CN103966338A - 长链非编码rna rmst的应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA(long no-coding RNA，LncRNA)RMST的应用方法，即用于制备胶质瘤患者的预后制剂，特别是制备出实时荧光定量分析法预测胶质瘤患者预后的试剂盒。通过研究证实LncRNA RMST在胶质瘤组织中表达上调，高表达LncRNA RMST的胶质瘤患者比低表达LncRNA RMST的胶质瘤患者预后差，因此，将Lnc RNA RMST的表达用于胶质瘤患者的预后预测，可以为胶质瘤患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和推广性。

Description

长链非编码RNA RMST的应用方法

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及LncRNA RMST在制备胶质瘤患者预后试剂中的应用方法。

背景技术

胶质瘤起源于外胚层，约占神经系统肿瘤的40.49％，是最常见的肿瘤之一，可以在任何年龄的人群中发病，具有很强的增殖能力和血管生成能力，很容易在颅内发生侵袭和转移。虽然其发病率仅占成人肿瘤的2％，但病死率却占所有肿瘤相关死亡的10％。尽管一些治疗方法包括手术治疗、放疗及化疗有很大进展,但是胶质瘤患者特别是恶性胶质瘤的预后仍然很差。目前，对胶质瘤的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对人胶质瘤进行预后判定的需求。因此，对人胶质瘤进行预后判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为神经外科领域亟待解决的重要课题。

lncRNA是一类转录本长度大于200bp的非编码RNA，具有相对较长的核苷酸链，其分子内部具有特定的二级空间结构，能提供与蛋白质结合的多个位点，或与DNA、RNA之间通过碱基互补配对原则发生特异性、动态性相互作用。研究表明，lncRNA可作为人类基因组中一类非常重要的表观遗传调控因子，通过表观遗传、转录调控以及转录后调控等多种机制调控DNA甲基化、组蛋白修饰或染色质重构使基因沉默或激活。近年来，lncRNA作为一类重要的调控分子及其在临床诊断、化疗敏感性和预后评价等方面的应用价值，已经逐渐得到研究者的重视。有研究表明HOTAIR在原发乳腺肿瘤和转移瘤中的表达都会增加，原发肿瘤中HOTAIR的表达水平可以用来有效预测癌转移和死亡。lncRNA PCA3在前列腺癌中高度过表达，这种lncRNA是在尿液中发现的，相当便于临床检测。lncRNA-LALR1通过激活Wnt/β-catenin信号，加速了细胞周期进程，促进了肝细胞增殖。采用药物靶干预lncRNA-LALR1诱导肝脏再生，有可能有益于肝衰竭和肝移植治疗。由此可见，lncRNA作为诊断、预后和治疗的分子标志物具有巨大潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种LncRNA RMST的应用方法，即LncRNA RMST (rhabdomyosarcoma2associated transcript)定位于染色体12q23.1，GeneBank登录号：NR-024037能作为胶质瘤预后的判断标准，用于制备胶质瘤患者的预后制剂，更进一步能够提供一种性价比高，易于推广应用的胶质瘤预后预测试剂盒。

长链非编码RNA RMST的应用方法，所述的长链非编码RNA RMST用于制备胶质瘤患者的预后制剂，该长链非编码RNA RMST的序列见SEQ NO:1。用于制备胶质瘤患者的预后制剂具体包括实时荧光定量PCR检测试剂。

所述的实时荧光定量PCR检测试剂包括进行实时荧光定量PCR的特异性引物：

LncRNA RMST正向引物：5′-AACTCCGTGTCCCTTGTG-3′，

LncRNA RMST反向引物：5′-GGCAGTGGGTGACTGATC-3′。

所述的实时荧光定量PCR检测试剂为试剂盒，

该试剂盒包括：(1)从胶质瘤组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将LncRNA RMST逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及LncRNA RMST所用随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括LncRNA RMST实时荧光定量PCR特异性引物、U6snRNA内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水；

LncRNA RMST实时荧光定量PCR特异性引物：

正向引物5′-AACTCCGTGTCCCTTGTG-3′，

反向引物5′-GGCAGTGGGTGACTGATC-3′，

U6snRNA内参特异性PCR引物：

正向引物为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，

反向引物为5′-GGAACGCTTCACGAATT TG-3′。

在前期研究工作中，申请人通过DIANA-LncBase软件分析与miR-101竞争性结合MRE序列的LncRNA时，发现了LncRNA RMST。申请人在胶质瘤组织中提取RNA,逆转录后进行实时荧光定量PCR分析LncRNA RMST的表达，发现：LncRNA RMST在胶质瘤中表达上调，与正常人脑组织中的表达差异显著。且LncRNA RMST表达水平不同的胶质瘤患者中预后存在明显差异，经Kaplan-Meier生存分析发现LncRNA RMST高表达的胶质瘤患者生存率明显低于低表达的患者；多因素Cox比例风险模型的预后分析发现LncRNA RMST的相对危险度>1，表明LncRNA RMST高表达的患者预后较低表达的患者预后差，所以LncRNA RMST的高表达是胶质瘤患者预后风险预测的独立危险因素。据此，申请人提出利用LncRNA RMST制备用于胶质瘤患者预后的制剂。

将LncRNA RMST用于胶质瘤患者预后的检测方法：(1)收集待测个体术后切除的胶质瘤组织，抽提总RNA；(2)以总RNA为模板将RMST逆转录为cDNA；(3)用RMST特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，获得相对表达量2^ΔΔCT，当2^ΔΔCT>1.87时提示RMST为高表达。

利用本发明的检测制剂可以检测LncRNA RMST在胶质瘤患者中的表达水平，为胶质瘤患者预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR分析LncRNA RMST在胶质瘤组织与正常脑组织中的表达差异；

图2为LncRNA RMST与37例胶质瘤患者预后的关系。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

在前期研究工作中，申请人通过DIANA-LncBase软件分析与miR-101竞争性结合MRE序列的LncRNA时，发现了LncRNA RMST。申请人在胶质瘤组织中提取RNA,逆转录后进行实时荧光定量PCR分析LncRNA RMST的表达，发现：LncRNA RMST在胶质瘤组织中表达上调，与正常人脑组织中的表达差异显著(P＝0.0282)(图1)。且LncRNA RMST表达水平不同的胶质瘤患者中预后存在明显差异，经Kaplan-Meier生存分析发现LncRNA RMST高表达的胶质瘤患者生存率明显低于低表达的患者(P＝0.0035)(图2)，多因素Cox比例风险模型的预后分析发现LncRNA RMST的相对危险度>1(RR＝1.177)，表明LncRNA RMST高表达的患者预后较低表达的患者预后差，LncRNA RMST的高表达是胶质瘤患者预后风险预测的独立危险因素。

实施例1制备LncRNA RMST用于胶质瘤患者预后的试剂盒(50次反应)

1.RNA稳定溶液 50ml

2.异丙醇 100ml

3.三氯甲烷 100ml

4.Trizol 50ml

5.无酶水 10ml

6.1μM随机逆转录引物 50ul

7.5×逆转录缓冲液 200ml

8.10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸 100ul

9.40U/μl RNA酶抑制剂 500ul

10.200U/μl MMLV逆转录酶 50ul

11.Premix Ex Taq 50ul

12.10μM Lnc RNA RMST特异性引物 30ul

正向引物5′-AACTCCGTGTCCCTTGTG-3′

反向引物5′-GGCAGTGGGTGACTGATC-3′

13.10μM U6snRNA特异性引物30ul

正向引物为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′

反向引物为5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

实施例2胶质瘤组织中Lnc RNA RMST的检测

1、胶质瘤组织的保存：收集待测胶质瘤组织存放于盛有RNA稳定溶液的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。

2、组织中RNA的抽提：取适量标本于经180℃烘烤6-8h后的研钵中加入液氮研磨标本，研磨至粉末状后于研钵中加入1ml Trizol研钵标本，研磨成液体状后用移至tube管，加氯仿200μl/mlTrizol于Tube中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃12000g离心15min；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml/mlTrizol混匀，-20℃冰箱静置20min，4℃12000g离心10min；弃上清，加入75％DEPC水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入DEPC水10-20μl溶解RNA。分光光度计测RNA的浓度及质量，OD260/280比值在1.8-2.0之间，-80℃保存。

3、LncRNA RMST逆转录：使用Thermo公司的逆转录试剂盒。20μL逆转录反应的体系如下：

逆转录第一步条件：65℃5分钟

逆转录第二步程序：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。

4、RMST特异性引物进行实时定量PCR：RMST特异性引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

先将逆转录产物稀释5倍，混匀。20μL反应体系如下：

实时荧光定量PCR反应程序：95℃3分钟,40个循环，95℃10秒，60℃30秒。

LncRNA RMST特异性引物序列为：

F：5'AACTCCGTGTCCCTTGTG3'

R：5'GGCAGTGGGTGACTGATC3'

5、-2^ΔΔCT指标的测定：本实验数据采用相对定量的分析方法，U6作为内参基因，数据利用软件GraphPad Prism进行分析。分析发现，与LncRNA RMST在正常脑组织中的表达相比，52例脑胶质瘤患者中LncRNA RMST的表达明显上调，差异有显著性(P＝0.0282)。

6、预后判断

通过对实验所采用的52例胶质瘤患者随访统计资料发现，15例患者在随访时由于手机停机或者换号或者其他原因联系不上，最后能联系上的胶质瘤患者或家属为37例，这37例患者或家属接受后续的随访分析。我们详细询问了这些患者或家属首次发病的时间，治疗情况，复发状况及死亡时间等，随访时间为1-46个月。在所选取的胶质瘤患者中，选取荧光定量PCR分析的表达值为参考标准，所得结果降序排列后高于中位数的为LncRNA RMST高表达，共20例，其他为LncRNA RMST低表达，共17例。经Kaplan-Meier生存分析，LncRNA RMST高表达患者的生存期较LncRNA RMST低表达的患者短，预后差。差异有统计学意义(P＝0.0035)。多因素Cox比例风险模型的预后分析发现LncRNA RMST的相对危险度>1(RR＝1.177)，表明LncRNA RMST高表达的患者预后较低表达的患者预后差，LncRNA RMST的高表达是胶质瘤患者预后风险预测的独立危险因素。

以上研究表明，LncRNA RMST可作为胶质瘤患者预后的特异性分子标志物。

Claims (4)

1.长链非编码RNA RMST的应用方法，其特征在于，所述的长链非编码RNA RMST用于制备胶质瘤患者的预后制剂，该长链非编码RNA RMST的序列见SEQ NO:1。

2.根据权利要求1所述的长链非编码RNA RMST的应用方法，其特征在于，所述的用于制备胶质瘤患者的预后制剂包括实时荧光定量PCR检测试剂。

3.根据权利要求2所述的长链非编码RNA RMST的应用方法，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测试剂包括进行实时荧光定量PCR的特异性引物：

LncRNA RMST正向引物：5′-AACTCCGTGTCCCTTGTG-3′，

LncRNA RMST反向引物：5′-GGCAGTGGGTGACTGATC-3′。

4.根据权利要求3所述的长链非编码RNA RMST的应用方法，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测试剂为试剂盒，

该试剂盒包括：(1)从胶质瘤组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将LncRNA RMST逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及LncRNA RMST所用随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括LncRNA RMST实时荧光定量PCR特异性引物、U6snRNA内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水；

LncRNA RMST实时荧光定量PCR特异性引物：

正向引物5′-AACTCCGTGTCCCTTGTG-3′，

反向引物5′-GGCAGTGGGTGACTGATC-3′，

U6snRNA内参特异性PCR引物：

正向引物为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，

反向引物为5′-GGAACGCTTCACGAATT TG-3′。