CN110423819B - 一种参与人结直肠癌增殖和耐药的lncRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明开创性地发现一种参与人结直肠癌增殖和耐药的lncRNA其应用，并具体公开了所述lncRNA的转录本的序列结构和用于扩增该转录本序列的引物序列，同时公开了lncRNA可以作为结直肠癌诊断和预后效果的标记物，该lncRNA促进结直肠癌细胞的增殖和增强结直肠癌的耐药性，进而可将其应用于制备诱导肿瘤细胞凋亡的药物。
Description
技术领域
本发明涉及医学诊断领域，具体而言，涉及一种参与人结直肠癌增殖和耐药的lncRNA其应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是肿瘤相关死亡的主要原因之一，是全球第三大诊断性癌症。2012年全球范围内约有136万人被诊断患有结直肠癌，共69万例结直肠癌相关死亡。在中国，结直肠癌引起的死亡在所有肿瘤相关死亡中排第五位，发病率有增长趋势。新诊断的结直肠癌患者中，约有60％会发生转移，肿瘤转移是结直肠癌患者死亡的主要原因，但是目前医生和科研工作者对结直肠癌肿瘤发生的潜在分子机制仍未完全了解。因此，明确结直肠癌的发生发展机制是开发靶向药物和降低患者死亡率的关键。
近年来关于恶性肿瘤细胞如何通过各类分子，包括长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)来调控肿瘤的起始、进展和传播的研究越来越深入。lncRNA是一类长度大于200核苷酸，不具有编码蛋白功能的RNA。研究发现它们在调控细胞稳态，包括细胞的增殖、凋亡、转移和基因组稳定性方面起到重要作用。值得注意的是，lncRNA常常以一种细胞类型特异或者组织特异的方式进行表达。更重要的是，肿瘤来源的lncRNA在包括尿液和外周循环血等人类体液中可以被检测到，它们在体液中的水平常与肿瘤组织中的表达水平相关。lncRNA的这些特点使它们成为比传统的分泌性蛋白，肿瘤基因组学改变等更理想的用于无创诊断、监测肿瘤和判断患者预后情况的生物标志物。例如，与传统的血清前列腺癌标志物前列腺特异性抗原PSA相比，尿液中的lncRNA-PCA3可以更灵敏和特异地诊断前列腺癌。目前，结直肠癌发生发展相关lncRNA的研究还很有限，因此发现在结直肠癌动态变化过程中其关键作用的lncRNA，有利于让我们更全面地了解结直肠癌，为结直肠癌的治疗提供潜在靶点，并为找到更有价值的结直肠癌诊断和预后标志物提供可能。
发明内容
针对现有技术中长链非编码RNA在结直肠癌进展和耐药中的机制和作为结直肠癌诊断和预后标志物的价值还未明确，本发明提供一种新发现的参与人结直肠癌增殖和耐药的长链非编码RNA及其作为结直肠癌诊断和预后标志物应用潜在价值。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案包括：
本发明的第一个方面是提供一种参与人结直肠癌增殖和耐药的lncRNA，所述lncRNA的转录本的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示或为该核苷酸的变体，所述核苷酸的变体与该多核苷酸具有90％以上同源性，且具有相同的功能。
进一步地，所述lncRNA命名为PiHL，其转录本的序列具体如下所示：
GAACAGGTTGTGTGTGCCCCTTGAGGCGTTCATCCAGCACTGTTTCAGAGAAATCCCTATTTCAATCTATTCCTATACGTTAGTTATTGAAAAGCAATAGACAATCACAAAAAACAAGTTGACCTTTTTGTGTTCCTTGAGCCAAAGGGCCCTCATGACTGGGCCTCACACCGAATAACTCGTTACAAAAAGAGCTAGGGTCCCAGACTGCGCCAAAGCTTCAGGAGACTGCTCCTCGTCTGTGCACAGATGAGTGGCCAACTCTGGAGCCCAGGTTGTTGCTTCCTAGTCTGGTGGTGAATCCTTCATAGTCTGGAGGTGCTTATTTAGCAAATTCAACCTTAAACCTGAGTGCATGGAAACTATTGATGCAGTGTCCAAGGTGGAGAAAGGTCAGAGTGGATCCAGAGGAGCCAAGAGAAGACGTCCAGCATGGTGACCTGGGCTCAAGTCAAGGTCCTTATTTCTCTGCTGAACCATCACATTCCTTATACAGAGTGGGACAGCATTGGCTGAGTTCTACTAGCAAATGCCGGAGATGTGGTTCCTGTTGGCCTTTTAACTGATGTGATGAAATAAAGTCTTCCATAATTTGACAA(SEQ ID No.1)
进一步地，所述核苷酸的变体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。
进一步地，PiHL可以促进结直肠癌细胞的增殖和增强结直肠癌细胞的耐药性。
进一步地，所述结直肠癌细胞为RKO和HCT116细胞系。
进一步地，PiHL促进结直肠癌对化疗药物5氟尿嘧啶产生耐药的作用。
本发明的第二个方面是提供用于检测PiHL表达水平的引物，其包括如SEQ IDNo.5-SEQ ID No.6所示序列，具体如下：
上游引物：5’-GAGCCAAGAGAAGACGTCCAG-3’(SEQ ID NO.5)
下游引物：5’-AAAGGCCAACAGGAACCACAT-3’(SEQ ID NO.6)
本发明的第三个方面是提供一种用于检测人结直肠癌或检验人结直肠癌预后效果的试剂盒。
进一步地，该试剂盒的目的基因的引物序列包括SEQ ID No.5-SEQ ID No.6所示序列。
进一步地，该试剂盒的内参基因β-actin引物序列包括如SEQ ID No.7-SEQ IDNo.8所示，具体如下：
上游引物；5’-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’(SEQ ID NO.7)
下游引物：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’(SEQ ID NO.8)。
本发明的第四个方面是提供一种PiHL在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，抗肿瘤药物为诱导肿瘤细胞凋亡的药物。
本发明的第五个方面是提供一种PiHL作为人结直肠癌诊断标志物或人结直肠癌预后标记物的应用。
进一步地，所述人结直肠癌诊断标志物为结直肠癌外周血诊断标志物。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明开创性地发现一种lnc RNA标志结直肠癌的诊断及其活性的lncRNA及其应用，公开了所述lnc RNA PiHL的转录本的序列结构，同时公开了PiHL可以作为结直肠癌诊断和预后的标记物、促进结直肠癌细胞的增殖和增强结直肠癌的耐药性，进而可以考虑长链非编码RNA可用于制备诱导肿瘤细胞凋亡的药物的应用。
附图说明
图1为本发明一实施例中lncRNA-PiHL过表达细胞系的lncRNA PiHL的表达图，其中pCDH为空载对照，PiHL为lncRNA-PiHL过表达组，*P<0.05；
图2为本发明一实施例中lncRNA-PiHL干扰细胞系的lncRNA PiHL的表达图，其中siRNA-NC为对照组，siRNA-PiHL-1与siRNA-PiHL-2为两个干扰组，*P<0.05；
图3为本发明一实施例中lncRNA PiHL与结直肠癌细胞HCT116和RKO增殖的关系图，*P<0.05；
图4为本发明一实施例中lncRNA PiHL与结直肠癌细胞HCT116的耐药性的关系图，*P<0.05；
图5为本发明一实施例中lncRNA-PiHL在裸鼠皮下成瘤模型与结直肠癌细胞HCT116的耐药性的关系图；
图6为本发明一实施例中lncRNA PiHL在结直肠癌患者和正常对照外周血中的表达差异图；
图7为本发明一实施例中lncRNA在两个独立结直肠癌样本群中的表达水平与患者预后的相关性分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例一
本实施例验证体外构建细胞系并验证lncRNA PiHL对结直肠癌的增殖和耐药性的影响。
(1)细胞培养：
人结直肠癌细胞系SW480、HCT116和人胚肾上皮细胞HEK293T均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞培养于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，细胞置于适宜湿度，含5％ CO2的37℃细胞培养箱中培养。
(2)稳定过表达lncRNA细胞系的构建：
将lncRNA PiHL全长序列(即SEQ ID No.1)构建到慢病毒表达质粒pCDH上。利用HEK293T细胞进行表达PiHL序列的慢病毒。将病毒加入结直肠癌细胞系RKO和HCT116细胞培养基中培养12小时，更换完全培养基，48小时后更换含嘌呤霉素的培养基继续培养，每两天换一次液，直到细胞不再死亡，更换完全培养基继续培养，最终筛选出稳定表达PiHL序列的RKO和HCT116细胞。
(3)lncRNA干扰细胞的构建：
细胞铺于6孔板中过夜贴壁使其密度达到30-40％。弃旧培养基，每孔加入1.5mL新培养基。按照以下组合配制转染体系：Opti-MEM(250μL)，Lipofectamine RNAiMAX(3μL),Opti-MEM(250μL)，siRNA(100pmol/L)，混匀后室温孵育5分钟。转染体系加入细胞中，培养48小时后可进行后续实验。siRNA对照序列以及PiHL靶向序列为：
siRNA-NC：UCCUAAGGUUAAGUCGCCCUC；(SEQ ID No.2)
siRNA-PiHL-1:CGCCAAAGCUUCAGGAGACU；(SEQ ID NO.3)
siRNA-PiHL-2:GAGAAGACGUCCAGCATGGU。(SEQ ID NO.4)
(4)实时荧光定量PCR检测细胞中lncRNA表达水平：
1)总RNA的提取：收集相应细胞，向其中加入1ml Trizol混匀，置于冰上30分钟让细胞充分裂解，随后加入200μl氯仿，剧烈震荡15秒，室温静置5分钟，随后放入4℃离心机中，12000rpm离心15分钟，取上层液体放入新的管子中，加入500μl异丙醇，充分混匀，室温放置10分钟，4℃离心12000rpm，10分钟，弃上清，用750μl 75％酒精清洗沉淀，4℃离心机，7500rpm离心5分钟，弃上清，让沉淀充分干燥，用30-100μl取RNA酶超纯水将RNA溶解，测浓度。
2)RNA反转录为cDNA：利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser将纯化的RNA反转录为cDNA，反应条件为：37℃反应15分钟，85℃反应5秒。反应产物稀释5-10倍，置于-20℃长期保存。
3)实时荧光定量PCR：利用罗氏公司的FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒，采用Applied Biosystems 7500实时荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR。其中，
PiHL引物序列为:
上游引物：5’-GAGCCAAGAGAAGACGTCCAG-3’(SEQ ID NO.5)
下游引物：5’-AAAGGCCAACAGGAACCACAT-3’(SEQ ID NO.6)
β-actin引物序列为:
上游引物；5’-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’(SEQ ID NO.7)
下游引物：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’(SEQ ID NO.8)。
4)实时定量PCR数据的标准化处理：
用上述方法检测每个样本PiHL的Ct值(Ctlnc)和内源性参照β-actin的Ct值(Ctβ-actin)，用Ctβ-actin减去Ctlnc得到标准化后的表达丰度值(ΔCt)。根据荧光定量PCR实验的ΔCt值计算出实验组和对照组之间目标lncRNA转录本的表达变化倍数，并根据三次独立实验的结果进行作图。见图1和图2。
(5)细胞增殖检测：
CCK8实验：
将待检测的细胞进行消化和计数，使96孔板中的每个孔接种500-1000个细胞(取决于细胞的生长速度)。每组共重复接种5个孔，接种后0、12、24、48、72、96以及120小时进行细胞增殖情况的测定，用不含血清的培养基1:10稀释CCK8试剂，每孔加入100μl，37℃培养箱孵育1-2小时，450nm波长测量吸光度。将6个时间点的吸光度值绘制成曲线分析各组细胞增殖差异。
(6)细胞耐药检测：
1)体外细胞凋亡实验：500μM 5氟尿嘧啶分别处理过表达PiHL的HCT116细胞和对照细胞14小时和20小时。使用Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit II，根据使用说明，将细胞做不同标记，使用FACS Calibur流式细胞仪的Cell-Quest软件分析细胞凋亡情况。Annexin V-FITC和PI双染色结果可评价所有细胞中凋亡细胞的百分比。Annexin V阴性和PI阴性细胞用作对照。Annexin V阳性和PI阴性细胞为凋亡细胞，Annexin V阳性和PI阳性细胞为坏死细胞。每个测试重复三次。见图4。
2)体内5氟尿嘧啶处理裸鼠皮下成瘤实验：4-6周龄BALB/c雄性裸鼠随机分组，每组6只，向裸鼠皮下注射5×106个HCT116细胞(悬浮于0.2ml PBS中)，每三天测量一次皮下瘤体体积，计算公式为：长×宽2)/2，待肿瘤增长至200mm3体积时，给小鼠服用对照试剂或5氟尿嘧啶(i.p.,30mg/kg daily)12天。每三天测量一次瘤体大小。将开始用药后12天的瘤体体积进行统计绘制增长曲线，见图5。
结果显示lncRNA PiHL可以促进结直肠癌细胞HCT116和RKO的增殖(图3)，并促进HCT116细胞在体外和体内对5氟尿嘧啶产生耐药(图4、图5)。
实施例二
本实施例对结直肠癌患者和正常对照患者外周血PiHL的表达量进行对比。
(1)血液标本采集：
1)血液标本采集：20例2017年3月至2017年3月间于复旦大学附属华山医院门诊或住院的结直肠癌患者。健康对照组20例，均为同期该院体检正常的健康人。
(2)血液样本收集：
取结直肠癌患者和正常人血液样本若干例(EDTA抗凝管抗凝)，将各例血液样本分别进行常温下3000r/min离心10min，可见分为两层。吸去上层透明淡黄色液体，即血浆，分装成于1.5mlEP管后，放置于-80℃保存。
(3)血浆总RNA提取：
按比例(血浆：Trizol＝1:3)往血浆中加入Trizol，混匀后与4℃中放置20min；再按照比例(Trizol：氯仿＝5:1)加入氯仿，剧烈震荡后4℃12000r/min离心10min。吸取上层水相至新的EP管后按照比例(Trizol：异丙醇＝2:1)加入异丙醇，颠倒混匀后-40℃放置30min，然后4℃12000r/min离心10min。弃去上清，将白色沉淀中按比例(Trizol：75％乙醇＝2:1)加入75％乙醇，4℃12000r/min离心10min，弃上清。加入10ul DEPC水溶解RNA沉淀并紫外分光光度计测定RNA浓度。
(4)实时荧光定量PCR检测lncRNA表达水平：
其步骤与实施例一相应步骤相同。
通过实时定量PCR获得所有样本的PiHL的ΔCt值，见表1和图6。
将上述两组数据进行组间比较后发现结直肠癌和正常人lncRNA表达差异显著(P<0.001)，结直肠癌患者表达高于正常人，初步判定lncRNA可以用作诊断结直肠癌。
表1.结直肠癌以及正常人血液样本的PiHL的ΔCt值
实施例三
本实施例为结直肠癌PiHL表达水平与术后患者生存的相关性分析。
(1)结直肠癌患者癌组织总RNA的提取：
收集两个独立的结直肠癌样本群(Cohort 1和Cohort 2)，进行癌组织中总RNA的提取。
(2)实时荧光定量PCR检测lncRNA表达水平。
(3)结直肠癌PiHL表达水平与患者生存相关性分析：
将样本群中的患者根据PiHL在癌组织中的表达水平分为PiHL高表达组和低表达组，统计结直肠癌患者术后生存情况，利用统计学软件SPSS分析PiHL表达水平与患者生存期的相关性，见图7。统计临床病理参数以及术后的生存情况，利用SPSS进行各临床病理参数以及癌组织PiHL表达水平的单因素和多因素分析，判断PiHL表达水平是否能作为结直肠癌患者预后的独立标志物，见表2和表3。
两个独立样本群的结果均显示，PiHL高表达的结直肠癌患者的预后较差，并且PiHL水平可以作为判断患者不良预后的独立预后因子。
表2.在第一个样本群(Cohort 1)中PiHL表达水平可以作为患者预后的独立影响因子
表3.在第二个样本群(Cohort 2)中PiHL表达水平可以作为患者预后的独立影响因子
通过上述的实施例可以知道，本发明开创性地发现一种参与人结直肠癌增殖和耐药的lncRNA及其应用。lncRNA PiHL作为人结直肠癌诊断标志物或人结直肠癌预后标记物，可以促进结直肠癌的增殖、增强结直肠癌对5氟尿嘧啶的耐药性。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 复旦大学附属华山医院
<120> 一种参与人结直肠癌增殖和耐药的lncRNA及其应用
<130> IPI193058
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 599
<212> DNA
<213> lncRNA的转录本序列（Artificial Sequence）
<400> 1
gaacaggttg tgtgtgcccc ttgaggcgtt catccagcac tgtttcagag aaatccctat 60
ttcaatctat tcctatacgt tagttattga aaagcaatag acaatcacaa aaaacaagtt 120
gacctttttg tgttccttga gccaaagggc cctcatgact gggcctcaca ccgaataact 180
cgttacaaaa agagctaggg tcccagactg cgccaaagct tcaggagact gctcctcgtc 240
tgtgcacaga tgagtggcca actctggagc ccaggttgtt gcttcctagt ctggtggtga 300
atccttcata gtctggaggt gcttatttag caaattcaac cttaaacctg agtgcatgga 360
aactattgat gcagtgtcca aggtggagaa aggtcagagt ggatccagag gagccaagag 420
aagacgtcca gcatggtgac ctgggctcaa gtcaaggtcc ttatttctct gctgaaccat 480
cacattcctt atacagagtg ggacagcatt ggctgagttc tactagcaaa tgccggagat 540
gtggttcctg ttggcctttt aactgatgtg atgaaataaa gtcttccata atttgacaa 599
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> siRNA-NC（Artificial Sequence）
<400> 2
uccuaagguu aagucgcccu c 21
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> siRNA-PiHL-1（Artificial Sequence）
<400> 3
cgccaaagcu ucaggagacu 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> siRNA-PiHL-2（Artificial Sequence）
<400> 4
gagaagacgu ccagcatggu 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> lncRNA的转录本上游引物序列（Artificial Sequence）
<400> 5
gagccaagag aagacgtcca g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> lncRNA的转录本下游引物序列（Artificial Sequence）
<400> 6
aaaggccaac aggaaccaca t 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> β-actin上游引物序列（Artificial Sequence）
<400> 7
agttgcgtta caccctttct tg 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> β-actin下游引物序列（Artificial Sequence）
<400> 8
gctgtcacct tcaccgttcc 20
Claims (5)
1.一种用于检测一种参与人结直肠癌增殖和耐药的lncRNA表达水平的引物，其特征在于，所述lncRNA的转录本的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物为SEQ ID No.5-SEQID No.6所示序列的引物。
2.如权利要求1所述的引物在制备诊断人结直肠癌或检验人结直肠癌预后效果的试剂盒中的应用。
3.一种lncRNA的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述lncRNA的转录本的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述肿瘤为结直肠癌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为诱导肿瘤细胞凋亡的药物。
5.检测一种lncRNA的试剂在制备诊断人结直肠癌或预测人结直肠癌预后的产品中的应用，其特征在于，所述lncRNA的转录本的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
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