KR20190037071A - 대장암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

대장암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장암의 항암제 내성 여부를 진단할 수 있는 바이오마커를 이용한 항암제 내성 진단용 키트를 제공함으로써, 대장암 환자의 항암제에 대한 내성 여부를 사전에 판정하여 환자 맞춤형 치료를 가능하게 한다.
또한, 본 발명은 EphB3의 발현수준을 측정하는 방법을 통해 대장암 환자의 항암제에 대한 내성 여부에 관한 정보를 효과적으로 제공할 수 있으며, EphB3의 억제제를 함유하는 본 발명에 다른 약제학적 조성물을 사용하면 이러한 항암제에 대한 내성을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한, EphB3의 발현을 억제할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 통해 항암제 내성 억제제를 효과적으로 탐색할 수 있다.

Description

대장암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도{Biomarker for Diagnosis of Anticancer drug Resistance of Colon Cancer and Uses thereof}
본 발명은 대장암 환자의 항암제 내성 진단 마커로서의 EphB3, 이를 이용한 항암제 내성 진단용 키트 및 상기 EphB3의 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 대한 내성 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
대장암은 현재 우리나라에서 전체 3번째의 높은 발생률을 가지고 있으며, 남자에서 2번째, 여자에서 3번째의 높은 발생률 가지며 그 발생률과 사망률이 계속 증가하고 있는 추세를 보인다. 또한 생활양식이 점차 서구화되어 가는 것을 고려하면 대장암의 증가는 더욱 가속화 될 것으로 예상되어 우리 사회에서 대장암에 대한 적극적 관심과 연구가 반드시 필요하다. 또한 대장암은 완치 후 재발률이 최대 50%에 이를 정도로 높아 그 위험률은 더 심각하다. 대장암은 외과적 근치 절제술이 치료의 원칙이고 조기 대장암일 경우에는 수술만으로 좋은 생존율이 기대된다. 암이 전이된 환자의 경우나 재발 또는 전이의 위험이 높은 환자의 경우에는 보조요법으로 이리노테칸, 옥살리플라틴과 같은 상대적으로 비 선택적인 세포독성의 약제들이 지금까지 대장암의 치료에 사용되었으며 이에 더하여 최근에는 선택적인 치료제로 알려진 세툭시맙이나 베바시주맙과 같은 약제들이 대장암 치료제로 사용되고 있다. 이제까지 대장암의 항암요법에 널리 쓰이는 약제는 대장암 세포뿐만 아니라 정상 세포도 죽임으로써 심각한 부작용을 초래하였으며, 암화 과정의 억제에 집중되어있기 때문에 실질적인 치료의 한계를 가지고 있다. 또한 선택적인 치료제로 알려진 표적항암제의 경우에는 항암제 내성이라는 큰 문제점을 가진다. 따라서 앞으로 개발이 될 약제들은 이러한 부작용을 최소화시키는 약제가 되어야 한다.
EGFR은 서로 가까이서 작용을 하는 4종류의 키나아제들인 EGFR, HER2/c-neu, Her3 및 Her4의 아과(subfamily)이다. EGFR은 세포표면에 위치하면서 리간드인 EGF (epidermal growth factor) 및 transforming growth factor α 등과 결합하면서 활성화된다. EGFR의 활성화는 표피세포의 내재면역반응에 매우 중요하다. 반면에, 변이를 통한 과다 발현이나 과다반응은 세포의 성장이나 전이, 신생혈관형성에 자극이 되어 폐암, 대장암 등의 암 발생과 관련이 있다고 보고되고 있다. 이와 관련하여 EGFR와 결합하여 활성화를 막는 항체가 대장, 결장암 등의 치료제로 승인을 받아서 사용되고 있다.
상대적으로 비선택적인 세포독성의 약제들이 많이 사용되다가, 2000년대 중반 이후에는 세툭시맙, 베바시주맙과 같은 표적치료제의 도입으로 전이성 대장암 환자의 생존율이 크게 향상되었다. 표적치료제는 분자와 세포 수준의 변화에 초점을 맞춤으로써 기존의 치료보다 효과적이고 정상세포에 대한 피해가 적어 그 부작용이 적은 장점을 가진다.
이러한 표적항암제는 특정 암종에서 나타나는 신호전달기전의 이상을 타겟으로 제작된 것으로, 정상세포에 대한 독성은 거의 없으며 특정 표적인자가 나타나는 환자에서 효과를 볼 수 있다. 그러나 상기 표적항암제의 가장 큰 문제점은 항암제 내성이며, 이 내성 기전을 규명하여 극복하여야 한다. 전이성 대장암 환자의 약 50-70 %가 KRAS wild type이고 이 환자들을 대상으로 세툭시맙과 같은 EGFR 표적치료제를 이용한 치료가 이루어지고 있다.
상기 EGFR 표적치료제는 화학치료에 반응하지 않는 대장암을 앓는 환자의 전체 생존율을 개선하고 삶의 질을 보존하지만, 이러한 환자들의 대부분은 내성을 가지고 있기 때문에 상기 표적치료제의 효과가 상대적으로 높지 않다. 따라서, 상기 EGFR 티로신 키나아제 억제제에 대한 효과를 극대화할 수 있도록 항암제 내성 여부를 판단하기 위한 바이오마커 및 상기 항암제에 대한 내성을 억제할 수 있는 약제의 개발이 요구되고 있다.
JP 2016-532856 A KR 1622454 B
본 발명자들은 대장암의 항암제 내성 여부를 조기에 정확하게 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하고자 예의 노력하였으며, 아울러 대장암의 항암제 내성을 극복하기 위한 치료제를 개발하기 위한 연구를 실시하였다. 그 결과, EphB3의 발현이 항암제 비내성 대장암 세포주에 비하여 항암제 내성 대장암 세포주에서 현저히 증가되어 있음을 확인하여 EphB3가 항암제 내성 획득에 관여하고 있음을 검증하였으며, 나아가 EphB3의 발현 억제를 통하여 항암제 내성 대장암 환자의 항암제에 대한 감수성(susceptibility)을 증진시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 대장암의 항암제 내성 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 대장암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 효과적으로 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 대장암의 항암제 내성 억제용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암제 내성 억제제를 효과적으로 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 EphB3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머, 올리고펩타이드 또는 PNA(Peptide nucleic acid), 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자에 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 대장암의 항암제 내성 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 대장암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검체로부터 EphB3의 발현수준을 측정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 EphB3의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 대한 내성 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 EphB3의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 포함하는 항암제에 대한 감수성 증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 EGFR을 표적으로 하는 항암제, 및 EphB3의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) EphB3를 발현하는 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; b) 피검화합물이 처리된 세포에서 EphB3의 발현수준을 측정하는 단계; 및 c) 대조군과 비교하여 발현수준이 감소된 시험군의 피검화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 항암제에 대한 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 대장암의 항암제 내성 여부를 진단할 수 있는 바이오마커 및 이를 포함하는 항암제 내성 진단용 키트를 제공함으로써, 대장암 환자의 항암제에 대한 내성 여부를 사전에 판정하여 환자 맞춤형 치료를 가능하게 한다.
또한, 본 발명은 EphB3의 발현수준을 측정하는 방법을 통해 대장암 환자의 항암제에 대한 내성 여부에 관한 정보를 효과적으로 제공할 수 있으며, EphB3의 억제제를 함유하는 본 발명에 다른 약제학적 조성물을 사용하면 이러한 항암제에 대한 내성을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한, EphB3의 발현을 억제할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 통해 항암제 내성 억제제를 효과적으로 탐색할 수 있다.
도 1은 항암제 내성 대장암 세포주(SW48R)가 그렇지 않은 세포주(SW48)에 비해 항암제에 대한 내성을 가지고 있음을 보여주는 MTT 어세이 결과이다.
도 2는 세툭시맙 내성 대장암 세포주(SW48R)가 그렇지 않은 세포주(SW48)에 비해 세툭시맙에 의한 암 세포 성장 억제 효과가 더 적은 것을 나타내는 MTT 어세이 결과이다.
도 3은 세툭시맙 내성 대장암 세포주(SW48R)가 그렇지 않은 세포주(SW48)에 비해 세툭시맙에 의한 암 세포 성장 억제 효과가 더 적은 것을 나타내는 콜로니 형성능력 확인(colony formation assay) 사진이다.
도 4는 대장암 세포에서 세툭시맙 내성 획득에 따른 내성 관련 마커의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하여 나타낸 것이다.
도 5는 대장암 세포에서 세툭시맙 내성 획득에 따른 EGFR 신호전달 관련 단백질의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하여 나타낸 것이다.
도 6 및 도 7은 Stat3에 의하여 Gli1(SHH 신호전달 관련 단백질)이 조절되는 것을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.
도 8은 세툭시맙의 내성을 가진 세포주에 대하여 DNA 수준의 잠재적 관련성을 평가하기 위하여 SW48 모세포와 SW48R 세포의 샘플에서 DNA 수준에 대한 표준 Microarray 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 대장암 세포에 EFNB3를 첨가하는 경우 EFNB3의 수용체인 EphB3의 단백질 발현이 증가하고, 약물 내성 관련 마커 및 EGFR 신호전달 관련 단백질의 발현이 증가하는 것을 나타내는 웨스턴 블랏 실험 결과이다.
도 10은 대장암 모세포주인 SW48에 EFNB3의 농도를 증가시켜가며 배양하고 이를 MTT 어세이한 결과를 나타내는 것이다.
도 11 및 도 12는 모세포주(SW48)에 비해 항암제 내성 대장암 세포(SW48R)에서 EphB3의 발현 및 분비가 현저히 증가되어 있음을 각각 나타내는 Immunofluorescence 및 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 13은 대장암 세포에 EphB3 억제제를 처리한 후 EGFR 신호전달 관련 단백질, 내성 관련 marker 등을 사용하여 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 SW48R 세포에 세툭시맙과 EphB3 억제제를 조합하여 처리하는 경우의 세포 생존 능력을 MTT assay를 통하여 확인한 결과이다.
도 15는 SW48R 세포에서 세툭시맙과 siSTAT3를 조합하여 처리하는 경우의 세포 생존 능력을 MTT assay를 통하여 확인한 것이다.
도 16은 대장암 세포에서 세툭시맙과 EphB3 억제제를 병용처리한 후 c-PARP 단백질 발현을 확인한 웨스턴 블랏 결과이고, 도 17은 대장암 세포에서 세툭시맙과 siSTAT3를 병용처리한 후 c-PARP 단백질 발현을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.
도 18은 대장암 세포에서 세툭시맙과 EphB3 억제제를 병용처리한 후 유세포 분석으로 세포사멸이 증가하는 것을 확인한 결과이고, 도 19는 대장암 세포에서 세툭시맙과 siSTAT3를 병용처리한 후 유세포 분석으로 세포사멸이 증가하는 것을 확인한 결과이다.
도 20은 대장암 세포주가 세툭시맙에 대한 내성을 획득 하였을 때, EGFR과 EphB3의 결합이 증가하는 것을 나타내는 것을 Co-immunoprecipitation을 통해 확인한 결과이다.
도 21은 대장암 세포주가 세툭시맙에 대한 내성을 획득 하였을 때, EGFR과 EphB3의 결합이 증가하는 것을 나타내는 것을 Immunofluorescence을 통해 확인한 결과이다.
도 22는 대장암 세포에서의 EGF의 농도를 ELISA를 이용하여 확인한 결과이다.
도 23은 세툭시맙에 대한 내성을 획득하게 되면 Stat3를 활성화하는 site로 알려진 p-EGFR(Y1068) site만이 활성화 되는 것을 Western blotting을 통해 확인한 결과이다.
도 24는 세툭시맙에 대한 내성을 획득하게 되면 Stat3를 활성화하는 site로 알려진 p-EGFR(Y1068) site가 EphB3 inhibitor에 의하여 그 활성정도가 감소하는 것을 Western blotting을 통해 확인한 결과이다.
도 25 및 도 26은 세툭시맙 치료 전의 대장암 조직과 치료 후 내성을 획득한 환자로부터 적출된 대장암 조직에서의 EphB3 및 EFNB3의 발현을 확인하기 위하여 Immunohistochemical(IHC) staining 분석을 수행한 결과이다.
도 27 및 도 28은 세툭시맙 치료 전의 대장암 조직과 치료 후 내성을 획득한 환자로부터 적출된 대장암 조직에서의 Gli1 및 Stat3의 발현을 확인하기 위하여 Immunohistochemical(IHC) staining 분석을 수행한 결과이다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 EphB3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머, 올리고펩타이드 또는 PNA(Peptide nucleic acid), 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자에 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 대장암의 항암제 내성 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명자들은 대장암의 항암제 내성 여부를 조기에 정확하게 분자진단 할 수 있는 바이오마커를 발굴하고자 예의 노력하였으며, 아울러 대장암의 항암제 내성 극복을 위한 치료제를 개발하기 위한 연구를 실시하였다. 그 결과, EphB3의 발현이 항암제 비내성 대장암 세포주에 비하여 항암제 내성 대장암 세포주에서 현저히 증가되어 있음을 확인하여 EphB3가 항암제 내성 획득에 관여하고 있음을 검증하였으며, 나아가 EphB3의 발현 억제를 통하여 항암제 내성 대장암의 항암제에 대한 감수성(susceptibility)을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 사용된 표현, “대장암의 내성 진단용 키트”는 “대장암의 내성 진단용 조성물”이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현“대장암의 항암제 내성 진단용 키트”는 “대장암의 항암제 내성 진단용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.
본 명세서에서 사용된 용어, “진단”은 항암제에 대한 대장암의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 발병한 대장암이 항암제 내성을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 또는 항암제 내성 대장암의 예후(prognosis)(예컨대, 항암 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 상기 진단에 대한 정보를 제공하는 것을 포함한다.
본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 대장암의 항암제 내성 획득 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 사용된 용어, “진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)”란 항암제 내성 대장암 세포를 판별할 수 있는 물질로, 항암제에 대하여 내성을 획득한 대장암 세포에서 증가 양상을 보이는 유기 생체 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 대장암 내성 진단 마커는 EphB3 단백질 및 이를 코딩하는 핵산분자(DNA 또는 mRNA)를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트, 즉 면역분석 방식(항원-항체 반응)으로 EphB3 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인할 수 있는 키트이며, 예를 들어, 상기 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다.
본 발명의 키트는 EphB3 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 측정하기 위한 EphB3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 항체란, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 새로운 대장암 내성 진단용 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein(1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.
본 발명의 항체는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab’), F(ab’)2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 키트는 통상적인 면역 분석 방법을 통하여 대장암의 항암제 내성을 진단하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.
상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA, 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물 또는 세포 배양물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물 또는 세포 배양물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
ELISA 방법을 포함한 면역분석 방법에서, 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
다른 한편으로, 본 발명의 키트는 마커 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏에 이용될 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동 하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 대장암의 내성 여부를 확인할 수 있다.
또 다른 한편으로, 본 발명의 키트는 상기 마커 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색에 이용될 수 있다.
본 발명의 키트에는, 항체 대신에 본 발명의 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 포함할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩티드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 마이크로어레이 또는 유전자 증폭 키트이다. 본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상 표면에 프로브가 고정화 되어 있으며, 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.
본 발명의 진단용 키트에 포함된 프로브 또는 프라이머는 EphB3 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용된 용어, "상보적(complementary)"은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화 할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "상보적"은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화 할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만, 전형적으로 15-30 뉴클레오티드이다. 이러한 프라이머의 디자인은 EphB3의 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프로브"는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고, 타깃 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다.
프라이머 또는 프로브 제작시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오티드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있으며, 이 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다.
본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA 또는 mRNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 예를 들어, 대장암 세포 또는 이의 배양액, 대장암 조직, 혈액, 혈청 및 혈장이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.
상기 "유전자 증폭 키트"를 언급하면서 사용한 용어,"증폭"은 핵산분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국등록특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국등록특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국등록특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국등록특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)와 같은 다양한 증폭 반응들이 당업계에 알려져 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 대장암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 검체로부터 EphB3의 발현수준을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 방법은 상술한 항원-항체 반응 방식 또는 유전자 증폭 방식으로 실시된다.
상기 방법들을 통하여, 대조군에서의 마커 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산분자의 발현량과 대장암 환자 유래의 분석대상 생물학적 시료에서의 마커 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산분자의 발현량을 비교할 수 있으며, 상기 발현량의 유의한 변화 여부를 판단하여 대장암의 항암제 내성 여부를 진단할 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 대장암의 항암제 내성을 분자 진단 방법으로 판단한다. 본 발명의 마커는 항암제 내성 대장암에서 고농도로 존재하는 생체 분자이다. 본 명세서에서 사용된 용어, "고농도"는 조사 대상인 생물학적 시료 내의 마커의 양이 대조군 시료와 비교하여 많은 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커가 대조군과 비교하여 2-10배 정도 많은 양이 검출되는 경우, 본 발명에서의 "고농도"로 판정하고 항암제에 대하여 내성을 갖는 대장암으로 판정한다. 이를 통하여, 대장암의 항암제 내성 여부를 확인할 수 있다.
상기 대조군 시료의 범위에는, 항암제에 대하여 내성을 획득하지 않은 것으로 확인된 대장암 환자 유래의 세포, 이의 배양액 및 조직뿐만 아니라, 혈액, 혈청 및 혈장도 포함된다.
상기 분석대상 생물학적 시료 역시 대장암 세포 또는 이의 배양액, 대장암 조직, 혈액, 혈청 및 혈장으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 EphB3의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 대장암의 항암제 내성 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 EphB3의 발현 억제제는 EphB3 유전자 또는 EphB3의 발현을 촉진하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이고, EphB3의 활성 억제제는 EphB3에 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 앱타머로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이다.
본 발명에서 이용되는 EphB3의 활성 억제제 또는 발현 억제제는 대장암의 항암제 내성을 억제한다. 상기 용어, "항암제 내성 억제"는 "항암 감작" 또는 "화학 감작"과 동일한 의미를 갖는 용어로서, 항암제로 암을 치료 시 항암제 내성 억제용 조성이 없는 경우보다 있는 경우에 항암제의 대장암에 대한 독성이 더 강화되거나 증가되는 것으로서, 항암제 내성 등 항암제에 대한 저항성이 줄어들고 항암제의 효과가 더 잘 발휘되는 것을 의미한다. 본 발명에서 EphB3 억제제를 포함하는 조성물은 항암제에 대하여 대장암 세포를 민감화 시킴으로써, 항암제에 대한 대장암 세포의 저항성을 줄이고 항암제의 효과를 높일 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 항암제는 세툭시맙(cetuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 파니튜뮤맙 (panitumumab) 및 트라스투주맙(Trastuzumab)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 EphB3 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열로서, EphB3 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55(1995)).
안티센스 올리고뉴클레오티드의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나, 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다.
본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인은 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다(Weiss, B. (ed.): Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA : Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997; Weiss, B., et al., Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes. Cell. Mol. Life Sci., 55:334-358(1999).
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 EphB3 발현 억제제는 EphB3 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 shRNA 또는 siRNA이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "shRNA(small hairpin RNA 또는 short hairpin RNA)"는 견고한 헤어핀 턴을 만드는 RNA의 서열을 나타내며, 이는 RNA 간섭을 통해 유전자 발현을 사일런스 시키는데 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "siRNA(small interference RNA)"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산분자를 의미한다(참조: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO00/44914). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자 치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥과 안티센스 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 siRNA 분자는, 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 상보적은 100% 상보적인 경우뿐만 아니라 불완전한 상보성도 포괄하는 의미이다.
상기 EphB3 단백질의 활성 억제제는 EphB3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스(Peptide mimetics 또는 앱타머일 수 있다. 상기 EphB3 단백질에 특이적으로 결합하는 펩티드는 당업계에 공지된 통상의 방법, 예를 들어 파아지 디스플레이 방식으로 얻을 수 있다(Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface". Science 228 (4705):13151317(1985); Smith GP, Petrenko VA, "Phage display". Chem. Rev. 97(2):391410(1997)). 상기 펩티드 미메틱스는 EphB3 단백질의 결합 도메인을 억제하여 EphB3 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 모방체는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합(Benkirane, N., et al. J.Biol. Chem., 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으로 구성될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 체질 특이성, 제제의 성질 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 약제학적 조성물은 투여를 위하여 여러 가지 제제로 제형화 될 수 있으며, 부형제를 첨가하여 다양한 형태로 제형화 될 수 있다. 상기 부형제는 비독성이고 불활성인 약제학적으로 적합한 고상, 준고상 또는 액상의 모든 유형의 제형 보조물로서, 예를 들면, 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 분산제, 계면활성제 또는 희석제 등을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, EphB3의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 포함하는 항암제에 대한 감수성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, EGFR을 표적으로 하는 항암제, 및 EphB3의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, a) EphB3를 발현하는 세포에 피검화합물을 처리하는 단계; b) 피검화합물이 처리된 세포에서 EphB3의 발현수준을 측정하는 단계; 및 c) 대조군과 비교하여 발현수준이 감소된 시험군의 피검화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 항암제에 대한 내성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법을 통해 대장암에서의 항암제 내성 억제제를 효과적으로 탐색할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 방법
1) 세포 계대배양 및 항암제 내성 대장암 세포주 구축
인간 대장암 세포주인 SW48, DLD-1, HT29, colo205 및 HCT116은 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입 하였으며, ATCC의 지침에 따라 세포주가 유지되었다. 세툭시맙(cetuximab) 내성 획득 세포주는 상기 대장암 세포주들에 5 개월 동안 세툭시맙 투여량을 1μg/ml에서 10μg/ml까지 단계적으로 증가시킴으로써 얻어졌다.
2) 시약 및 항체
1. Erbitux (Cetuximab) (Merck Serono)
2. EphB3 inhibitor (LDN-211904) (Merck Millipore)
3. Ephrin-B3 Fc Chimera Biotinylated Protein (R&D Systems)
4. Anti-Gli3 (Bethyl)
5. Anti-Sox2, anti-N-cadherin, anti-E-cadherin (BD Biosciences)
6. Anti-Shh, anti-Smoothened, anti-EpCAM, anti-snail anti-EFNB3, anti-HHIP, Gli1 siRNA, STAT3 siRNA, EphB3 shRNA(h) Lentiviral Particles, negative control siRNA (Santa Cruz Biotechnology)
7. anti-EphB3 (abcam)
8. Anti-Gli1, anti-Gli2, anti-patched, anti-phospho STAT3, anti-STAT3, and anti-c-PARP-1, anti-Oct4, anti-EGFR, anti-p-ERK, anti-ERK, anti-p-mTOR anti-mTOR, anti-p-AKT, anti-AKT, anti-p-JNK, anti-JNK, anti-p-EGFR, anti-VEGFR2, anti-HER2 (Cell Signaling)
실험예 1. 대장암 세포에서 세툭시맙 내성 획득에 따른 세포 성장 측정
세툭시맙 내성 획득 확인
대장암 세포 SW48과 SW48R을 96well에 10,000 여개의 cell을 seeding한 후, 다음 날 세툭시맙(0, 5, 10, 15, 20 ug/ml)과 EGF(20 ng/ml)를 처리하였다. 24 시간 및 48 시간 후에 MTT 솔루션을 넣어 4 시간 동안 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 cell viability를 확인하였다.
대장암 모세포주인 SW48에 세툭시맙의 농도를 증가시켜가며 배양하고 이를 MTT 어세이한 결과, SW48R 세포의 세툭시맙에 대한 약제 민감성이 낮음을 확인하여 SW48R 세포가 세툭시맙에 대한 내성을 획득하였음을 확인하였다(도 1).
세툭시맙 내성 획득에 따른 세포 성장 확인
대장암 세포 SW48과 SW48R을 96well에 5000개의 cell을 seeding하였다. 그리고, 1일, 3일, 5일 후에 MTT solution을 넣어 4시간 반응 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 cell viability를 확인하였다.
그 결과 세툭시맙의 내성을 획득한 세포주(SW48R)는 그렇지 않은 세포주(SW48)보다, 세툭시맙에 의한 암 세포에 대한 성장 억제 효과가 적은 것을 확인할 수 있었다. 즉, SW48R는 세포의 성장이 더 빠른 것을 확인하였다(도 2).
세툭시맙 내성 획득에 따른 세포 콜로니 형성 능력 확인 - colony formation assay
대장암 세포 SW48과 SW48R을 96well에 seeding하였다. 그리고, 14일 후 염색하여 형성된 콜로니를 확인하였다.
그 결과 세툭시맙의 내성을 획득한 세포주(SW48R)는 그렇지 않은 세포주(SW48)보다, 세툭시맙에 의한 암 세포에 대한 성장 억제 효과가 적은 것을 확인할 수 있었다. 즉, SW48R는 콜로니 형성 능력이 더 큰 것을 확인하였다(도 3).
시험예 2. 대장암 세포에서 세툭시맙 내성 획득에 따른 다양한 단백질 발현 확인
대장암 세포에서의 세툭시맙 내성 획득에 따른 마커 확인 - Western blotting
대장암 세포 SW48과 SW48R을 seeding 한 후, harvest하여 lysis를 통하여 단백질을 모아 western blotting을 하였다. 그리고, 내성 관련 마커를 사용하여 단백질 발현을 확인하여 도 4에 나타내었다.
도 4는 대장암 세포에서 세툭시맙 내성 획득에 따른 내성 관련 마커의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하여 나타낸 것이다. 약물의 내성을 획득하게 되면, SHH 신호전달, EMT, Stemness 등과 연관이 있다고 알려져 있다. 도 4를 참조하면, 대장암 세포들이 세툭시맙에 대한 내성을 획득함으로써 SHH 신호전달, EMT, Stemness 등과 관련된 다양한 내성 관련 마커들이 발현된 것을 확인할 수 있었다.
대장암 세포에서의 세툭시맙 내성 획득에 따른 세툭시맙 반응 확인 - Western blotting
대장암 세포 SW48과 SW48R을 seeding 한 후, 다음 날 세툭시맙(10 ug/ml)과 EGF(20 ng/ml)를 처리하였다. 24시간 후에 harvest하여 lysis를 통하여 단백질을 모아 western blotting을 하였다. 그리고, EGFR 신호전달 관련 단백질을 확인하여 도 5에 나타내었다.
도 5는 대장암 세포에서 세툭시맙 내성 획득에 따른 EGFR 신호전달 관련 단백질의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인하여 나타낸 것이다.
도 5를 참조하면, 세툭시맙 내성을 획득한 대장암 세포주(SW48R)는 EGF와 세툭시맙에 반응하지 않지만, EGFR 신호전달 관련 단백질인 Stat3에는 반응하는 것을 단백질 수준에서 확인하였다. 이에 따라, 상기 Stat3를 타겟으로 선정하였다.
한편, 상기 도 4에서 확인한 것을 토대로 Stat3와 Gli1은 서로 상호작용을 하고 있다고 알려져 있으므로, 서로의 상하관계를 확인하였다(도 6 및 도 7). 상기 도 6 및 도 7을 참조하면, Stat3에 의하여 Gli1(SHH 신호전달 관련 단백질)이 조절되는 것을 확인하였다.
시험예 3. 세툭시맙 내성을 갖는 대장암 세포에서 EFNB3가 EphB3에 미치는 영향 확인
대장암 세포에서의 세툭시맙 내성 획득에 따른 변화하는 유전자 확인 - microarray analysis
대장암 세포 SW48과 SW48R을 seeding 하고, 24시간 후에 harvest하였다. 그리고, RNeasy mini kit를 사용하여 RNA를 뽑은 후, 전문 회사(macrogen)에microarray analysis를 의뢰하였다.
도 8은 세툭시맙의 내성을 가진 세포주에 대하여 DNA 수준의 잠재적 관련성을 평가하기 위하여 SW48 모세포와 SW48R 세포의 샘플에서 DNA 수준에 대한 표준 Microarray 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 8을 참조로 하면, Sox2의 SW48R/SW48 fold change가 확연히 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 이미 암과 관련이 있는 것으로 알려진 EFNB3의 수용체인 EphB3의 단백질 발현 또한 EFNB3 단백질 발현에 따라 증가한다는 것을 확인하였다.
한편, 암과 관련된 것으로 알려진 EFNB3를 추가적으로 첨가하는 경우, 상기의 실험들을 통해 암 세포주가 세툭시맙의 내성을 획득한 것과 같은 효과가 나타난다는 것을 MTT assay를 통한 세포성장과 단백질 발현양을 통해 확인하였다.
도 9는 대장암 세포에 EFNB3를 첨가하는 경우 EFNB3의 수용체인 EphB3의 단백질 발현이 증가하고, 약물 내성 관련 마커 및 EGFR 신호전달 관련 단백질의 발현이 증가하는 것을 나타내는 웨스턴 블랏 실험 결과이다.
도 10은 대장암 모세포주인 SW48에 EFNB3의 농도를 증가시켜가며 배양하고 이를 MTT 어세이한 결과를 나타내는 것이다. 도 10을 살펴보면, SW48R 세포의 EFNB3에 대한 약제 민감성이 낮음을 확인하여 SW48R 세포가 EFNB3에 대한 내성을 획득하였음을 알 수 있다.
항암제 내성 대장암 세포주에서 EphB3의 과발현 확인
항암제(세툭시맙) 내성 대장암 세포주 SW48R에서 EphB3의 발현을 Immunofluorescence 및 웨스턴 블랏 분석으로 확인하고자 하였다.
이를 위하여 먼저, 대장암 세포 SW48과 SW48R을 seeding 하였다. 그리고, 24시간 후 3.7% formaldehyde를 넣어서 고정화시키고, triton x100으로 항체의 투과율을 높여준 후 1차 항체, 2차 항체를 붙이고, 그 다음 DAPI 염색을 통하여 핵을 염색한 뒤 마운팅 하여 confocal microscopy를 통하여 EphB3 발현을 관찰하였다.
그 결과, 모세포주(SW48)에 비해 항암제 내성 대장암 세포(SW48R)에서 EphB3의 발현 및 분비가 현저히 증가되어 있음을 확인하였다(도 11 및 도 12 참조). 이러한 결과를 통해, EphB3가 대장암 세포의 항암제 내성 획득에 중요한 역할을 하고 있으며, EphB3의 발현 수준을 확인함으로써 대장암 세포의 항암제 내성 여부를 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.
시험예 4. 대장암 세포에서 세툭시맙 내성 획득에 따른 EphB3 역할 확인
대장암 세포에서의 세툭시맙 내성 획득에 따른 EphB3 inhibition 반응 확인 - Western blotting
대장암에서 SW48 세포와 SW48R 세포 사이의 EphB3 효과의 차이를 연구하기 위해 EphB3 inhibitor를 처리하여 두 세포에서 타겟 단백질인 Stat3의 단백질 수준을 확인하고자 하였다.
이를 위하여 먼저, 대장암 세포 SW48과 SW48R을 seeding 한 후, 다음 날 EphB3 inhibitor(20 uM)를 처리하였다. 0, 4, 8, 20 시간 후에 harvest하여 lysis를 통하여 단백질을 모아 western blotting을 한 후 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13은 대장암 세포에 EphB3 억제제를 처리한 후 EGFR 신호전달 관련 단백질, 내성 관련 marker 등을 사용하여 단백질 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13을 살펴보면, SW48R 세포의 p-Stat3의 발현 감소를 확인할 수 있었으며 그 하위 단백질 Gli1, Sox2 및 Vimentin의 단백질 발현 수준 또한 EphB3 저해에 의해 감소한다는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 14는 SW48R 세포에 세툭시맙과 EphB3 억제제를 조합하여 처리하는 경우의 세포 생존 능력을 MTT assay를 통하여 확인한 결과이다. 도 14를 살펴보면, 세툭시맙과 EphB3 억제제를 조합하여 처리하는 경우 세툭시맙 내성 대장암 세포주의 세포 생존 능력이 현저히 저하되는 것을 확인할 수 있었다.
도 15는 SW48R 세포에서 세툭시맙과 siSTAT3를 조합하여 처리하는 경우의 세포 생존 능력을 MTT assay를 통하여 확인한 것이다. 도 15를 살펴보면, 세툭시맙과 siSTAT3를 조합하여 처리하는 경우 세툭시맙 내성 대장암 세포주의 세포 생존 능력이 현저히 저하되는 것을 확인할 수 있었다.
대장암 세포에서 세툭시맙 내성 극복 확인 - Western blot, Flow cytometry
SW48R 세포에서 세툭시맙과 EphB3 억제제 또는 세툭시맙과 siSTAT3을 병용처리하는 경우의 항암제 내성 극복 여부를 판단하기 위하여 c-PARP 단백질 발현과 유세포 분석을 통하여 세포 사멸(Apoptosis)이 증가함을 확인하고자 하였다.
이를 위하여, 대장암 세포 SW48과 SW48R을 seeding하고, 다음 날 siRNA control과 EphB3 inhibitor (20 uM) 또는 Stat3 siRNA를 transfection하였다. 24시간 후, 세툭시맙 (10 ug/ml)과 EGF (20 ng/ml)를 처리하였다. 24시간 후, Annexin V-FITC, PI (propidium iodide)로 염색하고 Flow cytometry로 확인하였다.
도 16은 대장암 세포에서 세툭시맙과 EphB3 억제제를 병용처리한 후 c-PARP 단백질 발현을 확인한 웨스턴 블랏 결과이고, 도 17은 대장암 세포에서 세툭시맙과 siSTAT3를 병용처리한 후 c-PARP 단백질 발현을 확인한 웨스턴 블랏 결과이다.
그리고, 도 18은 대장암 세포에서 세툭시맙과 EphB3 억제제를 병용처리한 후 유세포 분석으로 세포사멸이 증가하는 것을 확인한 결과이고, 도 19는 대장암 세포에서 세툭시맙과 siSTAT3를 병용처리한 후 유세포 분석으로 세포사멸이 증가하는 것을 확인한 결과이다.
상기 도 16 내지 도 19의 결과로부터 세툭시맙에 대하여 내성을 획득한 대장암 세포의 세툭시맙 내성이 극복된 것을 확인할 수 있었다.
시험예 5. EGFR과 EphB3의 결합 및 상호작용 확인
대장암 세포에서의 EGFR과 EphB3의 상호작용 확인 - Co-immunoprecipitation
대장암에서 EphB3가 EGFR과 Stat3에 어떻게 영향을 주는지 알아보기 위해 우선 EGFR과 EphB3의 상호작용에 대하여 확인하고자 하였다.
대장암 세포 SW48과 SW48R을 seeding 한 후, 다음 날 harvest하여 lysis하였다. 1차로 EGFR antibody을 붙이고 난 후에, Western blotting과 같은 방법을 통하여 EphB3의 발현을 확인하였다.
도 20은 대장암 세포주가 세툭시맙에 대한 내성을 획득 하였을 때, EGFR과 EphB3의 결합이 증가하는 것을 나타내는 것을 Co-immunoprecipitation을 통해 확인한 결과이다.
도 20을 참조하면, EGFR은 EphB3와 binding하는 것을 확인하였으며 세툭시맙에 대한 내성을 획득 하였을 때, 이들 간의 binding의 증가로 인하여 더 많은 상호작용이 일어난다는 것을 확인할 수 있었다.
대장암 세포에서의 EGFR과 EphB3의 상호작용 확인 - Immunofluorescence
대장암에서 EphB3가 EGFR과 Stat3에 어떻게 영향을 주는지 알아보기 위해 우선 EGFR과 EphB3의 상호작용에 대하여 확인하고자 하였다.
이를 위하여 먼저, 대장암 세포 SW48과 SW48R을 seeding하였다. 24시간 후 3.7% formaldehyde를 넣어서 고정화시키고, triton x100으로 항체의 투과율을 높여준 후 1차 항체, 2차 항체를 붙이고, 그 다음 DAPI 염색을 통하여 핵을 염색한 뒤 마운팅 하여 confocal microscopy를 통하여 EGFR과 EphB3의 Intensity Profile을 통하여 결합을 관찰하였다.
도 21은 대장암 세포주가 세툭시맙에 대한 내성을 획득 하였을 때, EGFR과 EphB3의 결합이 증가하는 것을 나타내는 것을 Immunofluorescence을 통해 확인한 결과이다.
도 21을 참조하면, EGFR은 EphB3와 binding하는 것을 확인하였으며 세툭시맙에 대한 내성을 획득 하였을 때, 이들 간의 binding의 증가로 인하여 더 많은 상호작용이 일어난다는 것을 확인할 수 있었다.
대장암 세포에서의 EGFR과 EphB3의 상호작용 확인을 위하여 EGF 여부 관찰 - ELISA
대장암 세포에서의 EGF의 작용을 알아보기 위하여 ELISA를 이용하여 확인하고자 하였다.
이를 위하여, 먼저 대장암 세포 SW48과 SW48R을 seeding 하고, 다음 날 EGF를 처리하였다. 24시간 후, 메디아만 모아서 ELISA(EGF) kit를 사용하여 EGF의 양을 측정하였다.
도 22는 대장암 세포에서의 EGF의 농도를 ELISA를 이용하여 확인한 결과이다.
도 22를 살펴 보면, 세툭시맙에 대한 내성을 얻었을 때, supernatant에 EGF의 농도가 더 높은 것으로 보아 SW48R에서 EGF의 수용체에 대한 결합 정도가 낮은 것을 확인할 수 있다. 그 이유로 EGFR이 Ephb3와의 binding에 의하여 영향을 받았다고 추정할 수 있다.
세툭시맙에 대한 내성을 획득하게 되면 Stat3를 활성화하는 site로 알려진 p-EGFR(Y1068) site만이 활성화 되는 것을 Western blotting을 통해 확인하였다(도 23 참조). 또한 EphB3 inhibitor에 의하여 그 활성정도가 감소하는 것을 볼 수 있다(도 24 참조).
결론적으로, 세툭시맙에 대한 내성을 획득하게 되면, EGFR과 EphB3의 binding이 증가하게 되고, 이로 인하여 EGFR phosphorylation site 중에서 유일하게 p-EGFR (Y1068) site가 활성화되어 Stat3의 phosphorylation이 증가하게 된다.
시험예 6. 대장암 조직에서 세툭시맙 내성 획득시, EphB3 발현 확인
항암제 내성 환자의 대장암 조직에서의 EphB3 과발현 확인
상기 웨스턴 블랏 결과를 바탕으로 세툭시맙 치료 전 환자의 대장암 조직과 세툭시맙 치료 내성 획득 환자의 대장암 조직에서 유전자(EphB3, EFNB3, Gli1 및 Stat3)의 발현을 조사하였다. 구체적으로는, 2009 ~ 2016년도 고려대학교 구로병원에서 대장암 진단을 받은 환자로부터 세툭시맙 치료 전 조직과 치료 후 내성을 획득한 환자로부터 적출된 대장암 조직을 샘플로 제작하여 Immunohistochemical(IHC) staining을 실시하였다.
도 25 및 도 26은 세툭시맙 치료 전의 대장암 조직과 치료 후 내성을 획득한 환자로부터 적출된 대장암 조직에서의 EphB3 및 EFNB3의 발현을 확인하기 위하여 IHC staining 분석을 수행한 결과이다.
도 27 및 도 28은 세툭시맙 치료 전의 대장암 조직과 치료 후 내성을 획득한 환자로부터 적출된 대장암 조직에서의 Gli1 및 Stat3의 발현을 확인하기 위하여 IHC staining 분석을 수행한 결과이다.
상기 도 25 내지 도 28을 통해 EphB3, EFNB3, Gli1 및 Stat3의 발현을 확인한 결과, 상기 단백질들은 세툭시맙 치료 전 환자의 조직보다 세툭시맙 내성 획득 환자 조직에서 높게 발현된 것을 확인하였다.
이상의 결과들을 통하여, EphB3이 대장암의 항암제 내성 진단 또는 극복을 위한 새로운 치료용 타겟임을 규명하였다.
본 발명의 연구는 대장암 환자에서의 EphB3 발현양을 측정하여 세툭시맙 등의 항암제에 대한 내성 진단 또는 치료반응의 예측에 활용할 수 있는 가능성을 보여준다. 또한, EphB3을 타겟으로 하는 siRNA 또는 shRNA 약제를 개발할 경우, EphB3 억제제와 세툭시맙 등의 항암제의 병용치료를 통해 항암제에 내성이 생긴 암을 치료할 수 있을 것이며, 항암제의 사용용량을 줄일 수도 있을 것이다. 이는 항암제의 사용으로 인한 부작용을 감소시키는데 도움을 줄 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

Claims (14)

  1. EphB3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머, 올리고펩타이드 또는 PNA(Peptide nucleic acid), 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 대장암의 항암제 내성 진단용 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 면역분석(immunoassay)용 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 키트는 마이크로어레이 또는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 대장암 환자의 항암제 내성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 검체로부터 EphB3의 발현수준을 측정하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 항암제가 EGFR을 표적으로 하는 항암제인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 항암제는 세툭시맙(cetuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 파니튜뮤맙 (panitumumab) 및 트라스투주맙(Trastuzumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. EphB3의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제에 대한 내성 억제용 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항암제는 세툭시맙(cetuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 파니튜뮤맙 (panitumumab) 및 트라스투주맙(Trastuzumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    EphB3의 활성 억제제는 EphB3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  11. 제8항에 있어서,
    EphB3의 발현 억제제는 EphB3 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interfering RNA), shRNA(small hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  12. EphB3의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 포함하는 항암제에 대한 감수성 증진용 조성물.
  13. EGFR을 표적으로 하는 항암제, 및 EphB3의 활성 억제제 또는 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  14. a) EphB3를 발현하는 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
    b) 피검화합물이 처리된 세포에서 EphB3의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    c) 대조군과 비교하여 발현수준이 감소된 시험군의 피검화합물을 선별하는 단계;를 포함하는 항암제에 대한 내성 억제제 스크리닝 방법.
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