CN103966339B - 长链非编码rna crnde的应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA(long？no-coding？RNA,LncRNA)CRNDE的应用方法，即用于制备胶质瘤患者的预后制剂，特别是制备出实时荧光定量分析法预测胶质瘤患者预后的试剂盒。通过研究证实LncRNA？CRNDE在胶质瘤组织中表达上调，高表达LncRNA？CRNDE的胶质瘤患者比低表达LncRNA？CRNDE的胶质瘤患者预后差，因此，将Lnc？RNA？CRNDE的表达用于胶质瘤患者的预后预测，可以为预测胶质瘤患者的预后提供强有力的分子生物学依据，具有深远的临床意义和推广性。

Description

长链非编码RNA CRNDE的应用方法
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及LncRNACRNDE在制备胶质瘤患者预后试剂中的应用方法。
背景技术
胶质瘤约占神经系统肿瘤的40.49％，是最常见的肿瘤之一，目前采用的治疗手段包括手术治疗联合化疗和放疗，尤为手术切出效果明显。但是胶质瘤病人的生存期仍无明显延长。据相关报道，胶质瘤病人的5年生存率低于25％。目前，对胶质瘤的预后判定没有金标准，也没有特异性指标，远远不能适应对胶质瘤进行预后判定的需求。因此，对人胶质瘤进行预后判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为神经外科领域亟待解决的重要课题。
lncRNA是一类转录本长度大于200bp的非编码RNA，具有相对较长的核苷酸链，其分子内部具有特定的二级空间结构，能提供与蛋白质结合的多个位点，或与DNA、RNA之间通过碱基互补配对原则发生特异性、动态性相互作用。近年来，lncRNA作为一类重要的调控分子及其在临床诊断、化疗敏感性和预后评价等方面的应用价值，已经逐渐得到研究者的重视。有研究表明HOTAIR在原发乳腺肿瘤和转移瘤中的表达都会增加，原发肿瘤中HOTAIR的表达水平可以用来有效预测癌转移和死亡。lncRNAPCA3在前列腺癌中高度过表达，这种lncRNA是在尿液中发现的，相当便于临床检测。由此可见，lncRNA作为诊断、预后和治疗的分子标志物具有巨大潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种LncRNACRNDE的应用方法，即LncRNACRNDE(colorectalneoplasiadifferentiallyexpressed)定位于染色体16q12.2，GeneBank登录号：NR_110452能作为胶质瘤预后的判断标准，用于制备胶质瘤患者的预后制剂，更进一步能够提供一种性价比高，易于推广应用的胶质瘤预后预测试剂盒。
长链非编码RNACRNDE的应用方法，所述的长链非编码RNACRNDE用于制备胶质瘤患者的预后制剂，该长链非编码RNACRNDE的序列见SEQNO:1。
所述的用于制备胶质瘤患者的预后制剂包括实时荧光定量PCR检测试剂。
所述的实时荧光定量PCR检测试剂包括进行实时荧光定量PCR的特异性引物：
LncRNACRNDE正向引物：5'-CTGCGTGACAACTGAGGA-3'，
LncRNACRNDE反向引物5'-GTAGGATGCCACTGGAAAT-3。
所述的实时荧光定量PCR检测试剂为试剂盒，
该试剂盒包括：(1)从胶质瘤组织中抽提总RNA所用试剂，包括RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；(2)以总RNA为模板将LncRNACRNDE逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及LncRNACRNDE所用随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括LncRNACRNDE实时荧光定量PCR特异性引物、U6snRNA内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水；
LncRNACRNDE实时荧光定量PCR特异性引物
LncRNACRNDE正向引物5'-CTGCGTGACAACTGAGGA-3'，
LncRNACRNDE反向引物5'-GTAGGATGCCACTGGAAAT-3。
U6snRNA内参特异性PCR引物：
正向引物为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，
反向引物为5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。
在前期研究工作中，申请人通过DIANA-LncBase软件分析与miR-101竞争性结合MRE序列的LncRNA时，发现了LncRNACRNDE。申请人在胶质瘤组织中提取RNA,逆转录后进行实时荧光定量PCR分析LncRNACRNDE的表达，发现：LncRNACRNDE在胶质瘤中表达上调，与正常人脑组织中的表达差异显著。且LncRNACRNDE表达水平不同的胶质瘤患者中预后存在明显差异，经Kaplan-Meier生存分析发现LncRNACRNDE高表达的胶质瘤患者生存率明显低于低表达的患者；多因素Cox比例风险模型的预后分析发现LncRNACRNDE的相对危险度>1，表明LncRNACRNDE高表达的患者预后较低表达的患者预后差，所以LncRNACRNDE的高表达是胶质瘤患者预后风险预测的独立危险因素。据此，申请人提出利用LncRNACRNDE制备用于胶质瘤患者预后的制剂。。
将LncRNACRNDE用于胶质瘤患者预后的检测方法：(1)收集待测个体术后切除的胶质瘤组织，抽提总RNA；(2)以总RNA为模板将CRNDE逆转录为cDNA；(3)用CRNDE特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，获得相对表达量2ΔΔCT，当2ΔΔCT>0.61342时提示CRNDE为高表达。
利用本发明的检测制剂可以检测LncRNACRNDE在胶质瘤患者中的表达水平，为胶质瘤患者预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR分析LncRNACRNDE在胶质瘤组织与正常脑组织中的表达
差异；
图2为LncRNACRNDE与37例胶质瘤患者预后的关系。
具体实施方式
在前期研究工作中，申请人通过DIANA-LncBase软件分析与miR-101竞争性结合MRE序列的LncRNA时，发现了LncRNACRNDE。申请人在胶质瘤组织中提取RNA,逆转录后进行实时荧光定量PCR分析LncRNACRNDE的表达，发现：LncRNACRNDE在胶质瘤组织中表达上调，与正常人脑组织中的表达差异显著(P＝0.017)(图1)。且LncRNACRNDE表达水平不同的胶质瘤患者中预后存在明显差异，经Kaplan-Meier生存分析发现LncRNACRNDE高表达的胶质瘤患者生存率明显低于低表达的患者(P＝0.014)(图2)，多因素Cox比例风险模型的预后分析发现LncRNACRNDE的相对危险度>1(RR＝1.245)，表明LncRNACRNDE高表达的患者预后较低表达的患者预后差，LncRNACRNDE的高表达是胶质瘤患者预后风险预测的独立危险因素。
实施例1制备LncRNACRNDE用于胶质瘤患者预后的试剂盒(50次反应)
1.RNA稳定溶液50ml
2.异丙醇100ml
3.三氯甲烷100ml
4.Trizol50ml
5.无酶水10ml
6.1μM随机逆转录引物50ul
7.5×逆转录缓冲液200ml
8.10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸100ul
9.40U/μlRNA酶抑制剂500ul
10.200U/μlMMLV逆转录酶50ul
11.PremixExTaq50ul
12.10μMLncRNACRNDE特异性引物30ul
正向引物5'-CTGCGTGACAACTGAGGA-3'
反向引物5'-GTAGGATGCCACTGGAAAT-3'
13.10μMU6snRNA特异性引物30ul
正向引物为5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'
反向引物为5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
实施例2胶质瘤组织中LncRNACRNDE的检测
1、胶质瘤组织的保存：收集待测胶质瘤组织存放于盛有RNA稳定溶液的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。
2、组织中RNA的抽提：取适量标本于经180℃烘烤6-8h后的研钵中加入液氮研磨标本，研磨至粉末状后于研钵中加入1mlTrizol研钵标本，研磨成液体状后用移至tube管，加氯仿200μl/mlTrizol于Tube中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃12000g离心15min；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml/mlTrizol混匀，-20℃冰箱静置20min，4℃12000g离心10min；弃上清，加入75％DEPC水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入DEPC水10-20μl溶解RNA。分光光度计测RNA的浓度及质量，OD260/280比值在1.8-2.0之间，-80℃保存。
3、LncRNACRNDE逆转录：使用Thermo公司的逆转录试剂盒。20μL逆转录反应的体系如下：
成分 剂量/管
随机逆转录引物(1μM) 1μl
RNA样本 2ug
无酶水 To12μl
逆转录第一步条件：65℃5分钟
成分 剂量/管
5×逆转录缓冲液 4μl
三磷酸碱基脱氧核苷酸(10mM) 2μl3 -->
RNA酶抑制剂(40U/μl) 1μl
MMLV逆转录酶(200U/μl) 1μl
第一步PCR的产物 12μg
20μl
逆转录第二步程序：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。
4、CRNDE特异性引物进行实时定量PCR：CRNDE特异性引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。
先将逆转录产物稀释5倍，混匀。20μL反应体系如下：
成分 剂量/管
SYBR Premix Ex Taq 10μl
CRNDE特异性引物(10μM) 0.5μl
cDNA产物 1μl
无酶水 To20μl
实时荧光定量PCR反应程序：95℃3分钟,40个循环，95℃10秒，60℃30秒。
LncRNACRNDE特异性引物序列为：
正向引物5'-CTGCGTGACAACTGAGGA-3'，
反向引物5'-GTAGGATGCCACTGGAAAT-3。
5、-2ΔΔCT指标的测定：本实验数据采用相对定量的分析方法，U6作为内参基因，数据利用软件GraphPadPrism进行分析。分析发现，与LncRNACRNDE在正常脑组织中的表达相比，52例脑胶质瘤患者中LncRNACRNDE的表达明显上调，差异具有显著性(P＝0.017)。
6、预后判断
通过对实验所采用的52例胶质瘤患者随访统计资料发现，15例患者在随访时由于手机停机或者换号或者其他原因联系不上，最后能联系上的胶质瘤患者或家属为37例，这37例患者或家属接受后续的随访分析。我们详细询问了这些患者或家属首次发病的时间，治疗情况，复发状况及死亡时间等，随访时间为1-46个月。在所选取的胶质瘤患者中，选取荧光定量PCR分析的表达值为参考标准，所得结果降序排列后高于中位数的为LncRNACRNDE高表达，共19例，其他为LncRNACRNDE低表达，共18例。经Kaplan-Meier生存分析，LncRNACRNDE高表达患者的生存期较LncRNACRNDE低表达的患者短，愈后差。差异有统计学意义(P＝0.014)。多因素Cox比例风险模型的预后分析发现LncRNACRNDE的相对危险度>1(RR＝1.245)，表明LncRNACRNDE高表达的患者预后较低表达的患者预后差，LncRNACRNDE的高表达是胶质瘤患者预后风险预测的独立危险因素。
以上研究表明，LncRNACRNDE可作为胶质瘤患者预后的特异性分子标志物。

Claims (1)

1.一种用于胶质瘤患者的预后的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，
该试剂盒包括：(1)从胶质瘤组织中抽提总RNA所用试剂：RNA稳定溶液、Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇以及无酶水；(2)以总RNA为模板将LncRNACRNDE逆转录为cDNA所用试剂：逆转录缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、MMLV逆转录酶以及LncRNACRNDE所用随机引物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂：LncRNACRNDE实时荧光定量PCR特异性引物、U6snRNA内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料以及无酶水；
LncRNACRNDE实时荧光定量PCR特异性引物：
LncRNACRNDE正向引物5'-CTGCGTGACAACTGAGGA-3'，
LncRNACRNDE反向引物5'-GTAGGATGCCACTGGAAAT-3；
U6snRNA内参特异性PCR引物：
正向引物为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，
反向引物为5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。
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