CN108192974A

CN108192974A - 长链非编码rna linc00842作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用

Info

Publication number: CN108192974A
Application number: CN201810174120.1A
Authority: CN
Inventors: 陶永光; 毛超; 王敏; 刘双
Original assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2018-03-02
Filing date: 2018-03-02
Publication date: 2018-06-22
Anticipated expiration: 2038-03-02
Also published as: CN108192974B

Abstract

本发明公开了长链非编码RNA LINC00842作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用。可以检测长链非编码RNA LINC00842在肺腺癌患者中的表达水平，为肺腺癌患者预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

Description

长链非编码RNA LINC00842作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA LINC00842作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测试剂中的应用。

背景技术

近年来，肺癌的发病率越来越高，根据世界癌症研究基金会的统计，世界范围内每年新诊断出的肺癌病例占癌症总数的12.5％。全球因肺癌每年夺去100万人生命，在中国肺癌已经连续几年居各种癌症死亡率首位。肺癌根据组织学类型不同主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中肺腺癌是非小细胞肺癌中最常见的类型。尽管随着诊疗技术的进步，特别是靶向药物的应用，改善了肺腺癌的生存期，但其5年生存率仍然很低。肺腺癌多起源于小支气管，为周围型肺癌，故早期临床症状较轻，但肺腺癌细胞增殖转移能力强，部分早期即发生血行转移，故多数患者就诊时已处于中晚期，是造成其生存率低预后差的主要原因。因此，提高肺腺癌的诊断和预后判定是降低其死亡率的主要手段。目前，对肺腺癌患者的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对肺腺癌患者进行预后判定的需求。因此，对肺腺癌患者预后进行判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为胸外科领域亟待解决的重要课题。

长链非编码RNA是一类长度超过200个核苷酸残基，由RNA聚合酶Ⅱ转录，不能编码蛋白质的RNA分子。最初的研究认为它是转录组的"噪音"，但近十年来的生命科学研究发现，它们参与了多项生物调控过程。研究表明长链非编码RNA能够广泛地参与基因组调节，与包括肿瘤在内的许多疾病有密切联系。近年来，长链非编码RNA作为一类重要的调控分子及其在临床诊断、化疗敏感性和预后评价等方面的应用价值，已经逐渐得到研究者的重视。有研究表明HOTAIR在原发乳腺肿瘤和转移瘤中的表达都会增加，原发肿瘤中HOTAIR的表达水平可以用来有效预测癌转移和死亡。长链非编码RNA PCA3在前列腺癌中高度过表达，这种长链非编码RNA是在尿液中发现的，相当便于临床检测。长链非编码RNA LALR1通过激活Wnt/β-catenin信号，加速了细胞周期进程，促进了肝细胞增殖。采用药物靶干预长链非编码RNA LALR1诱导肝脏再生，有可能有益于肝衰竭和肝移植治疗。由此可见，长链非编码RNA作为诊断、预后和治疗的分子标志物具有巨大潜力。

目前，对肺腺癌患者的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对肺腺癌患者进行预后判定的需求。因此，对肺腺癌患者预后进行判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为胸外科领域亟待解决的重要课题。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供长链非编码RNA LINC00842作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用。

长链非编码RNA LINC00842定位于染色体10q11.22，GeneBank登录号：NR-033957.2(长链非编码RNA LINC00842序列见SEQ NO:1)。在前期研究工作中，发明人在肺腺癌组织中提取RNA，逆转录后进行实时荧光定量PCR分析长链非编码RNA LINC00842的表达，发现：长链非编码RNA LINC00842在肺腺癌组织中表达下调，与正常人肺组织中的表达差异显著(P<0.0001)(图1)。且长链非编码RNA LINC00842表达水平不同的肺腺癌患者中预后存在明显差异，经Kaplan-Meier生存分析发现长链非编码RNA LINC00842低表达的肺腺癌患者生存率明显低于高表达的患者(P＝0.0467)(图2)，比率风险模型预后分析发现长链非编码RNA LINC00842的风险率>1(HR＝2.7160)，表明长链非编码RNA LINC00842低表达的患者预后较高表达的患者预后差，长链非编码RNA LINC00842的低表达是肺腺癌患者预后风险预测的独立危险因素。因此，长链非编码RNA LINC00842能作为肺腺癌预后的判断标准，作为生物标志物用于制备肺腺癌患者的预后制剂，更进一步能够提供一种性价比高，易于推广应用的肺腺癌预后预测试剂盒。

所述肺腺癌预后检测试剂盒中包括长链非编码RNA LINC00842实时荧光定量PCR特异性引物：正向引物：5′-CTGCCCAGTTAAGGCACAACTCTC-3′(SEQ ID NO.2)；反向引物：5′-AGCGCTGCGGAGAGGCAGTCT-3′(SEQ ID NO.3)。

优选地，所述试剂盒中还包括GAPDH内参实时荧光定量PCR特异性引物：正向引物：5′-GTGGATATTGTTGCCATCAATGAC-3′(SEQ ID NO.4)；反向引物：5′-GACGGTGCCATGGAATTTGCCATG-3′(SEQ ID NO.5)。

将长链非编码RNA LINC00842用于肺腺癌患者预后的检测方法如下：(1)收集待测个体术后切除的肺腺癌组织，抽提总RNA ；(2)以总RNA为模板将长链非编码RNA LINC00842逆转录为cDNA；(3)用长链非编码RNA LINC00842特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，获得相对表达量2^ΔΔCT，当2^ΔΔCT<0.10时提示长链非编码RNA LINC00842为低表达。

综上，利用本发明的检测制剂可以检测长链非编码RNA LINC00842在肺腺癌患者中的表达水平，为肺腺癌患者预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR分析长链非编码RNA LINC00842在肺腺癌组织与正常肺组织中的表达差异；

图2为长链非编码RNA LINC00842与35例肺腺癌患者预后的关系。

具体实施方式

实施例1制备长链非编码RNA LINC00842用于肺腺癌预后检测试剂盒(50次反应)

1.RNA稳定溶液50ml

2.异丙醇100ml

3.三氯甲烷100ml

4.Trizol 50ml

5.无酶水10ml

6.1μM随机逆转录引物50ul

7. 5×逆转录缓冲液200ml

8. 10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸100ul

9. 40U/μl RNA酶抑制剂500ul

10. 200U/μl MMLV逆转录酶50ul

11. Premix Ex Taq 50ul

12. 10μM长链非编码RNA LINC00842实时荧光定量PCR特异性引物：

正向引物5′-CTGCCCAGTTAAGGCACAACTCTC-3′(SEQ ID NO.2)，

反向引物5′-AGCGCTGCGGAGAGGCAGTCT-3′(SEQ ID NO.3)，

13. 10μM内参GAPDH实时荧光定量PCR特异性引物：

正向引物为5′-GTGGATATTGTTGCCATCAATGAC-3′(SEQ ID NO.4)，

反向引物为5′-GACGGTGCCATGGAATTTGCCATG-3′(SEQ ID NO.5)。

实施例2肺腺癌组织中长链非编码RNA LINC00842检测

1、肺腺癌组织的保存：收集待测肺腺癌组织存放于盛有RNA稳定溶液的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。

2、组织中RNA的抽提：取适量标本于经180℃烘烤6-8h后的研钵中加入液氮研磨标本，研磨至粉末状后于研钵中加入1ml Trizol研钵标本，研磨成液体状后用移至离心管管，加氯仿200μl/ml于离心管中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃12000g离心15min；小心取上层水相入新离心管中，加入预冷的异丙醇0.5ml混匀，-20℃冰箱静置20min，4℃12000g离心10min；弃上清，加入75％无核酶水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入无核酶水10-20μl溶解RNA。分光光度计测RNA的浓度及质量，OD260/280比值在1.8-2.0之间，-80℃保存。

3、长链非编码RNA LINC00842转录：使用Thermo公司的逆转录试剂盒。20μL逆转录反应的体系如表1：

表1

成分	剂量/管
		随机逆转录引物(1uM)	1ul
RNA样本	2ug
		无核酶水	To 12ul

逆转录第一步条件：65℃5分钟，如表2：

表2

成分	剂量/管
		5×逆转录缓冲	4μl
三磷酸碱基脱氧核苷酸(10mM)	2μl
		RNA酶抑制剂(40U/μl)	1μl
MMLV逆转录酶(200U/μl)	1μl
		第一步PCR的产物	12μg

逆转录第二步程序：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。

4、长链非编码RNA LINC00842特异性引物进行实时定量PCR：长链非编码RNALINC00842特异性引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

转录产物稀释5倍，混匀。20μL反应体系如表3：

表3

实时荧光定量PCR反应程序：95℃3分钟，40个循环，95℃10秒，60℃30秒。

长链非编码RNA LINC00842特异性引物序列为：

正向引物5′-CTGCCCAGTTAAGGCACAACTCTC-3′(SEQ ID NO.2)，

反向引物5′-AGCGCTGCGGAGAGGCAGTCT-3′(SEQ ID NO.3)，

5、-2^ΔΔCT指标的测定：本实验数据采用相对定量的分析方法，GAPDH作为内参基因，数据利用软件GraphPad Prism进行分析。分析发现，与长链非编码RNA LINC00842正常肺组织中的表达相比，35例肺腺癌患者中长链非编码RNA LINC00842表达明显下调，且有显著性差异(P<0.0001)。

6、预后判断

通过对实验所采用的35例肺腺癌患者或家属随访，我们详细询问了这些患者首次发病的时间，治疗情况，复发状况及死亡时间等，随访时间为1-60个月。在所选取的肺腺癌患者中，选取荧光定量PCR分析的表达值为参考标准，所得结果降序排列后高于中位数的为长链非编码RNA LINC00842高表达，共18例，其他为长链非编码RNA LINC00842低表达，共17例。经Kaplan-Meier生存分析，长链非编码RNA LINC00842低表达患者的生存期较长链非编码RNA LINC00842高表达的患者短，预后差。差异有统计学意义(P＝0.0467)。比率风险模型预后分析发现长链非编码RNA LINC00842的风险率>1(HR＝2.7160)，表明长链非编码RNALINC00842低表达的患者预后较高表达的患者预后差，长链非编码RNA LINC00842的低表达是肺腺癌患者预后风险预测的独立危险因素。

以上研究还表明，长链非编码RNA LINC00842可作为肺腺癌患者预后的特异性分子标志物。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学湘雅医院毛超

<120> 长链非编码RNA

LINC00842作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2877

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gcgggggcgg gcgcgcgggg ccttgccgga gaacctgact ctccgcagca gcagtggaag 60

ccggagtgac gcgttgtgtt gaacaccagt tttctggagc gctgtgtgtt cttaacagct 120

gagcagtctg tttctccaat caggtttcaa agccacttca actgcactgg cccctgtggg 180

tcactgctgc accgccctga cccatgtggg tccctgagga gcgacctgcc ggggccacct 240

ggctggatga aaaagacaca ccttggactt aagccgtgag aaaaaaaaaa cttcatcagt 300

aagaagaatg aataaacaga ctaggttgaa tccatacaat ggaatgttag cagacaataa 360

aaagaaaatg aactactgat gccccctact gcacagcaga agctctgaat cgtgttcctg 420

aatgaaagaa gtcagagatg aaaagatggg ccaggagtcc agtttctgga aggccaagaa 480

tcgaagtagt aagctgcagc cgttttccag acaagcagga tgtggggatg cagaagaatt 540

caggactgga ggggcaaact ccgatgtgac tgaggcccca ctgccaaata gcagcatgct 600

cagatagcac ccaggaattt ggggaaaaaa actggtgctc acagctgccc agttaaggca 660

caactctccc gcctgctgca gggcttgtga ggtgtatcag aaccttgaag agatactctg 720

ggaagaaagg ccttcccaga ctgcctctcc gcagcgctgt aagaatcaga tttcttctat 780

gggggacttc caggtctctt cagcattttc tcagtcatca ctgtatccct gccactcagt 840

gaaccacagc aacaactccc agcttccagc cgagaagctt gaccctgaag ctggcctcga 900

ttctctacag aagtgaggcc acagagcaca ggtgaagggc cacttacctg gtatcatctc 960

tggtctcagc tctggagaac tagctcctct gccactgcca catcctgtcc accaagacct 1020

ccttgctgaa ccccaccccc acccggtgcc tcaggaccct aacttgtttg ctgacctcca 1080

tgtcctctca ccagatccag ccctggggag ctgaacttcc tctggcccac tgccagctct 1140

ggatcagtcc acaccccagc cagccacagc ccagccctgc ctctctctgt ctctctctca 1200

tggctgggtt ggccttggcc aatgctctct ctagagatca agacacaggc acctctcttg 1260

gtctgttctg gctgctgtga caaaatgcct taagctgggt ggcttataaa ccacagaaat 1320

ttatttctca ctgttctgga ggctgggaag tcctacagac tggggtactg gcctgcttgt 1380

ttcctcgtga gggctctctt cctgggttgc agatggacat ctccctgatg tatcttcaca 1440

tggcagagag agagagagag agagagacag aaagacagag aaagagagag agagagagag 1500

agagcatgct ctttggtctc ttctggtaag ggcctaatcc cgtcatgaag aatccccata 1560

acttcaacta aatctaatca cttctcaaag gctccatctc cacataccat cccattgtgg 1620

gttagggttt caacatagga attctggagg cacacaaacg tgcagttcaa aacatgtgga 1680

gacaaggggg caaggactag agagccctac catcctcgtt caaacccttg aatcaagcct 1740

gaagtcaaag aacttccttt ggagagcccc attccatgag ccgataattt ccccattttg 1800

ccatcaccca cttgagtttg ggattttccc ccagttactg agtgcctgac tgacatgatg 1860

ccccccacag atgggcctcc ctgcccccaa tctcacctcc tctgttagtt tcctggggtt 1920

gccacaacaa agcgttacag gcagagcggc taaaacgaca gaaacttatg gtctcacagt 1980

tctggaggct gcaagttcaa ggtcaaggtg tcagcagggt tggttccttc ggaaggctgt 2040

gcaggagcct gttgggtgcc tgtccctcag cttctagtgg attacttcca tcttcagcat 2100

gccttggctt gtagaaggac taccctgaac tctgccttca tggtcacaac acatcctccc 2160

tgtgtgtgtt tctgtgtcca aatttcccct tcttataagg acaccagtct tatacggaca 2220

atgctcaatg tatgaacctt tgccaaggga ttggattagg gacccactat attccagtat 2280

gacctcatct taactaatta tacctgcaat gacactgctt ccaaagaagg ccacatgatg 2340

aggtaccgtt ggttaggaat tcaatatatg agtttggggg gacacagttc agcccacacc 2400

acctcctctg accctgaatt ggatgctgtt tctgctctgc ttatgatcct cttgtcctca 2460

ctggcctctt ggtccagcac ccactgaggc accagctctg agagagctca ctggcttcac 2520

acaggtgcga cctgatggcg cctcacctca caccccaaac atccttctca tctctgcagg 2580

acctgctctg tttatgtcca ggtatgttca gtgttcctgt gtgtccccag agtgtgggga 2640

ggtaatgctc catgtacgaa cctttgccaa gggaatatgg aaaccgatgg atgagttctt 2700

acctcttttt tcgtccagac aaactgtcct aagatggttt taagagatac cgagtaatca 2760

gctgccagct cagtagcgca tcttcagatt gactctccct ccttccctgt ctccttcccc 2820

atattcttca tcttgttccc tgggatcttt ctccctaata aaggaaaagc tcataga 2877

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ctgcccagtt aaggcacaac tctc 24

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

agcgctgcgg agaggcagtc t 21

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gtggatattg ttgccatcaa tgac 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gacggtgcca tggaatttgc catg 24

Claims

1.长链非编码RNA LINC00842作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用。

2.长链非编码RNA LINC00842作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测试剂盒中的应用。

3.一种肺腺癌预后检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括长链非编码RNALINC00842实时荧光定量PCR特异性引物：

正向引物：5′-CTGCCCAGTTAAGGCACAACTCTC-3′；

反向引物：5′-AGCGCTGCGGAGAGGCAGTCT-3′。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括GAPDH内参实时荧光定量PCR特异性引物：

正向引物：5′-GTGGATATTGTTGCCATCAATGAC-3′；

反向引物：5′-GACGGTGCCATGGAATTTGCCATG-3′。