KR20170143134A - 포타슘 채널 단백질을 이용한 암 진단용 조성물 - Google Patents

포타슘 채널 단백질을 이용한 암 진단용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포타슘 채널 단백질들을 이용한 암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트 및 암 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 암 진단용 조성물 또는 키트를 사용하면, 개체의 시료가 처리된 혈관내피세포 또는 개체에서 분리된 적혈구로부터 포타슘 채널인 KCa3.1 채널, KCa2.3 채널 또는 이의 조절인자의 발현수준을 측정하여, 암의 종류에 상관없이 그의 발병여부를 진단할 수 있으므로, 다양한 암의 진행수준(성장, 전이, 예후 및 재발)의 판단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

포타슘 채널 단백질을 이용한 암 진단용 조성물{Composition for diagnosing cancer using potassium channel protein}
본 발명은 포타슘 채널 단백질을 이용한 암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트 및 암 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
'종양(tumor)'은 양성종양(benign tumor)과 악성종양(malignant tumor)으로 구분되는데, 양성종양은 성장 속도가 느리고 전이(metastasis)되지 않는다. 반면 흔히 암이라고 불리는 악성종양은 주위 조직을 침윤하면서 빠르게 성장하고 다른 부위에 전이되어 생명을 위협하게 된다. 우리나라 통계에 따르면 2013년 암에 의한 사망자는 전체 사망자의 28.3%로 가장 흔한 사망원인이며, 암 환자 수도 매년 20만 명 이상 새로운 환자가 발생하는 등 증가하고 있다. 암에 걸릴 확률은 우리나라 사람의 평균 수명에 가까운 81세까지 생존하는 경우 36.2%에 달할 정도로 매우 높다. 이와 같이 인간의 건강에 가장 큰 영향을 미치는 질환인 암은 내시경이나 CT와 같은 영상의학적인 방법 등을 이용하여 암 덩어리를 발견하고 조직학적 방법으로 확인하여 진단하게 된다. 이러한 전통적인 방법들은 암 덩어리가 발견 가능한 크기가 된 다음 즉 암이 어느 정도 진행된 다음에야 발견 가능하다. 그런데 암은 발생 초기에 발견하여 치료를 시작하는 것이 암을 적절하게 치료하는데 매우 중요하다. 그러므로 암 발생 혹은 재발을 조기에 발견하기 위한 방법들이 많이 연구되고 있다.
암 조기 발견을 위한 방법으로 종양표지자 등과 같은 특정암 마커들을 이용하는 방법들이 많이 연구되고 있는데, 이러한 종양표지자로는 대장암의 암 태아성 항원(carcinoembryonic antigen; CEA), 간암의 α-태아단백질(α-fetoprotein; AFP) 등이 있다. 그리고, 한국공개특허 제10-2009-0029868호에는 간암 환자의 체액에서 아넥신 2의 과발현 현상을 이용하여 간단한 분석을 통해 간암 진단의 정확성을 높인 간암 마커 및 상기 마커를 이용하여 간암을 진단하는 방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-1058783호에는 사이클로필린 A를 코딩하는 유전자를 간암진단용 마커로 사용하여 간암을 진단하는 방법이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제10-1071219호에는 TGFβRIII 유전자의 엑손 부위에 존재하는 다형성에 근거한 간암 진단용 다형성 마커 및 상기 마커를 이용하여 간암을 진단하는 방법이 개시되어 있다. 이러한 종양표지자를 이용한 암 진단방법들은 암 조기 진단을 위한 보조적 진단 방법으로 이부 사용되고 있거나 개발 중에 있다.
본 연구자는 KCa2.3과 KCa3.1 단백질의 발현 수준이 간암, 폐암, 췌장 암 등에서 크게 증가함을 발견하였다. 이러한 KCa2.3과 KCa3.1 단백질의 발현 수준 증가는 암세포가 암 조직 성장을 위해 분비하는 VEGF와 같은 혈관성장인자들에 의해 일어나는데, 정상 혈관내피세포를 환자 혈청에 24시간 이내로 노출시켜도 발생하여, 이러한 K+ 채널 단백질 발현 증가는 매우 빠른 시간 내에 일어남을 알 수 있었다. 그리고 이 K+ 채널 단백질의 발현을 조절하는 인자들(클라트린 등)의 발현 역시 매우 빠르게 조절됨을 알 수 있었다. 이런 결과로 미루어 KCa2.3과 KCa3.1 단백질, 그리고 이 K+ 채널 단백질의 발현 조절인자들의 발현 수준은 혈관성장인자의 수준을 잘 반영하는 것으로 생각된다. 그리고 환자 적혈구에서도 KCa3.1 단백질 발현이 증가하였다. 혈관내피세포와 적혈구는 동일한 혈청에 노출되므로, 혈관내피세포의 KCa3.1 발현 수준은 적혈구에서의 발현 수준으로 대체할 수 있을 것으로 생각된다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 혈관신생 관련 인자들의 발현 수준 측정을 통해 효과적으로 암을 진단하는 방법을 개발하기 위해 예의 연구노력한 결과, KCa2.3 단백질, KCa3.1 단백질 또는 이 채널들의 발현을 조절하는 인자들의 발현수준을 혈관내피세포 또는 적혈구에서 측정함으로써, 암의 발병여부를 효과적으로 조기진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 포타슘 채널 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 포타슘 채널 단백질은 Kca2.3 채널, KCa3.1 채널 또는 이들의 조합이 될 수 있다.
암 환자의 혈청이 처리된 정상 혈관내피세포 또는 암 환자의 적혈구에서 포타슘 채널(Kca2.3 채널 또는 KCa3.1 채널)의 발현수준은 증가하므로, 상기 채널을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 본 발명의 조성물을 이용하여 상기 혈관내피세포 또는 적혈구에서 포타슘 채널(Kca2.3 채널 또는 KCa3.1 채널)의 발현수준을 측정하여 암 진단에 다음과 같이 활용할 수 있다. 즉, KCa2.3 채널 또는 KCa3.1 채널의 발현 정도가 암 전이와 예후에 영향을 미친다고 알려져 있어, 이 채널들의 발현 정도로 예후와 전이 가능성을 판단할 수 있으며, 암 치료 후 감소했던 이 채널들의 발현이 다시 증가하는 경우 재발한 암 세포에서 분비된 VEGF에 의해 발현이 증가하였을 가능성이 있어 암 재발 진단에 활용할 수 있다.
뿐만 아니라, 간염에서 간경변증, 간경변증에서 간암으로 진행하는 과정 중에 있어서도 발현이 증가하기 때문에, 본 발명의 진단용 조성물은 암의 진행(성장, 전이, 예후 및 재발) 등의 판단에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
상기와 같은 개체의 혈액시료가 처리된 혈관내피세포 또는 개체의 적혈구에서 포타슘 채널(Kca2.3 채널 또는 KCa3.1 채널) 또는 이의 조절인자의 발현수준을 측정하여 암을 진단하는 기술은 지금까지 전혀 알려지지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
본 발명에서 제공하는 암을 진단하는 기술은 암 치료 후 재발 가능성에 대한 조기 진단에 유용할 것으로 예상된다. 암 치료 후 재발 가능성에 대한 조기진단방법도 많이 연구 중인데, 암 환자에서 재발이 많고 암 세포가 확산되기 전에 치료를 시작하여 완치가능성을 높일 수 있기 때문이다. 최근, 영국의 암연구소는 유방암에서 혈중 잔류 암세포가 다른 조직에 침투하기 전 방출하는 DNA를 검출하는 방법으로 재발가능성을 진단하는 방법을 개발하였으며, 이 방법으로는 CT, MRI 등 전통적인 방법으로 재발한 암 덩어리를 발견하기 전 수개월 전에 재발 가능성 진단이 가능할 것으로 추정된다. 암이 재발하기 전, 즉, 암 덩어리가 커지기 전에 혈관신생인자들의 분비와 이로 인한 KCa2.3, KCa3.1 발현증가가 선행할 것이므로 암 재발 진단에 유용할 것으로 생각된다. 그리고, 암의 전이 가능성과 예후 진단 등 판단에도 매우 유용할 것으로 예상된다. 일부 암에서는 KCa3.1 발현 증가가 암전이 가능성을 높이고 생존 가능성을 낮춘다는 보고가 있으며, 간암에서도 KCa2.3과 KCa3.1 발현을 증가시키는 VEGF 수용체가 증가하면 예후가 나쁘다는 보고도 있어 KCa2.3과 KCa3.1 발현 정도는 암 전이 가능성 및 예후 판정에 큰 도움이 될 것이다.
상기 조성물에 의해 진단될 수 있는 암은 암의 발병으로 인해 혈관내피세포 또는 적혈구의 KCa3.1 채널 또는 KCa2.3 채널의 단백질 또는 mRNA 수준이 증가되는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로, 간암, 폐암, 위암, 췌장암, 신장암, 자궁암, 자궁경부암, 뇌암, 구강암, 대장암, 담도암, 골암, 피부암 등의 암종이 단독으로 또는 복합적으로 발병된 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "포타슘 채널 단백질(potassium channel protein)"이란, 세포막에 존재하면서 세포의 안과 밖으로 이온을 통과시키는 막 단백질의 일종인 이온 채널 단백질(ion channel protein) 중에서 K+ 이온을 통과시키는 채널 단백질을 의미한다. 대체로, 이온 채널 단백질은 통과시키는 이온 종류에 따라 Na+ 채널, Ca2+ 채널, K+ 채널 등으로 분류되는데, 그 중 포타슘 채널 단백질은 세포막을 통한 이온의 흐름을 조절하여 막전압을 결정하며 이를 통해 세포 내 Ca2 + 농도와 흥분성을 조절하는 등 세포 기능에 큰 영향을 미친다. 세포 내 Ca2 +에 의해 활성화되는 K+ 채널에는 여러 가지 종류가 있는데 혈관내피세포에는 KCa1.1 채널, KCa2.3 채널, KCa3.1 채널 등이 있다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 포타슘 채널 단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, KCa3.1 채널 단백질 또는 KCa2.3 채널 단백질을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 포타슘 채널은 혈관내피세포의 경우 KCa3.1 또는 KCa2.3 일 수 있으며, 적혈구의 경우 KCa3.1 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "KCa3.1 채널(intermediate conductance calcium-activated potassium channel, subfamily N, member 4)"이란, KCNN4 유전자로부터 발현되고, 세포 내 칼슘에 의해 활성화되는 헤테로테트라머(heterotetramer) 형태의 전압-비의존성 포타슘 채널단백질을 의미한다. 혈관내피세포 KCa3.1 채널은 과분극을 유발시킬 수 있는데, 과분극이 유발되면 세포 내 Ca2 + 유입을 증가시켜 eNOS에 의한 NO 생성을 촉진하여 혈관을 이완시킬 수 있다. 또한, 상기 KCa3.1 채널은 혈관내피세포 증식을 촉진하여 혈관신생을 유발시킬 수 있다. 상기 KCa3.1 채널의 서열정보는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 등과 같은 공지의 데이터 베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 KCa3.1 채널은 NCBI GenBank Acession NO. NM_002250, NM_001163510, NP_002241 또는 NP_001156982일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "KCa2.3 채널"이란, SK3(small conductance calcium-activated potassium channel 3)라고도 하고, KCNN3 유전자로부터 발현되는 포타슘 채널단백질을 의미한다. 상기 혈관내피세포 KCa2.3 채널은 KCa3.1 채널과 마찬가지로 과분극 유발 및 eNOS에 의한 NO 생성 촉진을 통하여 혈관을 이완시키고, 혈관내피세포 증식을 촉진하여 혈관신생을 유발시킬 수 있다. 상기 KCa2.3 채널의 서열정보는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 등과 같은 공지의 데이터 베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 KCa2.3 채널은 NCBI GenBank Acession NO. NM_001204087, NM_080466, NP_001191016 또는 NP_536714일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 포타슘 채널 조절인자인, 클라트린(clathrin), 카베올린1(caveolin1), EEA, Rab5C 등의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 포타슘 채널 조절인자인 클라트린, 카베올린1, EEA, Rab5C 등은, 암 환자의 혈청이 혈관내피세포에 처리된 경우, 상기 혈관내피세포에서 발현수준이 감소되거나 또는 암 환자 유래 적혈구에서 발현수준이 감소되므로, 조절인자의 발현수준을 대조군과 비교하면 암을 진단할 수 있는 바, 상기 포타슘 채널 조절인자의 단백질 또는 mRNA 수준을 측정할 수 있는 제제는 암 진단용 조성물에 추가되어, 암 진단의 정확성을 향상시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "카베올린1(caveolin1)"이란, 대부분의 세포 타입에서 볼 수 있는 카베올레 플라즈마 막(caveolae plasma membrane)의 주요 구성요소로, Ras-ERK 경로에서 인테그린의 결합에 있어 초기 단계 및 세포주기 진행과 관련이 있다. 상기 카베올린1 서열정보는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 등과 같은 공지의 데이터 베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 카베올린1은 NCBI GenBank Acession NO. NM_001172897.1, NM_001243064.1, NM_031556.3 또는 NM_001135818.1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "클라트린(clathrin)"이란, 베지클을 코팅하는 단백질의 하나로서, 3개의 중쇄와 3개의 경쇄로 구성된 3개의 가지를 갖는 트리스켈리온 형태를 나타내는 단백질을 의미한다. 상기 3개의 가지는 상호작용하여 베지클을 감싸는 다면성 격자(polyhedral lattice)를 형성할 수 있다. 상기 클라트린 서열정보는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 등과 같은 공지의 데이터 베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 클라트린은 NCBI GenBank Acession NO. NM_001288653.1, NM_001003908.1, NM_019299.1 또는 XM_001136053.4일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어, “Rab5C”는 GTP 가수분해 효소(GTPase)의 하나로 초기 엔도좀(early endosomes)과 세포막(plasma membrane)간의 융합을 조절하여 멤브레인 트래픽 (membrane traffic)을 조절하는 역할을 하는 단백질을 의미한다. 본 발명의 Rab5C 서열정보는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 등과 같은 공지의 데이터 베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Rab5C는 NCBI GenBank Acession NO.CR541901.1, AB232595.1, NM_001105840.2 또는 NM_001246383.1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어, “EEA1(Early Endosome Antigen 1)”은 초기 엔도좀에 위치하여, 엔도좀 트래픽킹(endosomal trafficking)에서 중요한 역할을 한다. 본 발명의 EEA1 서열정보는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 등과 같은 공지의 데이터 베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 EEA1는 NCBI GenBank Acession NO. NM_003566.3, NM_001001932.3, NM_001108086.1 또는 XM_522610.5일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "단백질 수준을 측정할 수 있는 제제"란, 목적하는 단백질과 특이적으로 결합할 수 있고, 그의 수준을 용이하게 측정할 수 있는 제제를 의미하는데, 상기 제제를 사용할 경우, 목적 단백질의 수준을 용이하고 정확하게 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정할 수 있는 제제는 혈관내피세포 또는 적혈구에서 발현되는 KCa3.1 채널, KCa2.3 채널 또는 이의 조절인자의 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 일 예로서 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩 분석법(protein chip assay) 등의 방법에 사용되는 목적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 KCa3.1 채널, KCa2.3 채널 또는 이의 조절인자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 일 예로서, KCa3.1 채널 또는 KCa2.3 채널단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란, 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는데, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있다. 상기 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 링커의 작용기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 -NH2로 변형시킴으로써 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 앱타머는 KCa3.1 채널, KCa2.3 채널 또는 이의 조절인자에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머가 될 수 있고, 일 예로서, 상기 KCa3.1 채널, KCa2.3 채널 또는 이의 조절인자에 특이적으로 결합할 수 있는 DNA 앱타머가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "mRNA의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RTPCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 프라이머 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 암의 발병이 의심되는 개체의 적혈구 또는 혈청시료가 처리된 혈관내피세포에서 얻어진 mRNA로부터 cDNA를 합성한 후, 상기 cDNA에 포함된 KCa3.1 채널, KCa2.3 채널 또는 이의 조절인자의 유전자를 증폭시켜서 검출하는 수단으로서 상기 프라이머를 사용할 수 있다. 이때, 상기 프라이머는 상기 cDNA에 포함된 KCa3.1 채널, KCa2.3 채널 또는 이의 조절인자의 유전자를 증폭시킬 수 있는 한 그의 폴리뉴클레오티드 서열이 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 다양한 수단으로 표지될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 암의 발병이 의심되는 개체의 적혈구 또는 혈청시료가 처리된 혈관내피세포에서 얻어진 mRNA로부터 cDNA를 합성한 후, 상기 cDNA에 포함된 KCa3.1 채널, KCa2.3 채널 또는 이의 조절인자의 유전자를 검출하기 위한 수단으로 사용할 수 있다. 이때, 상기 프로브는 상기 cDNA에 포함된 KCa3.1 채널, KCa2.3 채널 또는 이의 조절인자의 유전자를 증폭시킬 수 있는 한 그의 폴리뉴클레오티드 서열이 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"란, 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하는데, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 구체적으로 8 내지 60 염기, 보다 구체적으로, 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 과정을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 암의 치료후 재발 가능성에 대한 진단, 암의 전이가능성에 대한 진단, 암 치료후 예후진단 등이 될 수 있다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 암의 발병이 의심되는 개체의 적혈구 또는 혈청이 처리된 혈관내피세포에서 발현되는 KCa3.1 채널 또는 KCa2.3 채널유전자의 단백질 수준 또는 mRNA 수준을 측정하여 암의 발병을 진단하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 유전자로부터 발현되는 단백질 수준 또는 mRNA 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 항체 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다. 이때, 사용될 수 있는 키트로는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트, MRM(Multiple reaction monitoring) 키트 등이 될 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 KCa3.1 채널 또는 KCa2.3 채널유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 일례로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또 다른 일례로서, 본 발명의 키트는 KCa3.1 채널 또는 KCa2.3 채널유전자로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 상기 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 상기 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC(Fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine B-isothiocyanate) 등이 될 수 있으며, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)), OPD(o-phenylenediamine), TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 등이 될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 암의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 사용하여 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 암 진단을 위한 정보의 제공방법은 (a) 암의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 포타슘 채널 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현수준을 정상 대조군 시료에서 측정된 발현수준과 비교하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 의하면, 상기 (a) 단계에서 측정한 발현수준이 정상 대조군 시료에서 측정된 발현수준보다 높은 수준을 나타내는 경우, 상기 생물학적 시료를 수득한 개체에서 암이 발병될 가능성이 높거나 또는 암이 발병된 것으로 판단할 수 있다.
이때, 상기 생물학적 시료는 포타슘 채널 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 혈액시료를 사용할 수 있고, 다른 예로서, 적혈구를 포함하는 시료를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포타슘 채널 단백질, 상기 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 방법 등은 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 용어 "개체"란 암이 발병된 사람을 비롯하여, 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
또한, 상기 방법은 (c) 상기 생물학적 시료에서 클라트린, 카베올린1, EEA 또는 Rab5C의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현수준을 정상 대조군 시료에서 측정된 발현수준과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 이 경우에는 상기 (c) 단계에서 측정한 발현수준이 정상 대조군 시료에서 측정된 발현수준보다 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 생물학적 시료를 수득한 개체에서 암이 발병된 것으로 판단할 수 있다.
아울러, 상기 방법은 (c) 상기 생물학적 시료에서 클라트린, 카베올린1, EEA 또는 Rab5C의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계; (d') 상기 (a) 단계에서 측정한 발현수준의 측정값을 상기 (c) 단계에서 측정한 발현수준의 측정값으로 나누어 상기 각 측정값의 비율을 산출하고, 이를 정상 대조군 시료에서 산출된 측정값의 비율과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우에는 상기 (d') 단계에서 산출된 측정값의 비율이 정상 대조군 시료에서 산출된 측정값의 비율보다 높은 수준을 나타내는 경우, 상기 생물학적 시료를 수득한 개체에서 암이 발병될 가능성이 높거나 또는 암이 발병된 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 간암환자의 적혈구에서는 KCa3.1 채널의 발현수준이 증가되었고(도 2a), 간경변환자의 적혈구에서는 KCa3.1 채널의 발현수준이 증가되었으며(도 2b), 간암환자 및 간경변환자의 적혈구에서 측정된 포타슘 채널 조절인자인 클라트린의 발현수준을 비교한 결과, 클라트린의 발현수준이 모두 감소되었고(도 2c), 췌장암 환자의 적혈구에서는 KCa3.1 채널의 발현수준은 증가되는 반면, 클라트린의 발현수준은 감소되었으며(도 3), 간암환자, 간경변환자 또는 췌장암환자의 적혈구에서 측정된 KCa3.1 채널의 발현수준과 조절인자(클라트린 또는 카베올린1)의 발현수준의 비율은 모두 대조군에서 측정된 비율(약 1) 보다 현저히 높은 수준을 나타냄을 확인하였다(도 5a 및 5b).
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 암의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 시료가 처리된 혈관내피세포를 사용하여 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 암 진단을 위한 정보의 제공방법은 (a) 암의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 시료를 혈관내피세포에 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 처리된 혈관내피세포에서 포타슘 채널 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현수준을 정상 대조군 시료에서 측정된 발현수준과 비교하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 의하면, 상기 (b) 단계에서 측정한 발현수준이 정상 대조군 시료에서 측정된 발현수준보다 높은 수준을 나타내는 경우, 상기 생물학적 시료를 수득한 개체에서 암이 발병될 가능성이 높거나 또는 암이 발병된 것으로 판단할 수 있다.
이때, 상기 생물학적 시료는 포타슘 채널 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로, 혈액시료를 사용할 수 있고, 더욱 구체적으로, 혈액, 혈청, 혈장 등을 포함하는 시료를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포타슘 채널 단백질, 상기 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 방법, 개체 등은 상술한 바와 동일하다.
또한, 상기 방법은 (d) 상기 (a) 단계에서 처리된 혈관내피세포에서 클라트린, 카베올린1, EEA 또는 Rab5C의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현수준을 정상 대조군 시료에서 측정된 발현수준과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 이 경우에는 상기 (d) 단계에서 측정한 발현수준이 정상 대조군 시료에서 측정된 발현수준보다 낮은 수준을 나타내는 경우, 상기 시료를 수득한 개체에서 암이 발병된 것으로 판단할 수 있다.
아울러, 상기 방법은 (d) 상기 (a) 단계에서 처리된 혈관내피세포에서 클라트린, 카베올린1, EEA 또는 Rab5C의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (e') 상기 (b) 단계에서 측정한 발현수준의 측정값을 상기 (d) 단계에서 측정한 발현수준의 측정값으로 나누어 상기 각 측정값의 비율을 산출하고, 이를 정상 대조군 시료에서 산출된 측정값의 비율과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우에는 상기 (e') 단계에서 산출된 측정값의 비율이 정상 대조군 시료에서 산출된 측정값의 비율보다 높은 수준을 나타내는 경우, 상기 시료를 수득한 개체에서 암이 발병될 가능성이 높거나 또는 암이 발병된 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 간암 환자의 혈청이 처리된 혈관내피세포에서는 KCa3.1 채널 및 KCa2.3 채널의 발현수준이 증가되었고(도 1), 카베올린-1과 EEA의 발현수준이 감소됨을 확인하였다(도 4).
한편, 간암 환자의 적혈구에서는 정상인의 적혈구 보다도 높은 수준으로 KCa3.1 채널의 발현수준이 증가되었으며(도 2a), 간암 환자와 간경변 환자의 적혈구에서는 클라트린의 발현수준이 감소됨을 확인하였고(도 2b), 췌장암 환자의 적혈구에서도 정상인의 적혈구 보다도 높은 수준으로 KCa3.1 채널의 발현수준이 증가되었다(도 3).
뿐만 아니라, 간암모델 마우스의 간조직에서도 KCa3.1 채널 및 KCa2.3 채널의 발현수준이 증가됨을 확인하였다(도 6).
따라서, 암의 발병여부가 의심되는 환자의 혈액시료가 처리된 혈관내피세포 또는 환자의 적혈구에서 측정된 포타슘 채널 또는 이의 조절인자의 단백질의 발현수준 또는 상기 각 발현수준의 비율을 이용하면, 상기 환자에서 암의 발병의 여부를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 암이 발병되기 전에 암의 발병 가능성을 조기진단할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에서 제공하는 암 진단용 조성물 또는 키트를 사용하면, 개체의 시료가 처리된 혈관내피세포 또는 개체에서 분리된 적혈구로부터 포타슘 채널인 KCa3.1 채널, KCa2.3 채널 또는 이의 조절인자의 발현수준을 측정하여, 암의 종류에 상관없이 그의 발병여부를 진단할 수 있으므로, 다양한 암의 진행수준(성장, 전이, 예후 및 재발)의 판단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 간암환자의 혈액시료(혈청)를 혈관내피세포에 처리하고, 상기 혈관내피세포에서 측정된 포타슘 채널인 KCa3.1 채널 및 KCa2.3 채널의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 상기 포타슘 채널의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 간암환자의 적혈구에서 측정된 포타슘 채널인 KCa3.1 채널의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 상기 포타슘 채널의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 간경변환자의 적혈구에서 측정된 포타슘 채널인 KCa3.1 채널의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 상기 포타슘 채널의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2c는 간암환자 및 간경변환자의 적혈구에서 측정된 포타슘 채널 조절인자인 클라트린의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 상기 클라트린의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 췌장암환자의 적혈구에서 측정된 KCa3.1 채널 및 이의 조절인자인 클라트린의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 상기 KCa3.1 채널 및 클라트린의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 간암환자의 혈액시료(혈청)를 희석하여 혈관내피세포에 처리하고, 상기 혈관내피세포에서 측정된 포타슘 채널인 KCa3.1 채널 및 KCa2.3 채널, 카베올린1, EEA1의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 5a는 간암환자 및 간경변환자의 적혈구에서 측정된 KCa3.1 채널 및 클라트린의 발현수준 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 췌장암환자의 적혈구에서 측정된 KCa3.1 채널 및 클라트린의 발현수준 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 세라마이드 합성효소 2(ceramide synthase 2)를 코딩하는 유전자가 결실되어, 간암이 유발되는 간암모델 마우스(CerS2)의 간조직세포에서 발현되는 KCa3.1 채널 또는 KCa2.3 채널의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 KCa3.1 채널의 발현수준을 정량분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 간암환자의 혈액시료가 혈관내피세포의 포타슘 채널에 미치는 효과
간암환자의 혈액시료의 처리에 의하여, 혈관내피세포에서 KCa3.1 채널 및 KCa2.3 채널의 발현수준이 변화되는지의 여부를 확인하고자 하였다.
즉, 간암환자로부터 수득한 혈액으로부터 혈청시료를 수득하고, 상기 혈청시료를 인간 혈관내피세포주에 처리한 다음, 24시간 동안 배양하고, 배양이 종료된 후, 상기 혈관내피세포에서 발현된 포타슘 채널인 KCa3.1 채널 및 KCa2.3 채널의 발현수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 측정한 후, 비교하였다(도 1). 이때, 대조군으로는 정상인의 혈청시료를 처리한 혈관내피세포주를 사용하였고, KCa3.1 채널 단백질의 발현수준은 RQVRLKHRKLREQV(서열번호 1)의 아미노산 서열을 가지는 항체를 이용하여 측정하였으며, KCa2.3 채널 단백질의 발현수준은 KCa2.3 채널 단백질에 특이적으로 결합하고, LHSSPTAFRAPPSSNSTAILHPSSRQGSQLNLNDHLLGHSPSSTA(서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 이용하여 측정하였고, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 1에서 보듯이, 정상인의 혈청시료를 처리한 혈관내피세포와는 달리, 간암환자의 혈청시료를 처리한 혈관내피세포에서는 KCa3.1 채널 및 KCa2.3 채널의 발현수준이 증가됨을 확인하였다.
실시예 2: 간암 및 간경변 환자의 적혈구에서 발현되는 포타슘 채널 및 그의 조절인자의 발현수준 분석
상기 실시예 1의 결과로부터, 간암환자의 혈청시료를 처리한 혈관내피세포에서는 KCa3.1 채널 및 KCa2.3 채널의 발현수준이 증가됨을 확인하였으므로, 상기 간암환자의 적혈구를 대상으로, 포타슘 채널 및 그의 조절인자의 발현수준을 분석하였다.
실시예 2-1: 간암 및 간경변 환자의 적혈구에서 발현되는 포타슘 채널의 발현수준 분석
간암환자의 적혈구에서 KCa3.1 채널 단백질의 발현수준이 증가되었는지를 웨스턴블럿 분석을 통해 확인하였다(도 2a). 이때. 대조군으로는 정상인의 적혈구를 사용하였고, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 2a에서 보듯이, 간암환자의 적혈구에는 정상인의 적혈구 보다도 높은 수준으로 KCa3.1 채널이 발현됨을 확인하였다.
또한, 간암환자가 아닌 간경변 환자의 적혈구에서도 상기 KCa3.1 채널 단백질의 발현수준이 증가되었는지를 웨스턴블럿 분석을 통해 확인하였다(도 2b). 이때. 대조군으로는 정상인의 적혈구를 사용하였고, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 2b에서 보듯이, 간경변 환자의 적혈구에서도 정상인의 적혈구 보다도 높은 수준으로 KCa3.1 채널이 발현됨을 확인하였다.
실시예 2-2: 간암 및 간경변 환자의 적혈구에서 발현되는 포타슘 채널 조절인자의 발현수준 분석
상기 실시예 2-1에서 사용된 간암환자 및 간경변 환자의 혈액시료로부터 수득한 적혈구에서 KCa3.1 채널 및 KCa2.3 채널의 조절인자로 알려진 클라트린의 발현수준을 PQLMLTAGPSVAVPPQAPFGYGYTAPPYGQPQPGFGYS (서열번호 3)의 아미노산 서열을 가지는 항체를 이용하여 웨스턴블럿 분석을 통해 측정하고, 비교하였다(도 2c). 이때, 대조군으로는 정상인의 적혈구를 사용하였고, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 2c에서 보듯이, KCa3.1 채널의 발현수준이 증가된 간암환자 및 간경변환자의 적혈구에서는 포타슘 채널 조절인자인 클라트린의 발현수준이 감소됨을 확인하였다.
실시예 3: 췌장암환자의 적혈구에서 발현되는 포타슘 채널 및 그의 조절인자의 발현수준 분석
상기 실시예 2의 결과로부터, 간암환자의 적혈구에서 KCa3.1 채널 단백질의 발현수준이 증가하고, 이의 조절인자인 클라트린의 발현수준이 감소됨을 확인하였으므로, 다른 암종인 췌장암환자에서도 동일한 결과를 얻을 수 있는지 확인하고자 하였다.
이에, 췌장암환자로부터 수득한 혈액으로부터 적혈구를 수득하고, 상기 적혈구에서 발현되는 KCa3.1 채널 및 클라트린의 발현수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 측정하고, 비교하였다(도 3). 이때, 대조군으로는 정상인의 적혈구를 사용하였고, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 3에서 보듯이, 췌장암환자의 적혈구에서도, 간암환자의 적혈구와 동일하게 KCa3.1 채널의 발현수준이 증가하고, 동시에 클라트린의 발현수준이 감소됨을 확인하였다.
실시예 4: 간암 환자 혈액시료의 희석 정도가 혈관내피세포의 포타슘 채널에 미치는 효과
간암환자로부터 수득한 혈액으로부터 혈청시료를 수득하고, 상기 혈청시료를 배양액으로 희석하여 혈관내피세포주에 처리한 다음, 배양하고, 배양이 종료된 후, 상기 혈관내피세포에서 발현된 포타슘 채널인 KCa3.1, KCa2.3 채널 및 상기 포타슘 채널들의 조절인자로 알려진 카베올린1과 EEA1의 발현수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 측정한 후 비교하였다. 카베올린1과 EEA1의 발현수준은 각각 MADELSEKQVYDAHTKEID (서열번호 4)과 FCAECSAKNALTPSSKKPVR (서열번호 5)의 아미노산 서열을 가지는 항체를 이용하여 웨스턴블럿 분석을 통해 측정하였으며, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 4에서 보듯이, 간암환자의 혈청을 처리한 혈관내피세포에서도, KCa3.1 채널 및 KCa2.3 채널의 발현수준이 증가하고, 동시에, 카베올린-1과 EEA1의 발현수준이 감소됨을 확인하였다.
실시예 5: 혈액시료가 처리된 혈관내피세포에서 포타슘 채널과 포타슘 채널 조절인자의 발현수준 비율의 분석
상기 실시예 1 내지 4에서 사용된 간암환자, 간경변환자 및 췌장암환자의 혈액시료(적혈구 또는 혈청시료)를 혈관내피세포주에 처리하고, 배양한 다음, 상기 혈관내피세포에서 발현된 포타슘 채널인 KCa3.1 채널 및 상기 포타슘 채널의 조절인자인 클라트린의 발현수준을 측정하고, 측정된 값을 하기 식에 적용하여, 채널 단백질의 발현수준 측정값과 조절인자의 발현수준 측정값의 비율을 산출하였으며, 산출된 비율을 정상 대조군에서 산출된 측정값의 비율과 비교하였다(도 5a 및 5b). 이때, 정상 대조군은 정상인의 혈액시료가 처리된 혈관내피세포주를 사용하였다.
측정값 비율 = KCa3.1 채널 발현수준 측정값 / 포타슘 채널 조절인자 발현수준 측정값
도 5a 및 5b에서 보듯이, 정상 대조군에서 산출된 측정값의 비율은 약 1.0을 나타낸 반면, 각 혈액시료(적혈구 또는 혈청시료)가 처리된 혈관내피세포주에서 산출된 측정값의 비율은 2.0 이상을 나타냄을 확인하였다.
이처럼, 포타슘 채널 또는 포타슘 채널 조절인자의 발현수준을 단독으로 측정하여 비교하는 경우에는 암환자와 정상인에서 측정된 값이 유사할 경우, 진단결과에 오류가 발생할 수 있음에 반하여, 포타슘 채널 및 포타슘 채널 조절인자의 발현수준을 함께 측정하고, 이의 비율을 산출한 경우에는 측정값이 유사한 경우에도, 암환자와 정상인에서 산출된 각 측정값의 비율이 명확히 구별되므로, 진단결과에 오류가 발생할 가능성을 현저히 감소시킬 수 있다.
따라서, 상기 포타슘 채널 및 포타슘 채널 조절인자의 발현수준의 비율은 암의 진단 및 예후 예측에 유용하에 활용될 수 있을 것으로 분석되었다.
실시예 6: 간암모델 마우스의 간세포에서 포타슘 채널의 발현수준 분석
상기 실시예에서 보듯이, 간암환자 또는 췌장암 환자의 적혈구에서 KCa3.1 채널 또는 KCa2.3 채널의 발현수준이 증가됨을 확인하였으므로, 간암모델 마우스의 간조직에서 상기 포타슘 채널의 발현수준을 측정하였다.
구체적으로, 세라마이드 합성효소 2(ceramide synthase 2)를 코딩하는 유전자가 결실되어, 간암이 유발되는 간암모델 마우스(CerS2)로부터 간조직을 수득하고, 상기 수득한 간조직에서 발현되는 KCa3.1 채널 또는 KCa2.3 채널의 발현수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 측정하고, 정량분석하였다(도 6). 이때, 대조군으로는 정상 마우스의 간조직을 사용하였고, 내부대조군으로는 알파-튜불린을 사용하였다.
도 6에서 보듯이, 간암모델 마우스의 간조직에서는 KCa3.1 채널 및 KCa2.3 채널의 발현수준이 증가됨을 확인하였다.
상기 실시예의 결과를 종합하면, 암환자의 혈액시료가 처리된 혈관내피세포 또는 암환자의 적혈구에서 포타슘 채널 단백질의 발현수준, 상기 채널 단백질 조절인자의 발현수준 또는 상기 각 발현수준의 비율을 사용하여 암환자와 정상인을 구별할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 간암이 발병되지는 않았으나, 간암이 발생될 가능성이 높은 간경변 환자에서도 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 암의 발병여부가 의심되는 환자의 혈액시료가 처리된 혈관내피세포 또는 환자의 적혈구에서 측정된 포타슘 채널 또는 이의 조절인자의 단백질의 발현수준 또는 상기 각 발현수준의 비율을 이용하면, 상기 환자에서 암의 발병의 여부를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 암이 발병되기 전에 암의 발병 가능성을 조기진단할 수 있음을 알 수 있었다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.
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Claims (18)

  1. 포타슘 채널 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 포타슘 채널 단백질은 Kca2.3 채널 단백질, KCa3.1 채널 단백질 또는 이들의 조합인 것인, 암 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머인 것인, 암 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 mRNA의 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인, 암 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 암 진단용 조성물은 클라트린, 카베올린1, EEA 및 Rab5C로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 추가로 포함하는 것인, 암 진단용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 암은 간암, 폐암, 위암, 췌장암, 신장암, 자궁암, 자궁경부암, 뇌암, 구강암, 대장암, 담도암, 골암, 피부암 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 암인 것인, 암 진단용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 진단은 암의 치료후 재발 가능성에 대한 진단, 암의 전이가능성에 대한 진단 또는 암 치료후 예후진단인 것인, 암 진단용 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 암 진단용 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것인 암 진단용 키트.
  10. (a) 암의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 포타슘 채널 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현수준을 정상 대조군 시료에서 측정된 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보의 제공방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 포타슘 채널은 KCa3.1 채널, KCa2.3 채널 또는 그의 조합인 것인, 암 진단을 위한 정보의 제공방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 방법은 (c) 상기 생물학적 시료에서 클라트린, 카베올린1, EEA 및 Rab5C로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에서 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현수준을 정상 대조군 시료에서 측정된 발현수준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 암 진단을 위한 정보의 제공방법.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 방법은 (c) 상기 생물학적 시료에서 클라트린, 카베올린1, EEA 및 Rab5C로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계;
    (d') 상기 (a) 단계에서 측정한 발현수준의 측정값을 상기 (c) 단계에서 측정한 발현수준의 측정값으로 나누어 상기 각 측정값의 비율을 산출하고, 이를 정상 대조군 시료에서 산출된 측정값의 비율과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 암 진단을 위한 정보의 제공방법.
  14. 제10항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 적혈구를 포함하는 시료인 것인, 암 진단을 위한 정보의 제공방법.
  15. (a) 암의 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 시료를 혈관내피세포에 처리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 처리된 혈관내피세포에서 포타슘 채널 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현수준을 정상 대조군 시료에서 측정된 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보의 제공방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 포타슘 채널은 KCa3.1 채널, KCa2.3 채널 또는 그의 조합인 것인, 암 진단을 위한 정보의 제공방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 방법은 (d) 상기 (a) 단계에서 처리된 혈관내피세포에서 클라트린, 카베올린1, EEA 및 Rab5C로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 측정된 단백질 또는 mRNA의 발현수준을 정상 대조군 시료에서 측정된 발현수준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 암 진단을 위한 정보의 제공방법.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 방법은 (d) 상기 (a) 단계에서 처리된 혈관내피세포에서 클라트린, 카베올린1, EEA 및 Rab5C로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된 mRNA의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    (e') 상기 (b) 단계에서 측정한 발현수준의 측정값을 상기 (d) 단계에서 측정한 발현수준의 측정값으로 나누어 상기 각 측정값의 비율을 산출하고, 이를 정상 대조군 시료에서 산출된 측정값의 비율과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 암 진단을 위한 정보의 제공방법.
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