CN115247213B

CN115247213B - 长链非编码rna linc00205在制备诊断或治疗结直肠癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN115247213B
Application number: CN202210416202.9A
Authority: CN
Inventors: 孟祥祺; 李孟鸿
Original assignee: Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Current assignee: Sixth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date: 2022-04-20
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2042-04-20
Also published as: CN115247213A

Abstract

本发明公开了长链非编码RNA LINC00205在制备诊断或治疗结直肠癌的药物中的应用，属于生物医药技术领域。该长链非编码RNA LINC00205的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，特别是缺氧诱导高表达的LINC00205，在结直肠癌(CRC)中高表达并与不良的CRC预后相关，其中高表达的LINC00205可促进CRC细胞增殖和肿瘤形成，通过p53的负调控因子BCL6调节尿素循环和多胺合成，其结合miR‑10a/34c可保护BCL6免受miR‑10a/34c介导的降解。本发明中LINC00205可作为CRC诊断或预后的生物标志物，为制备诊断或治疗CRC药物提供新途径。

Description

长链非编码RNA LINC00205在制备诊断或治疗结直肠癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及长链非编码RNA LINC00205在制备诊断或治疗结直肠癌的药物中的应用。

背景技术

结直肠癌(CRC)是最致命的癌症类型之一，具有不同的分子表型和对治疗有很强的耐药性，是一种死亡率非常高的癌症。因此，识别潜在的危险因素、癌症生物标志物和微生物标志物对于CRC的有效治疗具有重要意义。表观遗传修饰与CRC恶性进展有关，包括长链非编码RNA(lncRNAs)解除调控，lncRNAs通过多种生理和病理功能参与癌症，然而lncRNAs畸变在CRC中的病理生理学机理尚未完全确定。明确lncRNAs的解除调控机理及其下游调控分子机制可促进CRC的诊断和预后，并提供潜在的治疗应用潜力。

缺氧会促进癌症的形成并导致治疗耐药性，而肿瘤区域通常含氧水平较低(缺氧)，根据对8000多个肿瘤样本的研究，这些缺氧区域会引起促进基因组不稳定或促进远处转移的潜在风险。缺氧诱导因子(HIF)负责调节代谢重编程、先天免疫，如免疫和炎症，以及未折叠蛋白反应(UPR)通路。虽然有报道称缺氧也可以通过调节一些lncRNAs来促进癌症进展，但肿瘤缺氧导致的lncRNA许多分子癌症特征仍有待研究。尿素循环(UC)是一种将含氮代谢物(如氨和谷氨酰胺)分解为尿素的处理机体氮废物的途径。尿素循环失调(UCD)是由UC酶表达的特异性改变引起的，这是癌症的一种代谢现象。例如，p53抑制尿素的生成和氨的消除，从而抑制肿瘤生长。在正常细胞中，过量的氮被处理为尿素。相比之下，大多数氮被进一步用于癌细胞合成大分子，如嘧啶合成。当p53丢失时，UC加快导致嘧啶合成，从而促进癌症生长。UCD影响癌变、诱变和免疫治疗反应；因此，表征UCD在肿瘤发生中的分子调控对于诊断和治疗至关重要。此外，鸟氨酸脱羧酶1(ODC1)是利用UC中的鸟氨酸进行多胺生物合成的关键酶，在癌症中经常被解除调控，增强的多胺生物合成促进癌症生长。然而，ODC1的过表达及靶向性作用对CRC的作用尚不清楚。

发明内容

本发明的第一目的是提供长链非编码RNA作为CRC诊断和预后标志物的应用，所述长链非编码RNA为LINC00205，Ensembl号为ENSG00000223768，首次鉴定并公开其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，由位于21号染色体的DNA序列编码。

作为优选，所述LINC00205为缺氧诱导高表达的LINC00205。

本发明的第二目的是提供一种检测长链非编码RNA LINC00205的试剂在制备诊断CRC的检测试剂中的应用，所述长链非编码RNA LINC00205的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

作为优选，所述长链非编码RNA LINC00205为缺氧诱导高表达的LINC00205。

本发明的第三目的是提供长链非编码RNA LINC00205的抑制剂在制备治疗CRC的药物中的应用。

作为优选，所述长链非编码RNA LINC00205的抑制剂为干扰RNA，可以抑制LINC00205在CRC肿瘤组织中表达。

作为优选，所述CRC肿瘤组织包括结直肠腺瘤组织和/或CRC癌组织，来源于CRC新发或预后不良的受试者。

本发明首次鉴定Ensembl号为ENSG00000223768的长链非编码RNA LINC00205(以下命名为lncRNA-LVBU)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，同时发现缺氧诱导的lncRNA-LVBU在CRC中高表达，并与不良的CRC癌症预后相关(较差的癌症生存率)；其中高表达的lncRNA-LVBU可以促进CRC细胞增殖和肿瘤形成，通过p53的负调控因子BCL6调节UC和多胺合成；高表达的lncRNA-LVBU结合miR-10a/34c还可以保护BCL6免受miR-10a/34c介导的降解，反过来允许BCL6阻断由p53介导参与UC/多胺合成基因(如精氨酸酶1(ARG1)、鸟氨酸转氨基酰酶(OTC)、ODC1)的抑制，证明lncRNA-LVBU可以作为CRC诊断和预后的生物标志物，为制备诊断或治疗CRC的药物提供新的用药途径。

附图说明

图1是验证lncRNA-LVBU在CRC中高表达并与不良预后密切相关的结果；其中，a：RKO细胞在低氧(1％O₂)条件下培养24小时，在指定的时间点收获细胞，分离RNA，通过高通量测序确定lncRNA的表达水平，热图显示的lncRNA在所有时间点与时间0相比，表达变化大于1.5倍，每一行代表一个独立的lncRNA，变化倍数进行log2转换；b：高通量测序结果与GEO数据集(GSE129344和GSE76743)在缺氧条件下上调的lncRNA交集；c：LVBU在正常黏膜和腺瘤组织中的表达水平(GSE41657)，采用不成对学生t检验(数据以均数±标准差表示，***p<0.001)；d：LVBU在癌旁正常组织及癌组织中的表达水平(GSE18105)，采用配对学生t检验(数据以均数±标准差表示，*p<0.05)；e：基于TCGA数据库中结肠癌组织(COAD)和肝细胞癌组织(HCC)中LVBU表达的Kaplan-Meier总生存(OS)曲线，以中位表达值(COAD)和ROC曲线(HCC)定义高、低表达组，并采用log-rank分析进行显著性检验；f：qRT-PCR检测18对结肠癌和配对正常组织中LVBU的相对mRNA表达水平的瀑布图；g：基于cDNA阵列(不包括粘液癌类型)中COAD LVBU表达的Kaplan-Meier总生存(OS)曲线，用中位数表达值确定高、低表达组，用log-rank分析进行显著性检验。

图2是测试HIF-1a结合到LncRNA-LVBU的启动子区促进其转录的结果；其中，a：用qRT-PCR检测缺氧(1％O₂)条件下RKO和HCT116细胞LVBU的表达，Western blot检测缺氧处理后指定时间点HIF-1α的表达(n＝3个独立样本，数据以均数±标准偏差表示，**p<0.01；***p<0.001)；b：在常氧或缺氧条件下，当HIF-1α被敲低时，用qRT-PCR检测LVBU的表达(n＝3个独立样本，数据以均数±标准差表示，**p<0.01)；c：在LVBU的启动子(-2000bp-TSS)处显示HIF-1α/1β的预测结合区(BRs)，该预测通过网站JASPAR执行；d：在低氧(1％O₂)条件下，用双荧光素酶报告基因转染HEK-293T细胞后，检测荧光素酶活性，N＝3个独立样本，数据以均数±标准差表示，***p<0.001；e：在LVBU的启动子区(-300bp-+1bp)显示HIF-1α的预测结合基序；f：插入LVBU启动子的pGL3-basic荧光素酶报告质粒构建示意图，用荧光素酶报告质粒转染HEK-293T细胞后，采用双荧光素酶报告基因法检测荧光素酶活性(n＝3个独立样本，数据以平均值±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01)；g：染色质免疫沉淀(ChIP)检测证实RKO和HCT116细胞中HIF-1α在LVBU启动子上的结合位点(n＝3个独立样本，数据以平均值±标准差表示，***p<0.001)。

图3是验证LncRNA-LVBU通过调节p53和UC通路促进CRC细胞增殖的结果；其中，a-b：GSEA结果显示sh-LVBU组p53信号通路上调，氮代谢通路下调，sh-NC：阴性对照；c：用siRNA下调LVBU表达后，用qPCR检测p53和p21 mRNA的表达水平(n＝3个独立样本，数据以均数±标准差表示，***p<0.001)；d-e：在HCT116和RKO细胞中，用siRNA敲低或过表达LVBU后，Western blot检测p53和p21蛋白水平；f：HCT116和RKO细胞转染p53报告基因(PG13-luc)和海肾质粒，转染si-NC或si-LVBU细胞后检测相对荧光素酶活性(n＝3个独立样本，数据以均数±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01)；g：UC和多胺途径的代谢产物和关键酶的示意图；蓝色和红色箭头分别表示UC和多胺代谢途径；h：用shRNA敲除LVBU后，液相色谱-质谱联用检测UC/多胺代谢途径相关代谢产物(n＝6个独立样本，数据以均数±标准差表示，***p<0.001)；i：用shRNA敲低LVBU后，用qRT-PCR检测RKO和HCT116细胞中p53、ARG1、ODC1和OTCmRNA的表达水平(n＝3个独立样本，数据以均数±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；j：在HCT116和RKO细胞中用shRNA敲低或过表达LVBU后，Western blot检测ARG1、ODC1和OTC蛋白水平；k：HCT116和RKO细胞经缺氧和shLVBU处理后，检测ODC1和OTC mRNA表达变化情况(n＝3个独立样本，数据以平均值±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

图4是验证LncRNA-LVBU通过调节BCL6调控p53和UC通路的结果；其中，a：敲低LVBU后潜在p53转录调控因子的表达情况；b：BCL6在癌症样本(Oncomine,Hong结肠直肠癌)中的表达水平较高，采用学生t检验(数据以均数±标准差表示，***p<0.001)；c：基于TCGA数据库中COAD中BCL6表达水平的Kaplan-Meier总生存(OS)曲线分析，采用ROC曲线确定高、低表达组，利用log-rank分析进行显著性检验；d-e：在HCT116和RKO细胞中敲低LVBU后，通过qRT-PCR和Western blot检测BCL6的表达水平(n＝3个独立样本，数据以均数±标准差表示，**p<0.01；***p<0.001)；f：免疫印迹分析BCL6和p53在转染相应质粒和siRNA后的表达水平；g-h：用相应的质粒转染RKO细胞后，测量其增殖率和克隆形成情况(n＝3个独立实验，数据以均数±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；i：用LVBU过表达质粒转染HCT116和RKO细胞后，用qRT-PCR检测BCL6、OTC和ARG1 mRNA的表达(n＝3个独立样本，数据以均数±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；j：用相应的质粒转染含或不含DOX诱导的LVBU敲低细胞，采用qRT-PCR检测ARG1和OTC mRNA表达变化(n＝3个独立样本，数据以均数±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01)。

图5是验证miR-10a/34c介导LncRNA-LVBU对BCL6调节作用的结果；其中，a：LVBU和BCL6 3'UTR上miR-10a/34c结合位点示意图，结合位点由生物信息网站DIANA预测；b：用AGO2抗体在HCT116和RKO细胞中进行RIP实验，采用特异性引物进行qRT-PCR检测LVBU和BCL6的富集(n＝3个独立实验，数据以均数±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；c：使用生物素标记的miR-10a和miR-34c进行RNA沉降检测，采用qRT-PCR检测LVBU和BCL6 mRNA水平(n＝3个独立实验，数据以均数±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；d：用miR-10a或miR-34c模拟物和对照miRNAs转染RKO细胞后，通过qRT-PCR检测LVBU和BCL6的表达(n＝3个独立样本，数据以均数±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；e：用siRNA和miRNA-inhibitor转染细胞后，对BCL6蛋白进行免疫印迹分析；f：用图示的miRNA-mimic和LVBU过表达质粒转染细胞后，对BCL6蛋白进行免疫印迹分析；g：在HEK-293T细胞中转染相应的报告质粒(WT:在LVBU序列上插入miR-10a或miR-34c结合区域；MUT:插入LVBU序列上突变的miR-10a或miR-34c结合区)和miRNA模拟物(n＝3个独立样本，数据以均数±标准差表示，*p<0.05)。

图6是验证LncRNA-LVBU促进CRC细胞的体内成瘤能力的结果；其中，a-c：将构建好的DOX诱导的HCT116-shLVBU细胞皮下注射到裸鼠(n＝6)，小鼠腹腔注射PBS或DOX(诱导LVBU敲低)，显示肿瘤生长曲线和最终肿瘤重量(n＝6个独立肿瘤，数据以均数±标准差表示，*p<0.05)；d：采用qRT-PCR检测(a)中肿瘤组织中LVBU和BCL6的mRNA表达(n＝6个独立样本，数据以均数±标准差表示，***p<0.001)；e：采用qRT-PCR检测(a)获得的sh-NC或sh-LVBU肿瘤组织中相应的UC基因的mRNA表达(n＝3个独立样本，数据以均数±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；f：(a)获得的肿瘤组织中Ki-67、BCL6、p53、ARG1、ODC1和OTC的代表性IHC染色，(f)中指示蛋白的染色强度用Image J定量，以条形图表示(n＝3个独立肿瘤，数据以均数±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；g：检测使用或不使用DFMO处理，LVBU过表达质粒转染细胞后的相对细胞增殖率(n＝3个独立样本，数据以均数±标准差表示，*p<0.05；***p<0.001)；h：将DOX诱导的HCT116-shLVBU细胞皮下注射到裸鼠(n＝4)，小鼠腹腔注射PBS、DOX或DOX+DFMO，显示肿瘤生长曲线和最终肿瘤重量(n＝4个独立肿瘤，数据以均数±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01)。

图7是验证靶向尿素/多胺合成通路抑制LncRNA-LVBU高表达的CRC移植瘤(PDX)生长的结果；其中，a：ODC1抑制剂DFMO的处理方案，每天腹腔注射DFMO(Vehicle)直到实验结束；b：PDX肿瘤切片进行LVBU和BCL6 RNA荧光原位杂交(FISH)染色；c：免疫缺陷小鼠中接种高或低表达LVBU的CRC PDXs生长曲线，有代表性的PDX瘤图像和肿瘤体积和重量的统计分析(n＝4或5个独立的肿瘤，数据以均数±标准差表示，*p<0.05；***p<0.001)；d：对CRC PDX肿瘤切片进行Ki-67、OTC、ARG1、ODC1免疫组化染色和荧光TUNNEL染色，用Image J定量染色强度，以条形图表示(n＝3个独立实验，数据以mean±标准差表示，*p<0.05；***p<0.001)。

图8是图示HIF-1α诱导的LVBU通过竞争性结合miR-10a/34c影响BCL6-p53调控UC/多胺合成从而促进CRC肿瘤发生的结果；在缺氧诱导LVBU后，由于LVBU的竞争性结合，BCL6免于受到miR-10a/34c介导的降解，从而稳定下来，减弱p53的转录抑制活性，并促进ARG1、CPS1、OTC和ODC1的表达，从而通过调节UC/多胺的合成促进肿瘤的发生。

图9是LVBU全长的RACE分析结果；其中，a：LVBU 5’-RACE和3’-RACE PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；b：LVBU的核苷酸序列全长；c：已确定的LVBU基因组序列(包括外显子和内含子)和RACE引物位点示意图。

图10是LVBU在CRC细胞中的分布检测结果，LVBU在CRC细胞中的分布，U1(细胞核)和β-Actin(细胞质)作为对照。

图11是LVBU促进CRC细胞增殖的结果；其中，a-c：细胞增殖和克隆形成实验；d：细胞衰老(SA-gal染色)；e：细胞周期分析(FACS)在HCT116和RKO细胞中转染siRNA、反义寡核苷酸(ASO)或表达质粒(n＝3个独立实验，数据以平均±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。

图12是LVBU调控UC相关基因表达的结果；其中，a：基于TCGA数据库中直肠癌组织中OTC表达的Kaplan-Meier总生存(OS)曲线，采用ROC曲线确定高、低表达组，采用log-rank分析进行显著性检验；b：基于TCGA数据库中直肠癌组织中ASL表达的Kaplan-Meier总生存(OS)曲线，用三分位法确定高、低表达组，采用log-rank分析进行显著性检验；c：通过RT-PCR方法，用ASO下调LVBU的表达抑制了UC相关基因的表达(n＝3个独立实验，数据以平均±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01)。

图13是低氧条件调节UC相关基因表达结果；其中，a：细胞在低氧条件下12和24小时后，对前30条改变的通路进行KEGG富集分析；b：采用qRT-PCR检测低氧处理后RKO和HCT116细胞ARG1、ODC1和OTC mRNA的表达(n＝3个独立实验，数据以平均值±标准差表示，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；c：用qRT-PCR检测DMSO或放线菌素-D处理后细胞p53 mRNA的表达，GAPDH作为内对照。

图14是预测可能与BCL6和LVBU结合的miRNA；其中，a：预测的与BCL6和LVBU可能结合的miRNAs，用targescan和DIANA网站进行预测；b：LVBU的预测二级结构及其与miR-10a、miR-34c的潜在结合位点，用RNAfold webServer进行预测；c：用qRT-PCR检测CRC PDX组织标本中LVBU mRNA的表达，LVBU在CRC2225和CRC2451 PDX组织中表达相对较高，在CRC2406和CRC2417 PDX组织中表达较低(n＝3个独立实验，数据以平均±标准差表示，***p<0.001)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一、实验

(1)细胞培养、试剂和转染

所有细胞均来自ATCC，并在37℃和5％CO₂保存。缺氧处理时，HEK-293T细胞在1％O₂环境，含有10％胎牛血清的改良培养基(DMEM)中培养。HCT116细胞在含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养。RKO细胞在含有10％胎牛血清的改良培养基(MEM)中培养。siRNA双链和ASO由Ribobio合成miR-10a和miR-34c模拟物、抑制剂和相应的阴性对照(NC)，序列见表2。所有质粒、siRNA、ASO、miRNA模拟物和抑制剂的瞬时转染均符合脂质体2000转染试剂(Invitrogen，CA，USA)的标准方案。

(2)患者和标本

收集中山大学附属第六医院外科18例CRC肿瘤组织和非肿瘤邻近结直肠组织，CRCcDNA芯片(#HColA095Su02)购自上海芯超生物科技有限公司，包含80例CRC病例及相关临床和生存信息，所有实验均经中山大学附属第六医院伦理委员会批准。

(3)质粒

选用pGL3-basic、pGL3-control、pGL4.73和PG13-luc(p53报告质粒)，用

MAX DNA聚合酶(Takara，Kyoto，JPN)从293T细胞中扩增出LVBU和BCL6。将LVBU克隆到pEYFP-C1-tag载体的AgeI和ecoRI位点上(替换Citrine序列)，将BCL6克隆到pcDNA3.1-myc载体的BamH I和Hind III位点上。LVBU启动子野生型和突变克隆引物(pGL3-LVBU启动子BR1、pGL3-LVBU启动子BR-2、pGL3-LVBU启动子BR-3、pGL3-LVBU启动子MUTA、pGL3-LVBU启动子MUTB、pGL3-LVBU启动子MUTC、pGL3-LVBU启动子MUTD、pGL3-LVBU启动子MUTE、pGL3-LVBU启动子MUTALL)、miR10a和miR-34c的野生型结合位点见表3，DOX诱导敲除质粒(HIF1α，LVBU，BCL6)的shRNA序列见表2，所有酶均购自新英格兰生物实验室(MA，美国)。

(4)RNA-seq分析

使用Trizol试剂提取总RNA，进行mRNA-seq分析以及整个转录组测序。

(5)5’和3’的cDNA末端快速扩增(RACE)

5’RACE和3’RACE检测使用SMARTeR^TMRACE cDNA试剂盒(ClonRech)进行，用于PCR的基因特异性引物(GSP)的序列列于表3。

(6)实时荧光定量PCR(qPCR)

使用Trizol试剂(Invitrogen，CA，USA)从细胞中提取总RNA，然后用ReverTra

qPCR RT Master混合液与gDNA清除试剂进行逆转录。使用/>

480II仪器进行实时定量PCR，实时定量PCR实验的引物序列见表4。

(7)Western blot免疫印迹

用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳提取并分离细胞总蛋白。并将蛋白质转移到PVDF膜上。室温下用5％脱脂乳封闭PVDF膜1小时，然后用指定的一抗孵育。随后，用过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育孵育1小时。几次洗涤后，膜上免疫检测带的化学发光图像记录在X射线胶片上使用增强化学发光(ECL)系统，使用针对BCL6、p53、p21、ARG1、ODC1、OTC、HIF1α和GAPDH的抗体。

(8)荧光素酶报告基因分析

构建的荧光素酶报告质粒和pGL4.73(对照肾细胞质粒)在指定处理后转染到HEK293T细胞中。48小时后，使用双荧光素酶报告检测系统测量荧光素酶活性，并利用肾荧光素酶活性进行归一化。

(9)ChIP检测

在缺氧条件下培养并收集RKO细胞，采用IgG(每次反应5μg；12-370，微孔，质量，USA)和HIF1α抗体(每反应5μg；GTX127309，Genetex，上海)进行ChIP检测，，针对HIF1α启动子的特异性引物见表4。

表1

表2

表3

表4

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(10)细胞增殖实验

将3000个细胞接种到96孔板中，使用细胞计数试剂盒定量细胞活力。将500个细胞接种于6孔板中，在正常培养基中培养10天，固定后用0.5％结晶紫染色，计数菌落数。

(11)细胞敏感性试验

将si-NC或si-LVBU处理后的RKO细胞接种于6孔板细胞培养基下的细胞。24小时后，收集细胞进行β-半乳糖苷酶染色。

(12)细胞周期实验

将si-NC或si-LVBU处理后的RKO和HCT116细胞接种于6孔板中48h后，用流式细胞仪收集细胞进行细胞周期分析。

(13)动物实验

动物实验经中山大学附属第六医院动物伦理与福利委员会批准。采用雌性无胸腺BALB/c裸鼠(5周龄)，RKO细胞(1×10⁷)被注射到小鼠皮下后侧，建立CRC异种移植(PDX)模型。随后，小鼠被随机分为两组，PBS或强力霉素均采用腹腔注射，每周测量两次肿瘤的长度和宽度，并根据公式计算体积(长度×宽度²)/2，实验结束时收集PDX物进行分析。

对于患者来源的PDX模型进行实验(PDX模型在中山大学附属第六医院建立)，患者来源的肿瘤小块组织(2-3mm³)通过手术接种到NCG小鼠的皮肤下，当肿瘤达到约50mm时，小鼠被随机分为两个治疗组。

(14)免疫组化(IHC)分析

石蜡包埋切片进行免疫组化染色：分别使用针对BCL6、p53、ARG1、ODC1、OTC和Ki-67的抗体，免疫组化采用商业试剂盒。

(15)LC-MS

稳定转染的CRC细胞在含或不含阿霉素的6孔板中培养48小时。48小时后，细胞用冰PBS洗涤两次，再用200μL 80％预冷的HPLC级甲醇收集。样品在-80℃中保存过夜，13000r离心10分钟后，上清液转移到一个新鲜的玻璃瓶中进行LC-MS分析，由中山大学仪器分析与研究中心进行。鉴定和定量是在UPLC-Q-TOF上进行。采用

BEHHILIC柱，以0.1％甲酸乙腈为溶剂A，0.1％甲酸水，2.1mm×100mm，1.7μm水为溶剂B进行梯度洗脱分离，梯度程序如下：01min85％A、1-5min85％A至50％A、5-7min50％A、7-7.1min50％A至85％A、7.110min85％A，流量设为0.4mLmin1，注射量为5μl，每个样本的总运行时间为10min。采用ESI离子源进行正离子模式检测，毛细管电压为4500V，干燥温度保持在220℃，干燥气体为8.0Lmin1，雾化器为1.5bar，数据使用MetaboScape4.4(Bruker)软件进行分析。

(16)RNA稳定性试验

用si-NC或si-LVBU处理细胞并接种于6孔板中48h。在收集细胞前，用100ng/mL放线菌素D处理一定时间(2h、4h、6h、8h和10h)。48h后，使用Trizol试剂提取总RNA，RT-qPCR检测剩余的p53 mRNA，用GraphPadPrism7.00作图并进行统计学比较分析si-NC组和si-LVBU组p53mRNA的稳定性。

(17)LVBU和BCL6RNA荧光原位杂交(FISH)染色

使用RNA荧光原位杂交试剂盒对CRC患者来源的PDX组织进行RNA FISH染色，其中LVBU探针(地高辛标记)设计针对ENST00000647108.1的2563-3034bp区域，BCL6探针(用生物素标记)设计针对1378-1957bp区域Enst0000406870.7。抗地高辛和亲和素-HRP二抗孵育后，用酪胺信号扩增(TSA)荧光信号，细胞核用DAPI染色。最后用显微镜拍摄图像。

(18)RNA沉降实验

生物素标记的miR-10a、miR-34c和阴性对照模拟物购自上海吉玛公司，5×10⁶HCT116细胞用脂质2000转染600pmol的生物素标记miRNA的。24小时后，用PBS洗涤两次后，用含完全蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(5mM氯化镁，100mM氯化钾，20mMTris(pH7.5)、0.3％NP-40,50U的RNaseOUT(Invitrogen，美国)在冰上裂解细胞10分钟。12000g离心10min后，上清液用于miRNA生物素的沉降实验，实时荧光定量PCR检测miRNA后LVBU和BCL6的mRNA水平。

(19)RNA免疫沉淀

使用MagnaRIP^TMRNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒，用RIP裂解缓冲液收集HCT116或RKO细胞，用AGO2抗体和蛋白A/G磁珠免疫沉淀结合RNA和蛋白复合物。除去未结合的材料后，用苯酚：氯仿：异胺醇(125：24：1，pH＝4.3)提取，采用实时荧光定量PCR方法检测共沉淀的RNA。以IgG为阴性对照，检测LVBU和BCL6的基因特异性引物见表3。

(20)统计分析

结果以均值±标准差表示，数据分析采用t检验(p<0.05)，累积生存率采用Kaplan-Meier方法进行评估，所有统计分析均使用SPSS16.0软件进行。

二、结果

(1)缺氧诱导的lncRNA-LVBU在CRC中表达上调，并与不良预后相关

通过实验发现，在缺氧条件下(0.5、12和24小时)评估HCT116细胞中lncRNA的转录情况(lncRNA在所有时间点的变化至少超过1.5倍，认为有显著变化)，发现在缺氧条件下有显著表达变化的1333个lncRNAs，其中593个lncRNAs表达上调，740个lncRNAs表达下调(图1a)。将上调的lncRNAs与GEO数据库重叠后，发现3个潜在的候选lncRNA(图1b)。其中，LINC00205(Ensembl号为ENSG00000223768，命名为lncRNA-LVBU)由位于21号染色体的DNA序列编码(如SEQ ID NO:1所示)，与正常黏膜或邻近正常组织相比，结直肠腺瘤和癌组织中LVBU表达上调(图1c-d)。Kaplan-Meier分析显示，高LVBU表达的中位生存时间(67个月)，5年生存率较低(52.2％)，同时高LVBU表达也与肝细胞癌患者较短的生存期相关(图1e)。对18对CRC组织和邻近正常黏膜中表达的定量RT-PCR分析显示，LVBU在肿瘤组织中的表达明显高于正常组织(图1f)。CRC患者的cDNA芯片分析显示，在结直肠腺癌组织中，LVBU的高表达与较差的总生存率相关(图1g)，LVBU的表达与CRC患者的临床病理信息关系见表1。以上结果表明缺氧可以上调LVBU表达，LVBU高表达的CRC不良预后相关。

(2)HIF-1α在缺氧条件下激活LVBU转录表达

cDNA末端扩增(RACE)实验鉴定发现，lncRNA-LVBU是一个4474-nt的转录本，由4个外显子和3个内含子组成，全基因序列如图9(a-c)，此外LVBU同时分布于细胞质和细胞核中(图9)。缺氧条件下通过HIF1α上调LVBU转录本的表达(图2a-b)，转录因子HIF1α在LVBU启动子区的9个潜在结合位点在分布3个结合区域(BR)内(图2c)。不同的HIF1α结合区域构建成荧光素酶报告基因检测表明，在缺氧条件下只有结合区3(BR-3)可以被诱导(图2d)。分别对结合区3内的各个预测结合位点(Motifs A-E)进行进一步突变，表明MotifB、D和E是HIF1α的潜在结合位点(图2e-f)，所有这些位点进一步突变均可消除缺氧条件下的诱导(图2e-f)；最后ChIP分析证实，在RKO和HCT116细胞中，HIF1α与211-89bp区域内的LVBU启动子结合(图2g)。表明LVBU的上调是通过CRC细胞中HIF1α与LVBU启动子的结合介导。

(3)LVBU促进体外CRC细胞增殖

siRNA或ASO敲除LVBU的表达均可显著抑制HCT116和RKO细胞的增殖和克隆形成能力(图11,a-b)，在HCT116细胞中过表达LVBU显著增加细胞增殖和克隆形成(图11c)，敲除LVBU的表达可以显著诱导细胞活性(SA-βgal染色)，并导致CRC细胞的G1细胞周期阻滞(图11,d-e)。

(4)LVBU通过p53/氮代谢途径调控CRC细胞增殖

shRNA敲除LVBU后进行高通量测序分析，p53信号通路相关基因在LVBU敲除组中富集，如p53和PTEN(图3a)，此外，在LVBU敲低组中，氮代谢途径相关基因如GLUD1和CPS1等表达下调(图3b)，提示LVBU可能通过p53/氮代谢途径调控CRC细胞增殖；敲除LVBU的表达会导致p53和p21的mRNA和蛋白水平均显著上调(图3c-d)。同样过表达LVBU可以降低p53和p21的蛋白水平(图3e)。p53荧光素酶报告基因检测(PG13-luc)显示，敲除LVBU的表达可以显著增加HCT116和RKO细胞的荧光素酶活性(图3f)，表明LVBU敲低导致p53的转录激活可能是通过对p53转录表达水平的影响。

(6)LVBU通过miR-10a和miR-34c正向调控BCL6的表达

对LVBU敲除后进行LC-MS代谢物分析，发现UC的中间代谢产物(瓜氨酸、精氨酸-琥珀酸、精氨酸、鸟氨酸)和多胺合成途径(亚精胺、N1、N12二乙酰乙酰亚精胺、n8-乙酰亚精胺))代谢产物合成降低(图3g、h)，表明LVBU通过调节UC/多胺合成在癌症的发展中起重要作用。Kaplan-Meier分析显示，鸟氨酸转氨基甲基化酶(OTC)和精氨酸琥珀酸裂解酶(ASL)与直肠癌患者的低生存率相关(图12a-b)，敲低LVBU可以导致ARG1和OTC的mRNA转录和蛋白水平下调(图3i，图12c)，这两个基因均被p53抑制。LVBU敲除介导的p53上调导致ARG1和OTC的下调(图3i-j)，表明LVBU-p53存在关联。同样过表达LVBU增加这些基因的蛋白表达(图3j)，ODC1也被p53抑制，在LVBU敲除中也下调(图3i)，过表达LVBU在多胺合成中起关键作用。这些数据表明，LVBU介导的这些基因通过调控p53的表达，LVBU可以正向调控ARG1、OTC和ODC1的表达。KEGG富集分析显示，在12和24小时缺氧时间点，氮代谢、碳代谢通路和hif1信号通路在前30个KEGG富集通路内(图13a)，暗示这三种通路之间的联系，如上所述LVBU由缺氧反应诱导。通过qPCR实验发现，缺氧条件导致CRC细胞中ODC1和OTC基因表达的升高(图13b)，这种升高被LVBU敲除逆转(图3k)，说明缺氧-LVBU在调节氮代谢中的作用。综上所述，低氧诱导的LVBU调节p53和UC/多胺合成途径，LVBU-BCL6负向调控p53从而促进尿素循环。

检测放线菌素D处理下LVBU下调时p53的mRNA稳定性，发现LVBU的敲除不会影响p53的mRNA周转率(图13c)。当LVBU被敲除时，p53的转录抑制因子被下调(图4a)，BCL6的高表达与结肠癌患者的不良预后相关(图4b-c)。LVBU敲除导致CRC细胞中BCL6mRNA和蛋白水平的下调(图4d-e)，提示LVBU和BCL6之间存在调控关系。最重要的是，LVBU基因敲除介导的p53上调可以被BCL6的表达所逆转(图4f)。通过CCK8和病灶形成实验，过表达BCL6可以逆转LVBU敲低介导的生长抑制(图4g)，另一方面下调BCL6可以抑制LVBU介导的生长促进(图4h)；LVBU过表达导致BCL6、OTC和ARG1同时升高(图4i)，另一方面LVBU敲除导致ARG1/OTC基因表达下调，而BCL6的表达可以逆转(图4j)，表明BCL6确实与LVBU介导的氮代谢有关，LVBU调控BCL6进而抑制p53，进而上调ARG1和OTC的表达。

与BCL6或LVBU结合的miRNAs中，miR-10、miR-30和miR-34同时与BCL6和LVBU结合(图14a)。由于LVBU和BCL6在CRC中均表达上调，且有报道称BCL6可被miR-10a和miR-34c调控，通过miRNA依赖的机制调控BCL6 mRNA的表达，进行生物信息学分析和二级结构预测(图14b)，发现miR-10a和miR-34c在LVBU RNA和BCL6 3‘UTR的RNA序列中确实有几个结合位点(图5a)。在HCT116和RKO细胞中，RIP结果显示LVBU和BCL6与AGO2抗体富集，表明LVBU和BCL6与miRNAs相互作用(图5b)。此外，从转染3‘端生物素化miR-10a、miR-34c、链霉亲和素包被珠中捕获假定的结合RNA，结果显示LVBU和BCL6在miR-10a或miR-34c捕获组中均显著富集(图5c)，表明miR-10a和miR-34c参与调节LVBU和BCL6之间的联系。此外，miR-10a和miR-34c模拟物的瞬时过表达导致BCL6和LVBU mRNA水平的降低，表明miR-10a和miR-34c同时结合BCL6和LVBU RNA以发挥功能(图5d)。Westernblot结果显示，miR-10a或miR-34c抑制剂可以逆转LVBU敲除引起的BCL6下调(图5e)。另一方面，LVBU介导的BCL6上调可以被miR-10a或miR-34c模拟物减弱(图5f)。最后，发现含有野生型miR-10a或miR-34c模拟物的HEK-293T细胞结合位点的报告基因在过表达miR-30c模拟物或miR-34c模拟细胞中荧光素酶活性显著降低，但突变结合位点没有这种现象(图5g)。证明LVBU通过miR-10a和miR-34c正向调控BCL6的表达。

(7)敲除LVBU可以抑制体内肿瘤的生长

将DOX诱导的LVBU稳定敲除细胞皮植入裸鼠皮下，建立结RC小鼠PDX模型。与sh-LVBU对照组相比，携带LVBU敲除细胞的小鼠肿瘤生长减少(图6a-c)。对小鼠PDX肿瘤组织的定量RT-PCR分析证实LVBU的敲除同时也有BCL6的下调(图6d)。根据定量RT-PCR检测，LVBU敲低肿瘤也显示UC和多胺相关酶的基因表达降低，包括ARG1、ASL、ASS1、CPS1、ODC1和OTC(图6e)。免疫组化染色结果显示，肿瘤肿块中BCL6、Ki-67和UC相关基因(ARG1、ODC1和OTC)产物明显降低，而在LVBU敲除的肿瘤中p53表达上调(图6f)。异氟氨酸(二氟甲基氯氨酸，DFMO)是ODC1的抑制剂，是多胺生物合成途径的限速酶，目前用于复发/难治性神经母细胞瘤(NCT04301843)，并用于III期临床试验，用于预防高危腺瘤和第二原发性CRC(NCT01349881)的复发。发现DFMO可以消除LVBU介导的细胞增殖(图6g)，表明DFMO可以有效地靶向LVBU表达调控的ODC1活性。CRC PDX小鼠模型显示，DFMO联合治疗和LVBU敲除可进一步显著抑制肿瘤发生和肿瘤重量(图6h-i)。

(8)阻断多胺合成可抑制LVBU-高表达的CRC恶性生长

建立患者来源的PDX模型(图7a)，从CRC患者中切除的新鲜原发肿瘤样本(LVBU高或LVBU低)植入免疫功能低下的小鼠。根据RNA荧光原位杂交(FISH)染色和定量分析，LVBU高CRC样本确实含有高BCL6水平，而LVBU低CRC样本降低BCL6的表达(图7b)，RT-PCR检测(图14c)，采用DFMO进行PDX治疗疗效试验，当PDX肿瘤可触及时，注射载体或DFMO。在已建立的LVBU-高PDX的模型中，给予多胺生物合成途径DFMO抑制剂可有效抑制肿瘤生长(图7c)。相比之下，DFMO对LVBU-低PDX的PDX模型的生长没有显著影响(图7c)。因此，基于CRC患者来源的PDX模型中LVBU的表达水平，DFMO对抑制肿瘤生长具有不同的治疗效果。免疫组化Ki-67和荧光TUNEL染色显示，在LVBU高表达的PDX模型中，DFMO处理可显著抑制肿瘤细胞生长，诱导更多的细胞凋亡；而在LVBU低表达的PDX模型中，没有次效应(图7d)，虽然OTC、ARG1和ODC1在LVBU-高表达的PDX模型中的表达水平高于LVBU-低的PDX肿瘤，但这些蛋白的表达水平不受DFMO处理的影响(图7d)。显然在LVBU高表达的CRC中，DFMO抑制ODC1活性而不改变ODC1蛋白的表达水平。

(9)LVBU正向调节UC来处理氨

动物模型数据表明，LVBU在激活UC/多胺合成途径和促进肿瘤细胞生长方面的关键作用可以在体内重现。在肿瘤发生过程中，LVBU敲除的信号导致BCL6表达水平低、p53激活和UC衰减。PDX模型实验表明，抑制多胺生物合成途径可以有效抑制LVBU高表达水平的肿瘤生长。LVBU过表达通过BCL6-p53促进UC重启，调节UC酶(CPS1、OTC和ARG1)和多胺生物合成酶(ODC1)，且通过保留BCL6介导的p53转录抑制以及p53介导的转录UC酶(CPS1、OTC和ARG1)和多胺生物合成酶(ODC1)的抑制而受到异常调控(图8)。因此，LVBU正向调节UC来加速氨代谢，并参与UC/多胺的生物合成。

综上所述，本发明通过实验确定lncRNA-LVBU作为一个关键的调控因子，为复杂的控制UC和多胺合成提供途径。LVBU是一种新型HIF1α诱导的lncRNA，在CRC中表达上调，并与不良预后相关，可通过调节BCL6-p53和UC/多胺合成途径促进CRC进展，促进CRC细胞增殖和肿瘤发生，可作为CRC的生物标志物或治疗靶点。

序列表

<110> 中山大学附属第六医院

<120> 长链非编码RNA LINC00205在制备诊断或治疗结直肠癌的药物中的应用

<141> 2022-03-07

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4474

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

gcagcggcta gaggttccat tgcagacccg gaggccgtgg ctgtggttcg cggcggtgct 60

gtcgcgggcg ccctggcgca gcccacgcag gggctcctga gggtccgcga ggccgggagg 120

tccgggggtc gggaggtccc ggggtcggga agtcggtgga ccctgcaggc cagtggggag 180

gggagacata agacatcagt cagtacatgt gaggtgtgca ttggattgat ccagaaagtc 240

aggacgactc caagtggaaa ggcctccaga gacaggagac agtaaaagaa atggcctctc 300

tcctctgtca gagtggagtc ccgagctccc agaaatgcca catgatggac aaacgcttgg 360

gggaaaaaaa aaaaaaagga gacctcagtc ggacacaaaa gcaggagctt taaaagaaaa 420

aataagagat aagttgaact tcaccaaaaa ataagcgttt ctggtctttg aaagacactt 480

aaaatgaaaa ggcaagccat cgatggggaa aatactcaga ataatggatc tgacagaggg 540

ctgtatctag aatatatgaa gatattttaa aatccagtaa tttgacataa agatggtagc 600

cagcctgaca cacaaaggaa cccgaatggc caatggacag gaagggaacc cgtatggccg 660

atggacagaa agggaagtga acgtgaacat ctcattgggg atgccgttat caccactgga 720

atagtcaaaa acatggacac caagtattgg tgggtgagtg gaatggcggg aacccacata 780

cacggtcgat gggagctgca ccctttggaa atcatttcac agtttgtgct ccatcctggc 840

caaacccaca gctggagtct ttccaaaaac agtgacggga gtttccacca gggagtgcct 900

caaaccatcc cgagatgggg ctggttggga ttccagggag aggcactcgt tgccagggtg 960

atccgtccag agcacttcct aggggatctg gcataaggag ggctgcagtg tatcctcagg 1020

acagatagga cagatagtgt atctttggga cagacggcaa gatggggatt ccacccaggt 1080

ctgtctgcag cgagttgata tgagagttta aggaatttgg accagggctg ctttgtttca 1140

gggttttggg caatgaccta aacaccttta tcagtgcctg ggaatgctca aggcccagct 1200

tgagttcagg cctgcaggga aaacctgcaa ctggccgggc tgcagagtgg tcagggcacg 1260

gaaagccaga agctggggac acacctgctg tatgatccag ccgttcgtct ttacctggga 1320

gaaatggcac cacctggctg aacataactt cttacactcc catgagtcct cctggacagg 1380

tgctgtgacc tcgtgcagcc ttggggaccc tgacactccc acggacaggc caaggggttt 1440

gcctgggccc tgtgggcaca gagccccttg agatgggttt ccctatgcag ccccccaccc 1500

cccaccgggg acccatggca ctgcagccct caccccccct ctagggaccc acaacactgc 1560

agccctcgcc cccctccggg gtcccacagc actgcagccc tcgcccccca tcggggaccc 1620

acagcactgc agccacgccc aggccaccgc ctccaaacac agggccgctg ctgtttctgt 1680

gaacagatac ttcttgcaga tgtcaatggt taatggatgg ggaggtgacc gcccaagcag 1740

aagccgaccc tcttcatgaa ggggccacag gtcaccccga agcagaaatc catagaacag 1800

ccaaggccac agcggaaccg agcaggccac gcctctgcct ctgggccgct cagggccagg 1860

cctccctgac cccactggct ctattgtgag gactcagggt ggagctctgc tgggctcagt 1920

ggccttcaca gccggggtcc acagacccgg gtcctacggg cagtactgtg ctcacctaga 1980

ggccacggtc catgccctgt ctccagcagg cccaagtcac ttgtccatgg cgaaggcccg 2040

gccttgcttc aggccccggg cgcgctcccc ctgctccccc tgcccaccgt ttcttcccag 2100

gtgacagagg cgggagagca ggcgagccac gtgccgggcg ccgcagcagg gggcactcca 2160

ggctggcgcc cctctgcctc tccgtgggct ctgacctttc ttctccctgc ctgggcagcc 2220

tccttcaggt tggggagtct tttgttgacc cctggattaa agtcctaatc aggaatgacc 2280

cggaagaggt cttatgaggc tttcctcaag agaagaaaat ctgtccctga gtatcaggaa 2340

gtggcccctt tccctgcacc gcagtcttct gtgaccagcg gctcacacag cgaaggaggg 2400

gctggcggcc cccacaggcc actgccccga ggccgccacg agagggcagg agagcccttc 2460

ctgggagctc tgtgccacgg ggaaacgcag ccccgccaag cacagcatgg atgtttccag 2520

cagggaatga agagagaggc cccagcacat gagagaagag cacactgggc ggcccctgtc 2580

ggagcctctc ctgtccccag cgacccctga gagcaggccc tgggcctctg cggcccctcc 2640

cggagccact cttcaactgc tgacctgctc ccagctcttc tgtgccccgc ccagctccct 2700

gcaaaacctc acctgagggg aaggaggccc tgtttgggct cagacgcagc aggtgcagct 2760

tgtggtcctg gggccacacc tgttagagcc catccttcta cccctgctgg gccctgagtg 2820

tcgtccgtcc ccacagaact cagcagggtc aggtctgggc actccaggcc gccagccccc 2880

tgagtgagcc ctgggccgga ggtagttgtg ggtcacaggc accccagcca gaacacccac 2940

agtgggtaga tgtgtgggga ccggatgtgg gtcctctcct gagagacgtg cagatgggga 3000

gaggctgggc agttctcagc acagctggag catctacctg tcaccacctc ggagcctcct 3060

ggccccgtgg gggcggccct gggagcaggg tcggcagtga agagcagaga aaggcagttg 3120

gggatgttgc cactgtcccc cgagaccacc ctgccatgga gacgagggag ctgtcccttc 3180

gcggaagggg gctggccagc aagaaggaca gagagtggac tggccgagga ccgctgagct 3240

caggacccaa ggaggactct tctaggagac gagagagcga acgccaggga ccctgtgcag 3300

gcctgctcct ccgtttgcaa gcaggctccc tccccgaggc cgttcagaag cattcctcag 3360

cgggtcctac acgtttcctc tcccatgtca agtttagaag cagtgtcaag acccacagca 3420

gtcctgcggg agttttaagg gatgcacgga gtttatgggg acagtttgga aaattgacat 3480

tcatgtgact tagagtccta ctacttgaaa atggattcca gctctcaacg aatttagagc 3540

tttggcaaaa tttttaagat ttctttgatg tccgatgtgc tcatttcttg gtttgttctt 3600

gagtattttg tggattttta tgaaatccac aaagtttttg ttataatgaa tgggacactt 3660

tcccataaaa tgttgtaatt ctgtattgct gttttagtaa acactgttga ttgatgtata 3720

ttgatgttac acttggtcac ttgtaatagt ttgtccgttc attattttga actttttagg 3780

taaacagtca tataattatg caaataatta tagttgtgtc tctgcctttc taatatttat 3840

actttgtgta tattatcatg ttggccagga ctcaagcgtc tttctcttgt ttctgactaa 3900

tgcgaatgat tctaatgcag gggtttccaa actggtggcc ggggggccaa atccagccaa 3960

tggtctcttc ttgtaaataa agttttattg gaacacagtt acacacattt ttctacatat 4020

tgtctgatgg ctactgtcac gccacagcaa tgctgttaaa tagtccagac agaggcggta 4080

ttgcccgaaa aacctagaat attcaccatc tgagctttta cgggaaaatt tgctaatatc 4140

tgttctcatg cattaaatac aatgtttgtt acaggttaag gaagtttctg actattttta 4200

gctttctgaa tatcttgtgg ttgtgtgtgc tttaaaatta ggactaaata ttaaatttac 4260

cagttgcttg ttaggggcct atcttttgag atgcccaaag tttccctttt ttagtctctt 4320

catgtagtga gttgtactaa cagattctct aatgttgaac cgtctttgct ttccggagat 4380

agactttact tgctcctggt ggattggatt ctgtttgtta atacttttat ttttgggtaa 4440

ttacatccct attataaata atatgtcagc atca 4474

Claims

1.一种检测长链非编码RNA的试剂在制备结直肠癌预后评估产品中的应用，所述长链非编码RNA为LINC00205，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种检测长链非编码RNA LINC00205的试剂在制备诊断结直肠癌的检测试剂中的应用，所述长链非编码RNA LINC00205的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.长链非编码RNA LINC00205的抑制剂在制备治疗结直肠癌的药物中的应用，所述长链非编码RNA LINC00205的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；其特征在于，

所述长链非编码RNA LINC00205的抑制剂为siRNA或反义寡核苷酸ASO或 shRNA。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA LINC00205的抑制剂为siRNA，抑制LINC00205在结直肠癌肿瘤组织中表达。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌肿瘤组织包括结直肠腺瘤组织和/或结直肠癌癌组织。