CN108192976A - 长链非编码rna linc00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测制剂中的应用 - Google Patents

长链非编码rna linc00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了长链非编码RNA LINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测制剂中的应用。可以检测长链非编码RNA LINC00336在肺鳞癌患者中的表达水平，为肺鳞癌患者预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

Description

长链非编码RNA LINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预 后检测制剂中的应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及长链非编码RNA LINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测试剂中的应用。
背景技术
肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，肺鳞癌即鳞状细胞癌，是一种最常见的肺癌类型，是来源于支气管上皮的一种恶性上皮性肿瘤，占原发性肺癌的40％～51％，经手术、放化疗等综合治疗后，其5年生存率仍低于15％。目前，对肺鳞癌患者的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对肺鳞癌患者进行预后判定的需求。因此，对肺鳞癌患者预后进行判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为胸外科领域亟待解决的重要课题。
长链非编码RNA(long noncoding RNA)是长度大于200nt的非编码RNA的统称。最初的研究认为它是转录组的"噪音"，但近十年来的生命科学研究发现，它们参与了多项生物调控过程。有研究表明，长链非编码RNA可作为人类基因组中一类非常重要的表观遗传调控因子，通过表观遗传、转录调控以及转录后调控等多种机制调控DNA甲基化、组蛋白修饰或染色质重构使基因沉默或激活。近年来，长链非编码RNA作为一类重要的调控分子及其在临床诊断、化疗敏感性和预后评价等方面的应用价值，已经逐渐得到研究者的重视。有研究表明HOTAIR在原发乳腺肿瘤和转移瘤中的表达都会增加，原发肿瘤中HOTAIR的表达水平可以用来有效预测癌转移和死亡。长链非编码RNA PCA3在前列腺癌中高度过表达，这种长链非编码RNA是在尿液中发现的，相当便于临床检测。长链非编码RNA LALR1通过激活Wnt/β-catenin信号，加速了细胞周期进程，促进了肝细胞增殖。采用药物靶干预长链非编码RNALALR1诱导肝脏再生，有可能有益于肝衰竭和肝移植治疗。由此可见，长链非编码RNA作为诊断、预后和治疗的分子标志物具有巨大潜力。
目前，对肺鳞癌患者的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对肺鳞癌患者进行预后判定的需求。因此，对肺鳞癌患者预后进行判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为胸外科领域亟待解决的重要课题。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供长链非编码RNALINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测制剂中的应用。
长链非编码RNA LINC00336定位于染色体6p21.31，GeneBank登录号：NR-027908.1(长链非编码RNA LINC00336序列见SEQ NO:1)。在前期研究工作中，发明人在肺鳞癌组织中提取RNA，逆转录后进行实时荧光定量PCR分析长链非编码RNALINC00336的表达，发现：长链非编码RNA LINC00336在肺鳞癌组织中表达上调，与正常人肺组织中的表达差异显著(P<0.0001)(图1)。且长链非编码RNA LINC00336表达水平不同的肺鳞癌患者预后存在明显差异，经Kaplan-Meier生存分析发现长链非编码RNALINC00336高表达的肺鳞癌患者生存率明显低于低表达的患者(P＝0.0290)(图2)，比率风险模型预后分析发现长链非编码RNALINC00336的风险率<1(HR＝0.3615)，表明长链非编码RNA LINC00336高表达的患者预后较低表达的患者预后差，长链非编码RNALINC00336的高表达是肺鳞癌患者预后风险预测的独立危险因素。因此，长链非编码RNALINC00336能作为肺鳞癌预后的判断标准，作为生物标志物用于制备肺鳞癌患者的预后制剂，更进一步能够提供一种性价比高，易于推广应用的肺鳞癌预后预测试剂盒。
所述肺鳞癌预后检测试剂盒中包括长链非编码RNA LINC00336实时荧光定量PCR特异性引物：正向引物：5′-CCACTGAGCAGAGGTGCTGGC-3′(SEQ ID NO.2)；反向引物：5′-GTGCAGTGGCTCACGCCTATAA-3′(SEQ ID NO.3)。
优选地，所述试剂盒中还包括ACTB内参实时荧光定量PCR特异性引物：正向引物：5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′(SEQ ID NO.4)；反向引物：5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′(SEQ ID NO.5)。
将长链非编码RNA LINC00336用于肺鳞癌患者预后的检测方法如下：(1)收集待测个体术后切除的肺鳞癌组织，抽提总RNA；(2)以总RNA为模板将长链非编码RNALINC00336逆转录为cDNA；(3)用长链非编码RNA LINC00336特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，获得相对表达量2ΔΔCT，当2ΔΔCT>5.23时提示长链非编码RNALINC00336为高表达。
综上，利用本发明的检测制剂可以检测长链非编码RNA LINC00336在肺鳞癌患者中的表达水平，为肺鳞癌患者预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR分析长链非编码RNA LINC00336在肺鳞癌组织与正常肺组织中的表达差异；
图2为长链非编码RNA LINC00336与35例肺鳞癌患者预后的关系。
具体实施方式
实施例1制备长链非编码RNA LINC00336用于肺鳞癌预后检测试剂盒(50次反应)
1.RNA稳定溶液50ml
2.异丙醇100ml
3.三氯甲烷100ml
4.Trizol 50ml
5.无酶水10ml
6.1μM随机逆转录引物50ul
7.5×逆转录缓冲液200ml
8.10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸100ul
9.40U/μl RNA酶抑制剂500ul
10.200U/μl MMLV逆转录酶50ul
11.Premix Ex Taq 50ul
12.10μM长链非编码RNA LINC00336实时荧光定量PCR特异性引物：
正向引物5′-CCACTGAGCAGAGGTGCTGGC-3′(SEQ ID NO.2)，
反向引物5′-GTGCAGTGGCTCACGCCTATAA-3′(SEQ ID NO.3)，
13.10μM内参ACTB实时荧光定量PCR特异性引物：
正向引物为5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′(SEQ ID NO.4)，
反向引物为5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′(SEQ ID NO.5)。
实施例2肺鳞癌组织中长链非编码RNALINC00336检测
1、肺鳞癌组织的保存：收集待测肺鳞癌组织存放于盛有RNA稳定溶液的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。
2、组织中RNA的抽提：取适量标本于经180℃烘烤6-8h后的研钵中加入液氮研磨标本，研磨至粉末状后于研钵中加入1ml Trizol研钵标本，研磨成液体状后用移至离心管管，加氯仿200μl/ml于离心管中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃12000g离心15min；小心取上层水相入新离心管中，加入预冷的异丙醇0.5ml混匀，-20℃冰箱静置20min，4℃12000g离心10min；弃上清，加入75％无核酶水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入无核酶水10-20μl溶解RNA。分光光度计测RNA的浓度及质量，OD260/280比值在1.8-2.0之间，-80℃保存。
3、长链非编码RNALINC00336转录：使用Thermo公司的逆转录试剂盒。20μL逆转录反应的体系如表1：
表1
成分 剂量/管
随机逆转录引物(1uM) 1ul
RNA样本 2ug
无核酶水 To 12ul
逆转录第一步条件：65℃5分钟，如表2：
表2
成分 剂量/管
5×逆转录缓冲 4μl
三磷酸碱基脱氧核苷酸(10mM) 2μl
RNA酶抑制剂(40U/μl) 1μl
MMLV逆转录酶(200U/μl) 1μl
第一步PCR的产物 12μg
逆转录第二步程序：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。
4、长链非编码RNA LINC00336特异性引物进行实时定量PCR：长链非编码RNALINC00336特异性引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。
转录产物稀释5倍，混匀。20μL反应体系如表3：
表3
成分 剂量/管
SYBR Premix Ex Taq 10μl
LINC00336特异性引物(10μM) 0.5μl
cDNA产物 1μl
无酶水 To 20μl
实时荧光定量PCR反应程序：95℃3分钟，40个循环，95℃10秒，60℃30秒。
长链非编码RNA LINC00336特异性引物序列为：
正向引物5′-CCACTGAGCAGAGGTGCTGGC-3′(SEQ ID NO.2)，
反向引物5′-GTGCAGTGGCTCACGCCTATAA-3′(SEQ ID NO.3)，
5、-2ΔΔCT指标的测定：本实验数据采用相对定量的分析方法，ACTB作为内参基因，数据利用软件GraphPad Prism进行分析。分析发现，与长链非编码RNALINC00336正常肺组织中的表达相比，35例肺鳞癌患者中长链非编码RNA LINC00336表达明显上调，且有显著性差异(P<0.0001)。
6、预后判断
通过对实验所采用的35例肺鳞癌患者或家属随访，我们详细询问了这些患者首次发病的时间，治疗情况，复发状况及死亡时间等，随访时间为1-60个月。在所选取的肺鳞癌患者中，选取荧光定量PCR分析的表达值为参考标准，所得结果降序排列后高于中位数的为长链非编码RNA LINC00336高表达，共18例，其他为长链非编码RNALINC00336低表达，共17例。经Kaplan-Meier生存分析，长链非编码RNA LINC00336高表达患者的生存期较长链非编码RNA LINC00336低表达的患者短，预后差。差异有统计学意义(P＝0.0290)。比率风险模型预后分析发现长链非编码RNA LINC00336的风险率<1(HR＝0.3615)，表明长链非编码RNALINC00336高表达的患者预后较低表达的患者预后差，长链非编码RNA LINC00336的高表达是肺鳞癌患者预后风险预测的独立危险因素。
以上研究还表明，长链非编码RNA LINC00336可作为肺鳞癌患者预后的特异性分子标志物。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南大学湘雅医院王敏
<120> 长链非编码RNA LINC00336
作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测制剂中的应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2107
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
agatgcgagc gcctgcgcag gtacgcacgc tccgctggag cctggggtgg cctggcagtc 60
gtggccgaga cgtgtttgct gcacttcggt gcgcacaggc actgcggtgc caacctcttg 120
gttccgccct ccccccgcag gcgcccacgc gtgacctcgg ccgcccacag gccttcgact 180
cttcccggac tccaggtccc aggccgcccc gctccaccct gcggatgatg gagacaaagt 240
cccccacaag cccctcatat ggggcaaggg ggaaggtacc acctggggcg gggcctggct 300
ccccactgag cagaggtgct ggccaaggcg ctccccttag tgagacaagg tttcaccatg 360
ttgcccaggc ttttctcaaa ctcctgagct caagcaatcc gcccacctca gcctccgaaa 420
gtgctaggat tataggcgtg agccactgca cccagcccca ggtggcaagt ctttctgata 480
ggcactgctc caaagtgaat cacactgtgc taagcccccg caagggagtg cctttgcagc 540
ttacagctgc acactcgtca tctcaggagg tccttgcaac agtccccttt cacgggtaaa 600
gaaactgagg cctctactca acctcacaga gcaagctaat gccagactaa aacctctggc 660
ctccaaaccc catgcccttt ctttttgtaa gctacacaga ctgtcagggc aaatgtccac 720
tggataaaag catgagatga tgaatggacg gaaattaacc aaaaaggtca tcaacacatt 780
ttcaacagat ccatcaatgt gcactcaaag aagctgagac aggcctaacc tttaaaggct 840
gatgtcaagg aaggggagca gcaggatggt actcggtctg acccagcggg gtcgctcccc 900
tgagcctatg tgtgtttgga gtggacgaga atgggagaga gattagaaaa acagcagcat 960
catgtgaatt acagatgcac aggaaagctt acagcctgtc tagacaaatt cacttatgtt 1020
acagatgagg aaactgaggc tcagaaagag gaagggactt gcccaaggcc acatagcaaa 1080
ggaatagcaa agttgagaca aaaataatgg acattgtgac tctgagtcaa gtgagaaaca 1140
gagagactga tggagaagtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgttta tgtgcatgca 1200
gtgtgcactc actcaggggg ccagggtcct gaatttagaa acactaccac caagaaggca 1260
ttatgcctac cctacccagg cagtgggggc tggagccagg gcctgggggc tggaaccagg 1320
gcccagggcc tggaggggat ggtaagcctc cagccccacc ttctccagga aggggttggt 1380
ggtctggcac gggccaagcg tacctggcca tccacaatgc tcacctccac cacggtgatc 1440
tctggccggg taagcagctc tcggccctct tggctgccta gcttccagag gcgggactct 1500
tgctgcattc ccagaagctt cttcaactcc gactccagga aacctgagag ccagagagat 1560
ggcaagggac agggagatgg cagggaacag gcaggagtag gatggagcag cccactggga 1620
acccaaggac ccggaggtgc aaccgctccc tgagcctcat cccagctctg tgtggttcct 1680
gctcaccctc agccacagcc ctctcttctt ccaggacgta gagccagcca ggtaccaccc 1740
ctccttcgcc ctgccttccc caggaagctc actctttgag ggccttctct ggcagcggca 1800
gcatgagagc ctgcgtcttc acccactggg gacagcatgc aaagggcagg tatttgcccc 1860
caccaccaac caactcaaga gcctggatct ggaacccaaa ctgcctgcac tcaagtccca 1920
gctctgccca tcactagctg tgtgacatcg ggcaagttct cactgtgaac tggagatggc 1980
aataggacct acctcagagt cgtaaaatgc aggattttat gaaaagtgct taaagagggt 2040
ctgccccatt aatggctatg taaatgtgaa ccacgatttt catcatatta tgtatgctat 2100
caccact 2107
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ccactgagca gaggtgctgg c 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
gtgcagtggc tcacgcctat aa 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
caccattggc aatgagcggt tc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
aggtctttgc ggatgtccac gt 22

Claims (4)

1.长链非编码RNA LINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测制剂中的应用。
2.长链非编码RNA LINC00336作为生物标志物在制备肺鳞癌预后检测试剂盒中的应用。
3.一种肺鳞癌预后检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括长链非编码RNALINC00336实时荧光定量PCR特异性引物：
正向引物：5′-CCACTGAGCAGAGGTGCTGGC-3′；
反向引物：5′-GTGCAGTGGCTCACGCCTATAA-3′。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括ACTB内参实时荧光定量PCR特异性引物：
正向引物：5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3′；
反向引物：5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′。
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