JP2000509248A

JP2000509248A - 腫瘍血管新生および転移の分子診断方法

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Publication number: JP2000509248A
Application number: JP09533491A
Authority: JP
Inventors: ヒルス，クラウス，ピー．
Original assignee: スーゲン，インコーポレーテッド
Priority date: 1996-03-21
Filing date: 1997-03-04
Publication date: 2000-07-25
Also published as: AU2066697A; WO1997035032A1; US20010018186A1; CA2249618A1; EP0914466A1; US5942385A

Abstract

(57)【要約】本発明は、異常血管新生によって特徴付けられる疾患の分子段階を評価する方法に関する。より具体的には、本発明は、特異的分子マーカーの存在を測定することによって腫瘍の転移可能性を決定する方法に関する。本発明は、一部は、腫瘍の結果としておこる転移を決定するための主要マーカーが血管内皮増殖因子であるという発見に基づくものである。腫瘍状態に存在する特定のマーカーについての知識によって、医師は、癌治療を調整し、疾患状態を管理することが可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍血管新生および転移の分子診断方法１．序論本発明は、患者の適切な治療を計画するために癌の状態を分子的に病期分類する方法に関する。具体的には、本発明は、転移性固形腫瘍の全ての型に共通の分子マーカー、具体的には血管内皮増殖因子およびそのコグネイト受容体、ならびにその他の予後分子マーカーを使用することによって癌の血管新生表現型を評価するためのアッセイに関する。２．発明の背景腫瘍の転移可能性を知ることは、患者の生存期間および生活の質を最大にする癌治療の開発において重要である。最も攻撃的な治療養生法は、急速な腫瘍増殖および転移の危険が非常に高い患者に対して取っておくべきである。したがって、癌の転移可能性に特有のマーカーを同定することに非常に多くの努力が集中している。癌の転移病期分類のためのマーカーの１つの型は、癌遺伝子対立遺伝子の存在である。例えば、乳癌および卵巣癌の30％以上に関連する遺伝子は、neu／HER2 ／c-erbB2原癌遺伝子として同定されている。原癌遺伝子の増幅およびそのタンパク質産物の過剰発現の程度は、疾患の重篤度および乏しい予後徴候に相関することがわかった。Slamonら，Science244:707-712(1989)を参照されたい。さらに、rasおよびmyc遺伝子ファミリーの異常対立遺伝子は、ヒト癌の進行に関与していることがわかっており、何人かの研究者はそれらが予後指標として有用であると推測している（Field．J．K.ら，Anticancer Res．10:1-22(1990)）。さらに、レシピエント細胞にH-rasファミリー癌遺伝子および突然変異体p53対立遺伝子をトランスフェクトすることにより、転移可能性が誘発される（Liotta，L．A. ら，Cell 64:327-36(1991)）。しかしながら、これらの癌遺伝子マーカーの使用に伴う主な問題は、これらの因子が腫瘍の全ての型の前兆ではないということである。それどころか、これらのマーカーは、それらが発生した組織または腫瘍の型に特異的であり、転移性癌の全ての型に対する広い適用可能性を有していそうにはない。増大している一連の証拠は、血管新生が癌の進行に必須であるということを示すものである。血管新生は、それ以前に存在する血管からの新しい毛管の発生である。通常、哺乳類の血管新生は、生殖系、胚形成および発達、ならびに損傷後の修復に限られる。しかしながら、血管新生は、癌、網膜新生血管形成、アテローム斑における新生血管形成、血管腫、関節炎および乾癬などの病的状態においても生じ得る。Folkman，J．New England J．of Med．333:1757-63(1995)を参照されたい。血管形成がない場合、腫瘍は、小さい（２〜３ミリメートル未満）無症候性病巣として何年もの間そのままの状態で存在し得る。Weidnerら，New England J． of Med．324:1-8(1991)を参照されたい。血管形成に至る腫瘍には、灌流によって多くの酸素と栄養分が供給される。したがって、血管形成される腫瘍は、成長し、増殖することができる。腫瘍は、成長を続けるために新しい毛細血管の増殖を絶えず刺激しなければならない。さらに、血管新生は、宿主動物の循環系に腫瘍細胞を侵入させる。新しい血管は、腫瘍細胞に、循環に入って遠隔の部位に転移するための通り口を提供するものである。Folkman，J．Natl．Cancer Inst．8 2:4-6(1990)；KlagsbrunnおよびSoker，Current Biology 3:699-702(1993)；Fol kman，J.，J．Natl.，Cancer Inst．82:4-6(1991)；Weidnerら，New Engl．J．M ed．324:1-5(1991)を参照されたい。実際、新生血管形成の程度は、原発性(primary)乳癌、膀胱癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、皮膚黒色腫、および子宮頚癌における転移と強く相関している。Fe rrara，N.，Breast Cancer Research and Treatment 36:127-137(1995)の概説を参照されたい。これらの研究においては、腫瘍標本が組織学的に分析され、微小水疱の数は手で数えられている。腫瘍塊血管形成の程度は、転移可能性の独立予測物であり、その他の予後マーカーよりも信頼性が高いということがわかった。これらの結果より、研究者らは、腫瘍血管形成が転移の予測のための診断ツールとして用いられ得ることを予測するようになった。しかしながら、腫瘍標本中の微小水疱の計数は、大きな労働力を要することに加えて、定性的な技術である。この方法には、信頼性および再現性のある結果を得るためにかなり技術的な訓練が必要である。いくつかのグループは、この方法を再現するのは困難であると報告している。Wiedner，N．Amer．J．Path．147:9-19(1995)を参照されたい。さらに、組織学のための標本を調製し、微小水疱を計数するプロセスは時間がかかる。そのため、この技術の適用は、一般的に、研究目的に限定されている。したがって、腫瘍血管形成を評価することにより腫瘍の移転可能性を予測するために、診療所で一般的に使用することができる迅速で客観的な技術が必要とされている。何人かの研究者は、血管新生タンパク質の存在を定量することによって患者における血管新生活性を測定することが可能であり得ると推測した。その存在によって潜在的に血管新生の存在を示す12個の血管新生タンパク質が知られている。 Folkman J．New England J．of Med．333:1757-63(1995)を参照されたい。これらの因子の中で、最も一般的に腫瘍と関連していることがわかっているものは塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン増殖因子２、血小板由来増殖因子、およびコロニー刺激因子である。血管新生および転移マーカーの候補となるその他の因子は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターおよびプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１、ならびに種々のコラゲナーゼおよびウロキナーゼである。Wiedner，N.，Amer．J ．Path．147:9-19(1995)を参照されたい。しかしながら、血管新生および転移に一般的に適用可能なマーカーを選択するためには、このプロセスにおける主要因子を同定するのが望ましい。現在のところ、腫瘍血管新生を引き起こす因子または因子群は未だ決定されていない（前述の文献参照）。ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦは相乗作用するものと推測されている（前述の文献参照）。ｂＦＧＦのレベルは、広範な癌患者の約37％の尿中で上昇していた。同様に、ｂＦＧＦはかかる患者の10％の血清中でも上昇していた。最大レベルのｂＦＧＦは、転移性疾患の患者において観察された。Folkman J．New E ngland J．of Med．333:1757-63(1995)の概説を参照されたい。ｂＦＧＦは、脳腫瘍の小児の脳脊髄液中でも異常に高く、これらの高レベルは腫瘍標本における微細血管の密度と相関していた（前述の文献参照）。一方、別の研究者は、黒色腫細胞系にＶＥＧＦ発現プラスミドをトランスフェクトしてマウスに注射した場合、それらの増殖、血管新生および転移能力が増大するということを見出した。Claffey，K.ら，Cancer Res．56:172-81(1996)を参照されたい。腫瘍標本中の免疫反応性ＶＥＧＦタンパク質の半定量的レベルと、微小水疱発達および転移可能性の程度との相関関係が、結腸癌患者において観察された。Takahashi，Y.ら，Cancer Res．55:3964-68(1995)を参照されたい。この研究は、単に、組織化学切片におけるＶＥＧＦ染色のレベルを主観的に評価したものである。さらに、それらのデータには一定の矛盾があるので、これらの実験者らは、ＶＥＧＦが常に血管新生の原因となる因子であり得るとは限らないと仮定するに至った。別のグループによる研究においては、マウスにヒト腫瘍細胞を実験的に異種移植したところ、高レベルの血管形成およびＶＥＧＦＲＮＡが、生存率の低い患者から誘導されたそれらの異種移植腫瘍中で観察されるということが示された。Berger，D．P.ら，Annals．of Oncology 6:817-825(1995)を参照されたい。しかしながら、この研究は、陰性対照を含んでおらず、ヌードマウス中で連続的に最大８〜12回継代させた（よって腫瘍の特徴が変化する可能性が高まる）腫瘍細胞の回想的分析であった。最後に、何人かの研究者は、腫瘍血管新生の発達の原因となる機構または因子はないと主張している。腫瘍は血管新生分子を放出し得るが、その研究者らはこれらの因子の放出が非血管新生細胞といかに異なるかは不明であると主張している。それどころか、これらの研究者は、血管新生活性の開始は存在している因子のバランスによって決定されると考えている。Folkman，J．およびShing，Y．J ．Biol．Chem．267:10931-34(1992)を参照されたい。よって、どれが腫瘍血管新生および転移可能性の最も優れたマーカーであるかという論争が存在する。せいぜい、固形組織癌の全ての型に全般的に適用可能であるマーカーまたはマーカー群に関する論争があるくらいである。本発明は、この論争の解決を提供するものであり、腫瘍標本の面倒な組織学的分析の必要性を完全に排除し、患者の固形組織癌の転移可能性を決定するための一般的に適用可能で迅速な方法を提供するものである。３．発明の概要したがって、本発明の目的は、異常な血管新生が関与する疾患の状態の進行を特徴付けし、病期分類するための客観的な分子診断ツールを提供することである。本発明の好ましい実施態様においては、癌の状態は、ヒト被検者の特定の分子マーカーの発現をアッセイすることによって監視される。しかしながら、網膜新生血管形成、アテローム斑における新生血管形成、血管腫、関節炎および乾癬などの異常血管新生によって特徴付けられる疾患は全て、本発明の方法を用いて分子的に病期分類され得る。この診断ツールによって取得した情報は、これらの疾患の状態を治療し、管理するための治療プロトコルを計画するために医師によって用いられる。本発明の一つの態様においては、癌状態のヒトにおけるＶＥＧＦ発現のレベルが検出され、監視される。腫瘍によるＶＥＧＦの発現の異常な増大が血管新生の開始のきっかけとなるので、ＶＥＧＦのレベルが癌の状態の進行についての分子マーカーである。ＶＥＧＦの存在は、生体組織検査によって体液中で、または外科的デバルキング(debulking)によって得られた組織標本中でアッセイされ得る。本発明の別の態様においては、ＶＥＧＦおよびその他の因子に応答する、腫瘍と関連した内皮細胞における受容体タンパク質の発現も検出され、監視される。これらの受容体タンパク質としては、限定するものではないが、KDR/flk-1、flt -1、および／またはtek/tie-2が挙げられる。ＶＥＧＦとこれらの受容体タンパク質のどれかの同時発現も、増殖および転移が増大し得る腫瘍の指標となる。血管新生経路に関与する特定の受容体の同定は、どの治療が血管新生の阻害に最も効果的で選択的であるかを決定することにおいて重要である。本発明のさらなる態様は、疾患の進行の指標となる種々のその他の分子マーカーの存在をアッセイすることである。例えば、ＶＥＧＦまたはKDR/flk-1発現の不在下での腫瘍部位における低酸素由来因子（ＨＩＦ）の発現は、その腫瘍が血管新生阻害因子による治療が必要である段階まで進行していないことを示すものである。一方、癌遺伝子および／または腫瘍抑制遺伝子における突然変異に関連したＶＥＧＦおよびKDR/flk-1の発現によって悪性腫瘍が規定され、より攻撃的な治療養生法が指示される。４．発明の詳細な説明 4.1 癌進行中の形態学的および分子的事象腫瘍は、細胞が急速に分裂しているが、細胞の死滅速度が細胞増殖の速度と等しい小さな無症候性癌として何年もの間存続し得る。壊死腫瘍塊内では、間質圧力の増大および低酸素状態が生じる。最近、低酸素状態が、ＶＥＧＦの発現に関与する細胞転写因子である低酸素由来因子（ＨＩＦ）の発現を誘導することがわかった。ＨＩＦ−１は、ヘテロダイマーＤＮＡ結合タンパク質としてクローニングされ、同定されている。Wang，G．L.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:551 0-14(1995)（これは、参照により本明細書に含まれるものである）を参照されたい。転移性腫瘍の発達中、腫瘍塊中のいくつかの細胞は、血管新生表現型に「スイッチ」し、新生血管形成が起こる。この「スイッチ」は、一部は、低酸素およびＨＩＦの誘導によるものである。しかしながら、ＨＩＦの産生だけではＶＥＧＦの発現のきっかけとなるのには不十分である。腫瘍はＨＩＦを産生し得るが、ＶＥＧＦは産生せず、休止したままである。本発明は、一部は、ＶＥＧＦが腫瘍転移の主要分子マーカーとして用いられ得るという発見に基づくものである。低酸素およびＨＩＦの産生に応答してＶＥＧＦを産生することができる腫瘍のみが増殖し続け、最終的に転移することができるのである。したがって、ＨＩＦではなくＶＥＧＦが、腫瘍が血管新生表現型にスイッチされるかどうかの主要な決定因子である。ＶＥＧＦは、約45kDのヘパリン結合性のホモダイマー糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、種々の起源および細胞系から単離されており、その遺伝子は、ヒト細胞ならびにその他の種の細胞からクローニングされている。Tisher，E.ら，J．B iol．Chem．266:11947-54(1991)およびHouck，K．A．ら，Mol．Endocrinol．5:1 806-14(1991)（いずれの論文も参照により本明細書に含まれるものである）を参照されたい。ＶＥＧＦ遺伝子転写産物は、121、165、189および206アミノ酸からなる少なくとも４つの異なる分子種のいずれかにスプライシングされる。ＶＥＧＦ₁₆₅が最も一般的な形であり、組換え技術によって産生されたタンパク質産物として市販されている（R&D Systems，ミネアポリス、ミネソタ州）。この産物の生化学的特性は、天然源から単離されたＶＥＧＦ₁₆₅のものとよく一致している。腫瘍塊によるＶＥＧＦの放出は、隣接する内皮細胞における血管新生を刺激する。通常、毛管内皮細胞は、非常にゆっくりと（何千日かけて）交代し、血管周囲細胞と呼ばれる特殊細胞との接触によって休止状態を維持する。ＶＥＧＦが腫瘍塊によって発現されると、ＶＥＧＦ＋腫瘍細胞に近接する内皮細胞が、ＶＥＧＦ受容体分子KDR/flk-１および/またはflt-１の発現をアップレギュレートする。 KDR/flk-１およびflt-１は両方とも、ＶＥＧＦに対して高い特異性を有する受容体チロシンキナーゼタンパク質である。それらのリガンドが結合すると、これらの受容体はダイマー化し、チロシンリン酸化によって細胞内シグナルを伝達する。KDR/flk-１受容体チロシンキナーゼは、ヒト細胞およびMatthews，W.ら，Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 88:9026-30（これは、参照により本明細書に含まれるものである）に報告されているｃＤＮＡからクローニングされている。そのすぐ後に、同様の受容体をマウス細胞中で同定し、特徴付けしたところ、KDR/flk- 1受容体に対するリガンドはＶＥＧＦと同定された。同時係属中の、1994年２月９日に出願した米国特許出願第08/193,829号（参照により本明細書に含まれるものである）を参照されたい。ＶＥＧＦはflt-１受容体に対するリガンドでもある。ヒトflt-１タンパク質のヌクレオチド配列は、Shibuya，M.ら，Oncogene 5:519-24(1990)（参照により本明細書に含まれるものである）に報告されている。内皮細胞においてＶＥＧＦがそのコグネイトＶＥＧＦ受容体に結合すると、シグナル伝達を通してこれらの細胞における走化性作用が開始される。新しい毛管が内皮脈管からＶＥＧＦ＋腫瘍細胞の方へ発生する。血管新生中、内皮細胞は最大５日毎に分裂することによって急速に増殖する。ＶＥＧＦがそのコグネイト受容体に結合することによって内皮細胞の刺激が生じた後すぐに、オーファン受容体tek/tie-2が新しい毛管に発達している内皮細胞によって発現される。tek/tie-2は侵入性毛管の先端およびより発達した血管中で発現し、この受容体は、移動、増殖および新しい毛管細胞の維持に関係すると考えられる。実際、発達中のマウス脳における血管新生中のチロシンキナーゼ受容体発現の分析によって、KDR/flk-１受容体発現の約12時間後にtek/tie-２の発現が示された。tek/tie-２についてのヒト遺伝子のクローニングは、Zieg1er ，S．F．ら，Oncogene 8:663-70(1993)（参照により本明細書に含まれるものである）に記載されている。血管新生中に観察されたその他の受容体は、かかるプロセスにおけるその役割は依然として不明確であるが、flk-4受容体、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子β受容体、上皮増殖因子受容体、およびMet癌遺伝子である。Ｔu ija，M.およびAlitalo，K.，J．Cell Biol．129:895-898の概説を参照されたい。本発明は、癌の転移段階を評価し、適切な治療を案出するための方法において、上記で概説したような血管新生の開始と関連した分子事象の知識を用いるものである。特に、本発明の方法の鍵は、ＶＥＧＦを発現する腫瘍のみが増殖および転移する能力を有するという認識である。本発明の一つの態様においては、ヒト由来の腫瘍の試料が、下記の技術を用いて、ＶＥＧＦメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質の存在について分子的に特徴付けられる。また、同様の技術を用いて、試料は、因子ＨＩＦ−１、KDR/flk- １、flt-１、および/またはtek/tie-２の発現についても特徴付けられる。さらなる血管新生因子および受容体の存在、ならびに癌遺伝子対立遺伝子の存在も評価され得る。試料は、生検、針生検によって、または外科的デバルキング後に得られるものであり、組織学的に、または細胞溶解物として分析され得る。あらゆるＶＥＧＦの存在が血管新生活性の指標となるが、グルユース-6-リン酸デヒドロゲナーゼなどの対照マーカー、またはその他の任意の「ハウスキーピングタンパク質」もしくはＲＮＡ種に対するＶＥＧＦのレベルが、正常な組織試料におけるＶＥＧＦのレベルと比較され得る。本発明の主な利点は、試料中の血管を手動で計数することの必要性が排除される（それは、今でも行い得るが）ということである。ＨＩＦ−１の発現は、腫瘍塊中および腫瘍塊付近で生じる低酸素に対するマーカーである。したがって、ＨＩＦ−１は、腫瘍の壊死性低酸素部分が得られているという指標として使用され得る。ＶＥＧＦも存在する場合、このことによって腫瘍が血管新生表現型に「スイッチ」され、転移が起こり得るということが示されたことになる。血管新生に関与するさらなる受容体チロシンキナーゼの存在は、腫瘍によって生じた血管新生の段階および治療的処置の可能性のあるターゲットに関するさらなる情報を提供するものである。また、試料は、限定するものではないが、ABL、ERBB-1、NEU、GTP、GSP、MYC 、L-MYC、H-RAS、K-RAS、N-RAS、RET、ROS、K-SAM、SIS、SRC、およびTPKを含む、癌に関与していることが知られている多数の癌遺伝子のいずれかの発現についても分析され得る。Bishop，J．M．Cell 64:235-48(1991)（これは、参照により本明細書に含まれるものである）の概説を参照されたい。さらに、RB1、p53、WT 1、DCC、NFL1、FAP、およびMEN-1などの腫瘍抑制遺伝子の発現も評価され得る。本発明の別の態様においては、体液、例えば血液、血清、尿、リンパ液、および/または脳脊髄液が、ＶＥＧＦの濃度上昇についてアッセイされる。あるいは、ＶＥＧＦに特異的な放射性標識された抗体、またはＶＥＧＦ受容体分子の細胞外ドメインを含む標識タンパク質などの検出可能なように標識されたＶＥＧＦに対するリガンドをヒトの身体に導入して、標識リガンドの局在が、ＣＡＴスキャン、ＭＲＩ、ガイガーカウンター、またはその他の同等の装置などの標準手順によって検出される。本発明の方法を用いて腫瘍の分子プロフィールを測定すれば、医師は、癌治療の有効性および患者の生活の質の両方を最適化するための適切な治療を計画することができる。したがって、本発明の方法によって得られた知識を用いることによって、急性死亡性疾患を慢性状態に変換するために、癌の状態の管理を改良し得る。 4.2 血管新生中の分子事象についてのアッセイ腫瘍血管新生および転移の診断および予後評価、ならびにそのような状態に対する疾病素質を有する被検者の同定には、種々の方法を用いることができる。そのような方法は、例えば、本明細書に記載するように、ＶＥＧＦヌクレオチド配列およびＶＥＧＦ抗体などの試薬を利用し得る。具体的には、そのような試薬は、例えば、(1)非発癌性組織状態に対するＶＥＧＦｍＲＮＡの存在または過剰発現の検出；(2)非発現性組織状態に対するＶＥＧＦタンパク質の過剰発生量の検出；(3)腫瘍塊における低酸素状態の検出；(4)隣接内皮組織におけるＶＥＧＦチロシンキナーゼ受容体およびその他の血管新生受容体の発現の検出；および (5)癌遺伝子の発現の検出のために用いられ得る。本明細書に記載する方法は、例えば、本明細書に記載する少なくとも１種の特異的ＶＥＧＦヌクレオチド配列またはＶＥＧＦ抗体試薬を含む予めパッケージされた診断キットを利用することによって行い得るものであり、例えば、臨床状況において腫瘍血管新生および転移の危険のある患者を診断するために都合よく用いられ得る。ＶＥＧＦ遺伝子発現の検出のために、ＶＥＧＦ遺伝子が発現するあらゆる細胞型または組織、例えば腫瘍細胞などが利用され得る。ＶＥＧＦタンパク質の検出のために、ＶＥＧＦ遺伝子が発現するあらゆる細胞型または組織、ならびに内皮細胞などのＶＥＧＦ受容体を発現することが知られているあらゆる細胞が使用され得る。さらに、ＶＥＧＦタンパク質の存在は、腫瘍塊に連通したあらゆる体液においてアッセイされ得る。例えば、脳腫瘍の場合においては、好ましくは髄液が利用され得る。その他の種の腫瘍に対しては、血液、血清、および/または尿が分析され得る。核酸に基づく検出技術は、下記の4.2.1節に記載する。ペプチド検出技術は、下記の4.2.2節に記載する。これらの技術は全て、本発明の方法に用いられる主要マーカーであるＶＥＧＦ発現の検出に関して記載されているが、これらの技術は全て、血管新生に関連したその他のあらゆる分子マーカーの検出にも用いられ得る。例えば、これらの技術は、ＨＩＦ−１および受容体タンパク質KDR/flk-1 、flt-１、およびtek/tie-２、ならびにその他の血管新生タンパク質の発現パターンおよび発現レベルを測定するのに用いられ得る。さらに、異なる癌遺伝子対立遺伝子の発現が、これらの方法を用いて評価され得る。その他のマーカーの発現に関して得られたさらなる情報は、特定の患者における癌の分子段階に適した血管新生および/または腫瘍増殖を阻害するための適切な治療を計画する助けになる。 4.2.1 ＶＥＧＦ遺伝子および転写物の検出ＶＥＧＦ遺伝子発現のレベルは、ＶＥＧＦ転写を検出および測定することによってアッセイすることができる。あらゆる細胞由来の核酸がそのようなアッセイ技術の出発点として用いられ、この核酸は当業者によく知られた標準核酸調製手順にしたがって単離され得る。例えば、ＶＥＧＦ遺伝子を発現すると推測される腫瘍標本由来のＲＮＡが、単離され、下記のようなハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ技術を用いて試験され得る。単離細胞は、細胞培養物または患者から誘導することができる。培養から得られた細胞の分析は、ＶＥＧＦ遺伝子の発現における化合物の効果を試験するのに有用であり得る。そのような分析によって、ＶＥＧＦ遺伝子発現の活性化または不活性化を含む、ＶＥＧＦ遺伝子の発現パターンの定量的および定性的局面の両方が明らかになり得る。そのようなＶＥＧＦ遺伝子転写物を検出する診断方法には、例えば、試料から得られたＲＮＡまたはＲＮＡから作製されたｃＤＮＡなどの核酸を、組換えＤＮＡ分子またはin vitroで転写したアンチセンスＲＮＡプローブを含む１以上の標識化核酸試薬と、これらの試薬がＶＥＧＦ遺伝子内の相補配列へ特異的にアニーリングするのに適した条件下で接触させ、インキュベートすることが含まれ得る。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは、少なくとも15〜30ヌクレオチドである。インキュベート後、アニールされていない全ての核酸を、核酸：ＶＥＧＦ分子ハイブリッドから除去する。次いで、ハイブリダイズした核酸の存在は、そのような分子が存在する場合、検出される。このような検出スキームを用いて、目的の細胞型または組織由来の核酸は、例えば、膜などの固体支持体、またはマイクロタイタープレートまたはポリスチレンビーズの表面などのプラスチック表面に固定することができる。この場合、インキュベート後、5.1節に記載したタイプのアニールされていない標識化核酸試薬は容易に除去される。残ったアニールされた標識化ＶＥＧＦ核酸試薬の検出は、当業者によく知られた標準技術を用いて行なわれる。ＶＥＧＦ遺伝子発現が存在するか否かを測定するために、標識化ＶＥＧＦ遺伝子配列が試料にアニールした度合いを、正常な細胞または組織から予測したアニーリングパターンと比較することができる。患者の試料またはその他の適当な細胞ソースにおいてＶＥＧＦ遺伝子特異的核酸分子を検出する別の診断方法には、例えば、ＰＣＲ（Mullis，K．B.，1987, 米国特許第4,683,202号に記載された実験態様）によってそれらの分子を増幅した後、当業者によく知られた技術を用いて増幅分子を検出することが含まれ得る。ＶＥＧＦ遺伝子発現がアップレギュレートされたか否かを測定するために、得られた増幅配列を、増幅されたその核酸が正常なレベルのＶＥＧＦ遺伝子転写物のみを含む場合に予測されるものと比較することができる。そのような検出スキームの１つの実施態様においては、ｃＤＮＡは目的のＲＮＡから（例えば、ＲＮＡ分子をｃＤＮＡに逆転写することによって）合成される。次いで、ｃＤＮＡ内の配列を鋳型として用いて、ＰＣＲ増幅反応などの核酸増幅反応を行う。この方法の逆転写工程および核酸増幅工程において合成開始試薬（例えばプライマー）として用いられる核酸試薬は、ＶＥＧＦ核酸配列の中から選択される。そのような核酸試薬の好ましい長さは、少なくとも９〜30ヌクレオチドである。増幅産物の検出のために、核酸増幅は放射性または非放射性標識化ヌクレオチドを用いて行なわれ得る。また、標準臭化エチジウム染色またはその他の適当な核酸染色方法を利用して視覚化し得るように十分な増幅産物が作られ得る。さらに、核酸精製の必要がないように、「in situ」にて、すなわち生検または切除から得られた患者の組織の組織切片（固定および/または凍結したもの）に対して直接、そのようなＶＥＧＦ遺伝子発現アッセイを行うことも可能である。4.1節に記載したような核酸試薬を用いることによってinsitu手順のためのプローブおよび/またはプライマーを設計し得る（例えば、Nuovo，G．J.，1992, 「ＰＣＲ in situハイブリダイゼーション：プロトコルおよび応用」，Raven Pr ess，NYを参照されたい）。また、十分な量の適当な細胞が得られ得る場合、標準ノーザン分析を行って、ＶＥＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定することができる。 4.2.2 ＶＥＧＦタンパク質の検出ＶＥＧＦタンパク質、またはその保存変異体もしくはそのペプチド断片に特異的な抗体を、本明細書に記載するように、腫瘍血管新生および転移の診断および予後として用い得る。そのような診断方法を用いて、ＶＥＧＦ遺伝子発現のレベルでの異常、またはＶＥＧＦの構造および/または一時性(temporal)、組織、細胞または細胞下の位置における異常を検出し得るものであり、そのような診断方法は、例えば生検組織などでin vivoまたはin vitroで行い得るものである。また、抗体は、異常なＶＥＧＦ活性の阻害方法としても用いられ得る。したがって、そのような抗体は癌治療法の一部として利用され得る。本発明の方法に用いられ得る抗体としては、限定するものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab')2断片、Fab発現ライブラリーによって産生された断片、抗イディオタイプ（抗−Id）抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられる。抗体の産生のために、ＶＥＧＦ、末端切断したＶＥＧＦポリペプチド、およびＶＥＧＦ融合タンパク質の注射によって種々の宿主動物を免疫し得る。ＶＥＧＦは、よく知られた技術を用いて天然ソースから単離されるか、組換え的に産生され得る。組換えＶＥＧＦは、R&D Systems（ミネソタ州）から市販されている。ＶＥＧＦの融合タンパク質は抗原にも適している。ほぼあらゆる遺伝子に由来するコード配列を用いた融合タンパク質の産生になじみやすいよく知られたシステムは、ｐＧＥＸベクター（Pharmacia，ピスカタウェイ(Piscataway)，ニュージャージー州）を用いるシステムである。選択したコード領域を、グルタチオン -S-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードするオープンリーディングフレームのフレーム内および下流にある細菌発現ベクターに挿入する。得られたベクターをE.coliに形質転換する。ベクターから発現を誘導することによってグルタチオンアガロースビーズ（Pharmacia，ピスカタウェイ，ニュージャージー州）上の細胞溶解物から容易に精製され得るＧＳＴ−融合タンパク質が産生された。精製融合タンパク質は抗原として直接用いられ得るものであり、または融合タンパク質および免疫原として用いられる挿入配列によってコードされるペプチドからＧＳＴ部分は切断され得る。抗体の産生のための宿主動物としては、限定するものではないが、少し名前を挙げるとすると、ウサギ、マウスおよびラットが挙げられ得る。免疫応答を高めるために宿主種に依存して種々のアジュバントが用いられ得、限定するものではないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール(pluronic polyols)、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウムパルブム(Corynebacterium parvum)などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。ポリクローナル抗体は、免疫化動物の血清から誘導される抗体分子の不均一集団である。モノクローナル抗体は、特定の抗原に対する抗体の均一集団であるが、培養において連続細胞系により抗体分子を産生させる技術によって得られ得る。そのような技術としては、限定するものではないが、KohlerおよびMilstein(1975，Nat ure 256:495-497;および米国特許第4,376,110号）のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosborら，1983，Immunology Today 4:72;Coleら，1 983，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 80:2026-2030)、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Coleら，1985，Monclonal Antibodies And Cancer Therapy，Alan R． Liss，Inc．pp.77-96)が挙げられる。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ,．ＩｇＡ,．ＩｇＤ、およびそれらのサブクラスを含むあらゆる免疫グロブリンクラスに含まれるものであり得る。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、in vitroまたはin vivoで培養され得る。高力価のｍＡｂのin vivo産生によりこれは現在のところ好ましい産生方法である。さらに、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライスすることによって「キメラ抗体」(Morrisonら，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81:6851-6 855;Neubergerら，1984，Nature，312:604-608;Takedaら，1985，Nature，314:4 52-454)を産生するために開発された技術を用いることができる。キメラ抗体は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリン定常領域から誘導された可変領域を有するものなどの、種々の部分が異なる動物種から誘導された分子である。また、単鎖抗体の産生について記載された技術（Bird，1988，米国特許第4,94 6,778号;Science 242:423-426；Hustonら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:5879-5883；およびWardら，1989，Nature334:544-546）を用いてＶＥＧＦタンパク質に対する単鎖抗体を産生することができる。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域のＨ鎖断片とＬ鎖断片を結合して単鎖ポリペプチドにすることによって形成される。特異的エピトープを認識する抗体断片は、公知の技術によって作製され得る。例えば、そのような断片としては、限定するものではないが、抗体分子のペプシン消化によって産生され得るF(ab')₂断片およびF(ab')₂断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製され得るFab断片が拳げられる。また、Fab発現ライブラリーを構築することによって(Huseら，1989，Science，246:1275-1281)、所望の特異性を有するモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能であり得る。次いで、ＶＥＧＦに対する抗体を利用して、当業者によく知られた技術を用いてＶＥＧＦを「模倣」する抗イディオタイプ抗体を作製することもできる（例えば、GreenspanおよびBona，1993，FASEB J．7(5):437-444;ならびにNissinoff，19 91，J．Immunol．147(8):2429-2438を参照されたい）。例えば、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ受容体に結合するのを競合的に阻害する抗体を用いることによって、ＶＥＧＦを「模倣」して受容体を結合および中和する抗イディオタイプ抗体を作製することができる。そのような中和抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのFab断片を治療養生法に用いて、ＶＥＧＦ活性を中和し、血管新生を阻害することができる。さらに、その存在が検出され得るＶＥＧＦ受容体融合タンパク質またはＶＥＧＦ受容体複合タンパク質を投与することができる。好ましくは、膜貫通および細胞内キナーゼドメインが欠けている内因的にコードされたsflt-1受容体などのＶＥＧＦ受容体の可溶性細胞外ドメインが用いられ得る。Kendall R．およびThoma s,K.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:10705-10709(1993)。例えば、放射線不透過性化合物またはその他の適切な化合物で標識されたＶＥＧＦ受容体融合または複合タンパク質を投与して、標識抗体について上記したように、in vivoで視覚化することができる。さらに、そのようなＶＥＧＦ受容体融合タンパク質は、 in vitro診断手順に利用することができる。ＶＥＧＦに特異的な抗体をin vivoで用いることにより、身体におけるＶＥＧＦの発現のパターンおよびレベルを検出することができる。そのような抗体は、例えば、Ｘ線、ＣＡＴスキャンまたはＭＲＩなどの標準方法を用いて身体において発現したＶＥＧＦへの結合を視覚化するために、放射性不透過性の化合物またはその他の適切な化合物で標識されて、被検者に注射することができる。標識化抗体断片、例えば、抗原結合領域の最小部分を含むFabまたは単鎖抗体は、血液脳関門を横切ることを促進する目的にとって好ましい。また、上記のようなイムノアッセイまたは融合タンパク質検出アッセイを生検および検死試料においてin vitroで利用して、ＶＥＧＦの発現パターンを評価することができる。そのようなアッセイは、ＶＥＧＦを規定する抗体の使用に限られず、HIF-1、KDR/flk-１、flt-１およびtek/tie-２のドメインのいずれかのエピトープに特異的な抗体の使用が含まれ得る。これらの標識化抗体のそれぞれまたは全てを使用することにより、腫瘍発達の段階に関する有用な情報が得られる。分析される組織または細胞型には、概して、腫瘍細胞、ＶＥＧＦタンパク質に対する結合部位を含む内皮細胞、および体液などのＶＥＧＦ遺伝子を発現すると推測されるものが含まれる。体液中のＶＥＧＦの定量に適したＶＥＧＦアッセイについての記載は、Baker，P.D.ら，Obstetrics ＆ Gynecology 86:815-821(199 5)（この内容全体が参考として本明細書に援用される）にある。本明細書で用いるタンパク質単離方法は、例えば、HarlowおよびLaneに記載された方法である（ Harlow，E．およびLane，D.，1988，「抗体：実験マニュアル」，Cold Spring H abor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，ニューヨークを参照されたい。この内容全体が参考として本明細書に援用される）。単離細胞は、細胞培養物またはヒトから誘導することができる。培養物から得られた細胞の分析は、ＶＥＧＦ遺伝子の発現における化合物の効果を試験するのに有用であり得る。本発明において有用な抗体（もしくはその断片）またはＶＥＧＦ受容体融合もしくは複合タンパク質は、さらに、ＶＥＧＦタンパク質またはその保存変異体もしくはペプチド断片のin situ検出のために、免疫蛍光検査法、免疫電子顕微鏡検査法、または非免疫アッセイにおいても組織学的に用いられ得る。 in situ検出は、患者由来の組織学的標本を取り出し、それを本発明の標識化抗体または融合タンパク質と接触させることによって行なわれ得る。抗体（もしくは断片）または融合タンパク質は、好ましくは、標識抗体（または断片）を生物学的試料上にのせることによって適用される。そのような手順を使用することによって、ＶＥＧＦタンパク質の存在のみならず、検査される組織におけるＶＥＧＦタンパク質の分布も測定することができる。当業者は、本発明を用いて、そのようなin situ検出を行うために広範な組織学的方法（染色手順など）のいずれかを変更することができるということに容易に気づくであろう。ＶＥＧＦタンパク質またはその保存変異体もしくはペプチド断片についてのイムノアッセイおよび非イムノアッセイには、典型的には、生体液、組織抽出物、新たに採取した細胞、または細胞培養中でインキュベートした細胞の溶解物などの試料を、ＶＥＧＦタンパク質またはその保存変異体もしくはペプチド断片を同定することができる検出可能なように標識化された抗体の存在下でインキュベートし、当該分野において周知の多くの技術のいずれかによって結合抗体を検出することが含まれる。生物学的試料を、ニトロセルースなどの固相支持体または担体、または細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定することができるその他の固体支持体上に接触させ固定することが可能である。次いで、支持体を、適切な緩衝液で洗浄した後、検出可能に標識化されたＶＥＧＦ抗体またはＶＥＧＦ受容体融合タンパク質で処理し得る。その後、固相支持体を緩衝液で再度洗浄し、非結合抗体または融合タンパク質を除去し得る。次に、固体支持体上の結合標識の量を通常の手段によって検出し得る。「固相支持体または担体」とは、抗原または抗体を結合する能力のあるあらゆる支持体を意味する。周知の支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロス(gabbros)、ならびに磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のためには、ある程度まで可溶または不溶のいずれでもあり得る。支持体材料は、実質的には、結合した分子が抗原または抗体に結合することができるかぎり、どのような構造的外形を有していてもいてもよい。したがって、支持体の外形は、ビーズのような球形、または試験管の内表面もしくは棒の外表面のような円筒形であり得る。また、その表面は、シート、試験ストリップなどのように平坦であり得る。好ましい支持体としては、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体または抗原を結合するのに適したその他多くの担体を知っており、または常套的な実験によりそれらを突きとめることができるであろう。所与の群のＶＥＧＦ抗体の結合活性は、周知の方法によって測定され得る。当業者は、常套的な実験によって各測定についての有効かつ最適な条件を決定することができるであろう。抗体について、ＶＥＧＦ抗体を検出可能なように標識し得る方法の１つは、この抗体を酵素に結合し、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）において使用するものである（Voller，A.，「酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）」，19 78，Diagnostic Horizons 2:1-7，Microbiological Associates Quarterly Publ ication，ウォーカースヴィル(Walkersville)，メリーランド州）；Voller，A．ら，1978，J．Clin．Pathol．31:507-520;Butler，J．E.，1981，Meth．Enzymol ．73:482-523;Maggio，E．（編），1980，Enzyme Immunoassay，CRC Press，ボッカレイトン(Boca Raton)，フロリダリダ州Ishikawa，E.ら(編)，1981，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，東京）。例えば、スペクトル分光法、蛍光光度法、または視覚化手段によって検出することができる化学部分を産生することができるような手法で、抗体に結合する酵素を、適当な基質、好ましくは色素産生基質と反応させる。検出可能なように抗体を標識化するために用いられ得る酵素としては、限定するものではないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌性ヌクレアーゼ、δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、 α−グリセリンリン酸、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。検出は、酵素に対する色素産生基質を用いる比色分析法によって行なうことができる。また、検出は、基質の酵素反応の程度を、同様に調製した標準物質と視覚的に比較することによっても行い得る。また、検出は、種々のその他のイムノアッセイのいずれかを用いても行い得る。例えば、抗体または抗体断片を放射性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いてＶＥＧＦを検出することができる（例えば、参考のためにその全体が援用されるWeintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays， S eventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine So ciety，1996年３月を参照されたい）。放射性同位体は、ガンマカウンターもしくはシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーを用いるような手段で検出することができる。抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識抗体を適当な波長の光に曝すと、その存在が蛍光により検出され得る。最も一般的に用いられている蛍光標識化合物には、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン(phycocyanin)、アロフィコシアニン(allophycocya nin)、o-フタルデヒド(o-phthaldehyde)およびフルオレサミン(fluorescamine) がある。また、抗体は、¹⁵²Eu、またはランタニド系列のその他の金属などの蛍光放出金属を用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート団を用いて抗体に結合させることができる。また、抗体は、抗体を化学ルミネッセンス化合物に結合することによって検出可能に標識することもできる。この場合、化学ルミネッセンス標識化抗体の存在は、化学反応過程に生じるルミネッセンスの存在を検出することによって測定される。特に有用な化学ルミネッセンス標識化合物としては、例えば、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル(theromatic acridi nium ester)、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが挙げられる。さらに、生物ルミネッセンス化合物を用いて本発明の抗体を標識することも可能である。生物ルミネッセンスは、生体系に見とめられる化学ルミネッセンスの１種であり、触媒タンパク質が化学ルミネッセンス反応の効率を増大させる。生物ルミネッセンスタンパク質の存在は、ルミネッセンスの存在を検出することによって測定される。標識目的に重要な生物ルミネッセンス化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。 4.3 癌および転移に関連したさらなる分子マーカーの検出上記のように、腫瘍中のＶＥＧＦの存在を分析するための上記に詳述した核酸およびタンパク質検出技術はまた、HIF、KDR/flk-1、flt-１、tek/tie-２、または血管新生に関与する種々の受容体チロシンキナーゼのいずれかをこれらに限定されることなく含む、血管新生表現型に関連した種々のその他の因子の発現についてアッセイするために使用してもよい。さらに、上記で詳述した技術を用いて、癌遺伝子対立遺伝子の発現または腫瘍抑制遺伝子産物の皆無についてアッセイしてもよい。ＶＥＧＦタンパク質を検出するための上記で詳述した方法の改変において、検出可能に標識、またはその存在が容易に測定され得るタンパク質に融合されたＶＥＧＦを用いることによって、KDR/flk-１および/またはflt-１などのＶＥＧＦ受容体タンパク質の存在を検出し得る。例えば、ＶＥＧＦは、組換え合成中に、³⁵ Ｓ−含有アミノ酸で放射性標識され得る。また、ＶＥＧＦは、当業者に周知の技術を用いて、免疫グロブリン定常ドメインを含む融合タンパク質として組換え的に産生され得る。 KDR/flk-１、flt-１、tek/tie-２ならびにその他の受容体チロシンキナーゼ受容体を含む、試料中に存在する受容体チロシンキナーゼ受容体の完全なプロフィールは、その開示全体が参考として本明細書に援用される1995年５月５日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/436,065号に完全に記載される転写物画像化技術を用いて決定され得る。 4.4 癌治療を設計し、血管新生阻害剤を選択するための腫瘍の分子プロファイリング上記詳述した本発明の方法から得られた情報を用いて、医師は、患者の癌の状態の分子段階に適合した適切な治療を設計することができる。癌の第一段階においては、細胞は急速に増殖し始める。小さな腫瘍が形成される。成長している腫瘍塊へのさらなる栄養素および酸素の一定の流れがなくなると、細胞は、腫瘍部位で細胞分裂と同じくらい急速に死滅し始める。この段階においては、壊死腫瘍塊内で低酸素状態が生じ、これはＨＩＦ−１の誘導によって検出することができる。しかしながら、ＶＥＧＦが存在しない場合、血管新生は生じず、腫瘍塊は小さいままであり、循環系から隔離されたままである。この腫瘍由来の試料を本発明の方法を用いてアッセイすると、細胞がＨＩＦ−１を発現していることがわかるであろうが、ＶＥＧＦは発現していないであろう。この腫瘍段階は、血管新生前であり、転移表現型まで進行していない。したがって、腫瘍の治療は、もしあったとしても腫瘍部位に限定されるべきであり、患者はその後定期的に検査されるべきである。患者から単離された腫瘍細胞が本発明の診断方法を用いてＶＥＧＦを発現していることがみとめられた場合、この患者は抗血管新生治療を受ける候補となる。血管新生が阻害されると、腫瘍増殖および転移も阻害されるという証拠が相当蓄積されている。例えば、Asano，M.ら，Cancer Research 55:5296-5301(1995);Ko ndo，S.ら，Biochem．Biophys．Res．Comm．194:1234-41;およびMillauer，B.ら，Nature367:576-79(1994)を参照されたい。適当な抗血管新生剤は、例えば、Folkman J．New England J．of Med．333:17 57-63(1995)に記載されているように、インターフェロン−α２ａ、サリドマイド、ミノサイクリン、フマギリン(fumagillin)TNP-470の合成類似体、インターロイキン-12、メタロプロテアーゼ阻害剤、および血小板因子４などの血管新生をほぼ阻害すると知られている、または考えられているものから選択され得る。さらに、Asano，M.ら，Cancer Research 55:5296-5301(1995)に記載されているようなＶＥＧＦを結合および中和する特異的モノクローナル抗体によって、または膜貫通および細胞内キナーゼドメインが欠けている内因的にコードされたsflt -1受容体などの末端切断したＶＥＧＦ受容体を用いることによって、ＶＥＧＦの活性は直接的に阻害され得る。Kendall R．およびThomas，K.，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 90:10705-10709(1993)を参照されたい。さらに、ＶＥＧＦに加えて、癌の状態に関与する特異的受容体に関する知識によって薬剤治療のためにそれらの受容体を標的にすることができる。例えば、KD R/flk-１がその癌に関与することが知られている場合、参考としてその全体が援用される1996年３月21日に出願した共願で同時係属中の米国特許出願代理人事件登録簿第7683-114号に記載された化合物を利用することにより、KDR/flk-１受容体を特異的に阻害し得る。さらに、ＶＥＧＦが存在する場合、このことは、腫瘍が、転移が生じ得る段階まで進行していることを示している。得られた特定の腫瘍プロフィールに依存して、医師は抗血管新生治療を化学療法などの積極的な全身治療と組み合わせるべきである。公知の腫瘍癌遺伝子ならびに転移および増殖の予後指標の同定は、医師によって選択される治療養生法の積極性の決定の助けとなる。均等物前述の記載は、当業者が本発明を実施するために十分であると考えられる。実際、本発明を実施するために分子生物学またはそれに関連する分野の当業者に明らかな上記の方法の種々の改変が、以下の特許請求の範囲内に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）ヒトから細胞試料を取り出し；ｂ）試料をＶＥＧＦ転写活性についてアッセイし；そしてｃ）ＶＥＧＦ転写活性の誘導によって特徴付けられる転移性疾患の存在を決定することを含む、ヒトの転移性疾患を診断する方法。２．前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。３．前記腫瘍細胞が腫瘍の外科的デバルキングによって得られる、請求項２に記載の方法。４．前記転写活性を、標識された相補的な核酸に前記細胞由来のＲＮＡをハイブリダイゼーションさせることによって測定する、請求項１に記載の方法。５．前記転写活性をポリメラーゼ連鎖反応によって測定する、請求項１に記載の方法。６．前記試料を、ＶＥＧＦタンパク質の存在についてアッセイすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。７．前記試料を、血管新生に関与するチロシンキナーゼ受容体の発現についてアッセイすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。８．前記チロシンキナーゼ受容体が、KDR/flk-1受容体、flt-1受容体、および /またはtek/tie-２受容体からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。９．前記試料を、低酸素由来因子１の発現についてアッセイすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。 10．癌遺伝子の異常発現についてアッセイすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。 11．ａ）ヒトから組織または体液の試料を取り出し；ｂ）該試料中のＶＥＧＦタンパク質の存在をアッセイし；そしてｃ）ＶＥＧＦタンパク質の存在によって転移性疾患の存在を決定することを含み、ＶＥＧＦタンパク質の異常存在が転移性疾患の存在を示すものである、ヒトの転移性疾患を診断する方法。 12．前記試料が腫瘍の外科的デバルキングによって得られる、請求項11に記載の方法。 13．前記体液が血液である、請求項11に記載の方法。 14．ＶＥＧＦの存在を、抗ＶＥＧＦ抗体を用いて決定する、請求項11に記載の方法。 15．前記抗ＶＥＧＦ抗体をＥＬＩＳＡアッセイに用いる、請求項14に記載の方法。 16．前記試料を、血管新生に関与するチロシンキナーゼ受容体の発現についてアッセイすることをさらに含む、請求項11に記載の方法。 17．チロシンキナーゼ受容体が、KDR/flk-1受容体、flt-1受容体、および/またはtek/tie-2受容体からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。 18．前記試料を、低酸素由来因子の発現についてアッセイすることをさらに含む、請求項11に記載の方法。 19．癌遺伝子の発現についてアッセイすることをさらに含む、請求項11に記載の方法。 20．ａ）ＶＥＧＦを特異的に認識するリガンドを検出可能なように標識し；ｂ）標識リガンドをヒトに投与し；そしてｃ）そのヒトにおける標識抗体または融合タンパク質の局在を検出することを含み、ＶＥＧＦの異常局在化が転移性疾患を示すものである、ヒトの転移を診断する方法。