CN109652548B - circ-CCNB1作为胃癌和结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点的应用 - Google Patents
circ-CCNB1作为胃癌和结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了环状RNA CCNB1(circ‑CCNB1)作为一种新的潜在的胃癌和结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点的应用。circ‑CCNB1(hsa_circ_0001495|chr5:68470703‑68471364+|CCNB1)是由CCNB1基因第6‑7号外显子反向剪接所形成,环化序列有378个碱基。本发明制备了circ‑CCNB1的qRT‑PCR引物以及体外干扰circ‑CCNB1的小干扰RNA(siRNA)。与正常对照相比,circ‑CCNB1在胃癌和结直肠癌病人肿瘤和血浆样本中表达均显著上调。体外实验显示circ‑CCNB1在胃癌和结直肠癌细胞中发挥促癌基因的作用。本发明研究结果表明circ‑CCNB1是一种新的潜在的胃癌和结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点。
Description
技术领域
本发明属于医学技术领域,涉及一种环状RNA CCNB1作为胃癌和结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点的应用。
背景技术
胃肠道肿瘤是最常见和最主要的肿瘤类型,包括胃癌、结肠癌和直肠癌等。根据2018年最新的全球癌症统计报告,在所有恶性肿瘤中,胃癌死亡率位居全球第三,发病率位居全球第五:结直肠癌死亡率位居全球第二,发病率位居全球第三。目前研究表明,胃癌的发生与地域环境及饮食生活因素、幽门螺杆菌感染、癌前病变,以及遗传和基因因素有关。大肠癌的发生与高脂肪低纤维素饮食、大肠慢性炎症、大肠腺瘤、遗传因素和其他因素(如环境因素、吸烟等)有关。关于胃肠道肿瘤的诊断和治疗取得了很大进展,但是其预后差仍是目前面临的严峻问题,如何寻找有效的诊断标志物及治疗靶点对于提高胃肠道肿瘤的预后将具有重要的科学意义和临床价值,可为胃肠道肿瘤的临床预防和治疗开辟新途径。
环状RNA(circular RNA/circRNA)是一大类共价结合形成环形结构的非编码RNA。环状RNA首先于1976年在植物病毒中发现,最初它被认为是一类错误剪接且没有研究意义的RNA。随后研究发现circRNA在生物体内对基因表达有重要的调控作用,其结构特点为具有闭合的环状结构,没有5’帽子端和3’尾端。这种环状结构是通过上游3’端剪接受体经反向剪接与下游5’端剪接供体连接形成。这种以共价键结合的环状闭合结构导致circRNA不受核酸外切酶影响,比线性RNA更加稳定。近年来研究发现circRNA具有以下基本功能:作为竞争性内源性RNA(ceRNA)吸附microRNA;调控转录及选择性剪接;作用于RNA结合蛋白;翻译成蛋白质。基于以上circRNA的功能,相关研究已经证实circRNA与人类疾病包括肿瘤密切相关。因此,深入研究circRNA在胃肠道肿瘤中的作用机制,对于胃肠道肿瘤的诊断及治疗具有潜在的巨大意义。
发明内容
本发明提供了circRNACCNB1(circ-CCNB1)在胃癌和结直肠癌诊断及治疗方面的应用。本发明公开了circ-CCNB1作为一种新的潜在的胃癌和结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点:circ-CCNB1在胃癌和结直肠癌病人的肿瘤和血浆样本中表达显著上调;受试者工作特征(ROC)曲线显示circ-CCNB1具备良好的诊断胃癌和结直肠癌的潜能;circ-CCNB1促进胃癌和结直肠癌细胞的增殖。
本发明的第一个目的是提供一种胃癌和结直肠癌潜在诊断生物标志物和治疗靶点,其为circ-CCNB1(hsa_circ_0001495|chr5:68470703-68471364+|CCNB1)(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)。circ-CCNB1是由CCNB1基因第6-7号外显子反向剪接所形成,环化序列有378个碱基。
本发明的第二个目的是提供特异性识别circ-CCNB1的引物对,包括上游引物和下游引物。上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
本发明的第三个目的是公开circ-CCNB1在胃癌和结直肠癌病人肿瘤组织中的表达情况。
本发明的第四个目的是公开circ-CCNB1在胃癌和结直肠癌病人血浆中的表达情况,以及相应的评价circ-CCNB1诊断能力的ROC曲线。
本发明的第五个目的是公开circ-CCNB1在胃癌和结直肠癌细胞中发挥的功能。
本发明的有益效果有:1)首次发现circ-CCNB1可作为胃癌和结直肠癌诊断生物标志物和药物治疗靶点;2)与正常对照相比,circ-CCNB1在胃癌和结直肠癌病人的肿瘤和血浆样本中均显著上调;3)ROC曲线显示circ-CCNB1具备良好的诊断胃癌和结直肠癌的能力。4)本发明的结果表明干扰circ-CCNB1可以抑制胃癌和结直肠癌细胞的增殖,表明circ-CCNB1在胃癌和结直肠癌的发生发展中发挥促癌基因的作用,为临床治疗胃癌和结直肠癌提供了新的靶点。
附图说明
图1为circ-CCNB1的生物学合成及结构示意图。
图2为使用circ-CCNB1引物对胃癌病人组织表达量检测的结果图。***代表p值<0.001。
图3A为使用circ-CCNB1引物对胃癌病人和健康体检者血浆表达量检测的结果图;B为评价circ-CCNB1诊断胃癌潜能的ROC曲线图。****代表p值<0.0001。
图4为使用circ-CCNB1引物对结直肠癌病人组织表达量检测的结果图。****代表p值<0.0001。
图5A为使用circ-CCNB1引物对结直肠癌病人和健康体检者血浆表达量检测的结果图;B为评价circ-CCNB1诊断结直肠癌潜能的ROC曲线图。***代表p值<0.001。
图6为circ-CCNB1小干扰RNA(siRNA)在HGC-27和SW480两种细胞系中转染敲降效率的qRT-PCR验证图。si-NC代表阴性对照组;si-circCCNB1#1,si-circCCNB1#2分别代表转染两种靶向circ-CCNB1反向剪接位点的siRNA组。*代表p值<0.05,**代表p值<0.01,****代表p值<0.0001。
图7为敲降circ-CCNB1后胃癌和结直肠癌细胞增殖变化的结果图。**代表p值<0.01,***代表p值<0.001。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例:
1.实验材料与方法:
临床样本:收集2016-2018年期间在首都医科大学附属北京朝阳医院普通外科接受手术治疗的30名胃癌和60名结直肠癌病人的肿瘤组织及癌旁正常粘膜组织。组织标本通过液氮速冻,转存于-80℃冰箱。收集上述30名胃癌和60名结直肠癌病人的术前血。另外收集45名年龄与性别匹配的健康体检者的血作为对照。血浆通过离心获得,储存在-80℃冰箱。
细胞系及细胞培养:人胃癌细胞系HGC-27和结直肠癌细胞系SW480,购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection,ATCC)。细胞培养在含有10%胎牛血清(Gibco,NY,USA)的DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)培养基中,添加100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco,NY,USA)。在37℃含有5%CO2的环境中培养细胞。
RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT-PCR):采用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取细胞及组织的总RNA;采用TRlzolTM LS(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取血浆的总RNA。逆转录试剂盒采用PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa,Dalian,China);荧光定量PCR试剂盒采用TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(TaKaRa,Dalian,China);采用ABI7500实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)进行PCR反应;采用18S rRNA作为内参;采用2-ΔΔCt法计算RNA相对表达量;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;引物序列见表1。
表1 qRT-PCR使用的引物序列
转染:靶向circ-CCNB1反向剪接位点的特异性小干扰RNA(siRNA)及阴性对照(si-NC)由吉玛基因(上海)合成;利用Lipofectamine 3000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)将50nM的siRNA转染入胃癌和结直肠癌细胞中;siRNA序列见表2。
表2 siRNA序列
CCK-8实验:采用CCK-8试剂(Dojindo Laboratories,Kumamoto,Japan)进行细胞增殖实验。接种约1000个细胞于96孔板中。在0,24,48,72,96小时,向96孔板中加入10μlCCK-8试剂。孵育两小时后,采用多功能酶标仪(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)读取450nm光密度(OD)值。每组测定5个重复值。
统计分析:使用SPSS 23.0软件对结果进行统计分析。使用GraphPad Prism 7.0软件作图。根据情况采用配对t检验或Wilcoxon符号秩检验进行统计学分析。数据以至少三次独立实验的均数±标准差的形式表示,所有P值均为双侧,P<0.05被认为有统计学意义。
2.实验结果:
如图1所示,circ-CCNB1由CCNB1基因第6-7号外显子反向剪接所形成。
如图2的qRT-PCR结果显示,与正常组织相比,circ-CCNB1在胃癌肿瘤组织中表达显著上调。***代表p值<0.001。
如图3A的qRT-PCR结果显示,与健康体检者相比,circ-CCNB1在胃癌病人血浆中表达显著上调。图3B中ROC曲线下面积(AUC)为0.780,表明circ-CCNB1具有良好的诊断胃癌病人的潜能。****代表p值<0.0001。
如图4的qRT-PCR结果显示,与正常组织相比,circ-CCNB1在结直肠癌病人肿瘤组织中表达显著上调。****代表p值<0.0001。
如图5A的qRT-PCR结果显示,与健康体检者相比,circ-CCNB1在结直肠癌病人血浆中表达显著上调。图5B中AUC为0.756,表明circ-CCNB1具有良好的诊断结直肠癌病人的潜能。***代表p值<0.001。
如图6所示,在HGC-27胃癌和SW480结直肠癌细胞系中转染si-circCCNB1#1和si-circCCNB1#2后,circ-CCNB1表达量显著下调,而其对应的CCNB1 mRNA表达量则无明显变化。*代表p值<0.05,**代表p值<0.01,****代表p值<0.0001。
如图7所示,转染si-circCCNB1#1后,胃癌和结直肠癌细胞增殖能力显著下降。**代表p值<0.01,***代表p值<0.001。
上述结果表明circ-CCNB1在胃癌和结直肠癌病人肿瘤组织以及血浆中表达上调;ROC曲线显示circ-CCNB1具备良好的诊断胃癌和结直肠癌的能力。体外实验显示circ-CCNB1促进胃癌和结直肠癌细胞的增殖,表明circ-CCNB1在胃癌和结直肠癌中发挥促癌基因的作用;circ-CCNB1有望成为一种新的胃癌和结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点。
以上所述的实施例是示例性的,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的保护范围不限于此,对于本领域的普通技术人员,在不脱离本发明技术原理的前体下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种环状RNA circ-CCNB1在制备胃癌和结直肠癌诊断产品中的应用,其特征在于:所述环状RNA circ-CCNB1的circBase ID为hsa_circ_0001495,来源于人类第5号染色体,由CCNB1宿主基因第6到7号外显子反向剪接环化产生,其环化成熟序列长度为378bp,核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述产品选自制剂、芯片或试剂盒。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述产品包括特异性识别circ-CCNB1的引物对。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:所述引物对包括上游引物和下游引物,所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示;所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
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