CN111575374B

CN111575374B - 用于早期胰腺肿瘤检测分子标志物、其检测方法及应用

Info

Publication number: CN111575374B
Application number: CN202010356498.0A
Authority: CN
Inventors: 肖桂山; 肖晓莺
Original assignee: Dalian Kailun Biotechnology Consulting Co ltd
Current assignee: Kant Shenzhen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2040-04-29
Also published as: CN111575374A; US20230265523A1; WO2021218592A1

Abstract

本发明公开了用于早期胰腺肿瘤检测分子标志物、其检测方法及应用，属于生物技术及临床分子诊断药物开发领域。该胰腺癌标志物miRNAs：miR‑30c、miR‑24、miR‑23a和miR‑132。本发明所提供的组合、方法和试剂盒能够用于早期胰腺癌的筛查与鉴别诊断、疾病并发症发生和复发的监测、疗效、药效及指导精准用药等方面评价，具有检出谱系广、灵敏度高、特异性好、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于胰腺癌早期普查和预后等相关工作，改进单一的标记物或目前临床广泛应用的生物标志物本身的不稳定性所难以克服的个体差异、所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高早期胰腺癌的临床检出率、降低对胰腺癌误诊率和漏诊率，成为早期胰腺癌筛查和诊断的有效手段。

Description

用于早期胰腺肿瘤检测分子标志物、其检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术及临床分子诊断药物开发领域，特别涉及能区分早期胰腺癌、胰腺炎及胰腺导管内乳头状黏液肿瘤病变以及正常人血液检测标志物、PCR(多聚酶联反应)或任何以这些标志物为检测手段的方法和试剂盒。

背景技术

早期胰腺癌通常指肿块直径≤2.0cm，无淋巴结转移，无胰腺被膜和胰周浸润，无血管和邻近脏器侵犯的胰腺癌，分期属T1aN0M0。但是有学者认为，1.0cm～2.0cm的胰腺癌大多已发生了淋巴结转移，主张肿瘤直径≤1.0cm为早期胰腺癌的标准。除非病灶恰巧位于十二指肠乳头处，可以早期出现胆胰管梗阻症状以外，极少有临床症状。另有学者提出，早期胰腺癌和小胰腺癌的定义有所区别，后者主要是指肿瘤最大直径≤2.0cm，而无论有无淋巴结转移。因此，早期胰腺癌的诊断，应重点在于高危人群的筛查、分子生物学诊断和探索新的影像检查手段。

目前临床应用最为广泛的胰腺癌诊断手段，即应用多种影像学方法来鉴别疑似胰腺癌患者的肿瘤，其中包括腹部B超、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)、内镜超声(EUS)和正电子发射断层扫描(PET)。由于胰腺癌肿瘤所处于人体内脏的深处，在初期没有明显的临床表现，并且在微小癌灶时期难以用放射成像进行诊断，导致大部分胰腺癌患者在确诊时已进入晚期，病灶已经转移，患者丧失用手术进行治疗的机会。

考虑到影像检测手段的局限性，研究者们开始思考是否可以利用人体体内的某些生物分子作为诊断靶标，从而提高诊断的特异性。因此在近些年，人们热衷于开发新型生物标志物。关于胰腺癌的生物标志物的研究也有很多，但是很少能被证明是有效的检测早期胰腺癌。目前，碳水化合物类抗原19-9(CA 19-9)是应用最广泛的胰腺癌生物标志物。然而，由于CA19-9、CA125、CA50、TIMP-1、及CEA对胰腺癌的诊断敏感性和特异性都较低(都在30～40％和60％左右)，因此它们并不是筛查和早期检测胰腺癌的最佳诊断标，其主要临床应用是作为监测病情进展和治疗反应的标志物。

现有技术中CN101942502A和发明人的在先申请CN109423519A虽然公开了采用微小核糖核酸作为检测临床早期胰腺癌诊断的用途，但现有技术中都是用单一检测指标来判断，并且所发明的单一miRNAs并不是最灵敏的，不是最能反映临床病人体内实际情况的，缺乏综合考虑每种miRNAs个体化临床上表征，有可能导致其产品检测结果不能真实反映病人实际状况，造成漏诊和误诊。

传统的miRNA的检测技术主要是Northern Blotting印迹法、微阵列、原位杂交(ISH)和核酸扩增技术。如今，尽管在开发miRNA检测技术的研究方面已经取得许多进展，但是仍然存在以下的问题亟待解决：

1)目前，虽然已经报道了许多种miRNA检测方法，但可商业化且推广至临床的技术主要还是PCR。但是普通的RT-PCR并无法达到实际所要求的高灵敏度、准确性以及特异性，并且面对临床大规模样品，如何实现快速且大批量检测是技术难点；

2)通常一个miRNA可以同时调控多种功能，与多种疾病息息相关。因此，开发可同时检测多种目的miRNA的高通量检测技术是非常重要的；

3)目前在临床中经常以血液作为检测样品，进行体外miRNA分析。这一般需要从血清中提取和分离miRNA，但其中miRNA的含量较低，并且容易出现RNA降解的情况，因此有必要进一步开发一种可以提供高质量miRNA样品的RNA提取技术。

因此，开发高效、灵敏的miRNA及检测方法对于胰腺癌的早期诊断、治疗及预后具有非常重要的意义。

发明内容

针对目前胰腺癌早期诊断困难及现有的生物标志物敏感性和特异性较低的问题，本发明提供了一组血清中miRNAs差异性表达筛查和检测胰腺癌的新方法以及早期胰腺肿瘤分子标志物的新用途。

本发明的发明构思是：miRNA是由非蛋白质编码的小RNA组成的长度为18-24个的核苷酸，涉及通过降解靶调节mRNA或多肽来实现多基因表达或抑制，从而调节各种肿瘤过程，包括细胞增殖，迁移，侵袭，存活和转移。由于miRNA的异常表达体现在胰腺癌的发病过程中的各个阶段，而且在分子水平上的表达量都是不同的。所以按照不同病理类型miRNA的差异表达，用来检测各个阶段特征疾病，是一个具有极好的敏感性和特异性地区分患者患有胰腺良性疾病还是胰腺癌的技术手段。

为实现上述目的，本发明请求保护的胰腺癌标志物miRNAs分别为：miR-30c、miR-24、miR-23a和miR-132。

所述miR-30c，包括hsa-miR-30c-5p；miR-24包括hsa-miR-24-3p；miR-23a包括hsa-miR-23a-3p；miR-132包括hsa-miR-132-3p。

上述miRNAs引物及探针序列为：

本发明另一个目的是请求保护分别含有上述miRNAs中任一个或2～4个组合的核心诊断组合。

所述组合包括：

组合1：miR-24/miR-23a/miR-132/miR-30c；

组合2：miR-130/miR-200c/miR-154/miR-30c；

组合3：miR-24/miR-132/miR-1207/let-7i；

组合4：miR-30c/miR-24/miR-59/miR-132；

组合5：miR-130/miR-21/let-7i/miR-30c；

组合6：miR-30c/miR-154/miR-23a/miR-57。

本发明不仅探明用于临床早期胰腺癌诊断最佳组合，而且找到用于胰腺癌病人最佳临床分类治疗方法。

本发明请求保护上述早期胰腺癌诊断分子标志物的应用，即，上述早期胰腺癌标志物在试剂盒或以任何其他便捷方法，包括但不限于可携带式检测试纸、数字检测条/卡及检测仪以及利用任何化学方法修饰以上miRNAs分子的衍生物等上的应用。该试剂盒或其他检测方法包括上述用于检测早期胰腺癌标志物的任何一种miRNAs探针组合。

本发明将多组合联合检测结果结合常规病理结果来综合判断检测准确性，检测精确度高(>95％)，而现有技术中仅采用单一检测指标(单个微小核糖核酸来判断，并且现有技术中的miRNAs并不是最灵敏的，缺乏综合考虑个体化临床特点，有可能导致产品检测结果不能真实反映病人实际状况。

本发明另一个目的请求保护利用上述miRNAs早期筛查、精准用药检测方法。在本发明筛选出一组在胰腺癌患者中异常高表达的miRNAs的基础上，将其作为胰腺癌早期检测的候选标志物。在检测过程中，考虑到成本和操作的便捷，本发明采用应用广泛的TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术。与SYBR Green I染料法相比，TaqMan探针法在特异性和灵敏度方面更有优势。鉴于人血清中miRNA含量较低，提高检测的特异性是一大难题。为了提高检测特异性避免假阳性结果，发明人根据Taqman探针技术原理，自主设计了目标miRNAs的特异性探针及引物；其次，为了减少普通Taqman探针检测中内参和靶标分开检测引起的误差，本发明采用多重探针技术，将内参(U6)与目标miRNA在同一体系中进行反应，这样不仅大大减少操作误差，还一定程度上避免了临床样本稀少给检测带来的不便。由于目前市面上没有已成熟的多重Taqman探针检测血清中miRNA的试剂体系，我们花费了大量时间和精力将市面上现有的RNA提取、逆转录及PCR试剂体系进行优化，并通过不同的样本类型反复测试，以建立一套稳定的标准检测体系(SOP)。

本发明所述miRNAs早期筛查、精准用药检测体系构建方法的具体步骤为：

S1.筛选胰腺癌miRNA，根据TaqMan探针技术原理，设计目标miRNA的特异性探针及引物；将U6或hsa-miR-16或hsa-miR-159a内参与目标miRNA在同一体系中进行反应；

S2.miRNA提取技术优化

S2.1确定提取试剂，根据分离试剂盒对测试样品提取的miRNA质量，筛选出最佳提取试剂为TRIzol LS Reagent；

S2.2优化提取过程中的影响因素，影响miRNA提取质量的因素主要有：裂解液用量、氯仿用量、异丙醇用量以及离心条件等，采用TRIzol LS Reagent试剂盒考察不同异丙醇用量以及离心条件对提取miRNA质量的影响，设计三种细节优化方案；

S2.3对TRIzol LS常规提取方式按照上述三种方案进行细节优化；

根据异丙醇用量、离心时间和用量，设计了三种优化方案及对比方案，方案A与传统方案的区别在于，离心时间为20min，离心20000g；方案B与传统方案的区别在于，异丙醇用量为200μL，600μL，800μL；方案C与传统方案的区别在于，异丙醇用量为800μL，离心时间为20min，离心20000g。

S3.多重RT-qPCR体系反应程序和反应体系的优化和建立

S3.1反转录的RNA上样量优化

对目标miRNA上样量进行梯度设置，确定反转录的RNA最佳上样量为50ng；

S3.2 PCR扩增反应试剂的优化

分别采用正常人血清及胰腺癌患者血清进行AceQ qPCR Probe Master Mix和Premix Ex Taq^TM对比实验，选取Premix Ex Taq^TM作为临床打样本检测的qPCR试剂。

本发明还请求保护采用上述方法构建的检测体系进行临床诊断的方法，具体步骤为：

S1.采集临床样品对符合条件的病例入组

S2.RNA提取

(1)每200ul血清样品中加入600ul TRIzol^TMLS室温孵育以充分裂解；

(2)向裂解液中加入氯仿，室温孵育；20000g，4℃离心20min，将上层水相移至新的离心管中；

(3)加入800μL异丙醇，室温孵育；12,000×g，4℃离心10min，RNA在管底形成白色沉淀，移去上清液；再加入75％乙醇重悬清洗沉淀；7500×g，4℃离心5min，去上清液，晾干；加入ddH₂O溶解RNA；测定所提RNA的浓度和质量。

S3.RT-PCR反应程序和反应体系

(1)在0.1ml 8-strip PCR管中配制以下体系吹打混匀，多个样品一起配制再分装：

将含有miR-30c、miR-24、miR-23a、miR-132中任意一个miR与U6组合，按照表中配伍比例，先配好工作液，然后，按表中比例加入相应反应试剂，确保总体积为15微升；然后，进行PCR扩增实验；在PCR扩增仪进行以下程序：16℃30min→42℃30min→85℃5min→4℃，完成后轻微离心至管底。

(2)在0.2ml PCR管或RNAase-free 1.5ml EP管中配制以下体系吹打混匀

试剂	用量(μl)
		cDNA	3
PremixExTaq(ProbeqPCR)(2×)	5
		U6ForwardPrimer(10μM)	0.2
U6ReversePrimer(10μM)	0.2
		miRNAForwardPrimer(10μM)	0.2
miRNAReversePrimer(10μM)	0.2
		U6Probe(10μM)	0.4
miRNAProbe(10μM)	0.4
		RNase-freeddH2O	0.4
总体积	10

采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃30秒，PCR反应，40个循环，95℃5秒，60℃30秒，退火50℃30秒，1个循环。

(3)QuantStudio DX实时荧光定量PCR系统，反应条件为：预变性，1个循环，95℃30秒，PCR反应，45个循环，95℃5秒和60℃40秒。

S4.根据用核心诊断组合进行的定量PCR结果，分析生物标志物在病人血样中分布，判断病人病理状态。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明的miRNAs是经过了系统研究发现、并反复用不同样本、通过多个研究中心和临床中心验证得出的最有效的生物标志物组合，提出miR-30c、miR-24、miR-23a、miR-132作为胰腺癌的诊断生物标志物，为早期胰腺肿瘤分子诊断与精准用药提供了理论支撑。

(2)针对miRNAs序列短、组织细胞含量低、高度同源性等特点，相应地对检测技术提出了更高的要求，本发明建立了一种Taqman探针多重实时荧光定量PCR体系来克服以上问题，达到便捷快速、高度特异性地检测血清样本中多种靶标miRNA的目的，实现可靠区分早期胰腺癌与胰腺炎病变以及正常人，为胰腺癌的早期检测提供技术支撑，也为miRNA标志物开发工作提供了新思路。

(3)本发明建立了一种多个组合联合检测，即，6个组合联合检测结果结合常规病理结果来综合判断检测准确性，检测精确度高(>98％)，该检测方法是建立在国内5个大临床研究中心近600病例验证基础上最佳的用于临床诊断与精准治疗方法。

本发明是基于多种miRNAs在早期胰腺癌细胞中的表达强度差异而开发出来的可用于早期胰腺癌分子诊断和治疗的生物小分子。本发明提供多种早期胰腺癌标记物组合及其早期筛查以及精准用药检测方法。本发明所提供的胰腺癌标记物包含受试者血清/血浆以及唾液中稳定存在且可检测的4种微小核糖核酸组合表达强度。

本发明提供的技术方案不同于现有技术任一种miRNAs及筛查方案，发明人通过临床多中心验证，综合病人医学背景、BMI(肥胖指数)、生活习惯(饮酒和吸烟)、临床代谢指标血象以及其在个体及随访个体血象中的变异度，运用大数据综合分析每一种miRNAs对早期胰腺细胞发生癌变的贡献度进行精度计算，从而选择与现有技术中所公开的不同的灵敏度高、特异性更强miRNAs，这样通过综合分析每种miRNAs的惩罚指数分析找到的miRNAs最能反映临床病人体内实际情况。

本发明所提供的组合、方法和试剂盒能够用于早期胰腺癌的筛查与鉴别诊断、疾病并发症发生和复发的监测、疗效、药效及指导精准用药等方面评价，具有检出谱系广、灵敏度高、特异性好、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于胰腺癌早期普查和预后等相关工作，改进单一的标记物或目前临床广泛应用的生物标志物本身的不稳定性所难以克服的个体差异、所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高早期胰腺癌的临床检出率、降低对胰腺癌误诊率和漏诊率，成为早期胰腺癌诊断的有效手段。

附图说明

图1TRIzol LS提取过程的优化流程；

图2qPCR试剂检测结果，其中图2a为Vazyme试剂测试结果，图2b为TAKARAqPCR试剂测试结果；

图3为PCR技术检测人血清miRNA拷贝数变化曲线；

图4为组合1筛查来自正常人、胰腺炎及早期胰腺癌病人血清miRNA拷贝数变化(*p<0.001)

图5为组合3和组合4基因在人血清中PCR检测拷贝数变化；

图6为组合1临床实验结果决策树分析(n＝800)；

图7为组合1临床实验结果随机森林模型分析(n＝800)。

具体实施方式

下面通过附图和具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。

实施例1

miRNAs早期筛查、精准用药检测体系(SOP)构建

S1、筛选胰腺癌miRNA，根据TaqMan探针技术原理，设计目标miRNA的特异性探针及引物；将U6内参与目标miRNA在同一体系中进行反应；设计的引物及探针如下：

表1.设计目标miRNA的引物及探针序列

S2.miRNA提取技术优化

(1)确定提取试剂。筛选出三种常用的商用RNA分离试剂盒，分别为TRIzol(Ambion)、TRIzol LS Reagent(Invitrogen)和miRNeasy Serum/Plasma kit(Qiagen)，通过比较提取出的miRNA质量，并且评估成本及操作难易程度等因素，选择综合性能最佳的提取试剂。采用这三种提取试剂分别根据其使用说明书进行同一测试样品(以Sw1990胰腺癌细胞株为例)的提取，并对提取结果进行分析。从附表2可以看到，TRIzol LS提取的RNA浓度最大，RNA质量较合适，因此决定采用TRIzol LS Reagent(Invitrogen)作为本发明的提取试剂。

表2三种miRNA提取试剂分光光度法及荧光定量PCR分析结果

(2)优化提取过程中的影响因素。对第一步已确定的试剂盒自带的提取操作过程进行改良优化，提高分离出的miRNA质量。已知影响提取质量的因素主要有：裂解液用量、氯仿用量、异丙醇用量以及离心条件(时间和转速)等。本发明主要是考量异丙醇用量以及离心条件对提取质量的影响。设计如图1所示的TRIzol LS提取过程的优化流程图。

(3)对TRIzol LS常规提取方式按照上述三种方案进行细节优化，提取来自同一个正常人的血清样本200μL，提取质量结果如下表3所示。通过对表3的实验结果进行统计学分析可以看出，A方案与传统方法相比，提取出的RNA浓度增大了约7～10ng/μL。这说明优化离心条件，其中包括提高速度，延长离心时间，可以使让分离出来RNA充分的沉淀，提高提取浓度，并且纯度也有略微提高，但仍然处于处于最佳值范围(OD260/280＝1.8～2.0)外；B方案是在其他条件相同的情况下，改变异丙醇的用量，分别为200μL，600μL，800μL，比较在这三种梯度实验条件下提取出的RNA质量，从测试结果看出，以异丙醇量为800μL的提取效果最佳，其中在浓度方面，与传统方法相比，提高了50.956±3.97ng/μL，不仅如此，在纯度方面，更是具有显著性提高，其OD260/280约为1.9，处于纯度最佳范围内。异丙醇是让RNA成球沉淀的，此结果说明了适当提高异丙醇用量，可以显著改善提取纯度；方案C是将方案A与方案B的有利因素综合使用，即改变离心条件至20000g，20分钟和提高异丙醇用量至800μL，测试结果浓度与纯度均明显提高，满足优化目的。

表3四种方案提取血清中miRNA的分光光度法及荧光定量PCR分析结果

S3.RT-PCR反应程序和反应体系的优化和建立。本发明建立的多重RT-qPCR体系主要分为两部分反应，反转录反应(RT)与扩增反应(PCR)。因此，我们分别调整反转录中RNA的上样量和PCR扩增反应中试剂的使用。

(1)反转录的RNA上样量优化：我们对RNA上样量设置5个梯度值50ng(A)，25ng(B)，12.5ng(C)，6.25ng(D)，3.125ng(E)，再按照TaqMan^TMMicroRNAReverse Transcription Kit(ABI 4366596)试剂盒的操作说明书进行操作。分别对表4中四种目的miRNA的5组实验组的实验结果进行统计学分析，可以看到四个探针均呈现随着RNA上样量的减小，Ct值显著增大的趋势。因此最终确定反转录的RNA上样量为50ng为最佳。

表4 5组不同RNA上样量的四种目的miRNA的多重RT-qPCR的结果

PCR扩增反应试剂的优化：我们考察了市面上两种常用的Taqman法qPCR试剂，并用相同的样本(正常人血清及胰腺癌患者血清)进行实验比较。这两种试剂分别为AceQ qPCRProbe Master Mix(Vazyme)和Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)(TAKARA)，分别按照试剂说明书进行操作。对两种试剂的检测结果进行统计分析可以看到，两种试剂都可以使miRNA正常进行PCR反应并区分正常人和胰腺癌患者的血清(与正常样品相比，胰腺癌患者血清中四种miRNAs显著高表达)。但是，Vazyme试剂在样品的稳定性不是很好，经常在三个重复实验中会有一个异常值，并且偏离其他两个值很远(统计图的errorbar较大)。因此，本发明采用Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)(TAKARA)作为临床打样本检测的qPCR试剂。

实施例2

利用本发明建立的血清中miRNA多重荧光探针检测技术，下述实施例中一共检测了近900例血清样本中miR-30c、miR-24、miR-23a、miR-132、miR-21、let-7i、miR-1207、miR-130、miR-200c、miR-154、miR-57的表达情况，分别分为6个组合，即，

组合1：miR-24/miR-23a/miR-132/miR-30c；

组合2：miR-130/miR-200c/miR-154/miR-30c；

组合3：miR-24/miR-132/miR-1207/let-7i；

组合4：miR-30c/miR-24/miR-59/miR-132；

组合5：miR-130/miR-21/let-7i/miR-30c；

组合6：miR-30c/miR-154/miR-23a/miR-57。

具体为：来自上海仁济医院、大连医科大学、北京协和医院及南京医科大学的患者血清样本(包括早期胰腺导管腺癌、胰腺炎、胰腺导管内乳头状黏液肿瘤)及湖南湘雅医院的正常人血清样本，根据前面建立的SOP进行操作，具体操作步骤为：

1.采集及处理样品

(1).所需临床样本(800例，并有详细临床随访数据；样本容量是基于统计力度大于95％)：

a)癌症：早期胰腺癌(<I期)(200例)、中晚期(>＝II)(300)

b)干扰组：

①导管内乳头状黏液肿瘤(IPMN)(50例)；

②炎症：(a)急性(30例)、(b)慢性胰腺炎(50例)

③胰腺假性假乳头状瘤(Solidpseudopapillary tumor ofpancreas)(35例)；

④胰腺囊性腺瘤(Pancreatic cystic adenoma)(35例)。

c)正常：无癌症、无传染性疾病、无其他代谢性疾病(100例)。

(2).样本类型：血清500微升/例

(3).所需临床信息：

①生理信息(性别、年龄、身高、体重、吸烟史、饮酒史、肿瘤家族史、糖尿病史)；

②病理信息(肿瘤部位、肿瘤大小、分期、组织学分级、淋巴结阳性数、有无癌转移)；

③参考指标(CA19-9、CA125、CEA、CA242)；

④治疗方案(是否化疗、化疗方案、是否放疗)；

⑤随访信息(随访时间、生存状态、是否复发、复发时间、死亡时间)

(4).入组条件：同时满足以下条件的病例才能入组：

①符合(1)中的样本类型；

②具备(3)中所需临床信息；

③样本保存完好，及时冻存，无反复冻融。

2.实验前准备

环境：整个实验过程在洁净室操作，常温温度20-25摄氏度；

仪器：高速离心机，Nanodrop，PCR扩增仪，定量PCR仪；

耗材：RNAase-free 1.5ml EP管、0.1ml 8-strip PCR管、1ml/200ul/10ul tips、384孔板；

试剂：TRIzol^TMLS Reagent(Invitrogen10296028)，RNase-free ddH2O，TaqMan^TMMicroRNA Reverse Transcription Kit(ABI 4366596)，Premix Ex Taq^TM(ProbeqPCR)TAKARARR390；氯仿，无水乙醇，RTprimer(U6、miR-30c、miR-24、miR-23a、miR-132)，qPCRprimer，probe(U6-Fam，VIC:miR-30c、miR-24、miR-23a、miR-132)。

3.RNA提取-TRIzol^TMLS Reagent

(1)每200ul血清样品中加入600ul TRIzol^TMLS，枪头反复吹打均匀，室温孵育5min以充分裂解；

(2)向裂解液中加入0.16ml氯仿，盖上盖子，室温孵育2-3min；

20000g，4℃离心20min，样品分为三层，将上层水相移至新的离心管中(注意不要吸到中间层)；

(3)加入800μl异丙醇，盖上盖子室温孵育10min；

(4)12,000×g，4℃离心10min，RNA在管底形成白色沉淀，移去上清液；

(5)加入0.8ml 75％乙醇重悬清洗沉淀；

(6)7500×g，4℃离心5min，去上清液，注意不要吸走RNA沉淀；

(7)敞开管盖空气中晾干5-10min；

(8)加入22ul RNAase-free ddH₂O溶解RNA；

(9)用Nanodrop测定所提RNA的浓度和质量。

4.逆转录-TaqMan^TMMicroRNAReverse Transcription Kit(ABI 4366596)

将含有miR-30c、miR-24、miR-23a、miR-132中任意一个miR与U6组合，按照表中配伍比例，先配好工作液，然后，按下表中比例加入相应反应试剂，确保总体积为15微升。然后，进行PCR扩增实验。在0.1ml 8-strip PCR管中配制以下体系吹打混匀，多个样品一起配制再分装：

试剂	用量(μl)
		RNA	X(50ng)
10xBuffer	1.5
		dNTPmix	0.15
RTenzyme	1
		RNaseinhibitor	0.19
U6RTprimer(5μM)	1
		miRNARTprimer(5μM)	1
RNase-freeddH2O	10.16-X
		Total	15

在PCR扩增仪进行以下程序：16℃30min→42℃30min→85℃5min→4℃，完成后轻微离心至管底。

5.RT-PCR-Premix Ex Taq^TM(Probe qPCR)TAKARARR390

在0.2ml PCR管或RNAase-free 1.5ml EP管中配制以下体系吹打混匀，分装至0.1ml8-strip PCR管或384孔板，cDNA单独加时打到管壁上，加完盖0.1ml 8-strip PCR管盖时，手不要直接接触管盖，垫张纸按下管盖。若使用384孔板贴上封膜，轻微离心甩到管底。

Premix Ex Taq可在-20℃长期保存，一旦融解请于4℃保存并在6个月之内使用完。

在定量PCR仪(Roche LC480II)采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃30秒，PCR反应，40个循环，95℃5秒和60℃30秒，退火50℃30秒，1个循环。

QuantStudio DX实时荧光定量PCR系统

反应条件为：预变性，1个循环，95℃30秒，PCR反应，45个循环，95℃5秒和60℃40秒。

试剂	用量(μl)
		cDNA	3
PremixExTaq(ProbeqPCR)(2×)	5
		ROXReferenceDye(50×)	0.2
U6ForwardPrimer(10μM)	0.2
		U6ReversePrimer(10μM)	0.2
miRNAForwardPrimer(10μM)	0.2
		miRNAReversePrimer(10μM)	0.2
U6Probe(10μM)	0.4
		miRNAProbe(10μM)	0.4
RNase-freeddH2O	0.2
		Total	10

6.病理状态分析

根据用核心诊断组合进行的定量PCR结果，分析生物标志物在病人血样中分布，判断病人病理状态。

图3，以组合1为例说明PCR技术检测人血清(来自正常人、胰腺炎及早期胰腺癌病人)miRNA拷贝数变化，由附图所示结果可知内参正对照U6在人血清样品中扩增信号以及组合1待测和负对照miRNAs的实际PCR信号。

图4所示为组合1筛查来自正常人、胰腺炎及早期胰腺癌病人血清miRNA拷贝数变化(*p<0.001)，有附图4所示结果可知组合1中4种miRNA标志物能明显区别早期胰腺导管癌变、胰腺炎及正常人，因此该组合为最佳组合。

图5所示为组合3和组合4基因在人血清中PCR检测拷贝数早期胰腺癌病人(肿瘤大小≤0.5CM)对吉西他滨治疗响应度(CR)(敏感，CR≥90；不敏感，CR≤10)：术前对病人血清PCR分析，*p<0.001。由该图所示结果可知，胰腺癌病人血清中组合3和组合4表达水平能显著区分不同病人对吉西他滨治疗的有效性，即对吉西他滨治疗有效的病人，其血液中组合3或4表达量最多高于正常人血液中的2倍左右(±0.25)；或对吉西他滨治疗无效的病人，其血液中组合3或4表达量大于正常人血液中的2.5倍以上。与正常人比较，上述miRNAs组合显著性高于正常人，其检测灵敏度和特异性均在95％以上。

对组合1miRNAs进行定量PCR分析，联合病人临床信息，并用大数据信息学云计算方法建模分析生物标志物在病人血样中分布，以此判断病人病理状态。800例临床试验分析如图6-7所示。图6结果表明，用大数据生物信息决策树分析发现，组合1能显著区分早期胰腺癌、胰腺炎、导管内乳头状黏液肿瘤及正常人。其检测灵敏度100％，特异性97.8％，准确性(AUC)为98.9％。

为进一步验证所建模型的稳定性，以上检测数据结合临床信息，通过随机森林模型验证(见附图7)，结果表明：组合1确实能显著区分早期胰腺癌、胰腺炎、导管内乳头状黏液肿瘤及正常人。其检测灵敏度100％，特异性98.9％，准确性(AUC)为99.4％。

由以上实验数据可知，本发明miRNAs组合能区分早起胰腺癌与良性導管內乳頭狀黏液性腫瘤、早期胰腺癌与胰腺炎、良性導管內乳頭狀黏液性腫瘤与胰腺炎、胰腺炎与正常组织；并能准确预测多药耐药性(准确率约90％)，临床检测灵敏度平均>98％。

以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

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Claims

1.用于检测早期胰腺癌的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-132-3p的组合。

2.检测如权利要求1所述分子标志物表达量的试剂在制备早期胰腺癌检测试剂盒中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，所述试剂盒包括可携带式检测试纸、数字检测条、数字检测卡及检测仪。

4.如权利要求2所述的应用，所述试剂盒包括检测其miRNAs的探针组合。