CN112662776A - 检测环状rna和/或所述环状rna表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测环状RNA和/或所述环状RNA表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用，涉及分子标志物技术领域。本发明以环状RNAhsa_circ_0006867作为一种新的结直肠癌检测分子标志物，所述标志物在结直肠癌患者癌组织中特异性下调表达，利用该分子标志物可以简单、快捷地进行结直肠癌诊断，成为结直肠癌检测诊断、病理分级、临床分期、治疗疗效判断的有效工具，具有良好的临床应用前景。本发明采用实时定量PCR测定所述环状RNAhsa_circ_0006867的表达量，不需要另行设计探针即可同时检测目的环状RNA和管家基因，对进一步研究结直肠癌相关环状RNA的生物学机制具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于分子标志物技术领域，具体涉及检测环状RNA和/或所述环状RNA表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤，结直肠癌因早期无特异性症状，发现时多半是中晚期而失去最佳治疗时间。因此早发现早治疗是提高结直肠癌治愈率的最佳途径，甚至可以达到痊愈。现有的肿瘤标志物CEA、CA19-9在结直肠癌诊断中的敏感度与特异性不高，因而寻找利于早期诊断和早期治疗的生物标志物一直是结直肠癌研究的热点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供检测环状RNA和/或所述环状RNA表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用，为结直肠癌的早期诊断和治疗效果提供了一种新型分子标志物，利用该分子标记物可以简单、快捷地进行结直肠癌诊断。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了检测环状RNA hsa_circ_0006867和/或所述环状RNA表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用，所述环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种结直肠癌的辅助诊断试剂，所述辅助诊断试剂中包括检测环状RNA hsa_circ_0006867和/或所述环状RNA表达量的特异性引物P1和P2，所述P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述辅助诊断试剂中还包括管家基因GAPDH，所述GAPDH的特异性引物包括P3和P4，所述P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了一种结直肠癌的辅助诊断试剂盒，所述诊断试剂盒中包括上述辅助诊断试剂。
本发明还提供了检测环状RNA hsa_circ_0006867和/或所述环状RNA表达量的制剂在制备判断结直肠癌治疗效果的试剂中的应用，所述环状RNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了一种判断结直肠癌治疗效果的试剂，所述试剂中包括检测环状RNA hsa_circ_0006867和/或所述环状RNA表达量的特异性引物P1和P2，所述P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了检测环状RNA hsa_circ_0006867和/或所述环状RNA表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用，以所述环状RNA hsa_circ_0006867作为一种新的结直肠癌检测分子标志物，所述标志物在结直肠癌患者癌组织中特异性下调表达，利用该分子标志物可以简单、快捷地进行结直肠癌诊断，仅需收集20mg结直肠癌组织即可检测所述环状RNA，成为结直肠癌检测诊断、病理分级、临床分期、治疗疗效判断的有效工具，具有良好的临床应用前景。本发明采用实时定量PCR测定所述环状RNA hsa_circ_0006867的表达量，荧光染料不需要另行设计探针即可同时检测目的环状RNA和管家基因，经济、方便，对进一步研究结直肠癌相关环状RNA的生物学机制具有重要意义。
附图说明
图1为正常组织和结直肠癌组织中hsa_circ_0006867和GAPDH的荧光信号曲线图；
图2为荧光定量RT-PCR验证结直肠癌组织异常表达的circ RNA，其中hsa_circ_0006867的表达在扩大标本验证实验中显著下调(P<0.001)；
图3为检测89例结直肠癌患者癌组织及其癌旁组织hsa_circ_0006867水平，而制作的ROC曲线。
具体实施方式
本发明提供了检测环状RNA hsa_circ_0006867和/或所述环状RNA表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用，所述环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明所述环状RNA hsa_circ_0006867在基因组上的定位为：chr4:151388824-151412187，相应的线性基因为LRBA(NM_001199282)，所述环状RNA的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示：ATCTTGGCATATACAGAAGGGCTGCATGGAAAATGGCTGTTCACAGAGATACGATCAATCTTTTCTCGTCGTTATCTTTTGCAAAATACAGCCCTGGAGATCTTTATGGCAAACAGAGTTGCTGTGATGTTCAACTTCCCAGACCCTGCAACAGTAAAGAAAGTGGTTAACTATCTACCTCGTGTTGGCGTTGGAACAAGTTTTGGATTGCCTCAAACCAGACGTATTTCATTAGCTAGTCCACGTCAGCTTTTTAAGGCTTCTAATATGACCCAGCGATGGCAACACAGAGAGATATCTAATTTTGAGTACTTGATGTTTCTCAACACGATAGCAGGACGGAGTTATAATGACTTAAATCAGTATCCAGTGTTTCCTTGGGTCATCACTAATTATGAATCAGAAGAACTGGATCTTACCTTGCCCACCAACTTCAGAGATTTGTCCAAG。
本发明所述环状RNA hsa_circ_0006867在结直肠癌患者的肿瘤组织中，特异性表达下调，可作为结直肠癌诊断的新型分子标志物。
本发明还提供了一种结直肠癌的辅助诊断试剂，所述辅助诊断试剂中包括检测环状RNA hsa_circ_0006867和/或所述环状RNA表达量的特异性引物P1和P2，所述P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’-TGCCCACCAACTTCAGAGAT-3’，所述P2的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示：5’-CCATTTTCCATGCAGCCCTT-3’。本发明所述辅助诊断试剂中优选还包括管家基因GAPDH，所述GAPDH的特异性引物优选包括P3和P4，所述P3的核苷酸序列优选如SEQ IDNO.4所示：5’-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’，所述P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：5’-GTGAGGGTCTCTCTCTTCCT-3’。
本发明还提供了一种结直肠癌的辅助诊断试剂盒，所述诊断试剂盒中包括上述辅助诊断试剂。本发明所述辅助诊断试剂盒中优选还包括2×QuantiNova SYBR Green PCRMaster Mix。
本发明还提供了利用上述辅助诊断试剂或上述辅助诊断试剂盒进行结直肠癌辅助诊断的方法，所述方法包括荧光定量PCR。通过所述荧光定量PCR过程中的目的基因和管家基因的Ct值，通过管家基因GAPDH的表达水平来均一化circ RNA的水平，计算得到组织中hsa_circ_0006867的相对表达水平，并使用2ΔCt公式来计算hsa_circ_0006867的PCR相对定量值，式中ΔCt＝Ct hsa_circ_0006867-Ct GAPDH；当样本中的hsa_circ_0006867生物标志物的PCR相对定量值ΔCt小于或等于9.09时，则认为是非结直肠癌样本；大于9.09时，则认为是结直肠癌样本。
本发明所述荧光定量PCR的体系以20μl计，优选包括2×QuantiNova SYBR GreenPCR Master Mix 12μl、模板1μl、引物各1.4μl和ddH2O 4.2μl。本发明所述模板优选为结直肠附件组织或结直肠癌患者的肿瘤组织提取得到的RNA经反转录后获得的cDNA。本发明对所述RNA的提取方法并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂盒法提取即可。
本发明所述荧光定量PCR的程序优选包括：95℃预变性2min；95℃变形5s，60℃退火30s，40个循环；95℃酶变性15s；60℃退火1min；4℃保温。
利用上述荧光定量PCR除用以诊断是否患有结直肠癌外，还可以用于对结直肠癌患者进行病理分级、临床分期、治疗疗效判断，且具体的方法优选与上述荧光定量PCR方法相同，在此不再赘述。
本发明还提供了检测环状RNA hsa_circ_0006867和/或所述环状RNA表达量的制剂在制备判断结直肠癌治疗效果的试剂中的应用，所述环状RNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了一种判断结直肠癌治疗效果的试剂，所述试剂中包括检测环状RNA hsa_circ_0006867和/或所述环状RNA表达量的特异性引物P1和P2，所述P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所述试剂优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的检测环状RNA和/或所述环状RNA表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例一：检测hsa_circ_0006867在结直肠癌组织和正常结直肠组织中的表达情况
1、芯片分析：采用上海康成生物公司Arraystar Human circ RNA Array(6×7K)芯片检测结直肠癌组织和正常组织中circ RNA的水平。
2、芯片结果：hsa_circ_0006867在结直肠癌组织和正常组织中二者差异达17.44倍，提示hsa_circ_0006867在结直肠癌中可能作为一个抑癌基因发挥作用。
实施例2
采集正常结直肠组织作为正常对照组，按照如下步骤进行环状RNA的检测，包括以下步骤：
a.收集组织：结直肠癌组织收集在加入了RNA保存液的无菌冻存管中，不及时使用时存放在-80℃超低温冰箱中；
b.释放RNA：称取约20mg组织放置于2ml离心管中，置于冰上加入1ml TRIzol。使用手持式自动匀浆机将组织充分匀浆至无固体，室温静置10min，使组织中的RNA充分释放至溶液中；
c.氯仿提取：加入0.2ml三氯甲烷，涡旋震荡混匀，室温静置10min；4℃下，13000rpm离心10min，此时液体分层，其中上层水相中富集了RNA，小心吸取上层水相至1.5ml RNase-free离心管中；
d.异丙醇沉淀：加入等体积异丙醇，涡旋震荡混匀，4℃下静置30min，12000rpm在4℃下离心10min，弃上清；
e.乙醇洗涤：加入1ml 75％的乙醇，混匀，12000rpm在4℃下离心5min，弃上清，弃尽上清，采取先倾倒，再用移液枪吸取，最后放置干燥的方法，最后加入适量RNase-free水溶解沉淀，即为组织中总RNA提取液，-80℃保存备用，经检测OD260/OD280比值均在1.8到2.0之间，且浓度为530～1093ng/uL；
f.RNA逆转录：使用逆转录试剂盒对上述步骤e提取出的RNA进行逆转录，得到cDNA，保存于-20℃备用；
g.荧光染料法实时定量PCR检测：将上述步骤f获得的cDNA配制反应体系，进行荧光定量PCR。
20μl荧光定量PCR体系：2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix 12μl、模板1μl、引物各1.4μl和ddH2O 4.2μl。
程序：95℃预变性2min；95℃变形5s，60℃退火30s，40个循环；95℃酶变性15s；60℃退火1min；4℃保温。
结果如图1所示，正常组织和结直肠癌组织中hsa_circ_0006867和GAPDH均得到有效扩增。由公式ΔCt＝Cthsa_circ_0006867-Ct GAPDH可得出正常组织的ΔCt＝4.43；结直肠癌组织的ΔCt＝12.62，明显大于正常组织的ΔCt值，说明结直肠癌组织中hsa_circ_0006867表达量低于正常结直肠组织中的表达量，与基因芯片的结果应该是一致的。
实施例3：应用hsa_circ_0006867生物标志物进行结直肠癌检测
1、收集组织样本；
2、结直肠癌组织中环状RNA的提取(提取方法如同实施例2)；
3、反转录和荧光定量PCR反应如同按照实施例2中的“反转录和荧光定量反应”进行操作；
4、以hsa_circ_0006867作为结直肠癌检测的生物标志物，分析89例结直肠癌患者癌组织与其癌旁组织中hsa_circ_0006867的表达水平。结直肠癌患者组hsa_circ_0006867的ΔCt明显高于正常组，P<0.01，证明其hsa_circ_0006867的表达水平明显低于正常组，如图2所示。hsa_circ_0006867作为结直肠癌标志物的截断值为9.09，当样本中的hsa_circ_0006867生物标志物的PCR相对定量值ΔCt小于或等于9.09时，则认为是非结直肠癌样本；大于9.09时，则认为是结直肠癌样本。
检测89例结直肠癌患者结直肠癌组织及其癌旁组织hsa_circ_0006867水平，制作ROC曲线，如图3所示，AUC值为0.980，P<0.001。表1为hsa_circ_0006867为生物标志物进行结直肠癌诊断的结果，可得出hsa_circ_0006867作为结直肠癌标记物的灵敏度为93.3％，特异度为97.8％。
表1 hsa_circ_0006867为生物标志物进行结直肠癌诊断的结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东医科大学
<120> 检测环状RNA和/或所述环状RNA表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 450
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
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Claims (6)
1.检测环状RNAhsa_circ_0006867和/或所述环状RNA表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用，其特征在于，所述环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种结直肠癌的辅助诊断试剂，其特征在于，所述辅助诊断试剂中包括检测环状RNAhsa_circ_0006867和/或所述环状RNA表达量的特异性引物P1和P2，所述P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述辅助诊断试剂，其特征在于，所述辅助诊断试剂中还包括管家基因GAPDH，所述GAPDH的特异性引物包括P3和P4，所述P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.一种结直肠癌的辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒中包括权利要求2或3所述辅助诊断试剂。
5.检测环状RNAhsa_circ_0006867和/或所述环状RNA表达量的制剂在制备判断结直肠癌治疗效果的试剂中的应用，其特征在于，所述环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.一种判断结直肠癌治疗效果的试剂，其特征在于，所述试剂中包括检测环状RNAhsa_circ_0006867和/或所述环状RNA表达量的特异性引物P1和P2，所述P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
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