取LINC01977相对表达量中位数进行分组，其中高表达LINC01977患者57例，低表达LINC01977患者41例，绘制总生存期曲线(OS Probability)如图5所示。结果表明：高表达LINC01977的早期淋巴结转移肺腺癌患者术后总生存期较低表达LINC01977的患者相比显著缩短，差异具有统计学意义，P值为0.028(小于0.05)。提示肺腺癌组织中LINC01977高表达与早期肺腺癌并具有淋巴结转移患者的不良预后相关，进一步证明LINC01977可以作为肺腺癌早期淋巴结转移的组织及预后标志物，可用于复发转移及预后评估。

实施例3

针对LINC01977的原位杂交检测及病理切片分析

本发明利用已有淋巴结转移的早期肺腺癌组织芯片，其中肿瘤组织98例，配对癌旁正常组织(肿瘤周围的/旁边的正常组织)98例，利用lncRNA组织原位杂交检测其组织中LINC01977表达水平。

方法：针对LINC01977的特异性序列设计组织原位杂交探针，使用ACD公司的杂交试剂盒(货号：322350,323180)进行实验，步骤如下：

(1)切片预处理：

60℃融蜡30min；二甲苯浸泡两次，每次5min；无水乙醇浸泡两次，每次1min；过氧化氢溶液室温孵育10min；蒸馏水清洗两次，每次5min；

(2)抗原修复：

1×检测靶标稀释液100℃恒温，将切片放入维持100℃，15min；蒸馏水清洗五次，每次2min；

(3)蛋白酶消化：

湿盒底部铺垫用40℃蒸馏水浸湿的滤纸，并维持湿度和温度30min；切片表面滴加蛋白酶溶液后放入湿盒，40℃维持15min；蒸馏水清洗五次，每次2min

(4)原位杂交：

洗涤液40℃流动清洗切片三次，每次5min；吸干水分后滴加探针，40℃孵育2h

(5)洗涤显色：

洗涤液40℃流动清洗切片三次，每次5min；Amp1 40℃30min-洗2min×2遍；Amp240℃15min-洗2min×2遍；Amp3 40℃30min-洗2min×2遍；Amp4 40℃15min-洗2min×2遍；Amp5室温50min-洗2min×2遍；Amp6室温15mi-洗2min×2遍；切片表面滴加显色液室温孵育10min；蒸馏水清洗五次，每次2min，其中Amp仅代表标签编码。

(6)核复染和封片

核染色液(DAPI)滴加到切片表面，室温避光孵育10min；蒸馏水清洗三次，每次2min；切片中央滴加一滴抗荧光淬灭封片剂，盖玻片覆盖后避免气泡产生；封片剂封边。

数据分析：本实验数据采用单位面积组织病理计数评分的分析方法，与癌旁正常组织相比，LINC01977在肿瘤组织中的表达差异。收集淋巴结转移的早期肺腺癌组织芯片患者的基本病理信息及术后生存时间，复发情况等随访信息，利用Graphpad及SPSS 17.0软件进行生存分析。

结果：早期肺腺癌淋巴结转移患者的肿瘤组织中LINC01977的表达情况与癌周正常组织相比高表达，组织芯片原位杂交示意图如图6所示。其中，两例早期肺腺癌淋巴结转移患者的代表性组织原位杂交图片展示，LINC01977阳性区域以圆圈标记。图6结果展示，与配对的癌周正常组织相比，肺腺癌肿瘤组织中的LINC01977呈现显著高表达，提示LINC01977可作为早期淋巴结转移肺腺癌患者的组织标记物。

本发明提供的伴有早期淋巴结转移的肺腺癌组织LINC01977作为诊断及预后标志物及其应用。本发明提供了一种伴有早期淋巴结转移的肺腺癌诊断试剂盒，采用特异性lncRNA引物，可以用于检测LINC01977。本发明为肺腺癌的诊断及淋巴结转移情况提供了一种方便可行的检查方法，为临床分期和治疗方案的选择提供了帮助。

序列表

<110> 江苏省肿瘤医院

<120> 标志物LINC01977及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2791

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

aattttccac tgtctctcag tatccagcca tccagccatc tagcctccta actacttctc 60

tgtgctggtc cagcccagtg ctcagagtta ggatattttt atgaataaaa cagacctagc 120

ttctgccctc gtggagctta cagcgtgggg cgaaaggaga ctgatcaaaa tgccacacac 180

atgtaattta caaccttggg aagtgccaag aaggggaagt gttgggtgcc actgagaaca 240

ttcacagagg ttaacctggg actgaggtgg aggaaaggtc agatggaagc tgtctaacca 300

ccctgggctt ctggcttagg atgtgtaggg ctagcagctc agcccatgag gttgtgtctt 360

gaacttgggt attgatggaa tagctataga aacagaacaa ccatgaagtg aagatggtga 420

atgaagatcc tctcatcagc ttgcgattgc atgacagagg aggctgcaag gacactcagg 480

tgtgaagacg gggcatgcag aaggaagaga gccttccaga ggaaagtcgc cttgttcctt 540

gctttgtgac cctcatctct gcgaggtaga gaagaaaagg agggctcttc catcgggagc 600

ttccaaggtt ccgggtgaga gctagccagc tctgcatttg gagcagagag agacaggaat 660

ttgggacact aggtcacaag ttggtctctt cctttgtcag cagtccattc aacatggcaa 720

tgcccacacc cacctcacaa ggcatggatg acacaaagag atggcttgcc tgcaagagac 780

ccagctggtc tggagttgga ggcacacttc atttctctgc ccagctcggc aggcggctgg 840

agcaaaccag gagatcgcct caaatgtttt aaatgtcaat atggtccctt cttgctggct 900

tgccaagatt tgaccagcta aattggcctg tgtggtgtgt tccctgcagt gcacgtagag 960

acagggtttc atcgtgttag ccaggatggt ctcgatctcc tgacctcgtg atccgcccgc 1020

ctcagccttc cagagtgctg ggattacagg cttcagccac cgtgcccagc ctcacccaga 1080

tggagtttca atctgtcacc caggctagag cacagtggca caatcttggc tcactgcaac 1140

ctctgtctcc aggattcaga tgaaaaaccc aaggtccaga aaggggacgc aatggccata 1200

gcagcagcag agcagggact gaatcccaag gctgatgact ttgacttcgg tgctccagca 1260

ttcgtcttcc ctggatttct cagctcgcag gctcgataac tctcttctct ccccagactt 1320

gttggcaggc aagaggaata actcatgtga gtcaaaagca atttgcaaac ataaataatt 1380

ttcaatgcca ggagaggaga cggtgggaag atgcatggaa ggttgagagg aacacagcca 1440

gccccaagtc tccctcgccc tgctgggcac ttcctctttc cacctcggcg ctggtgggag 1500

agtcggagtg cgccataaac aaggcaggaa acggctatca tgatgctcac ttccgctctt 1560

cctagaaggg attctgctcg gcaatctctc cactccccac cccctgccat gcacaggatt 1620

ttgtactccc agctcctctg gaggctcaga ggaggagatg gtcctgctgc actggcccag 1680

ccttcctcta cctggcttgt ctttttcctt gtcctcaacc ccaaacagca agtatcctaa 1740

caaagaatgg atagtacact attatttttg tgacattcat ctcagtgtca tattccaaag 1800

gagcttgaca ttaattgtcc tgttcctaat ttggacactg gtttacgaaa gtgtggtgac 1860

cactggagac tgttctctga cagtgtaaca ggtattcgcc cctttcccca gggtactaag 1920

actcacgtgg ccctgacagc cagcacagtc tcttaggagg ttccggaggg tggcagtggg 1980

aatgagcgta gagccgtgtc atttcggagg gctgagtgca ttccacacat cttcccaaag 2040

cccaccccaa gaggctgtct aacgcagggg gaaacaatga gaaaccagat accatggaat 2100

tagcaaagaa tttctcagat gaaacaggaa agggaggaaa tccagagggg tttacattac 2160

acctggctca ggttgaaagg attcagggcc agttgttggc aatattaaac tccaggctgc 2220

gtttgaaagg gtccttcact cgggcagcca aagagaggcg ttcctgccag gataggttgc 2280

atcgctgcag atctccagcc ctacgtgcat acacacgtgc acacacacgt gtacacacac 2340

gtgcacacac atgtatgcac acacatgtat gcacacacat gcatgcacac acatgtatgc 2400

acacacatgc atgcacacac acgcacacac atgcacacat gcatgcatac atgcacacac 2460

gcgcgcacac gtgtgcacgc acatgcatgc acacagacac gcacacgcac acacatgcat 2520

gcacacacgc acacacatgc acacacacgc acacacgcat gcacacacac acatgcatgc 2580

acacacgtgc atcttggata tctcttgtta atgtcagccc tctgccccaa actagatttg 2640

aaaacttgta ggtaatcaag ttttctggtt aagagaaata atcccagcca acagttagta 2700

agctcttatg tgtcaggcct tatccaaaca gttcacacga agaccagatc caaaaataaa 2760

agtgtgcttt gtcctctaaa aaaaaaaaaa a 2791

<210> 2

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgacagtgta acaggtattc gcc 23

<210> 3

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggctctacgc tcattccca 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列

<400> 4

accttctaca atgagctgcg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列

<400> 5

cctggatagc aacgtacatg g 21

Claims (15)

1.一种生物标志物LINC01977，其特征在于，该生物标志物LINC01977为长链非编码RNA，其是由染色体基因转录产生，所述LINC01977相应的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。

2.检测权利要求1所述的生物标志物LINC01977的引物或探针在制备用于癌症复发转移及预后评估的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物或探针用于检测生物标志物LINC01977的表达含量。

4.一种检测生物标志物LINC01977的引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

5.一种用于肺腺癌复发转移及预后评估的产品，其特征在于，所述产品中含有根据相应DNA序列为SEQ ID NO.1的生物标志物LINC01977设计的，用于实时定量PCR的特异性引物，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，所述产品包括试剂、试纸、试剂盒或基因芯片。

6.根据权利要求5所述的用于肺癌复发转移及预后评估的产品，其特征在于，所述产品中含有内参基因为β-actin，其上下游引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

7.根据权利要求6所述的用于肺癌复发转移及预后评估的产品，其特征在于，还包括组织lncRNA提取试剂、逆转录试剂及荧光定量PCR试剂。

8.一种用于肺腺癌复发转移及预后评估的试剂盒，其特征在于，含有组织lncRNA提取试剂、逆转录试剂、荧光定量PCR试剂、LINC01977的上下游引物及内参基因的β-actin的上下游引物，所述LINC01977的上下游引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，所述β-actin的上下游引物如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

9.一种用于肺癌复发转移及预后评估的试剂盒，其特征在于，所述产品中含有根据核苷酸序列为SEQ ID NO.1的生物标志物LINC01977设计的原位杂交探针及原位杂交检测试剂。

10.生物标志物LINC01977在制备用于癌症复发转移及预后评估的产品中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述癌症是肺腺癌。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂、试纸、试剂盒或基因芯片。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述试剂包括实时定量PCR检测试剂或原位杂交检测试剂。

14.根据权利要求10-13任一所述的应用，其特征在于：所述标志物LINC01977的检测方法包括组织RNA的提取、cDNA的制备及lncRNA的扩增。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的样品cDNA的制备、lncRNA的扩增的具体步骤包括：

1)样品cDNA的制备：采用HiScript Reverse Transcriptase试剂盒将提取得到的RNA的样品进行cDNA的制备；

2)lncRNA的扩增：采用TAKARA SYBR Premix Ex TaqTMII荧光定量试剂盒，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。

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