KR101416147B1 - 위암 진단 및 치료를 위한 ａｄｃｙ3의 용도 - Google Patents

위암 진단 및 치료를 위한 ａｄｃｙ3의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101416147B1
KR101416147B1 KR1020120078443A KR20120078443A KR101416147B1 KR 101416147 B1 KR101416147 B1 KR 101416147B1 KR 1020120078443 A KR1020120078443 A KR 1020120078443A KR 20120078443 A KR20120078443 A KR 20120078443A KR 101416147 B1 KR101416147 B1 KR 101416147B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
adcy3
gastric cancer
expression
biological sample
present
Prior art date
Application number
KR1020120078443A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140011710A (ko
Inventor
이연수
고성호
김인후
홍승현
Original Assignee
국립암센터
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 국립암센터 filed Critical 국립암센터
Priority to KR1020120078443A priority Critical patent/KR101416147B1/ko
Priority to US14/411,970 priority patent/US10435752B2/en
Priority to EP12881322.7A priority patent/EP2876444A4/en
Priority to PCT/KR2012/006606 priority patent/WO2014014157A1/ko
Priority to JP2015518309A priority patent/JP6005272B2/ja
Publication of KR20140011710A publication Critical patent/KR20140011710A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101416147B1 publication Critical patent/KR101416147B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y406/00—Phosphorus-oxygen lyases (4.6)
    • C12Y406/01—Phosphorus-oxygen lyases (4.6.1)
    • C12Y406/01001—Aodenylate cyclase (4.6.1.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 ADCY3의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준, 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 마커 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 위암 진단용 키트, 생물학적 시료에 상기 제제를 처리하여 제제와 상보적으로 결합하는 물질의 존부 및 그 양을 대조군과 비교함으로써 위암 진단을 위하여 ADCY3 폴리뉴클레오티드 또는 ADCY3 단백질을 검출하는 방법, ADCY3 폴리뉴클레오티드 또는 ADCY3 폴리펩티드를 억제시킬 수 있는 제제를 포함하는 위암 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 ADCY3을 위암 진단용 마커로 이용하는 경우, 높은 진단 감도 및 특이도를 가지고 위암을 진단할 수 있어 위암으로 인한 사망률의 감소에 크게 기여할 수 있는 이점이 있으며, 나아가 본 발명의 ADCY3의 발현을 조절할 수 있는 제제를 이용하여 위암의 예방 및 치료에 응용할 수 있다.

Description

위암 진단 및 치료를 위한 ＡＤＣＹ3의 용도 {Use of ADCY3 for the Diagnosis and Treatment of Gastric Cancer}
본 발명은 위암 진단 및 치료를 위한 ADCY3(Adenylate cyclase 3)의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 ADCY3의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준, 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 마커 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 위암 진단용 키트, 생물학적 시료에 상기 제제를 처리하여 제제와 상보적으로 결합하는 물질의 존부 및 그 양을 대조군과 비교함으로써 위암 진단을 위하여 ADCY3 폴리뉴클레오티드 또는 ADCY3 단백질을 검출하는 방법, ADCY3 폴리뉴클레오티드 또는 ADCY3 폴리펩티드를 억제시킬 수 있는 제제를 포함하는 위암 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.
전 세계적으로 위암은 암으로 인한 사망 중 1, 2위를 다투는 사망 요인으로 알려져 있다. 특히, 2011년에 발표된 중앙암등록본부 자료에 의하면 2009년에 우리나라에서는 전체 암 발생의 15.4%가 위암으로 2위에 해당하며, 남성에서는 암 중에서 1위를 차지할 정도로 유병률이 높은 암으로 알려져 있다.
위암은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 양상을 나타내고 있다. 또한, 위암의 증상은 어떤 특성을 가지는 것이 아니라 일반적인 소화기 증상을 나타낸다. 일반적으로 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하기 쉬어 위암의 사망률을 높이는 원인이 되기도 한다.
현재까지의 위암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이었다. 그 첫 번째로는 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법, 점막촬영법 등이 있으며, 두 번째로는 위내시경으로 위속을 직접 눈으로 들여다 볼 수 있게 하여, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변도 발견할 수 있을 뿐 아니라 위암이 의심스러운 장소에서 직접조직검사를 시행할 수도 있어, 그 진단율을 높이고 있다. 하지만, 이 방법은 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있어, 최근에는 위암에서 특이적으로 발현되는 유전자 마커의 발현수준을 측정함으로써 위암을 진단하려는 연구가 활발히 이루어지고 있다.
이에 본 발명자들은 고통과 불편을 최소화할 수 있는 위암의 진단 방법 및 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 특정 유전자 및 유전자의 발현 산물이 위암 진단마커로서 뿐만 아니라 치료제의 타겟으로 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 ADCY3(Adenylate cyclase 3)의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준, 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 위암 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 위암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 시료에 ADCY3의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 처리하고, 상기 제제와 상기 제제에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 결합을 검출하는 한편, 상기 검출된 양을 정상 대조군과 비교하여 ADCY3 mRNA 또는 ADCY3 단백질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ADCY3 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 위암 치료 및 예방용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ADCY3 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 치료 및 예방용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 ADCY3 폴리펩티드를 발현하는 세포에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계 및 ADCY3 폴리펩티드의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 위암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서 본 발명은 ADCY3의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 위암 마커 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "ADCY3"이란 아데닐산 고리화효소 3(adenylate cyclase 3)의 약자이고, ADCY3는 아데닐산 고리화효소 패밀리에 속하는 약 128kDa에 이르는 막관통 효소로서 이차전달자인 cAMP를 생성하는데 관여하는 단백질을 의미한다.
상기 ADCY3 단백질은 10여 가지 다른 타입이 알려져 있는 아데닐산 고리화효소 패밀리의 3번 타입으로 이를 ADCY3로 명명하고 있다. 이들 패밀리 중 일부는 몇몇 암 조직에서 발현이 증가한다고 알려져 있으나, 본 발명의 ADCY3와 관련하여 위암 특이적 발현 증가에 대해서 알려진 바 없었다.
본 발명의 ADCY3이 위암에 있어서 발현이 증가한다는 사실을 본 발명에서 최초로 규명하였다. 본 발명자들은 일실시예를 통해, 6개의 위암 세포주 (SNU-216, SNU-638, SNU-719, AGS, KATO III, MKN-28)와 2개의 정상 인간 세포주 (HDF, HMEC)에서 ADCY3의 발현 수준에 있어 위암 세포주가 정상 세포주와 비교했을 때 현저하게 높다는 것을 확인하였다(도 1A). 추가적으로, 주변의 정상 부위와 비교했을 때도 높은 ADCY3 발현을 나타내는 것을 확인하였다(도 1B).
본 발명에서 용어, "마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 위암 세포 또는 위암 질환을 가진 개체를 정상세포 또는 정상 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 암을 가진 세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 위암 진단 마커는 정상 세포 또는 조직의 세포에 비하여, 위암세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 ADCY3 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명에서 "mRNA 발현 수준 측정"이란 위암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 위암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 위암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿, ELISA (enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 본 발명의 ADCY3 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편에 대한 프라이머 (primer) 쌍, 프로브 (probe), 또는 안티센스 뉴클레오티드 (anti-sense nucleotide)이며, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 당업자가 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열을 용이하게 디자인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머 (primer)"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3‘-hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 ADCY3 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 위암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 하여 적절하게 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브 (probe)" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링 (labeling) 되어 있어 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는, 본 발명의 ADCY3 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 위암 질환의 발병 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
상기 프라이머 또는 프로브는 8개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하며, 하이브리드화 방법은 본 발명의 ADCY3 폴리뉴클레오티드에 상기 프라이머 또는 프로브를 노출 또는 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 바람직하게 이들 서열은, 비특이적 결합을 최소화 하도록 적절히 조절된 조건에서 혼성화 되며, 예를 들면 약 80% 내지 90%의 동일한 서열의 검출을 위한 적절한 조건은, 0.25M Na2HPO4, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% 덱스트란 설페이트 내, 42℃에서 밤새 (overnight) 혼성화시키고, 0.1 × SSC, 0.1% SDS 내, 55℃에서 최종 세척하는 것을 포함한다. 또한 약 90% 이상의 동일한 서열의 검출을 위한 적절한 조건은 0.25M Na2HPO4, pH 7.2, 6.5% SDS, 10% 덱스트란 설페이트 내, 65℃에서 밤새 혼성화시키고, 0.1 × SSC, 0.1% SDS 내, 60℃에서 최종 세척하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 ADCY3 단백질(이하 'ADCY3 폴리펩티드'와 혼용) 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다. 본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 ADCY3 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 ADCY3 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체를 포함한다.
본 발명의 위암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 위암 마커 검출용 조성물은 또한 ADCY3 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것일 수 있다. 최근 암과 관련된 유전자 발현에서 DNA 메틸레이션의 역할이 연구되고 있으며, 일반적으로 DNA 메틸레이션에 따라 mRNA 발현이 조절되는 것이 밝혀지고 있다. 그에 따라, 본 발명에서는 ADCY3 유전자의 메틸화 수준을 측정함으로써, 메틸화 수준이 낮을 경우 위암으로 진단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 ADCY3 발현이 높은 위암 세포주에서 ADCY3 유전자의 메틸화 수준이 낮음을 확인함으로써(도 5C), 프로모터 부위의 CpG 섬의 DNA 메틸레이션에 따라 ADCY3 발현이 조절됨을 확인하고, ADCY3 유전자의 메틸화 수준을 측정할 경우 위암을 진단할 수 있는 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 용어 "위암"이란 위에서 발생하는 암종(악성 종양)을 총칭하는 의미로서, 위에 발생하는 악성 종양에는 위선암, 림프종, 위 점막하 종양, 평활 근육종 등이 있으며, 이 중 98%가 위선암으로, 바람직하게 위암이라 함은 위선암을 의미할 수 있다. 위암의 증상으로는 상복부 불쾌감, 상복부 통증, 소화불량, 팽만감, 식욕부진 등이 있으나, 이러한 증상만으로는 진단이 어렵고, 일반적으로 방사선 검사 또는 위내시경 등으로 진단이 가능하며, 조직 검사로 최종 진단될 수 있다. 본 발명에서는 상기와 같이 번거롭고 복잡한 진단 방법을 사용하지 않고 단순히 위암 마커인 ADCY3의 양을 측정함으로써 간편하게 진단할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 본 발명에 따른 ADCY3를 제외한 나머지 ADCY 멤버는 위암 특이적으로 발현되지 않음을 확인하였다(도 2). 이러한 결과는, 모든 ADCY가 위암에서 발현하는 것이 아니며, ADCY 멤버 중에서 ADCY3만이 오직 위암 특이적으로 발현한다는 것을 의미하며, 그에 따라 ADCY3를 위암 특이적 마커로서 이용 가능함을 시사하므로, ADCY3의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준, 또는 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 본 발명의 위암 마커 검출용 조성물은 상기 위암의 진단을 위한 마커로 이용될 수 있음을 확인하였다.
다른 하나의 양태로서 본 발명은 ADCY3의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "진단"이란 생물학적 시료 또는 조직 샘플에서 본 발명의 ADCY3 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 측정함으로써 상기 유전자의 발현과 관련된 질환의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다.
본 발명의 키트는 위암 진단 마커인 ADCY3 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 키트는 위암 진단 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체 또는 항원 결합능을 유지하는 이의 단편뿐만 아니라, 상기 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 정량 검출을 위한 진단 키트는 ADCY3 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 1 종 이상의 올리고 뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, ADCY3의 오티드또는 일부 서열에 대응하는 프라이머, 역전사 효소, Taq 폴리머레이즈, PCR용 프라이머 및 dNTP를 포함할 수 있으며, 폴리뉴클레오티드 발현 수준을 측정하기 위해 상기 "mRNA 발현 수준 측정"과 관련하여 기술된 분석 방법을 이용한 키트를 이용할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 ADCY3 단백질의 수준을 측정하는 위암 진단 키트는, 본 발명의 ADCY3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 단백질 수준을 측정하는 키트는 "단백질 발현 수준 측정"을 위해 사용되는 상기 기술된 방법을 이용한 키트를 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 ELISA 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
항체를 이용한 단백질 발현 여부 측정은 ADCY3 단백질 및 그의 항체 간의 항원-항체 복합체를 형성함으로써 측정되며, 다양한 방법에 의해 상기 복합체의 형성량을 측정함으로써 정량적으로 검출할 수 있게 된다.
본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 위암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적인 측정이 가능하다.
예를 들면, 위암 의심 개체 및 정상 대조군의 항원-항체 복합체 형성량을 비교함으로써 ADCY3 단백질의 유의한 발현량 증가를 판단하여 특정 개체에서의 위암 발병 여부를 진단할 수 있는데, 위암이 의심되는 개체의 시료에 본 발명의 ADCY3 단백질에 대한 항체를 처리하면, ADCY3 단백질과 항체가 항원-항체 복합체를 형성하게 되고, 이는 상기 기술된 ELISA, RIA, 샌드위치 분석, 웨스턴 블럿, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니, 면역 확산법, 로켓 면역 전기 영동, 조직면역염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS, 단백질 칩 및 면역블럿 방법을 포함하는 키트에 의해 그 양을 측정할 수 있게 된다. 또한 상기 분석 결과를 정상 개체의 정량 결과와 비교 분석함으로써, 본 발명의 ADCY3 단백질의 발현 증가에 따른 위암 발병 여부를 진단할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 생물학적 시료에 ADCY3의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 처리하고, 상기 제제와 상기 제제에 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 결합을 검출하는 한편, 상기 검출된 양을 정상 대조군과 비교하여 ADCY3 폴리뉴클레오티드 또는 ADCY3 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로는, 유전자의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어 "생물학적 시료"란 ADCY3 유전자 또는 단백질 발현 수준을 검출할 수 있는 시료를 의미하며, 그 예로, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 검출방법은, 정상 대조군에서의 유전자 발현 수준을 위암 의심 개체의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 위암 의심 개체의 실제 위암 질환 발병 여부를 진단할 수 있다. 즉, 위암으로 추정되는 시료 또는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 시료 또는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 시료의 것보다 위암으로 추정되는 시료 유래에서 더 높은 수준으로 발현되면 암으로 추정되는 시료를 위암으로 예측할 수 있는 것이다.
바람직하게 상기 방법은, 본 발명의 ADCY3 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 마커로 이용하는 경우, (a) 생물학적 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에 ADCY3의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 처리하는 단계; (c) 상기 제제와 상기 제제에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 결합을 검출하는 단계; 및 (d) 검출된 양을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 ADCY3 폴리펩티드 마커를 이용하는 경우, (a) 생물학적 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 생물학적 시료에 ADCY3 단백질에 대한 항체를 처리하는 단계; (c) 항체-항원 복합체를 검출하는 단계; 및 (d) 검출된 양을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 방법을 이용하여 본 발명의 ADCY3 단백질을 검출할 수 있게 된다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 ADCY mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 위암 치료 및 예방용 조성물 또는 ADCY3 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.
바람직하게 본 발명의 조성물은 ADCY3 mRNA의 발현을 억제하는 물질을 포함할 수 있으며, 상기 mRNA의 발현을 억제하는 물질은 siRNA, shRNA, 앱타머(aptamer) 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 (antisense oligonucleotide)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 용어 "siRNA (small interfering RNA)"는 RNA 간섭 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 핵산 분자를 의미하며, siRNA가 세포 내에 도입되면, 다이서 (Dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 eIF3m 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 분해하여, 결국 유전자의 발현을 저해하게 된다. 상기 siRNA는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 서열번호 1의 핵산서열을 가지는 것일 수 있다.
"shRNA (short hairpin RNA)"는 siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프 (loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA)를 의미한다.
"앱타머(aptamer)"란 작은 RNA 조각을 의미하며, 20 내지 60 nt 정도의 작은 사이즈를 가지는 올리고머 분자이다. 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있어 목적하는 타겟 서열과 반응하여 효과적으로 억제가 가능하다.
용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적 서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고머는 ADCY3 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고머이다.
또한 바람직하게 본 발명의 조성물은 ADCY3 단백질의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는, 암의 성장 또는 전이를 억제하는 조성물일 수 있다. 바람직하게 상기 활성 억제 물질은 ADCY3 단백질을 특이적으로 인식하는 항체이다. 이러한 항체는 단일클론항체 및 이에 대한 카이메릭 항체 (chimeric antibody), 인간화 항체 (humanized antibody) 및 인간 항체 (human antibody)를 모두 포함한다. 또한 상기 항체는 ADCY3 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄 (heavy chain)와 2개의 경쇄 (light chain)의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서는, 본 발명에 따른 ADCY3가 과발현된 세포에서 세포의 이동성 및 침윤성을 증가시키고, 콜로니 형성능을 증가시킴을 확인함으로써, 종양 형성에 관련되어 있음을 확인하였고(도 3의 A 내지 C), ADCY3 특이적인 siRNA를 처리하여 그 발현을 하향 조절하는 경우, 세포의 이동성 및 침윤성을 감소시키고, 콜로니 형성능을 감소시킴을 확인함으로써, 종양 형성과 관련된 효과를 감소시키는 것을 확인하였다(도 3의 D 내지 G).
따라서, 본원발명의 위암 치료 효과는 위암의 전이 억제에 의하여 달성되는 것일 수 있다. 일반적으로 위암과 같은 악성 종양은 성장속도가 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나 더욱 악화될 수 있는데, 본원발명의 ADCY3 발현 및 활성 억제용 조성물은 세포의 이동성 및 침윤성을 감소시키고, 콜로니 형성능을 감소시켜 위암 전이를 억제함으로써, 궁극적으로 위암을 치료할 수 있는 효과가 있다.
바람직하게, 본 발명의 조성물은 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 첨가제와 함께 혼합될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 종류의 예로는 식염수 ,멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 상기 성분들 중 어느 하나의 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 통상적으로 사용되는 다른 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 투여 목적에 따라 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있고, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 또는 조직 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 상기와 같은 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류는 당업계의 통상적인 제제를 모두 포함하며, 상기 예에 의해 사용가능한 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기와 같은 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물의 양 및 투여 횟수는 예방 또는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 ADCY3 폴리펩티드를 발현하는 세포에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계 및 ADCY3 폴리펩티드를 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 위암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 위암 치료제 스크리닝 방법은 후보 물질의 처리에 의해 ADCY3 발현이 증가되는 경우, 상기 후보 물질을 위암 질환을 촉진시키는 물질로 판단할 수 있다. 또한, 후보 물질에 의해 ADCY3 발현이 감소하는 경우, 처리된 후보 물질이 위암 치료제로 사용될 수 있을 것으로 판단할 수 있게 된다. 이러한 스크리닝 방법에 있어서, 그 활성 측정은 ADCY3 발현 수준에 따라 용이하게 판단될 수 있다.
본 발명의 ADCY3을 위암 진단용 마커로 이용하는 경우, 높은 진단 감도 및 특이도를 가지고 위암을 진단할 수 있어 위암으로 인한 사망률의 감소에 크게 기여할 수 있는 이점이 있으며, 나아가 본 발명의 ADCY3의 발현을 조절할 수 있는 제제를 이용하여 위암의 예방 및 치료에 응용할 수 있다.
도 1은 위암 세포 및 조직에서의 ADCY3의 발현량을 나타낸다. A는 위암 세포 및 정상세포에서의 ADCY3 mRNA의 발현량을 나타내고, B는 위암 조직 및 정상조직에서의 ADCY3 mRNA의 상대적인 양을 나타내며, C는 다양한 인간 조직에서 ADCY3 mRNA의 발현을 나타낸다.
도 2는 여섯 개의 위암 세포주 (SNU-216, SNU-638, SNU-719, AGS, KATOIII, and MKN28) 및 두 개의 정상 세포주(HDF and HMEC)에서의 RT-PCR에 의한 ADCY 패밀리 멤버들의 발현의 검출을 나타낸다.
도 3은 ADCY3 과발현된 HEK293 세포에서 ADCY3의 발현이 세포 이동(A), 침윤(B)과 콜로니 형성(C)에 미치는 영향 및 SNU-216 위암 세포주에서 siRNA 처리에 ADCY3 단백질 발현의 감소(D), 세포이동(E), 침윤(F), 그리고 콜로니 형성능(G)의 ADCY3 사일런싱 효과를 나타낸다.
도 4는 ADCY3 발현 컨스트럭트 (pAc-GFP-ADCY3)를 감염시킨 HEK293 세포에서 mRNA 및 단백질 양의 증가(A), cAMP 양의 증가(B), 및 p-CREB의 증가(C)를 나타낸다.
도 5의 A는 위암 세포주에서 ADCY3의 메틸레이션 상태를 분석한 CpG 섬 지도를 나타낸다(a, b, c; MS-HRM 스크리닝 지역, d; 중아황산염 염기분석 지역). B는 HRM 분석 결과를 나타내며, HRM1, 2, 3은 A의 a, b, c 지역과 각각 일치한다. C는 중아황산염 염기서열분석 결과를 나타내며, KATOIII 세포주만이 패널 A의 d 지역에서 심한 메틸레이션을 보여주었다. D는 5-Aza-dC 처리에 의한 디메틸레이션은 음성 콘트롤과 비교했을 때 ADCY3 프로모터의 메틸레이션을 감소시키는 결과를 나타내며, E는 qRT-PCR로 평가했을 때 KATOIII 세포주에서 ADCY3 발현을 회복시키는 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포 및 조직 시료의 준비
인간 암 세포주들 (SNU-216, SNU-638, SNU-719-KCLB, Seuol, Korea; AGS, KATOIII, MKN28, HCT-116, SNU-81, SK-BR-3, Manassas, USA), 인간 표피 섬유아세포(HDF, ATCC로부터 분양받음) 및 HEK293 세포는 10% (v/v) FBS와 1 × 페니실린-스트렙토마이신 (Invitrogen, USA)을 포함하는 배지 (Cellgro, USA)에서 배양하였다. 인간 유방 표피 세포 (HMEC, Lonza, Switzerland)는 공급자로부터 제공받은 방법에 따라서 배양하였다. 또한, 정상 및 위암 조직 (표 1)은 국립암센터의 기관윤리심의 위원회로부터 인간 대상의 연구 승인 (승인번호: NCCNCS-08-127)을 받아 헬싱키 선언의 원칙에 의거하여 확보하였다.
Figure 112012057554834-pat00001
실시예 2. RT - PCR , qRT - PCR 및 노던 블랏팅을 통한 ADCY3 의 mRNA 확인
cDNA는 배양세포로부터 2 ㎍의 무작위 프라이머와 SuperScriptTMIII Fisrt-Strand Synthesis Kit (Invtrogen)를 이용하여 합성하였다. 또한, Hunam Multiple Tissue cDNA panel I (Clontech, USA)과 Human Digestive System MTC panel (Clontech, USA)을 사용하여 인간 조직 cDNA를 얻었다. RT-PCR과 qRT-PCR을 위한 프라이머들은 인터넷 사이트 "Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primers/)"를 이용하여 ADCY들에 대해 두개의 연속적인 엑손을 포함하도록 제작하였다 (표 2).
Figure 112012057554834-pat00002
qRT-PCR 반응은 LightCycler480 (Roche applied science, UK)와 ABI 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems)을 이용하여 β-액틴을 기준으로 상대적인 양을 측정하거나, 절대량 (absolute quantification)을 기초로 하는 표준 곡선을 사용하여 정량을 수행하였다.
노던 블랏팅을 위해서, 전체 RNA (20 ㎍/lane)을 Hybond-N+ membrane(Amersham Biosicence, UK)에 UV-고정하고 32P-라벨된 프로프가 포함된 ULTRAhyb solution (Ambion, USA)에서 42℃에서 하루 밤동안 반응시킨 후, -80℃에서 Bio Max MS 필름 (Kodak, USA)을 이용하여 확인하였다.
실시예 3. ADCY3 발현 의존형 세포 이동과 조절에 의한 침윤 평가
ADCY3의 과발현을 위해, HEK293 세포에 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000; Invitrogen)을 이용하여 pAcGFP1-ADCY3 벡터를 도입하였고, 음성 대조군으로 pAcGFP1-C1 벡터를 도입하였다.
또한, ADCY3 유전자의 발현을 억제하기 위해, 6 웰 플레이트에 각각 5 × 104 세포 농도의 인간 위암 세포 SNU-216를 준비하고, ADCY3 특이적인 siRNA (siADCY3: SI00058849 5’-ATGGAGCACCAGCTTCCTCAA-3’, 서열번호 1) 및 음성 대조군으로 사용된 siRNA (Cat. No. 1027280, Qiagen)를 HiPerfect (Qiagen)를 사용하여 처리하였다.
ADCY3의 단백질 발현을 평가하기 위해, 항-ADCY3 (ab14778, Abcam, England), 항-GFP (sc-9996, Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-CREB, 항-인산화-CREB Ser133 (#8212, Cell Signaling Technology, USA), 항-β-액틴, 항-α-튜불린(Sigma-Aldrich, USA) 항체들을 이용하여 웨스턴 블랏팅을 통해 총-CREB와 인산화-CREB의 양을 측정하였다.
세포 이동은 37℃에서 8 ㎛ pore filter insert (BD, USA)를 사용하여 하루밤동안 아래쪽으로 이동한 세포들을 1% 크리스탈 바이올랫 (crystral violet)으로 염색하고, VERSAmax microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 A564에서 측정하여 확인하였다.
침윤 평가는 Matrigel-coated insert에서 48시간동안 배양한 후 Diff-QuickTM(Sysmex, Japan)로 염색된 세포들의 수를 측정하여 확인하였다.
콜로니 형성능은 6 웰 플레이트에서 웰당 1 × 103세포를 7일간 배양한 후 Diff-QuickTM으로 염색하여 살아남은 콜로니들을 수를 측정하여 확인하였다.
실시예 4. cAMP 양의 측정
ADCY3와 그들 패밀리 단백질들의 발현에 따른 활성 변화를 확인하기 위해, ADCY3 발현에 따른 cAMP 양의 증가를 확인하였다. 웰당 2 × 104 개의 HEK293 세포를 포함하는 96 웰 배양 접시 상에서 400 ng의 pAcGFP 또는 pAcGFP-ADCY3를 리포펙타민 2000을 이용하여 형질도입하였다.
cAMP 양은 50 ㎕의 세포 용해물을 CatchPoint cyclic-AMP Fluorescent Assay Kit (Cat#R8088, Molecular Devices, Sunnyvale, USA)을 이용하여 제조업자의 방법에 따라서 측정하여 확인하였다.
실시예 5. 프로모터 메틸화 분석과 시험관내 탈메틸화
ADCY3 프로모터의 메틸화 상태를 평가하기 위해, 중아황산염 처리된 유전체 DNA에 EZ DNA Methylation-Kit (ZYMO Research, USA) 및 EpiDesigner (Sequenom, USA)를 이용하여 디자인한 메틸화 특이적인 프라이머를 처리하였다 (표 3).
Figure 112012057554834-pat00003
고-해상도 용융 실험 (High-resolution melting assay; MS-HRM)을 10 ng의 중아황산염 처리된 유전체 DNA와 LightCycler (Roche applied science)의 ResoLight dye를 이용하여 제조업체로부터 제공된 방법을 사용하여 처리한 후, Gene scanning 프로그램 (Roche)를 이용하여 분석하였다. 중아황산염 서열확인을 위해, 39 CpG 부위를 포함하는 프로모터 지역을 중아황산염 처리한 위암 세포 유전체 DNA로부터 증폭하고, TOPO-TA 벡터 (Invitrogen)을 이용하여 클로닝하여, 3730xl DNA 분석기 (Applied Biosystems)를 이용하여 서열을 확인하였다.
ADCY3에서 탈메틸화 효과를 보기위해, KATOIII 세포를 최종농도를 10 μM로 하여 96시간동안 5-Aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-dC; Sigma Aldrich, USA)를 처리하거나 혹은 처리하지 않은 배지에서 배양하여 ADCY3의 mRNA 양을 qRT-PCR을 이용하여 측정하였다.
실시예 6. 통계학적 분석
데이터의 통계학적 유의성은 Student's t-test를 이용하여 확인하였다. P-값은 0.05보다 작을 경우 통계학적으로 유의하다고 판단하였다. Student's t-test는 그룹간의 차이를 측정하여 수행하였다.
결과
1. 위암에서 ADCY3 의 증가된 발현
27명의 위암 환자에서 정상 조직과 위암 조직 간에 비교한 마이크로어레이 분석 결과, ADCY3가 위암 조직 및 세포에서 현저하게 과발현되는 것을 확인하여, ADCY3가 위암 진단을 위한 유전자가 될 수 있음을 발견하였다. 이러한 발견을 확인하고자, ADCY3의 상향-조절이 인간 위암의 진행과 어떤 관계가 있는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 qRT-PCR을 수행하여 ADCY3 발현양을 확인하였다. 6개의 위암 세포주 (SNU-216, SNU-638, SNU-719, AGS, KATO III, MKN-28)와 2개의 정상 인간 세포주 (HDF, HMEC)에서 ADCY3의 mRNA 양이 대부분의 위암 세포주가 정상 세포주와 비교했을 때 현저하게 높다는 것을 밝혀냈다 (도 1A). 또한, 21개의 한국 위암 세포 조직 중 19개 (95%)가 ADCY3 mRNA의 발현이 높게 나타났으며, 특히 21개 중 11개 (51.4%)가 주변의 정상 부위와 비교했을 때 높은 ADCY3 발현을 나타내었다 (도 1B).
추가적으로, 다른 암 및 정상 세포주에서 ADCY3의 선택적 스플라이싱 이소폼(alternative spliced isoform)이 존재하는지 여부를 노던블랏 분석으로 확인하였다. 스플라이스 변이체 (splice varients)를 발견할 수 없었으며, 4.4 kb에서 ADCY3의 단일 전사체를 측정할 수 있었고, 이 사이즈는 데이터베이스의 mRNA의 사이즈와 일치한다 (도 1C).
2. 위암에서 ADCY3 의 증가된 발현의 특이성
ADCY 패밀리는 ADCY1 내지 ADCY10의 10개의 서로 다른 멤버로 구성되어 있고, 모두 그들의 활성 부위의 서열 상동성을 공유한다. 진화학적으로 ADCY3는 ClustralW를 이용하여 그들의 오픈 리딩 프레임을 나열하고 비교하였을 때, ADCY2, ADCY4 및 ADCY7과 가깝다. 암발생에서 ADCY3 발현의 분석에 앞서, ADCY 패밀리 멤버간의 프라미어의 상호 반응성을 찾기 위하여 발현 테이터를 확인하였다. 위암세포 SNU-216, SNU-638, SNU-719, AGS, KATO III, MKN-28 및 정상세포 HDF, HMEC에서 다양한 ADCY 멤버들의 특이적인 프라이머로 RT-PCR을 수행했을 때, ADCY3를 제외한 나머지 ADCY 멤버는 위암 특이적으로 발현되지 않음을 확인하였다. 구체적으로, ADCY6 및 ADCY7은 위암 세포 및 정상세포에서 모두 발현하였으며, 나머지 ADCY 멤버들은 거의 발현하지 않으며, 각각의 세포별로 일부만이 발현함을 확인하였다 (도 2). 이러한 결과는, 모든 ADCY가 위암에서 발현하는 것이 아니며, ADCY 멤버 중에서 ADCY3만이 오직 위암 특이적으로 발현한다는 것을 의미하며, 그에 따라 ADCY3를 위암 특이적 마커로서 이용 가능함을 보여준다.
3. 위암 진행에서 ADCY3 의 역할
위암에서 ADCY3 유전자의 기능을 이해하기 위하여, 먼저 ADCY3가 과발현된 HEK293 세포에서 세포 이동과 침윤의 특성을 실험하였다. 세포 이동 실험에서 이동된 세포의 숫자는 pAcGFP-ADCY3 감염 세포에서 현저하게 증가되었고 (P=0.01), A564 측정에 의하여 ADCY3이 과발현된 경우 세포 이동이 약 43% 증가됨을 확인하였다 (도 3A). 세포이동과 마찬가지로, ADCY3가 감염된 HEK293 세포는 빈 벡터 콘트롤과 비교할 때 4.95배 침윤성 (invasiveness)의 증가를 보여주었다 (P=0.02)(도 3B). 이러한 결과들은 ADCY3의 과발현이 세포의 이동성과 침윤성을 증가시킴을 보여준다. 또한, pAcGFP-ADC3 과발현이 부착성 세포 증식 (anchorage-dependent cell growth)에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 밝히기 위하여, 콜로니 형성능을 실험하였다. 그 결과, 빈 벡터 대조군보다 pAcGFP-ADCY3 감염 세포에서 1.5배 증가하였다 (P<0.005)(도 3C). 이와 같은 결과를 통하여 ADCY3가 종양 형성과 관련된 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 ADCY3의 종양 형성 관련 효과가 ADCY3 특이적인 siRNA의 처리에 의하여 저해되는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 1 및 2에서 ADCY3가 과발현되는 것으로 확인된 SNU-216 위암 세포주에 ADCY3 특이적 siRNA를 처리하여 그 기능이 저해되는지 확인하였다. ADCY3 siRNA를 처리하는 경우, 그 발현이 하향 조절되고(도 3D), 세포 이동을 21% 감소시키며 (P=0.015)(도 3E), 세포의 침윤성을 5.29배 감소시켰다 (P=0.016)(도 3F). 또한, 세포 콜로니 형성능은 ADCY3 siRNA 처리 세포에서 NC siRNA 처리 세포보다 1.8배 감소되었다 (P=0.002)(도 3G). 이러한 결과들을 통하여, ADCY3의 발현을 억제시킬 경우 종양 형성과 관련된 효과를 낮추며, 그에 따라 ADCY3가 세포 증식을 가속한다는 것을 확인할 수 있다.
추가적으로, 위암의 진행에서 ADCY3의 상향 조절의 기능적 역할을 이해하기 위하여, pAcGFP-ADCY3가 감염된 세포에서 cAMP 양을 측정하였다. 먼저, ADCY3의 과발현을 확인하기 위하여, qRT-PCR에 의해 mRNA의 양을, 웨스턴 블랏으로 단백질의 양을 확인하였다 (도 4A). 다음으로, ADCY3 감염된 HEK293 세포는 cAMP 농도가 빈 벡터 콘트롤과 비교할 때 1.99배 증가한 것을 확인하였고 (P=0.0002), 그에 따라 ADCY3가 과발현되면 cAMP 농도에 영향을 미침을 확인하였다 (도 4B). 상기 결과와 관련하여, 위암의 진행에서 cAMP의 축적의 효과를 CREB 활성을 통해 조사하였다. 빈 벡터 콘트롤과 pAc-GFR-ADCY3 전달된 세포사이에서 총-CREB (t-CREB)와 단백질의 Ser133 잔기의 인산화-CRBE (p-CREB)의 양을 비교하였다. cAMP 양과 일치하게, t-CREB 양은 빈 벡터 콘트롤과 pAc-GFP-ADCY3 전달된 세포사이에서 일정하였으나, p-CREB의 양은 pAc-GFP-ADCY3 감염된 세포에서 현저하게 증가되어 있었다 (도 4C). 이러한 결과를 통하여 ADCY3가 과발현되는 경우, 세포 증식을 조절하는 신호 전달 인자의 증가를 확인할 수 있었다.
4. 프로모터 부위 CpG 메틸레이션의 ADCY3 발현 조절
암과 관련된 유전자 발현에서 DNA 메틸레이션의 역할이 최근에 연구되고 있는바, ADCY3 mRNA의 발현이 DNA 메틸레이션에 의해 조절되는지 여부를 확인하였다. 첫째, 번역 출발 부위 (translation start site)의 1kb 업스트림을 포함하는 ADCY3 프로모터 부위에 대하여 메틸레이션-민감성 고해상도 융합 (methylation-sensitive high resolution melting; MS-HRM) 분석을 하였다. 그러나, 높은 밀도 (high-density)의 CpG 부위 때문에, 단지 번역 시작부위 (ATG 코돈)의 -585부터 -129 업스트림 부위의 457bp를 포함하는 세 개의 프라이머쌍만이 설계되었고, 그 부위를 HRM으로 분석하였다 (도 5A). 결과들은 확연한 메틸레이션의 차이를 보여주지 않는데, 아마도 이들 지역이 기능을 가지는 CpG 섬을 정확하게 포함하지 않는 부위일 것이기 때문이다 (도 5B). 따라서, 더 업스트림에 위치한 번역 시작부위의 -694부터 -387을 포함하는 CpG 섬에 위치하는 308bp 중아황산염 처리한 DNA를 클로닝하고 염기서열분석을 했다. 그 결과, ADCY3를 발현하지 않는 KATOIII 세포주는 과메틸레이션 (hypermethylation)을, SNU-216, SNU-638, SNU-719, AGS와 MKN-28 같은 ADCY3를 많이 발현하는 세포주들은 메틸레이션의 양이 작음을 확인하였다 (도 5C). 프로모터 CpG 메틸레이션에 의한 ADCY 발현의 조절은 5-Aza-dC같은 디메틸레이션 물질을 KATOIII 세포주에 처리하여 확인하였다. 이 처리에 의한 결과로, ADCY3 프로모터의 CpG 부위, 특히 CpG 부위 31-39가 디메틸레이션되고 (도 5D) 음성 콘트롤과 비교했을 때 qRT-PCR에 의한 ADCY3 mRNA의 발현 양이 회복되는 것을 확인하였다 (도 5E). 종합하면, 이러한 결과들은 프로모터 부위의 CpG 섬의 DNA 메틸레이션이 ADCY3 발현을 조절한다는 것을 암시한다.
<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> Use of ADCY3 for the Diagnosis and Treatment of Gastric Cancer <130> PA120513KR <160> 29 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siADCY3 <400> 1 auggagcacc agcuuccuca a 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY1 <400> 2 ccatccccaa cttcaatgac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY1 <400> 3 aggtgggagg agatggactt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY2 <400> 4 ccatggtgga gtttgctttt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY2 <400> 5 tgacagtgtt gccccagata 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY3 <400> 6 gagtcacccc cgatgtcaac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY3 <400> 7 ttgccccaga tgtcgtagtg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY4 <400> 8 ctctccaagc ccaagttcag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY4 <400> 9 actacgggtc catggttcaa 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY5 <400> 10 agtgtgtggc ggtcatgtt 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY5 <400> 11 ctgccgatgg tcttgatctt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY6 <400> 12 gaggcaaaca atgagggtgt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY6 <400> 13 tagtcagcca gggcagtgat 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY7 <400> 14 ggcgtggaga agatcaagac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY7 <400> 15 cggaaggagt tgaaggagtg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY8 <400> 16 tgctgacttc gatgagttgc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY8 <400> 17 gtcagggcga gtgagaagtc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY9 <400> 18 gctgctcctg ctctacgtct 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY9 <400> 19 aggcggtagc tgacttcaaa 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY10 <400> 20 taggtacatg gaggggcaag 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY10 <400> 21 gacgtaagcc atcaggtggt 20 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY3-HRM1 <400> 22 aaatagaagg aaggtttagg aattt 25 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY3-HRM1 <400> 23 tcctatccct aacttataaa aaaacc 26 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY3-HRM2 <400> 24 ggttaggttt ttttataagt taggga 26 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY3-HRM2 <400> 25 caaaaccttc cctaccaccc 20 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY3-HRM2 <400> 26 gttgggaggt ttttgtagta gagat 25 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY3-HRM2 <400> 27 aaaaaaaacc acctccaaca a 21 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ADCY3-BS <400> 28 tttttaaggg atagtttgtg aattt 25 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ADCY3-BS <400> 29 aaccctatcc tactcccaaa aaac 24

Claims (17)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. ADCY3 (Adenylate cyclase 3) 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 위암 진단용 조성물.
  5. 제4항의 조성물을 포함하는 위암 진단용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 위암 진단용 키트.
  7. (a) 분리된 생물학적 시료를 제공하는 단계;
    (b) 상기 생물학적 시료에 ADCY3의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 생물학적 시료의 메틸화 수준을 정상 대조군과 비교하여 생물학적 시료에서 정상 대조군에 비하여 메틸화가 낮아지는 경우 위암으로 판단하는 단계를 포함하는, ADCY3 유전자 메틸화 측정을 통하여 위암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. (a) ADCY3 폴리펩티드를 발현하는 세포에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
    (b) ADCY3 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 위암 치료제의 스크리닝 방법.
  15. 제4항에 있어서, 상기 ADCY3 유전자의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물; ADCY3 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머인 서열번호 22 및 서열번호 23으로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머쌍, 서열번호 24 및 서열번호 25로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머쌍, 및 서열번호 26 및 서열번호 27으로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머쌍; 및 ADCY3 유전자 서열에 특이적인 프라이머인 서열번호 28 및 서열번호 29로 표시되는 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머쌍;을 포함하는 것인 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 ADCY3 유전자의 메틸화 수준이 위암 치료제 후보물질 처리전과 비교하여 메틸화가 높아지는 경우 위암 치료제로 판단하는 것인, 위암 치료제의 스크리닝 방법.
  17. (a) 분리된 생물학적 시료를 제공하는 단계;
    (b) 상기 생물학적 시료에 ADCY3의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 처리하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 생물학적 시료의 메틸화 수준을 정상 대조군과 비교하여 생물학적 시료에서 정상 대조군에 비하여 메틸화가 낮아지는 경우 위암으로 판단하는 단계를 포함하는, 위암 진단을 위하여 정보를 제공하는 방법.
KR1020120078443A 2012-07-18 2012-07-18 위암 진단 및 치료를 위한 ａｄｃｙ3의 용도 KR101416147B1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120078443A KR101416147B1 (ko) 2012-07-18 2012-07-18 위암 진단 및 치료를 위한 ａｄｃｙ3의 용도
US14/411,970 US10435752B2 (en) 2012-07-18 2012-08-20 Use of ADCY3 for diagnosis and treatment of gastric cancer
EP12881322.7A EP2876444A4 (en) 2012-07-18 2012-08-20 USE OF ADCY3 FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF GAS CANCER
PCT/KR2012/006606 WO2014014157A1 (ko) 2012-07-18 2012-08-20 위암 진단 및 치료를 위한 ａｄｃｙ3의 용도
JP2015518309A JP6005272B2 (ja) 2012-07-18 2012-08-20 胃癌診断及び治療のためのａｄｃｙ３の用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120078443A KR101416147B1 (ko) 2012-07-18 2012-07-18 위암 진단 및 치료를 위한 ａｄｃｙ3의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140011710A KR20140011710A (ko) 2014-01-29
KR101416147B1 true KR101416147B1 (ko) 2014-07-09

Family

ID=49948970

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120078443A KR101416147B1 (ko) 2012-07-18 2012-07-18 위암 진단 및 치료를 위한 ａｄｃｙ3의 용도

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10435752B2 (ko)
EP (1) EP2876444A4 (ko)
JP (1) JP6005272B2 (ko)
KR (1) KR101416147B1 (ko)
WO (1) WO2014014157A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA45275A (fr) 2016-09-30 2018-06-20 Nat Cancer Ct Procédé d'assistance au diagnostic du risque d'apparition du cancer gastrique et adn artificiel et kit permettant de diagnostiquer le risque d'apparition du cancer gastrique utilisés dans le procédé
CN110168106B (zh) 2017-03-14 2024-02-20 洛博生物科技有限公司 预测进展期胃癌患者的术后预后或抗癌药物适合性的系统
CN109652548B (zh) * 2019-01-21 2022-08-05 首都医科大学附属北京朝阳医院 circ-CCNB1作为胃癌和结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点的应用
WO2024001602A1 (zh) * 2022-07-01 2024-01-04 圣湘生物科技股份有限公司 一种用于检测胃癌的组合物，试剂盒及其用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007014500A1 (en) * 2005-08-02 2007-02-08 Capitalbio Corporation Differential expression gene profiles and applications in molecular staging of human gastric cancer
WO2011073629A2 (en) * 2009-12-17 2011-06-23 Ucl Business Plc Cancer diagnosis and treatment

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4297209B2 (ja) * 2001-03-30 2009-07-15 独立行政法人産業技術総合研究所 Ｋｉａａ０１７２遺伝子の疾病治療及び診断並びに創薬への利用
WO2004005483A2 (en) 2002-07-10 2004-01-15 Exelixis, Inc. ADCY3S AS MODIFIERS OF THE p21 PATHWAY AND METHODS OF USE
WO2005100998A2 (en) * 2004-04-16 2005-10-27 Europroteome Ag Membrane markers for use in cancer diagnosis and therapy
WO2006105642A1 (en) 2005-04-05 2006-10-12 British Columbia Cancer Agency Biomarkers for the detection of lung cancer and uses thereof
US20130130354A1 (en) * 2010-09-28 2013-05-23 CTI Salud S.A. Novel genes and uses thereof, expression profile of colon, gastric and pancreatic cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007014500A1 (en) * 2005-08-02 2007-02-08 Capitalbio Corporation Differential expression gene profiles and applications in molecular staging of human gastric cancer
WO2011073629A2 (en) * 2009-12-17 2011-06-23 Ucl Business Plc Cancer diagnosis and treatment

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Int. J. Data mining and Bioinformatics, 2011, 5권,5호,519-531면. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2014014157A1 (ko) 2014-01-23
US10435752B2 (en) 2019-10-08
KR20140011710A (ko) 2014-01-29
EP2876444A1 (en) 2015-05-27
US20150240313A1 (en) 2015-08-27
JP2015528694A (ja) 2015-10-01
EP2876444A4 (en) 2016-03-23
JP6005272B2 (ja) 2016-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220372582A1 (en) Tert promoter mutations in cancer
DK2456889T3 (en) Markers of endometrial cancer
US20140221244A1 (en) Methods and Compositions for the Treatment and Diagnosis of Colorectal Cancer
WO2005084109A2 (en) Cancer specific gene mh15
WO2008101118A2 (en) A gene expression signature identifying pro-angiogenic genes in ovarian tumor endothelial cell isolates
KR101966493B1 (ko) 삼중음성유방암 예후 예측용 바이오마커
JP2010512730A (ja) 肺癌の腫瘍マーカーおよび治療標的としてのｔｔｋ
TWI816712B (zh) 癌促進因子表現抑制劑的有效成分之篩選用試藥及其篩選方法、癌之預防或治療劑的有效成分之篩選用試藥及其篩選方法、癌促進因子表現抑制劑及癌之預防或治療劑
KR101416147B1 (ko) 위암 진단 및 치료를 위한 ａｄｃｙ3의 용도
EP2361315B1 (en) Cxcl4l1 as a biomarker of pancreatic cancer
US20120201837A1 (en) Use of eif3m for the diagnosis and treatment of cancer
KR20150085459A (ko) 대장암 마커로서의 신규 ntrk1 융합유전자 및 이의 용도
WO2009141440A1 (en) Netrin-1 overexpression as a biological marker and a survival factor for aggressive neuroblastoma
WO2012078648A2 (en) Novel method of cancer diagnosis and prognosis and prediction of response to therapy
KR20160021058A (ko) 암 진단 또는 치료 표적으로서 lypd1의 용도
JP6820014B2 (ja) 子宮体がんのリンパ節転移能の評価方法
US20110070245A1 (en) Imp-1 oncogene as a therapeutic target and prognostic indicator for lung cancer
KR20190037071A (ko) 대장암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도
KR101917677B1 (ko) 폐암의 예후 예측용 바이오 마커로서 메티오닐-티알엔에이 합성효소(mrs)의 유용성
US7635560B2 (en) Pygopus in diagnosis and treatment of cancer
KR20230077936A (ko) 구강암의 시스플라틴 내성 예측용 바이오마커 및 이의 용도
KR101927577B1 (ko) 간암 바이오 마커로서 ｈ２ａ．ｚ．１의 용도
KR20140042577A (ko) 암의 예후 예측 및 치료를 위한 ｍａｅｌ의 용도
KR20180132376A (ko) 대장암 진단 마커로서의 신규 folr2 융합유전자 및 이의 용도
WO2012011778A2 (ko) 암 진단 키트 및 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170426

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180620

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190625

Year of fee payment: 6