JP4474551B2 - 神経膠腫細胞株u251の増殖能抑制剤及び浸潤能抑制剤 - Google Patents
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Karpeh MS, Kelsen DP, Tepper JE :Cancer of the Stomach. In: Cancer, principles & practice of oncology. 6th ed. Devita VT Jr (ed) Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia,pp 1092-1121, 2001. Stewart LA: Chemotherapy in adult high-grade glioma: a systematic review and meta-analysis of individual patient data from 12 randomized trials. Lancet 359:1011-1018,2002. Maher EA, Furnari FB, Bachoo RM, Rowitch DH, Louis DN, Cavenee WK, DePinho RA: Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev 15:1311-1333, 2001. Miki T, Smith CL, Long JE, Eva A, Fleming TP : Oncogene ect2 is related to regulators of small GTP-binding proteins. Nature 362(6419):462-465, 1993. Tatsumoto T, Xie X, Blumenthal R, Okamoto I, Miki T : Human ECT2 is an exchange factor for Rho GTPases, phosphorylated in G2/M phases, and involved in cytokinesis. J Cell Biol. 147(5):921-928, 1999. Horii Y, Beeler JF, Sakaguchi K, Tachibana M, Miki T: A novel oncogene, ost, encodes a guanine nucleotide exchange factor that potentially links Rho and Rac signaling pathways. EMBO J. 13(20):4776-4786,1994. Lorenzi MV, Castagnino P, Chen Q, Hori Y, Miki T : Distinct expression patterns and transforming properties of multiple isoforms of Ost, an exchange factor for RhoA and Cdc42. Oncogene 18(33):4742-4755,1999 Yamanaka R, Blumenthal R, Lorenzi MV, Tatsumoto T, Miki T : Ostip2, a novel oncoprotein that associates with the Rho exchange factor Ost. DNA Cell Biol. 20(7):383-390,2001
神経膠腫細胞株(U251、T98G、ON12、NP3、GI−1)を、10%非働化ウシ胎児血清を添加したイーグル最小必須培地(MEM)(Nissui Pharmacoceutical Inc.,Tokyo, Japan)を用いて、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。
新潟大学脳研究所脳神経外科にて手術摘出された神経膠腫47例(WHO グレードII:9例、III:11例、IV:27例、平均年齢44歳)を対象とした(表1)。高悪性度のものは術後、放射線治療(腫瘍局所40Gy、全脳照射20Gy)並びにニトロソウレアを中心とした化学療法を施行した。生存期間は診断確定日より患者の死亡日もしくは最終受診日とした。組織診断はWHO脳腫瘍組織分類(Kleihues P, Louis DN, Scheithauer BW, Rorke LB, Reifenberger G, Burger PC, Cavenee WK: The WHO classification of tumors of the nervous system. J Neuropathol Exp Neurol 61:215-225, 2002)に基づいて行った。なお、本明細書に記載の実験は、新潟大学倫理委員会の規則に則り、全ての対象者からインフォームドコンセントを得ている。
5ミクロン切片を作成し、脱パラフィン化の後に10mMクエン酸ナトリウム(pH6.0)中にて121℃、10分間加温した。0.3%H2O2にて内因性ペルオキシダーゼ活性の阻害を行った。10%ヤギ血清にてブロッキング後、抗HECT2ウサギポリクローナル抗体,抗OSTウサギポリクローナル抗体(1:50;Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)と4℃で12時間反応させた。洗浄後、アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼシステム(Vectasin elite ABC kit, Vector Labs, Burlingame, CA)を反応させ、0.01%3,3−ジアミノベンジジン(DAB)(Sigma)とPBS0.01%過酸化水素水にて発色させた。
試料47例全例でHECT2mRNA,OSTmRNAの発現を検討した。RNAは凍結組織よりIsogen(Nippongene, Toyama, Japan)を用いて抽出した。第1鎖cDNAは試料から得られたmRNAから、オリゴ(dT)プライマー、逆転写酵素(Super Script II RNase H, Life Technologies, Grand Island, NY)を用いて作成した。定量PCRはライトサイクラー(Idaho Technology, Salt Lake City, UT)によるリアルタイムPCRで行った。PCR試薬の組成は1×ライトサイクラーDNAマスターSYBRグリーンI(Rosche Moleculer Biochemicals, Mannheim, Germany)、各プライマー0.5μM、3mM MgCl2、2μl cDNAテンプレートにて行った。PCRは95℃10分間で変性後、95℃15分、55℃5分、72℃10分の各サイクルを40サイクル行った。反応産物はPCRの融解サイクルを経て各サイクルで蛍光強度を測定した。標準化曲線はHECT2プラスミドDNA,OST プラスミドDNA(Dr.Toru MIKI,NIHから供与)から得られたHECT2cDNA,OSTcDNAの一連の段階的10倍希釈溶液により作成した。PCR増幅のためのプライマーの塩基配列は以下の通りである。HECT2センス鎖:5'-CAAATGGATGCCCGAGCTG-3';HECT2アンチセンス鎖:5'-GGTGGAAATGGTGACACGTCTG-3';OSTセンス鎖:5'-GCCTCACAACCTGTGGACAA-3';OSTアンチセンス鎖:5'-ATCTTGGTTGAGGATGGATTCG-3'。
ヒトHECT2,OSTに対する特異的なsiRNAはAMBION(Tokyo,japan)より購入した。HECT2(AMBION,#26070),OST(AMBION,#32098),ARK5(AMBION,#964),非サイレンシングコントロールおよびMAPK1(QIAGEN)を含めたこれらトランスフェクションにはRNAi ヒト/マウスコントロールキット (Qiagen, Tokyo)を用い、プロトコールに従って実験を行った。細胞株を96ウェルプレート(100μl/well)に培養し80%コンフレントに達した時点で培地を交換(75μl/well)し、SiRNA100nM/25μlを混和、トランスフェクションさせた。48時間の培養後、テトラカラーワン(Seikagaku CO.,Tokyo)を用いて発色し、MTTアッセイにより生存度を評価した。これらの値は非サイレンシングsiRNAによるネガティブコントロールと比較検討した。全て増殖試験は3回以上行い、結果は平均±標準偏差で示した。
細胞浸潤アッセイにはマトリゲル(Matrigel)(Becton-Dickinson, Tokyo)を購入し、プロトコールに従って実験を行った。神経膠腫細胞株(U251、T98G)は前述のごとくコントロールを含めてsiRNAトランスフェクションを行い24時間後、細胞解離溶液 (Sigma)に浮遊させ、洗浄後使用した。MEM10%FBSを満たしたウェル(24ウェルプレート)にマトリゲルチャンバー(底面がマトリゲルで被膜された8μm多孔膜よりなる)を静置して充分水和させた後、チャンバーに細胞を播き、24時間培養した。マトリゲルチャンバー内の細胞を払拭除去し、浸潤して多孔膜裏面に浸潤付着した細胞をギムザ染色液にて染色し、光顕200倍で10視野の細胞数を評価した。結果はコントロールとの比率で表し、平均±標準偏差で示した。
神経膠腫の各グループ間におけるHECT2,OSTの発現はMann−WhitneyのU検定にて評価し、p<0.05を統計学的に有意と判定した。生存曲線はKaplan−Meier法にて表現し、2群間の検定にはLog−rank検定で評価した。
神経膠腫組織におけるHECT2,OSTの局在を調べる為に免疫組織染色を行った。図1に示すように、HECT2(A)及び OST(B)のいずれにおいてもHECT2,OSTは全ての細胞質あるいは核で症例によって様々な程度に染色された。次いで、任意の3視野での各タンパク質の発現強度を0−3、および発現面積を0,0.25,0.5,0.75,1.0と表示し、それらの積の平均値を求め発現レベルとした。発現レベルからポジティブとネガティブの2群に分け、各群の生存曲線を描き、Logrank 検定にて2群間の有意差を検討した。染色強度の高いものほど生存期間が短く、2群間に有意差を認めた(A:HECT2,P=0.028, B:OST,P<0.05 Logrank検定 図2)。
神経膠腫組織中のHECT2mRNA,OSTmRNAの発現を定量リアルタイムPCRにて測定した。HECT2mRNA,OSTmRNAの発現によって症例を 高発現群、低発現群に分けて生存曲線で比較したところ、高発現群において生存期間が短いことが認められた(A:HECT2,P<0.001, B:OST,P=0.015 Logrank検定 図3)。
HECT2,OSTの過剰発現はこれまでの検討から神経膠腫の生物学的悪性度を反映していたと考えられる。そこで内因性のHECT2,OSTを抑制することにより神経膠腫細胞株の増殖能や浸潤能を抑制することができるかどうか確かめるため、HECT2,OSTに特異的なsiRNAを導入し、mRNAを下方制御することでHECT2タンパク質,OSTタンパク質の発現を押さえて細胞増殖能と浸潤能について検討した。HECT2(E0531,26070),OST(M477)に特異的なsiRNAを導入し、mRNAが下方制御されることが確認された(P<0.01,図4A)。siRNA導入によるU251細胞株の細胞増殖試験ではHECT2(E053)siRNA,OST(M477)siRNAを導入することで増殖抑制効果が見られた(P<0.01,図4B)。
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- HECT2siRNAからなる神経膠腫細胞株U251の増殖能抑制剤。
- HECT2siRNAからなる神経膠腫細胞株U251の浸潤能抑制剤。
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