CN105624275B - Eif4g1在鳞癌诊断和治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了EIF4G1在鳞癌诊断中的应用。具体地，本发明公开了真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因或其蛋白、或其检测试剂的用途，用于制备判断肿瘤是否为非小细胞肺鳞癌的试剂盒。此外，实验证明，在不同来源的鳞癌中，EIF4G1也有一定的高表达，因此，EIF4G1可作为鳞癌这一病理类型的标志物，从而为不同来源癌症的分型提供了更确切的方法。

Description

EIF4G1在鳞癌诊断和治疗中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断及治疗领域。具体地，本发明涉及EIF4G1基因或其蛋白、或其检测试剂在诊断和治疗鳞癌中的应用。

背景技术

肺癌是世界上许多国家最常见的恶性肿瘤之一，在我国，肺癌居恶性肿瘤死因首位。肺癌可分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(smallcell lung cancer,SCLC)两大类，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的80％～85％，而鳞癌在肺癌中最为常见，约占肺癌总体的50％。其中只有15-25％的非小细胞肺癌有手术治疗的机会，而即使接受根治性手术治疗，仍然有50％的NSCLC患者会复发。现在传统的治疗手段(手术及放化疗)在提高非小细胞肺癌的五年生存率方面遇到了瓶颈，而随着近几年转化医学的研究推进，研究了一些肿瘤检测方法和靶点，开发出了一些靶向性药物，例如：EGFR突变及其分子构想改变与靶向抑制剂的临床应用，对于EGFR敏感突变的特定人群，酪氨酸蛋白激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼能明显延长晚期NSCLC患者的无复发生存期，但是最终会出现耐药，归根结底是对于NSCLC的疾病机制还不清楚。

因此，本领域迫切需要对肺癌的发病机制进行研究，并开发相应的个性化治疗靶点。

发明内容

本发明提供了一种在非小细胞肺鳞癌中特异性高表达的分子标记物以及其在治疗非小细胞肺癌中的应用。

本发明提供了一种真核翻译起始因子4G1(eukaryotic translation initiationfactor 4 gamma 1，EIF4G1)基因或其蛋白、或其检测试剂的用途，用于制备判断肿瘤是否为鳞癌的试剂盒。

在另一优选例中，所述的EIF4G1基因或其蛋白来源于哺乳动物，较佳地，来源于人、小鼠、大鼠。

在另一优选例中，所述的EIF4G1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，编码所述EIF4G1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括EIF4G1的特异性引物、特异性抗体、探针和/或芯片。

在另一优选例中，所述的试剂盒包括EIF4G1基因或其蛋白的检测试剂。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括EIF4G1基因或其蛋白作为阳性对照。

在另一优选例中，所述的检测包括免疫组化、western blot、酶联免疫反应法(ELISA法)检测或时间分辨免疫荧光法(TRFIA法)检测。

在另一优选例中，所述的EIF4G1蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述的鳞癌包括来自以下肿瘤的鳞癌：非小细胞肺癌、皮肤癌、食道癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、乳腺癌。

在另一优选例中，所述的鳞癌为非小细胞肺鳞癌。

在另一优选例中，所述检测的对象包括组织样品、血液样品、血清样品或体液样品。

在另一优选例中，所述的组织样品包括癌组织和癌旁组织。

在另一优选例中，所述的判断还包括对鳞癌的分期进行判断。

本发明第二方面，提供了一种用于判断肿瘤是否为鳞癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测EIF4G1基因或其蛋白的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测鳞癌。

在另一优选例中，所述的容器中还含有独立包装的EIF4G1基因或其蛋白作为阳性对照。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括检测EIF4G1蛋白或其mRNA的试剂，较佳地，包括：

(a).抗EIF4G1蛋白的特异性抗体；和/或

(b).特异性扩增EIF4G1的mRNA或cDNA的特异性引物。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：当检测对象的肿瘤组织中EIF4G1基因或其蛋白的表达量与对照EIF4G1基因或其蛋白的表达量E0相比，E1≥1.5E0，较佳地，E1≥2.0E0，则表明，所述的肿瘤组织是鳞癌组织。

在另一优选例中，E0计为阴性，当E1相对于E0呈阳性时，则表明所述的肿瘤组织为鳞癌组织。

在另一优选例中，所述的表达量是相对于对照基因(如β-肌动蛋白)的相对表达量。

本发明第三方面，提供了一种体外非诊断性判断肿瘤组织是否为鳞癌组织的方法，包括步骤：

测定肿瘤组织中EIF4G1基因或其蛋白的表达量E1，并与癌旁组织的EIF4G1基因或其蛋白表达量E0作比较，当E1≥1.5E0时，较佳地，E1≥2.0E0，则表明，所述的肿瘤组织是鳞癌组织。

本发明第四方面，提供了一种判断肿瘤是否为鳞癌的方法，包括步骤：

测定肿瘤组织中EIF4G1基因或其蛋白的表达量E1，并与癌旁组织的EIF4G1基因或其蛋白表达量E0作比较，当E1≥1.5E0时，较佳地，E1≥2.0E0，则表明，所述的肿瘤为鳞癌。

本发明第五方面，提供了一种EIF4G1抑制剂的用途，用于制备治疗鳞癌的药物组合物。

在另一优选例中，所述的抑制剂包括：EIF4G1的抗体、EIF4G1核酸的反义RNA、siRNA、shRNA以及EIF4G1的活性抑制剂。

在另一优选例中，所述的药物含有药学上可接受的载体、EIF4G1抑制剂和任选的化疗剂。

本发明第六方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有EIF4G1抑制剂和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的EIF4G1抑制剂为EIF4G1的特异性抗体、EIF4G1的miRNA(siRNA)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了肿瘤标本EIF4G1表达量的代表性例子，其中高于癌旁组织的病人占有16例(50％)(图1A)，而有12例(37.5％)病人呈现相反的结果(图1C)，癌旁组织当中EIF4G1的表达量高于肿瘤组织；还有4例(12.5％)病人其EIF4G1在肿瘤标本和癌旁对照中的表达量无明显差别(图1B)。

图2显示了鳞癌标本EIF4G1表达量的代表性例子，所有的鳞癌中EIF4G1的表达量均高于癌旁组织。

图3显示了鳞癌标本EIF4G1表达量免疫组化结果的代表性例子，其中在所有鳞癌中，EIF4G1均高于癌旁组织和正常组织。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在非小细胞肺癌的肺鳞癌中，EIF4G1基因或其蛋白具有比癌旁组织更高的表达量，并通过样本量的扩大证实了EIF4G1与肺鳞癌具有密切的相关性。同时，本发明人还发现，在不同来源的鳞癌中，EIF4G1也有一定的高表达，因此，EIF4G1可作为鳞癌这一病理类型的标志物，从而为不同来源癌症的分型提供了更确切的方法。此外，本发明人发现在敲除EIF4G1基因之后，能对鳞癌的发生和发展具有一定的治疗作用，因此，EIF4G1有望成为治疗鳞癌，尤其是非小细胞肺癌中鳞癌的治疗靶点。在此基础上，完成了本发明。

EIF4G1蛋白和基因

真核翻译起始因子4G1(eukaryotic translation initiation factor 4 gamma1，EIF4G1)最早发现是作为翻译起始复合物EIF4F的组成蛋白之一，是EIF4G基因的一个亚基，与EIF4G2具有46％的同源性，其中EIF4G1占EIF4G的绝大部分。EIF4G1在蛋白质翻译过程中，作为一个“支架蛋白”，使其他与翻译起始有关的因子与之结合而发挥各自的作用。近年来研究发现，EIF4G1除促进蛋白翻译外，也与肿瘤的发生、进展密切相关。

在本发明中，术语“本发明蛋白”、“EIF4G1蛋白”、“EIF4G1多肽”或“真核翻译起始因子4G1”可互换使用，都指具有真核翻译起始因子4G1氨基酸序列(Genbank IDNo.AAI40893，SEQ ID NO.:2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的EIF4G1蛋白。此外，该术语还包括全长的EIF4G1及其片段。本发明所指的EIF4G1蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。

在本发明中，术语“EIF4G1基因”、“EIF4G1多核苷酸”或“真核翻译起始因子4G1基因”可互换使用，都指具有人EIF4G1核苷酸序列的核酸序列。EIF4G1基因序列NCBI GenBank登录号为NM_004953.4或如SEQ ID NO.:1所示。

需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。

在得到了EIF4G1的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的EIF4G1核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的EIF4G1多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人EIF4G1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，EIF4G1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含EIF4G1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

特异性抗体

在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗EIF4G1的特异性抗体”可互换使用。

本发明还包括对人EIF4G1多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人EIF4G1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人EIF4G1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人EIF4G1蛋白的分子，也包括那些并不影响人EIF4G1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人EIF4G1基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人EIF4G1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人EIF4G1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人EIF4G1蛋白功能的抗体以及不影响人EIF4G1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人EIF4G1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人EIF4G1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人EIF4G1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是组织样本)中的人EIF4G1蛋白。

检测方法和试剂盒

本发明涉及定量和定位检测人EIF4G1蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人EIF4G1蛋白水平，可以用于诊断肿瘤的病理类型是否为鳞癌。

一种检测样品中是否存在EIF4G1蛋白的方法是利用EIF4G1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与EIF4G1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物或发生显色反应，形成了抗体复合物或发生显色反应就表示样品中存在EIF4G1蛋白。

EIF4G1蛋白或其多核苷酸可用于EIF4G1蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗EIF4G1的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的EIF4G1蛋白。

本发明还提供了一种检测鳞癌的试剂盒，它含有特异性扩增EIF4G1的引物对和/或EIF4G1特异性抗体以及标签或说明书。

其中，所述的标签或说明书注明以下内容：当检测对象的EIF4G1相对-肌动蛋白的mRNA表达量E1与癌旁组织的EIF4G1相对-肌动蛋白的mRNA表达量E0之比≥2，则提示该检测对象为鳞癌。

一种典型的本发明的试剂盒可用于检测人肿瘤组织样品或血液样品。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的EIF4G1的拮抗剂，以及药学上可接受的载体。所述的药物组合物可用于抑制鳞癌，尤其是肺鳞癌的生长。

在本发明中，所述的拮抗剂包括针对EIF4G1的siRNA、反义RNA、抗体、或其组合。此外，所述的拮抗剂还包括可以降低EIF4G1表达或活性的小分子化合物。

通常，可将EIF4G1拮抗剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于抑制鳞癌的生长。此外，还可与其他肿瘤治疗剂联用。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的EIF4G1拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的EIF4G1拮抗剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点包括：

本发明提供了一种在鳞癌(尤其是在肺鳞癌)中高表达的标志物EIF4G1，该标志物可以特异性地区分鳞癌与其他病理类型的肿瘤，从而有助于为肿瘤患者提供个性化的治疗方案。此外，实验还发现，敲除或降低EIF4G1的表达，对鳞癌还产生一定的治疗作用。因此，EIF4G1不仅可以作为判断肿瘤病理类型的标志物，更可以作为治疗鳞癌的靶点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法

一、石蜡切片免疫组化

石蜡免疫组化的方法可根据本领域常规技术进行，优选的，可采用以下步骤进行：

1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。

2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(5min×2次)→95％乙醇(5min×2)→90％(5min)→85％乙醇(5min)。

3.PBS洗2次各5min，蒸馏水冲洗1次5min。

4.抗原修复：在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入，中火加热4次各6分钟，从微波炉中取出后自然冷却至室温。

5.蒸馏水洗1次5min，PBS洗2次各5min。

6.加3％H2O2孵育10min(室温)。

7.PBS洗3次各5min。

8.加封闭液(5％BSA)，室温孵育1小时，倾去，勿洗。

9.滴加一抗，4℃过夜。

10.PBS冲洗3次各5min。

11.加即用型MaxVisionTM试剂，室温孵育15分钟。

12.PBS洗3次各5min。

13.加新鲜配制DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟，自来水充分冲洗。

14.苏木素复染2～3min，自来水充分冲洗。

15.盐酸酒精分化2s，自来水充分冲洗。

16.脱水、透明80％(5min)→95％(5min)→95％(5min)→100％(5min)→100％(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)。

17.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干.

其中，即用型MaxVisionTM试剂购买于迈新生物技术开发有限公司；DAB显色试剂盒购买于迈新生物技术开发有限公司。

二.Western blot

1.主要材料及试剂：

1)Tris,10％SDS，10％过硫酸胺(AP)，TEMED，30％(w/v)丙烯酰胺溶液购自amresco公司

2)甘氨酸，TBS缓冲液,Tween20，1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8)，0.5mol/LTris·HCl(pH6.8)购自生工公司

3)PMSF，cocktail购自sigma公司

4)脱脂奶粉购自光明公司

5)5XSDS上样缓冲液购自凯基生物公司

6)Western Blot及IP细胞裂解液,BCA蛋白浓度测定试剂盒，抗体稀释液购自碧云天公司

7)PVDF膜购自miliipore公司

8)一抗，二抗购自CST公司

9)EP管96孔板购自康宁公司

10)预染marker购自Fermentas公司

11)组织样本由上海东方医院提供

Western blot可通过本领域常规方法进行，优选的方法如下：

组织总蛋白的提取

(1)把组织剪切成细小的碎片。

(2)取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF和cocktail，使PMSF和cocktail的最终浓度为1mM。

(3)按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)

(4)匀浆器匀浆，直至充分裂解。

(5)充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western实验

SDS-PAGE电泳

(1)配制7.5％分离胶；

(2)电泳：

每个上样孔加入40μg的总蛋白及预染的蛋白Marker。80V电压电泳至染料进入分离胶后，将电压增加到100V直至染料到达分离胶底部，终止电泳。

蛋白质的电转移

将PVDF膜浸于甲醇中15s，取出后迅速浸于转膜液中，使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，设定转膜电压为100V，转膜时间为60分钟。

封闭

转膜完毕后，TBST漂洗3次，加入Western封闭液，室温封闭60分钟。

蛋白的免疫检测

(1)一抗孵育

按一抗的说明书，按照1:1000比例稀释一抗。加入稀释好的一抗，4℃摇床缓慢摇动孵育过夜。

(2)二抗孵育

一抗孵育后洗涤3次，按二抗的说明书，按照1:10000比例用Western二抗稀释液稀释二抗。室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。

(3)蛋白检测

参照相关说明书，使用Odyssey双色红外激光成像系统进行蛋白的检测，并记录结果。

实施例1 NSCLC肿瘤组织和癌旁标本中EIF4G1表达量的检测

选取了32例病例，均获自上海市东方医院，其中包括了不同分期的肺腺癌、鳞癌、大细胞癌。对获得的NSCLC癌及癌旁组织，用Westernblot方法检测32例病人EIF4G1在组织中的表达情况，分析EIF4G1表达与NSCLC发生与发展的关系。

结果显示，在32例病人中，肿瘤标本EIF4G1表达量高于癌旁组织的病人占有16例(50％)(图1A)，而有12例(37.5％)病人呈现相反的结果(图1C)，癌旁组织当中EIF4G1的表达量高于肿瘤组织；还有4例(12.5％)病人其EIF4G1在肿瘤标本和癌旁对照中的表达量无明显差别(图1B)。

可见，在不同NSCLC病人中，EIF4G1在癌症组织和癌旁组织中表达量上存在不一致性。

实施例2鳞癌病例中EIF4G1的表达

基于实施例1的结果，对已知肺鳞癌中的EIF4G1结果进行了进一步的分析，结果显示(图2)，所有的鳞癌中EIF4G1的表达量均高于癌旁组织，可见EIF4G1可能是在鳞癌中普遍增高的分子标记物。

实施例3肺鳞癌样本量的扩大验证

为了扩大样本量进行验证，另购买了20例已知为鳞癌的肿瘤组织及癌旁组织病例(购自西安百思达生物科技有限公司)，通过免疫组化进一步分析EIF4G1在鳞癌中的表达情况。

从免疫组化结果可见(图3)，在所有鳞癌中，EIF4G1均高于癌旁组织和正常组织。

实施例4鼻咽癌、乳腺癌鳞癌的样本验证

取鼻咽癌、乳腺癌的病例(肿瘤组织和癌旁组织)各20例，其中鼻咽癌的病理类型包括鳞癌(7例)和非角化性癌(13例)，乳腺癌的病理类型包括腺癌(7例)、鳞癌(4例)、导管癌(9例)。采用westenblot对病例进行双盲的EIF4G1表达量测定。

结果显示，EIF4G1在鼻咽癌、乳腺癌的鳞癌中，表达量均高于其他病理类型的肿瘤及癌旁组织。可见，EIF4G1是在多种组织来源的鳞癌中均高表达的标记物。

实施例5 EIF4G1 mRNA检测试剂盒的制备

根据EIF4G1与鳞癌之间的相关性，制备了EIF4G1检测试剂盒。

该试剂盒含有：

试剂1，浓度为100μM的EIF4G1上游引物。

试剂2，浓度为100μM的EIF4G1下游引物。

试剂3，2×PCR反应液，包括Taq DNA聚合酶，dNTP，镁离子，SYBR荧光染料。

试剂4，无核酶水。

试剂5，内参GAPDH引物对，浓度各为100μM。

操作说明：(步骤)

(1)待测样品的制备，从待测样品中提取mRNA，并反转录为cDNA。可使用常规方法或试剂盒(如TRIzol RNA抽提试剂盒)。

(2)按如下体系配制PCR反应液：

cDNA模板，0.5-2μl

试剂1，1μl(终浓度0.5μM/μl)

试剂2，1μl(终浓度0.5μM/μl)

试剂3，10μl

试剂4，补足20μl

注：同时在同等条件下按相同体系配制内参对照GAPDH PCR反应液。

(3)PCR反应在荧光定量PCR仪上进行，PCR反应条件可根据需要调整，建议条件为95℃10分钟预变性，之后进行40个循环，每循环包括95℃20秒，60℃20秒，72℃25秒。

(4)分析实验结果，并与正常对照组织样品进行比较，EIF4G1 mRNA表达量高于正常对照1.5倍，更佳地2倍以上的为异常。

实施例6降低EIF4G1表达对鳞癌的抑制作用研究

(1)构建慢病毒载体的EIF4G1 shRNA(PLKO.1-EIF4G1shRNA)。表达包装病毒并感染鳞癌细胞株从而获取稳定消减EIF4G1的细胞株。用MTS法检测细胞生长，设立空白和空载体对照。

(2)鳞癌小鼠模型试验。将(1)中构建的细胞株(包括相应对照株)于雌性裸鼠接种注射1X107个细胞，建立鳞癌移植模型。接种10天后形成肉眼可见皮下肿块视为接种成功，荷瘤小鼠的正常生存期为50-70天；同时观察肿瘤生长情况；荷瘤50天常规处死小鼠，取出肿瘤块称重，拍照。检测EIF4G1是否在小鼠体内调节鳞癌细胞生长。

结果发现，通过抑制EIF4G1，能够显著地抑制鳞癌的生长。因此，EIF4G1可作为治疗鳞癌，尤其是肺鳞癌的有效靶点。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.真核翻译起始因子4G1(eukaryotic translation initiation factor 4gamma 1，EIF4G1)基因或其蛋白、或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备判断鳞癌的试剂盒，所述的判断包括对肺鳞癌的分期进行判断和判断肿瘤是否为乳腺鳞癌，所述判断是针对组织样品进行。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂包括EIF4G1的特异性引物、特异性抗体、探针和/或芯片。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肺鳞癌是为非小细胞肺鳞癌。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的EIF4G1基因或其蛋白来源于哺乳动物。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的EIF4G1蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.:2所示。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，编码所述EIF4G1蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.:1所示。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒包括EIF4G1基因或其蛋白的检测试剂。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒还包括EIF4G1基因或其蛋白作为阳性对照。

9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测包括免疫组化、western blot、酶联免疫反应法检测或时间分辨免疫荧光法检测。

10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的EIF4G1蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组织样品包括癌组织和癌旁组织。

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