CN103468799B - Eif5a2在制备治疗食管鳞状细胞癌制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了EIF5A2在制备食管鳞状细胞癌预后诊断试剂中的应用。实时定量PCR检测数据表明，EIF5A2在食管鳞癌组织中的表达显著高于相应的非肿瘤组织。免疫组化数据分析结果显示：EIF5A2表达与淋巴结转移，肿瘤浸润深度和肿瘤分期正相关。Kaplan-Meier分析显示EIF5A2过表达的病人总体生存率较差(P<0.001)。多变量分析也证明EIF5A2是独立的预后因子。EIF5A2在食管鳞癌的侵袭和转移中可能发挥重要作用。进一步的实验数据证明，EIF5A2的过表达可由基因扩增和缺氧导致；EIF5A2可以结合到HIF1α的启动子区域，上调HIF1α的表达；EIF5A2可以诱导上皮间质化转换，促进食管鳞癌的血管形成，进而促进食管鳞癌的侵袭与转移。敲除EIF5A2能显著抑制肿瘤细胞迁移，沉默EIF5A2有望成为食管鳞癌治疗的潜在靶点。

Description

EIF5A2在制备治疗食管鳞状细胞癌制剂中的应用

技术领域

本发明涉及EIF5A2的新应用，特别涉及EIF5A2在制备食管鳞状细胞癌的预后诊断试剂中的应用。

背景技术

食管鳞状细胞癌是世界上肿瘤发病率排名第七，致死率排名第五的常见恶性肿瘤。食管切除术是早期食管癌患者有力的根治性治疗。然而，大多数患者症状显现时局部肿瘤已进展到晚期，并且20-30%已发生远处转移。转移是食管癌致死的主要原因，因此确定其具体机制显得重要而又迫切。像其他实体肿瘤一样，食管癌的发病机理是一个涉及多基因改变的长期过程。

真核细胞翻译起始因子5A2(EIF5A2)是EIF5A家族中高度进化保守的基因之一。EIF5A2作为可能的癌基因在多种人类上皮源性肿瘤内呈高表达，并与肿瘤的分期和/或预后不佳相关。EIF5A2通过多种机制诱导肿瘤发生上皮间质转化进而促进肿瘤侵袭转移。EIF5A-MTA1/C-MYC轴可能是上皮源性肿瘤发生侵袭转移的重要调控通路之一。相关分子机制尚需进一步研究（孟庆彬， 于健春， 马志强. EIF5A2 在肿瘤中的作用研究进展[J]. 基础医学与临床， 2013， 33(001): 123-125.）。EIF5A2的过度表达与结直肠癌和肝癌的转移有关，并且提示了卵巢癌、肺癌、膀胱癌的不良预后。在肝细胞癌中，过度表达的EIF5A2可通过介导上皮间质化转换而促进肿瘤的侵袭和转移，这些过度表达的EIF5A2主要在侵犯周围组织的肿瘤细胞中检测到。尽管EIF5A2可以促进肝癌与结直肠癌细胞的运动能力，但是目前关于EIF5A2 促进肿瘤转移的确切机制尚进展甚微。

现有研究中，EIF5A2与食管鳞状细胞癌预后之后的关系尚未明确。Kim D H， MutoM， Kuwahara Y， et al. Array-based comparative genomic hybridization ofcirculating esophageal tumor cells [J]. Oncology reports， 2006， 16(5): 1053-1059.中指出，EIF5A2在食管鳞状细胞癌细胞中的表达量的升高有限，不到0.6倍，不适用于作为该肿瘤预后的生物标记物。

发明内容

本发明的目的在于提供EIF5A2在制备食管鳞状细胞癌的预后诊断试剂中的应用。

本发明的另一个目的在于提供一种治疗食管鳞状细胞癌的制剂。

本发明所采取的技术方案是：

EIF5A2在制备食管鳞状细胞癌的预后诊断试剂中的应用，EIF5A2高表达表明预后差，EIF5A2高表达的定义为：荧光定量PCR法：癌组织中EIF5A2的表达量超过癌旁非肿瘤组织的2.5倍；免疫组化检测法：肿瘤组织中染色深度×染色面积高于癌旁非肿瘤组织。

一种治疗食管鳞状细胞癌的制剂，含有可以减少EIF5A2的表达量的起效因子。

优选的，起效因子选自可使EIF5A2表达量下降的shRNA、siRNA。

特别的，shRNA的序列为

sh2：

top strand：5'-CACCGAGGACGACCATGCAAAATACGAATATTTTGCATGGTCGTCC-3'（SEQID NO：1）；

bottom strand：5'-AAAAGGACGACCATGCAAAATATTCGTATTTTGCATGGTCGTCCTC-3'（SEQ ID NO：2）

或sh4：

top strand：5'-CACCGCATTCAAGATGGTTACCTTCGAAAAGGTAACCATCTTGAATG-3'（SEQID NO：3）

bottom strand：5'-AAAACATTCAAGATGGTTACCTTTTCGAAGGTAACCATCTTGAATGC-3'（SEQ ID NO：4）。

本发明的有益效果是：

发明人通过实时定量PCR 检测了71例食管鳞状细胞癌病例中肿瘤和与相应的非肿瘤组织中EIF5A2的表达差异。EIF5A2在食管鳞癌组织中的表达显著高于相应的非肿瘤组织（P = 0.05）。与相应的非肿瘤组织相比，在31/71 (43.66%)食管鳞癌病例中检查到EIF5A2的过表达。232例资料完整的食管鳞癌病例的免疫组化数据分析结果显示：EIF5A2表达与淋巴结转移(P<0.001)，肿瘤浸润深度(P=0.037)和肿瘤分期(P=0.001)正相关。Kaplan-Meier分析显示EIF5A2过表达的病人总体生存率较差(P<0.001)。多变量分析也证明EIF5A2是独立的预后因子。这些结果表明：EIF5A2在食管鳞癌的侵袭和转移中可能发挥重要作用。

进一步的实验数据证明，EIF5A2的过表达可由基因扩增和缺氧导致；EIF5A2可以可以结合到HIF1α的启动子区域，上调HIF1α的表达；EIF5A2可以诱导上皮间质化转换，促进食管鳞癌的血管形成，进而促进食管鳞癌的侵袭与转移。敲除EIF5A2能显著抑制肿瘤细胞迁移，沉默EIF5A2有望成为食管鳞癌治疗的潜在靶点。

附图说明

图1，EIF5A2 在食管鳞癌中的过表达情况；

图2，EIF5A2的表达可被缺氧诱导并且EIF5A2可以上调HIF1α；

图3，EIF5A2可直接调控HIF1α的表达；

图4，沉默 EIF5A2能降低细胞运动能力；

图5，EIF5A2促进肿瘤转移和血管形成；

图6，敲除EIF5A2具有潜在治疗价值；

图7，细胞角蛋白免疫组化染色结果图。

具体实施方式

材料和方法

原发肿瘤组织，组织芯片与免疫组化

食管鳞癌病例是从林州肿瘤医院外科病理档案室中连续挑选的（河南，中国）。在这项研究中，所有病例都没有接受过术前放化疗。组织芯片（TMA）是根据现有技术构建。研究用人体组织经过中山大学涉及人体受试者研究的伦理审查委员会审查和批准。免疫组化染色（IHC）使用标准的免疫化学细染色方法进行。

原位杂交免疫荧光

EIF5A2基因和3号染色体着丝粒分别用红色和绿色探针标记。原位杂交免疫荧光按照之前描述进行操作⁹。

亚细胞结构分离

根据厂家说明书，使用NucBuster蛋白提取试剂盒分离出胞浆蛋白与胞核蛋白。

EIF5A2 与HIF1α的相互作用

EIF5A2 与HIF1α的相互作用机制是通过荧光素酶试验与染色体免疫共沉淀试验研究的。

体外迁移试验

将重悬于无血清培养基的细胞种植于内置8微米膜滤器小室中。细胞被含10%胎牛血清的培养基所吸引。30小时后，细胞被固定、染色、计数。侵袭实验中，膜滤器为一层基质胶覆盖。重复3次独立实验。

体内转移试验

所有的动物实验均根据对动物保健委员会的指导方针并且经中山大学批准进行。此次研究中使用的是四～六周龄的BALB/c裸鼠。动物根据血行转移组、淋巴结转移组、对照组随机分为三组。注射前2天，使用感染复数为150的腺病毒和对照载体（Ad LacZ）分别对细胞进行感染。经尾静脉向动物体内注射重悬于PBS中的6×10⁵个细胞，或经皮下足垫注射重悬于PBS中的1.5×10⁵个细胞。45天后处死所有动物。对肺和肝脏进行检查。对肝脏表面的肿瘤转移灶进行计数。将腹股沟淋巴结分离并用10%福尔马林固定。

微血管计数

微血管计数是使用CD34抗体对切片进行免疫组化染色后分析的。血管的最高值是在20倍物镜下计数的。

分子治疗实验

由于KYSE180细胞优良的成瘤性，用它来做裸鼠成瘤。在治疗实验中，应用了两步 成瘤法。首先，把KYSE180细胞接种到小鼠皮下。当肿瘤直径长到约8毫米时，将肿瘤分离并 切成约1×1毫米碎块，然后把它们再种植到裸鼠皮下。当肿瘤直径达到5～6毫米，动物分组 如下：PBS组，多西紫杉醇组（TXT），腺病毒EIF5A2-sh2 组，多西紫杉醇 +腺病毒EIF5A2- sh2；或PBS组，顺铂组，顺铂+腺病毒EIF5A2-sh2组，与顺铂+腺病毒EIF5A2-sh4组。瘤内注射 腺病毒（1×109 IFU /每个肿瘤），每周一次，连续四周。腺病毒剂量根据预实验结果制定。 多西紫杉醇用法为：腹腔注射，0.311毫克/只/次（用量根据于40 mg/体表面积计算），每周 一次，连续3周。顺铂用法为：0.2毫克/只/次。每两周测量一次肿瘤体积来检测肿瘤生长情 况。最后一次腺病毒注射后，处死动物，对肿瘤重量进行测量。实验中所用的shRNA序列如 下：⁹

sh2
		top strand	5'-CACCGAGGACGACCATGCAAAATACGAATATTTTGCATGGTCGTCC-3'
bottom strand	5'-AAAAGGACGACCATGCAAAATATTCGTATTTTGCATGGTCGTCCTC-3'
		sh4
top strand	5'-CACCGCATTCAAGATGGTTACCTTCGAAAAGGTAACCATCTTGAATG-3'
		bottom strand	5'-AAAACATTCAAGATGGTTACCTTTTCGAAGGTAACCATCTTGAATGC-3'

数据分析

数据用均数±标准误表示。EIF5A2表达与食管鳞状细胞癌病人临床病理特征之间的关系采用皮尔森 卡方检验。生存曲线根据Kaplan-Meier方法描绘。数据分析采用log-rank检验。多重回归分析模型被用于鉴定独立预后因素。所有的数据分析都通过SPSS软件完成。

实验结果：

EIF5A2在食管鳞状细胞癌中常常过表达

用实时定量PCR 检测了71例食管鳞状细胞癌病例中肿瘤和与相应的非肿瘤组织中EIF5A2的表达差异。实验结果如图1所示。图中，(A)采用实时定量PCR比较71对食管鳞癌病例中肿瘤及相应非肿瘤组织之间 EIF5A2 的表达差异 (**， P=0.05)。 (B) 与永生化食管上皮细胞系NE1相比，采用免疫印迹分析在所有被测细胞系中（KYSE510除外）检测到EIF5A2的过表达。(C) 两对食管鳞癌病例EIF5A2 免疫组化染色的代表图(原始放大倍数，100×)。 (D) Kaplan-Meier 分析显示伴有EIF5A2 过表达的食管鳞癌病人总体生存率较差(P<0.001)。

由图1可知，EIF5A2在食管鳞癌组织中的表达显著高于相应的非肿瘤组织（P =0.05）。与相应的非肿瘤组织相比，在31/71 (43.66%)食管鳞癌病例中检查到EIF5A2的过表达（增加>2.5倍定义为过表达）（图1A）。与永生化食管上皮细胞系NE1相比，免疫印迹分析表明: EIF5A2在除KYSE510细胞系外的绝大多数食管鳞癌细胞系表达增加（图1B）。使用EIF5A2的单克隆抗体对包含300对样本（肿瘤与非肿瘤配对）的组织芯片进行了免疫组化染色。有效IHC数据来自232个肿瘤组织和215例非肿瘤组织。EIF5A2阳性率在肿瘤组织和非肿瘤组织中分别为95 / 232（40.95%）和 36/215（16.74%）（P＜0.001，Fisher精确检验；图1C）。位于肿瘤组织边缘的肿瘤细胞EIF5A2的表达较高（图1C）。

食管鳞癌中EIF5A2过表达的临床意义

使用232例资料完整的食管鳞癌病例的免疫组化数据分析了 EIF5A2过表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征之间的关系。结果显示：EIF5A2表达与淋巴结转移(P<0.001)，肿瘤浸润深度(P=0.037)和肿瘤分期(P=0.001；表1)正相关。

表1：EIF5A2表达与原发食管鳞状细胞癌病理特征之间的联系

统计分析应用了皮尔逊卡方检验。当P＜0.05时，视为有显著差异。

Kaplan-Meier分析显示EIF5A2过表达的病人总体生存率较差(P<0.001；图 1D)。多变量分析也证明EIF5A2是独立的预后因子(表2)。

表2：食管鳞癌病人不同诊断参数的单变量和多变量分析

*Cox 回归模型；HR， 相对危险度；CI， 置信区间。

采用实时定量PCR 研究了EIF5A2过表达与临床病理特征之间的关系并汇总在表3中。这些结果表明：EIF5A2在食管鳞癌的侵袭和转移中可能发挥重要作用。

表3：EIF5A2表达原发食管鳞癌临床病理特征之间的关系（实时定量PCR样本）

注:在71对食管鳞癌组织中，同样分析了EIF5A2过表达和临床病理特征之间的联系。结果显示：在13/41 (31.7% )不伴淋巴结转移的病例中观察到了EIF5A2的过度表达，与此相比，这一比例在伴有淋巴结转移的病例中为18/30 (60.0%) (P=0.029)。

EIF5A2的过表达可由基因扩增和缺氧导致

由于在食管鳞癌中EIF5A2所在位点3q26经常发生扩增，采用FISH检测食管鳞癌中EIF5A2基因拷贝数来研究 EIF5A2过表达与基因扩增之间的关系（图2A，一个食管鳞癌病例显示EIF5A2扩增 的FISH代表图EIF5A2 (红色)；3号染色体着丝粒 (绿色)；核 (蓝色)）。结果显示： 65/223 (29.15%)病例中检测到了 EIF5A2 拷贝数增加。在同时拥有FISH和IHC数据的190个病例中，双变量分析显示： EIF5A2 的过表达与基因扩增显著相关(P=0.041)。然而在EIF5A2过表达（IHC阳性）的74例病例中，只有26例检测到了基因扩增，这提示存在着其他导致EIF5A2过表达的机制。

鉴于酵母TIF51B的表达可由缺氧诱导，发明采用了实时定量PCR检测了五个细胞系在正常氧压（20% O₂）和缺氧情况下（1%O₂）EIF5A2 mRNA水平，三次独立实验结果用均数±标准误表示 (**， P<0.01)。结果显示：与正常氧压下相比，缺氧应激下所有细胞系中EIF5A2的表达增加了4到8倍不等(P<0.01)（图2B）。免疫印迹分析确认了缺氧处理后EIF5A2的表达增长(图2C)，这些结果显示EIF5A2的表达可被缺氧诱导。

EIF5A2可以上调HIF1α的表达

随后通过检测3个食管鳞癌细胞系 (KYSE140， KYSE410 and EC18)瞬时转染EIF5A2后HIF1α的mRNA水平研究了EIF5A2与HIF1α之间的关系。结果显示：正常氧压下，不同细胞系的HIF1α mRNA水平增加了1.5到2.5倍不等（图2D）。为确认 EIF5A2可以调控HIF1α，应用两种携带有靶向干扰EIF5A2的shRNA（sh2 and sh4）的腺病毒沉默了这三个细胞系中EIF5A2的基础表达。与增强表达结果一致，当EIF5A2被沉默以后，HIF1α mRNA水平出现骤降（图2D)。 还在食管鳞癌细胞系KYSE510建立了EIF5A2的稳转株。实时定量PCR和免疫印迹证明：过表达EIF5A2可以上调HIF1α（图2E）。正如预期的那样，转染了EIF5A2的细胞即使在正常氧压下也检测到了HIF1α的表达。在缺氧情况下，与对照组细胞相比，转染了 EIF5A2的细胞的HIF1α表达明显升高。为证实EIF5A2所诱导的HIF1α具有功能活性，采用 qRT-PCR检测了转染EIF5A2组和对照组细胞之间四种已被报道过的受HIF1α调节的基因的表达水平。结果显示：所有被检测的4种基因在实验组细胞中表达均显著高于对照组 (P < 0.05)（图2F）。

EIF5A2可以结合到HIF1α的启动子区域

为了进一步验证EIF5A2 是否可以调节HIF1α的转录活性，围绕推定的HIF1α启动子（NM_001243084.1）区域的三个片段（F1：-2000~+143 bp；F2：-1500~+143 bp；F3：-1000~+43 bp的）被插入到 pGL3-基本报告质粒上的荧光素酶编码序列的上游（图3A），然后将每个片段与空载质粒或EIF5A2质粒(pcDNA3.1-EIF5A2)共转染到KYSE510 细胞。发现与F1片段共转染的EIF5A2显著增加了HIF1α的转录活性(P<0.005；图 3A)，说明EIF5A2有可能是通过与HIF1α启动子区的 -2000~-1500bp 结合而调控HIF1α的转录活性。为了证实这个结论，设计了三对位于HIF1α启动子区不同区域的引物(P1: -1900~-1777bp；P2: -1781~-1610bp；P3: -420~-291bp)(图 3A)。接着在经20%或1% O₂ 处理过24h的KYSE140细胞中用这三对引物做了染色体免疫共沉淀试验。ChIP试验证明：缺氧应激下，EIF5A2抗体结合并沉淀的DNA片段中显著富集了P1序列 (P<0.0001)，这说明 EIF5A2可以直接结合到 HIF1α的启动子区域(-1900~-1777bp) 。

为证实缺氧应激是否可以诱导EIF5A2从胞浆到胞核转移，应用免疫荧光检测了KYSE140 和KYSE410两个细胞系在常氧和缺氧情况下EIF5A2的亚细胞定位。有趣的是，缺氧处理不仅增加了EIF5A2表达并且促进EIF5A2从胞浆到胞核的转移（图3C，3D）。应用免疫印迹比较了常氧和缺氧情况下培养的细胞胞浆和胞核部分EIF5A2的蛋白水平。除此之外，ChIP试验也证明缺氧应激可以促进EIF5A2的胞浆到胞核转位，因为缺氧处理后EIF5A2抗体可结合HIF1α启动子的DNA片段（图3B）。这些结果证实：EIF5A2从胞浆至胞核转位可以被缺氧应激诱导。

EIF5A2促进食管鳞癌的侵袭与转移

缺氧情况下，肿瘤细胞能通过侵袭周围组织或诱导血管形成从而改变它们的生存状况。的临床相关分析也同样发现：EIF5A2 过表达与食管鳞癌侵袭和转移有关，这启示EIF5A2能够赋予肿瘤细胞迁移和侵袭的能力。为了测试它对细胞迁移的作用，将EIF5A2 瞬时转染到 EC109和KYSE510细胞中 （图3F）。细胞迁移试验发现：与对照组细胞相比，EIF5A2能够显著增强细胞运动能力 (P<0.01) 。 也通过用shRNA (sh2 或 sh4)沉默 EIF5A2表达来研究 EIF5A2 对细胞运动的作用。实时定量PCR(图 4A)与免疫印迹分析(图 4B)显示：与对照组相比，sh2 和sh4 都能显著沉默EIF5A2表达(P<0.01)。细胞迁移和侵袭试验证明：敲除EIF5A2能显著抑制肿瘤细胞迁移(P<0.01；图 4C)和侵袭(P<0.01；图 4D)，这证明EIF5A2可通过增强细胞运动能力从而促进肿瘤侵袭和转移。

为确定EIF5A2是否能够促进体内肿瘤转移，用裸鼠建立了血行转移和淋巴结转移模型。为此，用载有shRNAs (sh2 和 sh4) 的腺病毒感染了KYSE180细胞。以感染LacZ的KYSE180细胞作为对照。经处理的细胞分别通过尾静脉（血行转移组）或右后肢皮下足垫（淋巴结转移组）注射到裸鼠体内，每组包括5只裸鼠。45天后，裸鼠全部被处死，然后比较了shRNA处理组与对照组之间肝和肺的表面转移灶（血行转移组），腹股沟淋巴结转移（淋巴结转移组）的情况。在血行转移模型中，观察到相较在shRNA 组，对照组的肝脏表面观察到更多的转移灶。用免疫组化在对照组肝表面转移灶中检测到了EIF5A2的表达。肺表面没有观察到明显的转移灶。在淋巴结转移模型中，检查了腹股沟淋巴结转移情况（这种模型的前哨淋巴结）。免疫组化结果显示：对照组裸鼠腹股沟淋巴结EIF5A2和角蛋白染色为阳性，然而注射shRNA组中EIF5A2和角蛋白染色为阴性（图4F，图7）。

EIF5A2诱导上皮间质化转换

正如先前研究所示，EIF5A2 和HIF1α均通过促进EMT来诱导肿瘤侵袭和转移。为研究EIF5A2对于EMT的作用，应用免疫荧光研究上皮(β-catenin)和间质（vimentin and F-actin）标记物的表达水平。结果显示：当EIF5A2被sh2和sh4敲除掉之后，β-catenin的表达明显增加（图5A）。与此形成对照的是，当用siRNA沉默EIF5A2之后，vimentin 和F-actin 的表达减少了（图5A）。与免疫荧光结果一致，免疫印迹分析也证明EIF5A2可以减少上皮标志物的表达而增加间质标志物的表达（图5B）。

EIF5A2促进食管鳞癌的血管形成

由于 EIF5A2能够调控HIF1α（一种肿瘤转移和血管形成的主要调控因子），接着研究了EIF5A2在肿瘤血管形成中的作用。将转染了EIF5A2或者空载的KYSE510细胞注射到裸鼠皮下。使用CD34抗体（一种血管内皮细胞标志物)做免疫组化比较了由转染了EIF5A2和空载的细胞所致的皮下成瘤中微血管形成的密度 。转染了EIF5A2的细胞所致肿瘤的微血管形成密度明显高于对照组(P<0.05；图5C，5D)，这个结果与血管内皮生长因子上调有关(图5D)。随机挑选了10个免疫组化显示有EIF5A2 表达的食管鳞癌病例与16个免疫组化显示无EIF5A2 表达的病例来研究EIF5A2 表达与微血管形成之间的关系。应用 EIF5A2， VEGF 和CD34的抗体对食管鳞癌组织连续切片做免疫组化研究。VEGF的过表达和微血管密度增加与EIF5A2过表达显著相关(P<0.05；图 5E)。

HIF1α和VEGF的表达与EIF5A2过表达相关

为进一步研究 EIF5A2与HIF1α 和 VEGF之间的调控关系，用实时定量PCR测定了71对食管鳞癌病例中HIF1α和VEGF的表达情况。与相应非肿瘤组织相比，分别在 23/71(32.39%) 和21/71 (29.58%)的病例中检测HIF1α 和VEGF的过表达（定义：高于2倍为高表达）。关联分析显示：在这71例病例中，EIF5A2 的过表达与 HIF1α(R square=0.942；P<0.001；Pearson c² test；图5F) 和 VEGF表达(R square=0.889；P<0.001；Pearson c²test)正相关。正如预期，VEGF的表达也与HIF1α表达正相关(R square=0.942；P<0.001；Pearson c² test；图5F)。

沉默EIF5A2具有潜在治疗价值

为验证EIF5A2是否能成为癌症治疗的一个潜在靶点，测试了内源性EIF5A2表达被干扰RNA沉默掉的食管鳞癌细胞系EC18， KYSE180 和HKESC1的成瘤能力。向细胞中转染了不同感染复数的腺病毒，这些腺病毒载有靶向EIF5A2的shRNA。用体外功能试验比较了用shRNAs处理和未处理组之间细胞的成瘤性，这些功能试验包括细胞生长，软琼脂克隆形成试验和平板克隆形成试验。结果显示：相较于对照组，shRNA处理组的细胞生长速度（图6A），软琼脂克隆形成能力（图6B）和平板克隆形成能力（图6C）都显著降低。

随后检测了沉默EIF5A2联合化疗药物紫杉醇或者顺铂是否能够降低裸鼠肿瘤生长速度。为此，当裸鼠肿瘤（由KYSE180细胞诱导形成）长至直径5-6mm时，将含shRNA的腺病毒注射入瘤内。结果显示：用sh2沉默EIF5A2显著降低了肿瘤的生长速度(P<0.05；图 6D，6F)。相比于单纯sh2治疗组，联合紫杉醇后，sh2的肿瘤抑制作用更强(P<0.05)。顺铂和靶向沉默EIF5A2的shRNA联合治疗组，肿瘤体积和重量都显著降低（ sh2: P<0.01；sh4: P<0.05；图6E， 6F)。

<110> 中山大学附属肿瘤医院

<120> EIF5A2在制备食管鳞状细胞癌预后诊断试剂中的应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工shRNA

<400> 1

caccgaggac gaccatgcaa aatacgaata ttttgcatgg tcgtcc 46

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工shRNA

<400> 2

aaaaggacga ccatgcaaaa tattcgtatt ttgcatggtc gtcctc 46

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工shRNA

<400> 3

caccgcattc aagatggtta ccttcgaaaa ggtaaccatc ttgaatg 47

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工shRNA

<400> 4

aaaacattca agatggttac cttttcgaag gtaaccatct tgaatgc 47

Claims (2)

1.可以减少EIF5A2表达量的起效因子在制备治疗食管鳞状细胞癌制剂中的应用，起效因子选自可使EIF5A2表达量下降的shRNA、siRNA。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述shRNA的序列为

sh2：

top strand：5'-CACCGAGGACGACCATGCAAAATACGAATATTTTGCATGGTCGTCC-3'；

bottom strand：5'-AAAAGGACGACCATGCAAAATATTCGTATTTTGCATGGTCGTCCTC-3'

或sh4：

top strand：5'-CACCGCATTCAAGATGGTTACCTTCGAAAAGGTAACCATCTTGAATG-3'

bottom strand：5'-AAAACATTCAAGATGGTTACCTTTTCGAAGGTAACCATCTTGAATGC-3'。