CN114752676A - 检测hsa_circ_0099132的试剂在制备人结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测hsa_circ_0099132的试剂在制备人结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用及其试剂盒，其中hsa_circ_0099132的序列如SEQ ID No.1所示。本发明首次发现hsa_circ_0099132在结直肠癌细胞中表达上调，其表达量在结肠癌和癌旁组织中的差异具有统计学意义，在人结直肠癌诊断中具有诊断效能。同时，本发明还发现hsa_circ_0099132的表达量与结直肠癌确诊患者的临床特征和病理特征无相关性。因此本发明将检测hsa_circ_0099132的试剂应用于制备人结直肠癌辅助诊断试剂盒中，制备得到的人结直肠癌辅助诊断试剂盒具有敏感性和特异性较高且个体差异较小的优点。

Description

检测hsa_circ_0099132的试剂在制备人结直肠癌辅助诊断试 剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学检测技术领域，特别是涉及检测hsa_circ_0099132的试剂在制备人结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用及其试剂盒。

背景技术

结直肠癌是一种起源于结肠或直肠的恶性肿瘤疾病，是威胁人类生命健康的常见恶性肿瘤之一，且其发病率和死亡率均居高不下。结直肠癌目前的检测手段主要有组织活检、影像学检查和血清生物标记物水平的检测，但是组织活检和影像学检查的准确性和敏感性有限，而常用的血清生物标记物如CEA、CA12-5、CA19-9等的特异性较差、个体差异较大，因此需要寻找对结直肠癌敏感性和特异性较高的生物标志物。

环状RNA(CircRNA)在1976年首次被发现，是一类特殊的非编码RNA分子，其与线性RNA的最大不同在于结构呈缺乏自由末端的闭环状，因此与其他类型的RNA相比，环状RNA对核酸外切酶和RNA酶具有一定抵抗力，使之更稳定，进化上更保守。而目前对环状RNA的研究显示，其通过与miRNA结合的海绵作用以及与RNA结合蛋白的相互作用等参与癌症的发展机制。因此，环状RNA在成为癌症生物标志物方面具有巨大的潜力。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种检测hsa_circ_0099132的试剂在制备人结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用以及其试剂盒，其具有敏感性和特异性较高且个体差异较小的优点。

检测hsa_circ_0099132的试剂在制备人结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述hsa_circ_0099132的序列为SEQ ID No.1所示。

本发明所述的hsa_circ_0099132是一种环状RNA，其由两个外显子组成，拼接长度为535bp，其母基因为RAB3IP，在基因组上的定位为chr12:70149163-70150443。本发明通过研究首次发现hsa_circ_0099132在结直肠癌组织中高表达，且其表达量在结直肠癌组织和癌旁组织中具有显著差异，其表达水平与患者的临床特征无相关性。因此，所述的检测hsa_circ_0099132的试剂在结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用具有敏感性和特异性较高且个体差异小的优点。

进一步地，所述检测hsa_circ_0099132的试剂包括实时荧光定量检测hsa_circ_0099132表达量的引物。

进一步地，所述检测hsa_circ_0099132表达量的引物的上游引物序列如SEQ IDNo.2所示，所述引物的下游引物序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供一种人结直肠癌辅助诊断试剂盒，其包括检测hsa_circ_0099132的试剂。

进一步地，所述检测hsa_circ_0099132的试剂包括实时荧光定量检测hsa_circ_0099132表达量的引物。

进一步地，所述检测hsa_circ_0099132表达量的引物的上游引物序列如SEQ IDNo.2所示，所述引物的下游引物序列如SEQ ID No.3所示。

进一步地，所述试剂盒还包括特异性检测内参基因表达量的检测试剂。

进一步地，所述特异性检测内参基因表达量的检测试剂为检测GAPDH表达量的试剂。

进一步地，所述试剂盒还包括从组织或细胞中提取RNA的试剂。

进一步地，所述试剂盒还包括RNA逆转录试剂。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为实施例1中2对人结直肠癌组织和癌旁组织中差异表达的环状RNA热图；

图2为实施例1中2对人结直肠癌组织和癌旁组织中差异表达的环状RNA火山图，其中横轴表示log₂(fold-change)，纵轴表示-log₁₀(P值)，每一个点代表一个基因；平行于纵轴的两条虚线分别为X＝1和X＝-1，在X＝-1左侧的点代表下调2倍以上的基因，X＝1右侧的点代表上调2倍以上的基因；平行于横轴的虚线Y＝1.30以上的点表示表达差异具有显著性，距离虚线越远，表示差异越显著，图中主要对fold-change＞5的基因进行了标注；

图3为实施例1中hsa_circ_0003973在30对人结直肠癌及癌旁组织中相对表达情况示意图；

图4为实施例1中hsa_circ_0006870在30对人结直肠癌及癌旁组织中相对表达情况示意图；

图5为实施例1中hsa_circ_0066803在30对人结直肠癌及癌旁组织中相对表达情况示意图；

图6为实施例1中hsa_circ_0084765在30对人结直肠癌及癌旁组织中相对表达情况示意图；

图7为实施例1中hsa_circ_0099132在30对人结直肠癌及癌旁组织中相对表达情况示意图；

图8为实施例1中背靠背引物和对向引物分别扩增的目标产物的琼脂凝胶电泳图；

图9为实施例1中扩增产物的溶解曲线和扩增曲线；

图10为hsa_circ_0099132的分子特征示意图；

图11为实施例2中hsa_circ_0099132在60对人结直肠癌及癌旁组织中相对表达情况示意图；

图12为实施例2中60对结直肠癌患者癌组织中hsa_circ_0099132表达量的ROC曲线；

图13为实施例4中不同细胞株中hsa_circ_0099132的相对表达水平对比图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式进一步说明本发明。

实施例1

本实施例针对在结直肠肿瘤组织和癌旁组织中存在表达差异的环状RNA进行了筛选，并确定了以hsa_circ_0099132作为结直肠癌诊断的标志物，包括以下步骤：

1.总RNA的提取及质检

收集暨南大学附属第一医院已确诊的结直肠癌病人的癌组织及癌旁组织各2对(所有结直肠癌患者的临床组织标本采集均经患者知情同意，并经机构伦理委员会批准)，运用Magen Hipure Total RNA Mini Kit分离总RNA，Agilent法对总RNA进行质量检测。

2.环状RNA的富集和扩增

(1)取质检合格的RNA 1μg，与设计好的带有针对人/大鼠/小鼠的rRNA的探针的试剂混合，其中RNA样品中的rRNA与探针杂交形成复合链，然后用RNase H消化复合链中的rRNA，纯化；再用DNase I消化探针，纯化后得到去除rRNA的总RNA(rRNA-depleted)。

(2)对第(1)步中得到的rRNA-depleted RNA中的线性RNA末端进行polyA末端加尾实验，纯化，用RNase R消化线性RNA，纯化后得到去除单链线性RNA的RNA。

(3)使用SMARTer cDNA合成试剂盒对(2)步得到的RNA进行扩增。由于第(2)步中得到的RNA中除了环状RNA外还有非单链线性的RNA，而在polyA末端加尾实验中，除了环状RNA外，其余有线性末端的RNA都被加上polyA末端，因此本步骤中将SMART er cDNA合成试剂盒中可特异性与polyA末端结合的引物5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAG AGTACT(30)N_-1N-3'替换为5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACNNNNNN-3'以扩增不含poly(A)序列的环状RNA。其余试剂和操作方法与SMARTer cDNA合成试剂盒的常规操作方法相同，经滚环逆转录反应后得到环状RNA的cDNA。

(4)对上一步获得的cDNA进行PCR扩增反应并纯化。对纯化后的cDNA产物进行定量并对其大小范围进行检测，确认得到的cDNA得率有200ng以上，2100HS检测片段大小在200-2000bp，主峰在1000bp左右,出具cDNA的质检报告。

(5)对cDNA产物进行末端修复，完成后对产物进行纯化。

(6)对第(5)步中每个末端修复后的产物分别加上唯一编号的barcode。

(7)使用Qubit3.0对产物进行定量，根据每个样品的浓度与每个样品的数据量要求，进行相应摩尔质量的pooling。

3.获得环状RNA文库

对上一步已完成pooling的混合DNA通过纳米孔测序法进行测序，得到环状RNA文库。

4.环状RNA的差异表达分析

得到环状RNA文库后，采用edgeR的TMM(trimmed mean of M-values)方法将表达过低的环状RNA(CPM<1)进行过滤，并对剩下的环状RNA进行差异表达分析(fold-change＝1.5,p<0.05)，结果如图1、2所示，共检测到498条环状RNA存在明显的表达差异，其中314条环状RNA显著上调，184条环状RNA显著下调。

5.差异性表达的环状RNA筛选

从纳米孔测序得到的环状RNA文库中，选取差异性表达最明显的5组环状RNA，分别为：hsa_circ_0003973、hsa_circ_0006870、hsa_circ_0066803、hsa_circ_0084765、hsa_circ_0099132。

收集2021年1月至2021年12月在广州市番禺区中心医院接受结直肠癌手术切除的30例结直肠癌患者的癌组织和癌旁组织样本(每个样本均得到患者或家属的同意并签订知情同意书，并通过了广州市番禺区中心医院伦理委员会的批准)。确认患者此前未接受过新辅助化疗、放疗或其他方式的抗肿瘤治疗，所有组织已经过病理学证实。组织样品采集后立即在液氮中速冻，并置于-80℃冰箱中冻存，直至提取总RNA进行进一步实验。

在上述30例人结直肠癌组织及相对应的癌旁组织样本中对此5组环状RNA的表达差异进行验证，其结果如图3～7所示，结果显示：hsa_circ_0084765(P＝0.328，d＝1.520)不具有统计学意义；hsa_circ_0006870(P＝0.163，d＝5.244)不具有统计学意义；hsa_circ_0099132(P＝0.038，d＝2.073)具有统计学意义；hsa_circ_0003973(P＝0.215，d＝2.442)不具有统计学意义；hsa_circ_0066803(P＝0.048，d＝1.672)具有统计学意义。因此，本发明选择具有统计学意义且差异性最显著的hsa_circ_0099132作为目标基因。

6.hsa_circ_0099132分子稳定性鉴定

通过设计好的背靠背引物和对向引物对RNA进行扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示，在Rnase R存在的条件下通过背靠背引物扩增得到的目标RNA对其有抵抗力，表明目标RNA呈环形且耐受RNase R消化。

然后对扩增产物进行测序并测定其成环位点，将测序结果与Circbase数据库中的hsa_circ_0099132的序列及环化位点进行对比验证，两者的序列相一致，证明扩增产物即为hsa_circ_0099132。所述扩增产物的扩增曲线和溶解曲线如图9所示。hsa_circ_0099132的分子特征如图10所示。

实施例2

本实施例检测了hsa_circ_0099132在60例患者的结直肠肿瘤组织和癌旁组织中的表达差异，包括以下步骤：

1.样本采集

收集暨南大学附属第一医院、广州市番禺区中心医院2021年1月至2021年12月行结直肠癌切除术的患者共60例，年龄在24-85之间，其中男性41例，女性19例。标本的获取通过暨南大学附属第一医院、广州市番禺区中心医院伦理委员会的批准。收集患者的癌组织、癌旁组织及临床数据。

其中患者的纳入标准为：

(1)术前病理活检、术后冰冻病理，免疫组化均诊断为原发性结直肠恶性肿瘤，不存在其他原发恶性肿瘤。

(2)为初次诊断的恶性肿瘤，无其他恶性肿瘤病史。

(3)除高血压、糖尿病外无其他系统性疾病。

(4)术前未接受化疗、放疗、靶向治疗等相关抗肿瘤治疗。

患者的排除标准为：

(1)存在其他部位、类型的原发恶性肿。

(2)合并其他重要脏器功能障碍。

(3)术前曾接受过抗恶性肿瘤治疗。

(4)存在精神疾病及不愿合作者。

组织样品采集后立即在液氮中速冻，并置于-80℃冰箱中冻存，直至提取总RNA进行进一步实验。

2.提取组织样本中的RNA

(1)称量新鲜组织0.2g于研钵中，用液氮研磨至粉末状，加入Trizol溶液1mL，吹打混匀，充分裂解组织，静置于室温5min；

(2)加入氯仿溶液200μL，反复振荡混匀30s，静置于室温下2min；

(3)将样本置于离心机中，4℃、14000rpm/min离心，持续15min，离心结束后可见分为三层，取上层液体，移至另一个全新RNase-free EP管中；

(4)向(3)中移至全新RNase-free EP管中液体加入相同体积的异丙醇，轻柔地摇晃至充分混匀，在室温静置10min，使RNA充分沉淀；

(5)再次于4℃、14000rpm/min条件下离心10min，收集RNA沉淀，丢弃上清液；

(6)得到的样本用75％乙醇充分洗涤两次，超净台风干；加入60μL DEPC水溶解沉淀。

(7)用分光光度计测定RNA浓度。

3.cDNA逆转录

(1)根据步骤2中所测RNA浓度进行逆转录，在RNase free的PCR管中按表1配置第一链cDNA合成反应体系。

表1.逆转录反应体系

(2)将反应体系在25℃保温10min；42℃保温30min；85℃保温5s，12℃保温1min得cDNA产物。

4.荧光定量PCR反应

(1)根据hsa_circ_0099132的序列设计引物序列，其中上游引物序列如SEQ IDNo.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示。

以GAPDH为内参，GAPDH的引物序列如下：

上游引物：5’GGGAAACTGTGGCGTGAT

下游引物：5’GAGTGGGTGTCGCTGTTGA

(2)按表2配置反应试剂，设定荧光定量PCR仪的参数为95℃，5min；95℃，10s；60℃，32s，读板，40cycles；实验温度维持在60℃-95℃，设置3个复孔。

表2.实时定量PCR反应体系

(3)以GAPDH作为参比基因，采用2^-△△CT公式计算hsa_circ_0099132的相对表达量。

5.实验结果分析

根据2^-△△CT公式来计算目标基因的表达情况：相对表达量＝(2^-△△CT)的平均值±标准偏差；△△CT＝(待测样品中目的基因ΔCT-参照样品中目的基因ΔCT)的平均值±标准偏差；△CT＝(目的基因CT-内参CT)的平均值±标准偏差。设定1号样本的目标基因和内参基因CT值分别是CTa1和CTb1；2号样本的目的基因和内参基因CT值分别为CTa2和CTb2，以此类推；可以推测得到1和2号两个样本目标基因的表达水平比值可粗略计算为(2^-△△CT法)：△△CT＝(CTa2-CTb2)-(CTa1-CTb1)＝X，表明2号样本目标基因的表达水平约为1号样本的2^-X倍。

按照上述方法计算的hsa_circ_0099132在结直肠癌组织和癌旁组织中的相对表达量差异如图11所示。其中，与癌旁组织相比，在60对结直肠癌组织中的hsa_circ_0099132的表达量呈明显上调趋势，平均升高7.59倍，差异具有统计学意义(P<0.001)。

同时，为了确定hsa_circ_0099132对结直肠癌患者是否具有诊断效能，本发明对结直肠患者进行了ROC曲线分析，其结果请参考图12。结果表明，曲线下面积(AUC)为0.829，95％可信区间(CI)为[0.7566,0.9004]，敏感性为90％，特异性为63.3％，截断值为1.695，P＜0.001。因此可证实hsa_circ_0099132在人结直肠癌诊断中具有诊断效能。

实施例3

由于实施例2中部分患者临床数据缺失，本实施例针对实施例2中60例患者中的42例分析了hsa_circ_0099132在结直肠癌组织中的表达水平与患者的临床特征和病理特征之间的关系，包括：性别、年龄、肿瘤大小、是否存在淋巴结转移、是否有远处转移、TNM分期、肿瘤细胞分化程度以及患者术前外周静脉血液中的肿瘤标志物(CEA、CA19-9)，其结果如表3所示。

表3.hsa_circ_0099132的表达水平与结直肠癌患者的临床特征间的关系

如表3所示，结直肠癌组织中hsa_circ_0099132的表达水平与患者的性别(P＝0.729)、年龄(P＝0.682)、肿瘤大小(P＝0.997)、是否存在淋巴结转移(P＝0.300)、是否有远处转移(P＝0.516)、TNM分期(P＝0.444)、肿瘤细胞分化程度(P＝0.281)均无明显相关性；在肿瘤标志物的相关研究中，结直肠癌组织中hsa_circ_0099132的表达水平与患者的外周血液肿瘤标志物CA19-9(P＝0.094)、CEA(P＝0.076)无相关性。因此，hsa_circ_0099132的表达水平在人结直肠癌的诊断中具有个体差异性小的优点。

实施例4

本实施例检测了hsa_circ_0099132在4种结直肠癌细胞株，包括SW480、SW620、HCT116和LOVO，相对于人正常结直肠粘膜上皮细胞(FHC)的表达情况。

其中，所述SW480、SW620、HCT116和LOVO细胞株购自上海细胞生物学研究所，所述人正常结直肠粘膜上皮细胞(FHC)购自Procell，所有细胞系均在含10％胎牛血清的Dulbecco's改良Eagle's培养基DEME/F12中培养，培养皿置于37℃，5％CO2的潮湿培养箱中。0.25％胰蛋白酶用于细胞传代步骤。选取对数生长具有95％生存力的细胞进行进一步实验。实验包括以下步骤：

1.提取细胞样本中的RNA

(1)取1x10⁶个细胞用PBS清洗两遍，加入Trizol溶液1mL，吹打混匀，静置于室温下裂解5min；

(2)加入氯仿溶液200μL，反复振荡混匀30s，使水和有机质充分接触，静置于室温下2min；

(3)将样本置于离心机中，4℃、14000rpm/min离心，持续15min，离心结束后可见分为三层，取上层液体，移至另一个全新RNase-free EP管中；

(4)向(3)中移至全新RNase-free EP管中液体加入相同体积的异丙醇，轻柔地摇晃至充分混匀，在室温静置10min，使RNA充分沉淀；

(5)再次于4℃、14000rpm/min条件下离心10min，收集RNA沉淀，丢弃上清液；

(6)得到的样本用75％乙醇充分洗涤两次，超净台风干；加入60μL DEPC水溶解沉淀。

(7)用分光光度计测定RNA浓度。

2.本实施例后续的cDNA逆转录、荧光定量PCR反应、相对表达量计算步骤与实施例1相同。

根据2^-△△CT公式计算的hsa_circ_0099132在上述4中结直肠癌细胞株和人正常结直肠粘膜上皮细胞中的相对表达量对比如图13所示。其中，相较于人正常结直肠粘膜上皮细胞(FHC)，hsa_circ_0099132在4种结直肠癌细胞株中均呈上调性表达，4种癌细胞株中的hsa_circ_0099132表达量均高于人正常结直肠粘膜上皮细胞(FHC)，其中，以SW480细胞株中的表达量最高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，则本发明也意图包含这些改动和变形。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州市番禺区中心医院

<120> 检测hsa_circ_0099132的试剂在制备人结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 535

<212> RNA

<213> Artificial

<400> 1

guuaucuuau gaugaggcuu uugcuauggc uaaugauccc uuggaaggcu uccaugaagu 60

aaaccuugcu ucaccuacuu cuccggaccu ucuuggugug uaugaaucag gaacucaaga 120

gcagacuacc ucaccaagug ucaucuaccg gccacacccu ucagcuuuau ccucuguacc 180

uauccaggca aaugcauuag auguuucuga acuuccuaca caacccgugu auucaucccc 240

cagacguuua aauugugcgg aaauaucuag uaucagcuuu cauguuacag acccagcccc 300

uugcucuacc ucuggaguca cagcuggauu aacuaaauua acuacaagaa aggacaacua 360

uaaugcagag agagaguuuu uacagggugc uacuauaaca gaggcuugcg auggcaguga 420

ugauauuuuu ggguugagua cugauagucu gucucguuua cgaagcccau cuguuuugga 480

aguuagagaa aagggcuaug aacgauuaaa agaagaacuc gcaaaagcuc agagg 535

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

aaagggctat gaacgatt 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

acttggtgag gtagtctgct 20

Claims (10)

1.检测hsa_circ_0099132的试剂在制备人结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述hsa_circ_0099132的序列为SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测hsa_circ_0099132的试剂包括实时荧光定量检测hsa_circ_0099132表达量的引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测hsa_circ_0099132表达量的引物的上游引物序列如SEQ ID No.2所示，所述引物的下游引物序列如SEQ ID No.3所示。

4.一种人结直肠癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测hsa_circ_0099132的试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测hsa_circ_0099132的试剂包括实时荧光定量检测hsa_circ_0099132表达量的引物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测hsa_circ_0099132表达量的引物的上游引物序列如SEQ ID No.2所示，所述引物的下游引物序列如SEQ ID No.3所示。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括特异性检测内参基因表达量的检测试剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性检测内参基因表达量的检测试剂为检测GAPDH表达量的试剂。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括从组织或细胞中提取RNA的试剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA逆转录试剂。

Images