CN108949985A - circ-WHSC1作为结直肠癌诊断标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了环状RNA WHSC1在制备结直肠癌肿瘤发生以及肝转移疾病中临床诊断标志物的应用。本发明还公开了一种环状RNA WHSC1在作为结直肠癌药物治疗靶点中的应用。本发明进一步公开了一种治疗结直肠癌的制剂，包括特异性干扰环状RNA WHSC1的序列，该序列用于抑制所述环状RNA WHSC1的水平。本发明研究结果表明circ‑WHSC1在诊断结直肠癌发生以及转移中的重要临床意义，以及在制备用于治疗结直肠癌转移药物中的用途。

Description

circ-WHSC1作为结直肠癌诊断标志物及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤标志物医学技术领域，尤其涉及circ-WHSC1作为结直肠癌诊断标志物 及其应用。

背景技术

随着人们生活饮食习惯和工作居住环境的改变，结直肠肿瘤(CRC)的发病率和死亡率 在全球呈逐年递增趋势。CRC早期起病隐匿，较缺乏特异的临床表现，因此患者到医院就医 时大部分都已发生了转移。肝脏是CRC远端转移最主要的靶器官，CRC患者发生肝转移是 最主要的死亡原因，发生肝转移后5年生存率显著下降。在临床上若能早期发现、诊断CRC 及其肝转移，能及时且合理地行根治性手术在内的综合治疗，能够极大的提高CRC患者的生 存率、生存质量和延长生存时间。因此，深入进行CRC肝转移相关基因、分子及信号传导通 路的研究具有十分重要的临床意义。

环状RNA(circRNA)是由pre-RNA经反向剪接后形成的，它们与普通的线性RNA不同，是一类由5’帽子端和3’尾端以共价键结合的环状闭合结构RNA，由于其具有很高的组织特异性和稳定性而逐渐被人们关注。目前研究最多的是外显子环状RNA，已经有报道指出它们参与调控包括心血管疾病、系统性红斑狼疮、神经系统性疾病和肿瘤等多种人类基本病理 过程。越来越多的证据表明环状RNA参与调控多种肿瘤的发生，促进肿瘤细胞的增殖、调节 细胞周期进程等，也有一些环状RNA参与调控肿瘤的转移。总体而言，进一步研究circRNA 在结直肠肿瘤特别是结直肠肿瘤转移中的作用，对于结直肠癌的早期诊断以及肝转移的诊断 和预后都具有重要的帮助。目前关于结直肠癌的诊断标志物大多为线性基因，申请号为 2017108397037的中国专利报道了一种环状RNA作为结直肠癌诊断生物标志物的应用，但目 前关于circ-WHSC1作为结直肠癌发生及其肝转移的环状RNA诊断标志物尚未见报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供circ-WHSC1作为结直肠癌诊断标志物及其 应用，本发明公开了一种新的结直肠癌诊断标志物，能够明确清楚地表征结直肠肿瘤疾病的 发生，该标志物在小鼠结直肠癌肝转移模型中的肝转移灶肿瘤中表达显著高于对照肿瘤；并 且，在人临床结直肠癌组织中也呈现特异性高表达现象。

本发明的第一个目的是提供一种结直肠癌诊断生物标志物，其为环状RNA WHSC1(circ-WHSC1)，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

circ-WHSC1为线性WHSC1(又可称为NSD2，组蛋白甲基转移酶)第1-2号外显子剪切后所形成的环状RNA，circ-WHSC1在人基因组上的定位为：chr4:1902352-1906105+，相应的线性基因为WHSC1(NM_133334)，环化序列有789个碱基，包含2个外显子。

进一步地，结直肠癌诊断生物标志物用于诊断结直肠癌发生和/或结直肠癌肝转移。

本发明的第二个目的是公开上述结直肠癌诊断生物标志物在制备结直肠癌诊断产品中的 应用。

进一步地，产品选自制剂、芯片或试剂盒。

进一步地，产品包括特异性识别环状RNA WHSC1的引物对。

进一步地，引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所 示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明的第三个目的是公开一种结直肠癌药物治疗靶点，其为环状RNA WHSC1，核苷 酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的第四个目的是公开一种治疗结直肠癌的制剂，包括特异性干扰环状RNAWHSC1的序列，该序列用于抑制环状RNA WHSC1的水平。

进一步地，特异性干扰环状RNA WHSC1的序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4-6中的任 一中或几种所示。

进一步地，制剂用于治疗结直肠癌发生和/或转移。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明首次发现circ-WHSC1可作为结直肠癌诊断生物标志物或药物治疗靶点，其在结 直肠癌肿瘤中呈特异性高表达现象，而在正常组织中没有这种特异性高表达现象；通过检测 受试者体内的circ-WHSC1表达，可以快速、准确及清楚的确定结直肠癌的发生及转移。另 外，本发明的结果还表明干扰circ-WHSC1的化合物可以抑制结直肠肿瘤的生长和转移，为 临床治疗结直肠肿瘤提供了新的靶点。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依 照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是circ-WHSC1的结构示意图；

图2是小鼠结直肠癌肝转移模型全转录测序结果分析的热图；

图3是小鼠组织中circ-WHSC1的Sanger测序图；

图4是小鼠结直肠癌肝转移模型中肝转移灶肿瘤和原位肿瘤中circ-WHSC1水平的柱状 图；

图5是人结直肠癌细胞系中circ-WHSC1的Sanger测序图；

图6是50对人临床结直肠癌组织及其癌旁组织的新鲜标本中circ-WHSC1水平的散点图；

图7是50例人临床结直肠癌组织新鲜标本中circ-WHSC1水平的散点图；

图8是稳定过表达circ-WHSC1的结直肠癌细胞裸鼠皮下瘤模型的肿瘤体积测量图；

图9是图6裸鼠皮下瘤实验结束时的大体照片及肿瘤取出后的照片；

图10是稳定过表达circ-WHSC1的结直肠肿瘤细胞裸鼠肺转移模型的大体照片及肺重体 重比结果；

图11是对图9肺脏的HE染色结果；

图12是干扰circ-WHSC1后的结直肠癌稳定株裸鼠皮下瘤体积测量结果图；

图13是图12实验的裸鼠大体照片及肿瘤取出后的照片；

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于 说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1circ-WHSC1的鉴定及其在临床结直肠癌标本中的检测

利用小鼠结直肠癌肝转移动物模型获得了原位肿瘤以及肝转移灶肿瘤，进行全转录组测 序，具体方法如下：

购买4-6周的C57小鼠，麻醉后将1×10⁶小鼠结直肠癌细胞(CMT-93)注射在小鼠结直肠粘膜下，8-10周后处死小鼠；收集原位肿瘤和肝转移灶的肿瘤；送其中3对样品进行全转录组测序。如图1-4所示，图1为环状circ-WHSC1的结构示意图；图2的黑色框中的环状 即为circ-WHSC1；图3为小鼠组织中circ-WHSC1的Sanger测序图，图中，箭头下方的AAAG 和TGTT表示结合位点，结果表明，circ-WHSC1在小鼠组织中的确存在，并且在小鼠肝转移 灶肿瘤中的水平显著高于原位肿瘤(图4)，提示环状RNAcirc-WHSC1在结直肠癌肝转移中 的重要作用。

然后对人结直肠癌细胞中的对应环状RNA进行了鉴定和检测，结果如图5所示，结果显 示在人的结直肠癌细胞中也存在这个环状RNA。

收集人临床结直肠癌新鲜标本进行检测(样本数n＝50)，如图6所示，circ-WHSC1在结 直肠癌组织中的水平显著高于其对应的癌旁组织，并且发生转移的患者组织中含量要显著高 于未发生转移的患者。将这50例肿瘤标本中circ-WHSC1水平按照肿瘤病理分析进行统计， 结果发现circ-WHSC1水平随着肿瘤分期的增高表达增加。

以上结果都提示circ-WHSC1(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示， hsa_circ_0008460|chr4:1902352-1906105+|NM_133334|WHSC1)可作为结直肠癌发生和转移的 诊断标志物。并且可将上述结直肠癌诊断生物标志物制备成结直肠癌诊断产品，产品选自制剂、芯片或试剂盒。产品中包括特异性识别环状RNA WHSC1的引物对，包括上游引物和下 游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

作为优选实施例，上游引物序列如下(SEQ ID No.2)：

Circ-WHSC1上游引物:TGATTTGGTGTGGTCCAAAG

下游引物序列如下(SEQ ID No.3)：

Circ-WHSC1下游引物:ATTTCTGGTGCCTGCTTCAT

实施例2circ-WHSC1的水平直接影响结直肠癌肿瘤生长和转移

1、稳定细胞株的构建：

过表达质粒(pLCDH-circ-WHSC1)和siRNA由广州吉赛公司进行构建，在顺转鉴定无 误后分别进行重包装和构建得到慢病毒(10⁷和10⁹)。进行感染前一天，将10万肠癌细胞种 在p35培养皿板中，次日进行慢病毒感染(MOI＝50)，同时加入5μg/mLpolybrene(聚凝胺) 以增强感染效率。感染48小时后换液，继续培养24小时使慢病毒的基因组充分整合入肠癌 细胞基因组中。待细胞铺板率达到90％时进行传代，同时在培养基中添加5μg/mL嘌呤霉素 以筛选被稳定感染的细胞，筛选时应保持细胞的密度不超过50％。至少筛选2周。

siRNA可使用以下序列：

si-circ-WHSC1_001:TACCAAACTTAAAGTGTTC(SEQ ID No.4)；

si-circ-WHSC1_002:CCAAACTTAAAGTGTTCTA(SEQ ID No.5)；

si-circ-WHSC1_003:AAAGTGTTCTAAGAACGGA(SEQ ID No.6)。

2、实验方法：

运用构建的稳定细胞株(对照载体过表达的稳定株细胞以及circ-WHSC1过表达的结直 肠癌稳定株)进行裸鼠皮下荷瘤实验，每隔1天测量皮下瘤的最大径和最小径，检测1个月 内肿瘤体积变化；尾静脉注射肺转移模型观察肺和肝组织的形态、病理变化，HE染色观察结 直肠癌肺转移和肝转移的情况。

3、实验结果

如图7所示，circ-WHSC1升高后显著促进结直肠癌肿瘤的体内增殖速度。

图8是稳定过表达circ-WHSC1的结直肠癌细胞裸鼠皮下瘤模型的肿瘤体积测量图；图 中，pLCDH表示对照载体过表达的稳定株细胞，circ-WHSC1表示目的环状RNA过表达的结 直肠癌稳定株，结果表明circ-WHSC1过表达后，结直肠癌细胞体内生长速度显著升高。

如图9为小鼠处死后皮下瘤实验的大体照片(图9a)及肿瘤取出后的照片(图9b)，图 9a中同一小鼠左侧箭头所指肿瘤为pLCDH稳定株形成的肿瘤，右侧箭头所指处为 circ-WHSC1稳定株形成的肿瘤，结果显示circ-WHSC1稳定升高后结直肠癌细胞在体内形成 的肿瘤体积显著大于对照组(pLCDH)细胞；

图10是稳定过表达circ-WHSC1的结直肠肿瘤细胞裸鼠肺转移模型的大体照片(图9a) 及肺重体重比结果(图9b)。

图11为对图10的肺脏的HE染色结果，结果显示circ-WHSC1升高后的结直肠癌细胞更 容易转移至肺脏；表1为图11中，不同实验组肿瘤数目和肿瘤面积测试结果：

表1不同实验组肿瘤数目和肿瘤面积测试结果

	肿瘤数目/只	肿瘤面积(mm3)
			pLCDH(n＝3)	3	0.159
circ-WHSC1(n＝3)	5.75	1.456

如图12为干扰circ-WHSC1稳定株的后的结直肠癌稳定株裸鼠皮下瘤体积测量结果图， 图中LV3表示对照组细胞，sh-circ-WHSC1#1和sh-circ-WHSC1#2表示针对不同位点的 circ-WHSC1慢病毒干扰序列构建的稳定株细胞。图13为图12实验的裸鼠大体照片(13a)及肿瘤取出后的照片(13b)，图13a中，每个小鼠左侧为对照组稳定株，右侧为干扰circ-WHSC1 的稳定株，结果发现如果能敲低circ-WHSC1的水平，结直肠癌肿瘤细胞的生长速度会得到 显著的抑制。并且实验过程中，未见有明显不良反应，因此干扰circ-WHSC1的化合物或序 列有望开发成新一代安全有效，防治结肠癌发生及恶化的新药。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型， 这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种结直肠癌诊断生物标志物，其特征在于：其为环状RNA WHSC1，核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的结直肠癌诊断生物标志物，其特征在于：所述结直肠癌诊断生物标志物用于诊断结直肠癌发生和/或转移。

3.权利要求1所述的结直肠癌诊断生物标志物在制备结直肠癌诊断产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述产品选自制剂、芯片或试剂盒。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述产品包括特异性识别环状RNA WHSC1的引物对。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

7.一种结直肠癌药物治疗靶点，其特征在于：其为环状RNA WHSC1，核苷酸序列如SEQID No.1所示。

8.一种治疗结直肠癌的制剂，其特征在于：包括特异性干扰环状RNA WHSC1的序列，该序列用于抑制所述环状RNA WHSC1的水平。

9.根据权利要求8所述的治疗结直肠癌的制剂，其特征在于：所述特异性干扰环状RNAWHSC1的序列的核苷酸序列如SEQ ID No.4-6中的任一中或几种所示。

10.根据权利要求8所述的治疗结直肠癌的制剂，其特征在于：所述制剂用于治疗结直肠癌发生和/或转移。