CN101613748A - 一种检测胰腺癌血清标志物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学分子生物学技术领域，是一种检测胰腺癌血清标志物的方法。胰腺癌恶性程度高，早期诊断困难，缺乏确实有效的方法，预后极差。手术切除是唯一可以延长生存期的治疗手段。不幸的是，绝大多数胰腺癌患者诊断时已属晚期(TNM分期III、IV期)，失去了手术机会。本发明目的是提供一种检测胰腺癌血清标志物的方法，并将该方法用于胰腺癌的早期诊断和开腹手术指征的临床判断中。本发明经研究发现血清中miR－196a的表达水平与胰腺癌的术后生存期密切相关，之后发现miR－196a的相对表达丰度可以很好的将可切除胰腺癌(TNM分期I、II期)及进展期胰腺癌(TNM分期III、IV期)很好地鉴别开来，因此利用本发明的方法可以定量检测胰腺癌血清标志物microRNA－196a，而且检测方便、敏感性好、准确率高。

Description

一种检测胰腺癌血清标志物的方法

技术领域

本发明涉及医学分子生物学技术领域，是一种检测胰腺癌血清标志物的方法，该胰腺癌血清标志物具体为microRNA-196a。

背景技术

microRNA最早发现于1993年，是一种小的、非编码蛋白质的单链RNA，由18～25个核苷酸组成。microRNA通过与mRNA3’非翻译区(3’UTR)结合，使得靶mRNA降解或抑制其翻译，实现其生物学功能。经过20多年艰苦卓绝的努力，科学家对microRNA研究取得了突破性进展，发现其在动物、植物和病毒中普遍存在，且在许多生命活动中起着非常重要的作用。根据最新的microRNA数据库统计(miRBase Registry 13.0)，人体已经发现了706种microRNA。microRNA具有高度的保守性、时序性和组织特异性。

近来研究表明，某些microRNA在细胞的分化发育中起着重要的作用，提示其与肿瘤的发生密切相关。通过特定的分子生物学技术(包括：Northern印记杂交、实时定量PCR，上调或下调特定microRNA的表达等)，人们发现microRNA表达量的变化与很多肿瘤密切相关，如：肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、白血病等。功能学研究显示：microRNA可能与癌基因或抑癌基因起着同样的作用。超过50％的microRNA基因位于肿瘤相关的基因组区域或者不稳定区域，这种现象提示，microRNA在部分肿瘤的发生过程中起着重要的作用。

尽管科学家们对于血液中DNA的研究已经有很长的历史，但对血液中RNA的研究仍处在初始阶段。由于循环血中RNA酶含量丰富，因此在其中检测到的RNA片段常被当做大片段RNA的降解片段。进来，多篇相关文献验证了循环血中miRNA的稳定存在，并探讨了循环血中microRNA对于疾病诊断及预后研究的巨大意义。(Chen X，Ba Y，Ma L，Cai X，et al.Cell Res.2008Oct；18(10)：997-1006.Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2008Jul29；105(30)：10513-8.Gilad S，Meiri E，Yogev Y，et al.PLoS ONE.2008Sep5；3(9)：e3148.)

microRNA-196a(miRNA-196a)是一种进化上非常保守的microRNA(LaDeana W.Hillier，Webb Miller，Ewan Birney，et al.Nature.2004Dec9；432(7018)：695-716.)，在很多物种中广泛的存在(人类、小鼠、大鼠、蟾蜍、斑马鱼等)。有研究表明，miR-196a在细胞的分化发育中起着重要的作用，(QiuR，Liu Y，Wu JY，et al.Brain Res Bull.2009Apr 6；79(1)：26-31.Mansfield JH，HarfeBD，Nissen R，et al.Nat Genet.2004Oct；36(10)：1079-83.)已有研究证实：microRNA196a表达异常与许多肿瘤的发生发展密切相关，例如：miR-196a可以抑制ANXA1(一种肿瘤抑制蛋白，可以诱导凋亡，抑制细胞的增殖和迁移)的表达，从而促进食道癌，乳腺癌等的发生。(Luthra R，Singh RR，Luthra MG，et al.Oncogene.2008Nov 6；27(52)：6667-78.)SNP研究也表明：hsa-mir-196a与非小细胞肺癌的生存期密切相关。(Tian T，Shu Y，Chen J，et al.Cancer Epidemiol BiomarkersPrev.2009Apr；18(4)：1183-7.Hu Z，Chen J，Tian T，et al.J Clin Invest.2008Jul；118(7)：2600-8.)2008年，Charles等首先在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的血清中检测到microRNA-196a(miR-196a)，并证实其在DLBCL中的表达水平显著高于正常人，且与患者无复发生存期的长短密切相关。

胰腺癌恶性程度高，早期诊断困难，缺乏确实有效的方法，预后极差。手术切除是唯一可以延长生存期的治疗手段。不幸的是，绝大多数胰腺癌患者诊断时已属晚期(TNM分期III、IV期)，失去了手术机会。如果能寻找到胰腺癌特异的血清标志物，对胰腺癌的早期诊断和治疗方案的确定将具有极大的临床应用价值。

发明内容

本发明目的是提供一种检测胰腺癌血清标志物的方法。

本发明人在长期研究中，首先发现血清中miR-196a的表达水平与胰腺癌的术后生存期密切相关，之后发现miR-196a的相对表达丰度可以很好的将可切除胰腺癌(TNM分期I、II期)及进展期胰腺癌(TNM分期III、IV期)很好地鉴别开来，从而为胰腺癌的早期诊断和开腹手术指征的判断提供了新的标志物。

本发明的具体研究如下：

一、取适当数量的手术切除胰腺癌(病理证实为胰腺导管腺癌)病例，制作microRNA-196a表达量的标准图谱：

1)制备总RNA：

取外科手术证实胰腺导管腺癌患者的血液样本若干例，将各血液样本进行室温下静置，离心，取血清，在加入去酶剂后，将人工合成的microRNA(Cel-miR-39)分别加入各血清中作为标化物，使用美国Molecular ResearchCenter公司的TRI REAGENT BD(cat.no.TB 126)试剂常规抽提总RNA，用去酶水将其配成40ul的溶液，-80℃冰箱保存。

2)对各血清样本中microRNA-196a的表达丰度进行测定：

使用Applied Biosystems公司的microRNA检测试剂盒(TaqMan MicroRNAAssay)，以及荧光实时定量PCR技术，测得所得胰腺癌血清样本中microRNA-196a的表达丰度(Ct值)，用Ct196a表示。并用同样的方法测得加入的标化物Cel-miR-39的Ct值Ct39。

3)制作胰腺导管腺癌患者血清中MicroRNA-196a表达量的标准图谱：

使用(60-Ct196a)作为血清样本中microRNA-196a的初步表达度量，并使用各样本中测得的Ct39对其(60-Ct196a)进行标化，得到各样本的相对表达丰度(60-Ct)。

二、对各血清样本microRNA-196a的相对表达丰度进行研究，探讨其与胰腺导管腺癌TNM分期间的关系

对所有的入组胰腺导管腺癌患者进行随访，记录术后存活时间及生存情况。根据所得(60-Ct)选定适当的界值，将所有胰腺癌病例分为高表达microRNA-196a组和低表达microRNA-196a组，使用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank统计学方法验证血清中microRNA-196a含量对胰腺导管腺癌患者预后的影响。

根据美国癌症联合会第六版TNM分级系统(Katz MH，Hwang R，Fleming JB，Evans DB.CA Cancer J Clin.2008Mar-Apr；58(2)：111-25.)，对所得胰腺导管腺癌病例进行临床分期，制作可切除胰腺癌患者及进展期胰腺癌患者血清中microRNA-196a的表达图谱，并使用适当的统计学方法对两组间表达量的差别进行比较，验证其在判断胰腺导管腺癌手术适应证方面的价值，并确定适当的诊断界值。该诊断界值为17.80(60-Ct)，其鉴别进展期胰腺癌的敏感性为100％，特异性为73.9％。

三、早期检测和判断胰腺导管腺癌手术适应证的方法：

按以上方法检测未知血浆标本中的microRNA-196a表达丰度值(60-Ct)，对照上述胰腺导管腺癌可切除组和进展期组microRNA-196a表达量的标准图谱，如果落入可切除组(TNM分期I、II期)血清microRNA-196a的表达丰度范围内，则将其归为可切除组，否则归为不可切除组。

本发明提供一种检测胰腺癌血清标志物的方法，该胰腺癌血清标志物是microRNA-196a，该方法包括以下步骤：

A)待检血液样本，离心，取血清；

B)在经去酶剂处理的血清中加入Cel-miR-39作为标化物，抽提总RNA；

C)用Taqman microRNA反转录试剂盒对抽提的RNA进行反转录反应；

D)测定血清中microRNA-196a的标准化相对表达丰度(60-Ct)：

用荧光实时定量PCR(RT-PCR)技术，测得所得血清中microRNA-196a的表达丰度(Ct值)，用Ct196a表示；并用同样的方法测得加入的标化物Cel-miR-39的Ct值，用Ct39表示；计算各血清样本中microRNA-196a的初步定量值(60-Ct196a)，然后比较得出各样本中最小的Ct39值(Ct39_min)，计算出血清中microRNA-196a的标准化相对表达丰度(60-Ct)，(60-Ct)＝(60-Ct196a)-(Ct39-Ct39_min)。

本发明的检测方法不仅可以定量检测出胰腺癌的特异性血清标志物——microRNA-196a，而且具有检测方便、敏感性好、准确率高等特点，对胰腺癌的早期诊断和确定治疗方案中将具有极大的临床应用价值。

附图说明

图1为胰腺癌可切除组与进展组血清中microRNA-196a表达丰度的比较(箱图)

图2为阴性对照组(6种胰腺癌相关性microRNA)在胰腺癌可切除组与进展组表达丰度的比较(散点图)

图3为胰腺癌患者术后Kaplan-Meier生存曲线

图4为根据散点图及ROC曲线确定microRNA-196a作为剖腹手术适应证判断的表达丰度界值判定(A为散点图，B为ROC曲线图)

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1：

1.血清采集：

取长海医院外科手术证实胰腺导管腺癌患者的血液样本31份，将各全血样本进行室温下静置(30分钟至2小时)，4℃下1200×g离心20分钟，每份样本取上层血清500ul，转移至1.5ml离心管中，-80℃冰箱内保存。

2.血清中RNA抽提：

每份血清样本取50μl，加入750μl TRI REAGENT BD(Molecular ResearchCenter公司)和20μl 5N醋酸，混匀后加入5μl浓度为50pmol/L的Cel-miR-39(人工合成的microRNA，由Qiagen公司提供，以去除人为操作造成的检测差异)，震荡混匀，室温下静置5分钟，加入200μl氯仿，震荡混匀，室温下静置5分钟，4℃，12000×g离心15min，提取上清液，加入4μl DNA mate(TAKARA公司)，后加入与上清液等体积的异丙醇混匀，-20℃静置30min，4℃，12000×g离心15min，去上清，向沉淀中加入1ml75％乙醇清洗沉淀，4℃，7500×g离心洗涤沉淀5min。去上清，将沉淀室温晾干后加入40μl去酶水充分溶解，测定所得RNA的浓度。

3.RT-PCR反应：

使用Applied Biosystems公司的Taqman microRNA反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录反应。15μl反应体系中包含2μl所提取RNA的溶液，0.15μl的dNTPs(100mM)，1μl的反转录酶(50U/μl)，0.19μl的RNase抑制剂，1.5μl10×RT buffer，7.16μl去酶水，3μl stem-loop 5×RT primer(cel-miR-39，4373455；has-miR-196a，4373090；has-miR-155，4395459；has-miR-196a，4373104；has-miR-181a，4373117；has-miR-181b，4373116；has-miR-2196a，4373077；has-miR-222，4395387；has-miR-16，43731196a；Applied Biosystems)。使用Applied Biosystems公司9700热循环仪进行16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟的反转录。

对反转录产物进行1∶5稀释后，取5μl作为实时定量PCR的模板，使用Applied Biosystems公司的TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒进行实时定量PCR鉴定。PCR反应在Applied Biosystems 7900HT序列检测系统中进行。PCR反应体系为20μl，包含5μl稀释后的RT产物，10ul 2×TaqMan

UniversalPCR Master Mix，1.00ul TaqMan

MicroRNA Assays 20×TaqMan

Assay，4μl去酶水。将所有的反应体系首先进行95℃10分钟的预热，然后进行每循环95℃15秒，60℃1分钟，共60循环的PCR反应。所有的反应重复三次，使用7500软件系统(版本2.0.1.Applied Biosystems)进行分析，每次取固定的阈值，测定各样本中microRNA对应的Ct值，三次测定中的最小值作为该样本最终的Ct值。

4.实时定量PCR数据的标准化处理：

用上述方法先检测各例样本的MicroRNA-196a的Ct值(Ct196a)及标化物Cel-miR-39的Ct值(Ct39)，计算各血清样本中microRNA-196a的初步定量值(60-Ct196a)，然后比较得出各样本中最小的Ct39值(Ct39_min)，即可计算出所有样本中microRNA-196a的标准化相对定量值(60-Ct)。注：(60-Ct)＝(60-Ct196a)-(Ct39-Ct39_min)

5、胰腺导管腺癌患者血清中microRNA-196a含量在判断剖腹手术适应证中的应用价值验证及诊断界值的确定：

5.1通过RT-PCR及数据分析对所有胰腺导管腺癌血清样本中microRNA-196a进行相对定量测定。

为更好地说明问题，另取6个胰腺癌组织中高表达的microRNA(miR-21、155、181a、181b、221、222)作为阴性对照，测定所有microRNA的标准化相对定量值(60-Ct)，详见表1。

根据美国癌症联合会第六版TNM分级系统对胰腺癌患者进行临床分期(具体数值及临床数据见表2)，结合分期情况，将所有胰腺导管腺癌患者分为两组——可切除组(TNM分期I、II期)及进展期组(TNM分期III、IV期)，然后进行两组间所有7种microRNA的含量比较。microRNA-196a结果如图1，阴性对照结果如图2。结果表明：进展期组血清中microRNA-196a的表达水平显著高于可切除组(P＝0.002)，达60.96倍(图1)，而作为阴性对照的6个microRNA在两组间没有差别(图2)

5.2由于TNM分期与胰腺导管腺癌患者的预后密切相关，因此，我们对研究的31例患者的术后生存时间及存活情况进行了随访，记录术后存活时间及生存情况(表3)。根据所得病例统计情况及患者血清中microRNA-196a的表达水平，我们尝试选定16.7作为(60-Ct)的界值，将所有胰腺癌病例分为高表达microRNA-196a组和低表达microRNA-196a组，使用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank统计学方法验证血清中microRNA-196a含量对胰腺导管腺癌患者预后的影响。结果表明：高表达量组平均生存期为7.00个月(95％可信区间5.66-8.34个月)，低表达量组平均生存期为12.00个月(95％可信区间7.06-16.94个月)，二者之间差异显著(P＝0.014)。高表达量组一年生存率为0.0％，而低表达量组一年生存率为31.2％。这与我们TNM分期的结果一致，进一步证实了胰腺导管腺癌患者血清中microRNA-196a在判断剖腹手术适应证方面的应用价值。

5.3在成功判定血清中microRNA-196a在确定胰腺导管腺癌手术适应证潜在价值的基础上，对其进行ROC分析，AUC下面积为0.859，诊断准确度为中等，取诊断界值为17.80(60-Ct)，其鉴别进展期胰腺癌的敏感性为100％，特异性为73.9％，见图4。

表1：7种胰腺导管腺癌相关性microRNA的标准化相对定量值

表2：31例胰腺导管腺癌患者的临床数据及临床分期

表3：31例胰腺导管腺癌患者术后随访情况(截止至2009年6月)

Claims (1)

1、一种检测胰腺癌血清标志物的方法，其特征在于该胰腺癌血清标志物是microRNA-196a，该方法包括以下步骤：

A)待检血液样本，离心，取血清；

B)在经去酶剂处理的血清中加入Cel-miR-39作为标化物，抽提总RNA；

C)用Taqman microRNA反转录试剂盒对抽提的RNA进行反转录反应；

D)测定血清中microRNA-196a的标准化相对表达丰度(60-Ct)：

用荧光实时定量PCR(RT-PCR)技术，测得所得血清中microRNA-196a的表达丰度(Ct值)，用Ct196a表示；并用同样的方法测得加入的标化物Cel-miR-39的Ct值，用Ct39表示；计算各血清样本中microRNA-196a的初步定量值(60-Ct196a)，然后比较得出各样本中最小的Ct39值(Ct39_min)，计算出血清中microRNA-196a的标准化相对表达丰度(60-Ct)，(60-Ct)＝(60-Ct196a)-(Ct39-Ct39_min)。

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