JP2019522491A - カリウムチャネル蛋白質を用いた癌診断用組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、カリウムチャネル蛋白質を用いた癌診断用組成物、前記組成物を含む癌診断用キット、及び癌診断のための情報提供方法に関する。本発明で提供する癌診断用組成物またはキットを用いると、個体の試料が処理された血管内皮細胞または個体から分離された赤血球において、カリウムチャネルであるＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその調節因子の発現レベルを測定して、癌の種類にかかわらず、その発病有無を診断することができるので、多様な癌の進行水準（成長、転移、予後、及び再発）の判断に広く活用されるであろう。

Description

本発明は、カリウムチャネル蛋白質を用いた癌診断用組成物、その組成物を含む癌診断用キット、及び癌診断のための情報提供方法に関する。
腫瘍（ｔｕｍｏｒ）は、良性腫瘍（ｂｅｎｉｇｎ ｔｕｍｏｒ）と悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ）に分けられるが、良性腫瘍は、成長速度が遅く、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）されない。これに対して、よく癌と呼ばれる悪性腫瘍は、周囲組織を浸潤しながら速く成長し、他の部位に転移され、ヒトの命を脅かすようになる。韓国の統計によれば、２０１３年、癌による死亡者は、全体死亡者の２８．３％と最もありふれた死亡原因であり、癌患者数も、毎年２０万名以上の新たな患者が発生するなど、増えている。癌にかかる確率は、韓国人の平均寿命に近い８１歳まで生存する場合、３６．２％に達するほど極めて高い。このようにヒトの健康に最も大きな影響を及ぼす疾患である癌は、内視鏡やＣＴのような診断放射線医学的な方法を用いて癌塊を発見し、組織学的な方法で確認して診断するようになる。このような伝統的な方法は、癌塊が発見可能なサイズとなって、すなわち、癌がある程度進行してようやく発見可能である。ところが、癌は、発生初期に発見して治療を始めることが、癌を適切に治療するのに極めて重要である。このため、癌の発生または再発を早期に発見するための方法が多く研究されている。
癌の早期発見のための方法として、腫瘍マーカーのような特定癌マーカーを用いる方法が多く研究されているが、これらの腫瘍マーカーとしては、大腸癌の癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＥＡ）、肝癌のα−フェトプロテイン（α−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＦＰ）等がある。また、特許文献１には、肝癌患者の体液からのアネキシン２の過剰発現現象を用いて簡単な分析によって、肝癌診断の正確性を高めた肝癌マーカー、及び前記マーカーを用いて肝癌を診断する方法が開示されており、特許文献２には、サイクロフィリンＡをコードする遺伝子を肝癌診断用マーカーとして用いて、肝癌を診断する方法が開示されており、特許文献３には、ＴＧＦβＲＩＩＩ遺伝子のエクソン部位に存在する多形性に基づく肝癌診断用の多形性マーカー及び前記マーカーを用いて、肝癌を診断する方法が開示されている。このような腫瘍マーカーを用いた癌診断方法は、癌の早期診断のための補助的診断方法として既に用いられるか、または開発中にある。
本研究者は、ＫＣａ２．３とＫＣａ３．１蛋白質の発現レベルが、肝癌、肺癌、膵癌等において大いに増加することを見い出した。このようなＫＣａ２．３とＫＣａ３．１蛋白質の発現レベルの増加は、癌細胞が癌組織成長のために分泌するＶＥＧＦのような血管増殖因子により起こるが、正常血管内皮細胞を患者血清に２４時間以内に露出させても発生し、このようなＫ＋チャネル蛋白質の発現増加は、極めて短時間内に起こることが分かった。また、このＫ＋チャネル蛋白質の発現を調節する因子（クラスリン等）の発現も、極めて速く調節されることが分かった。この結果からみて、ＫＣａ２．３とＫＣａ３．１蛋白質、また、このＫ＋チャネル蛋白質の発現調節因子の発現レベルは、血管増殖因子のレベルをよく反映するものと思われる。また、患者赤血球でもＫＣａ３．１蛋白質の発現が増加した。血管内皮細胞と赤血球は、同一の血清に露出するので、血管内皮細胞のＫＣａ３．１の発現レベルは、赤血球における発現レベルに代替可能であるものと思われる。
このような背景下で、本発明者は、血管新生関連因子の発現レベルの測定によって、効果的に癌を診断する方法を開発するために、鋭意研究して努力した結果、ＫＣａ２．３蛋白質、ＫＣａ３．１蛋白質、またはこれらのチャネルの発現を調節する因子の発現レベルを血管内皮細胞または赤血球において測定することにより、癌の発病有無を効果的に早期診断できることを確認し、本発明を完成した。
韓国公開特許第１０−２００９−００２９８６８号公報 韓国登録特許第１０−１０５８７８３号公報 韓国登録特許第１０−１０７１２１９号公報
本発明の一つの目的は、癌診断用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記組成物を含む癌診断用キットを提供することである。
本発明のまた他の目的は、癌診断のための情報の提供方法を提供することである。
上述した目的を達成するために、本発明は、一態様として、カリウムチャネル蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定可能な製剤を含む癌診断用組成物を提供する。このとき、前記カリウムチャネル蛋白質は、ＫＣａ２．３チャネル、ＫＣａ３．１チャネル、またはこれらの組合せであってもよい。
癌患者の血清が処理された正常血管内皮細胞または癌患者の赤血球におけるカリウムチャネル（ＫＣａ２．３チャネル、ＫＣａ３．１チャネル）の発現レベルは増加するので、前記チャネルを測定可能な製剤を含む本発明の組成物を用いて、前記血管内皮細胞または赤血球におけるカリウムチャネル（ＫＣａ２．３チャネル、ＫＣａ３．１チャネル）の発現レベルを測定して、癌診断に以下のように活用することができる。すなわち、ＫＣａ２．３チャネルまたはＫＣａ３．１チャネルの発現程度が、癌転移と予後に影響を及ぼすと知られており、これらのチャネルの発現程度によって予後と転移可能性を判断することができ、癌治療後に減少したこれらのチャネルの発現が再度増加する場合、再発した癌細胞から分泌されたＶＥＧＦにより発現が増加した可能性があるので、癌再発診断に活用することができる。
それだけでなく、肝炎から肝硬変症、肝硬変症から肝癌への進行過程でも発現が増加するので、本発明に係る診断用組成物は、癌の進行（成長、転移、予後、及び再発）等の判断に極めて有用に用いられる。
このような個体の血液試料が処理された血管内皮細胞または個体の赤血球において、カリウムチャネル（ＫＣａ２．３チャネルまたはＫＣａ３．１チャネル）またはその調節因子の発現レベルを測定して癌を診断する技術は、今まで全く知られておらず、本発明者によって最初に開発された。
本発明で提供する癌を診断する技術は、癌治療後の再発可能性に対する早期診断に有用であるものと予想される。癌治療後の再発可能性に対する早期診断方法も多く研究されているが、癌患者において再発が多く、癌細胞の拡散前に治療を始め、完治可能性を高めることができるからである。最近、英国の癌研究所は、乳癌において、血中の残留癌細胞が他の組織に浸透しないうちに放出するＤＮＡを検出する方法で再発可能性を診断する方法を開発しており、この方法では、ＣＴ、ＭＲＩ等の伝統的な方法により、再発した癌塊を発見する数ヶ月前に再発可能性の診断が可能であるものと推定される。癌の再発前、すなわち、癌塊が大きくなる前に、血管新生因子の分泌と、これによるＫＣａ２．３、ＫＣａ３．１の発現増加が先行すべきであるので、癌再発の診断に有用であるものと思われる。また、癌の転移可能性と予後診断等の判断にも極めて有用であるものと予想される。一部の癌では、ＫＣａ３．１の発現増加が癌転移可能性を高め、生存可能性を低めるという報告があり、肝癌でもＫＣａ２．３とＫＣａ３．１の発現を増加させるＶＥＧＦ受容体が増加すると、予後が悪いという報告もあり、ＫＣａ２．３とＫＣａ３．１の発現程度は、癌転移可能性及び予後判定に大いに役立つであろう。
前記組成物により診断される癌は、癌の発病により血管内皮細胞または赤血球におけるＫＣａ３．１チャネルまたはＫＣａ２．３チャネルの蛋白質またはｍＲＮＡのレベルが増加する限り、特にこれに制限されないが、具体的に、肝癌、肺癌、胃癌、膵癌、腎癌、子宮癌、子宮頸癌、脳癌、口腔癌、大腸癌、胆道癌、骨癌、皮膚癌等の癌腫が単独または複合的に発病したものであってもよい。
本発明で使用された用語「カリウムチャネル蛋白質（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、細胞膜に存在しながら、細胞の内外にイオンを通過させる膜蛋白質の一種であるイオンチャネル蛋白質（ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）のうち、Ｋ＋イオンを通過させるチャネル蛋白質を意味する。大体、イオンチャネル蛋白質は、通過させるイオンの種類に応じてＮａ＋チャネル、Ｃａ２＋チャネル、Ｋ＋チャネル等に分類されるが、そのうち、カリウムチャネル蛋白質は、細胞膜によってイオンの流れを調節して、膜電圧を決定し、これにより、細胞内Ｃａ２＋濃度と興奮性を調節するなど、細胞の機能に大きな影響を及ぼす。細胞内Ｃａ２＋濃度により活性化するＫ＋チャネルは、数種があるが、血管内皮細胞にはＫＣａ１．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、ＫＣａ３．１チャネル等があると知られている。
本発明において、前記カリウムチャネル蛋白質は、特にこれに制限されないが、ＫＣａ３．１チャネルまたはＫＣａ２．３チャネル蛋白質を単独でまたは組み合わせて用いることができる。具体的に、前記カリウムチャネルは、血管内皮細胞の場合、ＫＣａ３．１またはＫＣａ２．３であってもよく、赤血球の場合、ＫＣａ３．１であってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明で使用された用語「ＫＣａ３．１チャネル（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ，ｓｕｂｆａｍｉｌｙ Ｎ，ｍｅｍｂｅｒ ４）」とは、ＫＣＮＮ４遺伝子から発現され、細胞内カルシウムにより活性化するヘテロ四量体（ｈｅｔｅｒｏｔｅｔｒａｍｅｒ）形態の電圧非依存性カリウムチャネル蛋白質を意味する。血管内皮細胞ＫＣａ３．１チャネルは、過分極を引き起こすことができるが、過分極が引き起こされれば、細胞内へのＣａ２＋流入を増加させ、ｅＮＯＳによるＮＯ生成を促進して血管を弛緩させることができる。また、前記ＫＣａ３．１チャネルは、血管内皮細胞の増殖を促進して血管新生を引き起こすことができる。前記ＫＣａ３．１チャネルの配列情報は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）のような公知のデータベースから得られる。例えば、本発明のＫＣａ３．１チャネルは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ．ＮＭ＿００２２５０、ＮＭ＿００１１６３５１０、ＮＰ＿００２２４１またはＮＰ＿００１１５６９８２であってもよいが、これに制限されない。
本発明で使用された用語「ＫＣａ２．３チャネル」とは、ＳＫ３（ｓｍａｌｌ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ３）ともいい、ＫＣＮＮ３遺伝子から発現されるカリウムチャネル蛋白質を意味する。前記血管内皮細胞ＫＣａ２．３チャネルは、ＫＣａ３．１チャネルと同様に、過分極誘発及びｅＮＯＳによるＮＯ生成促進によって血管を弛緩させ、血管内皮細胞の増殖を促進して血管新生を引き起こすことができる。前記ＫＣａ２．３チャネルの配列情報は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）のような公知のデータベースから得られる。例えば、本発明のＫＣａ２．３チャネルは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ．ＮＭ＿００１２０４０８７、ＮＭ＿０８０４６６、ＮＰ＿００１１９１０１６またはＮＰ＿５３６７１４であってもよいが、これに限定されない。
また、本発明に係る組成物は、カリウムチャネル調節因子であるクラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、Ｒａｂ５Ｃ等の蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定可能な製剤をさらに含んでもよい。
前記カリウムチャネル調節因子であるクラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、Ｒａｂ５Ｃ等は、癌患者の血清が血管内皮細胞に処理された場合、前記血管内皮細胞において発現レベルが減少し、または癌患者由来赤血球において発現レベルが減少するので、調節因子の発現レベルを対照群と比較すると癌を診断することができることから、前記カリウムチャネル調節因子の蛋白質またはｍＲＮＡのレベルを測定可能な製剤は、癌診断用組成物に加えられて、癌診断の正確性を向上させるのに用いられ得る。
本発明で使用された用語「カベオリン１」とは、殆どの細胞タイプから見られるカベオラ細胞膜（ｃａｖｅｏｌａｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の主要構成要素であって、Ｒａｓ−ＥＲＫ経路におけるインテグリンの結合において、初期段階及び細胞周期進行と関連がある。前記カベオリン１の配列情報は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）のような公知のデータベースから得られる。例えば、本発明のカベオリン１は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ．ＮＭ＿００１１７２８９７．１、ＮＭ＿００１２４３０６４．１、ＮＭ＿０３１５５６．３またはＮＭ＿００１１３５８１８．１であってもよいが、これに制限されない。
本発明で使用された用語「クラスリン」とは、ベシクルをコートする蛋白質の一つであって、３つの重鎖と３つの軽鎖で構成された３つの分枝を有するトリスケリオン形態を示す蛋白質を意味する。前記３つの分枝は、相互作用してベシクルを取り囲む多面体格子（ｐｏｌｙｈｅｄｒａｌ ｌａｔｔｉｃｅ）を形成してもよい。前記クラスリンの配列情報は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）のような公知のデータベースから得られる。例えば、本発明のクラスリンは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ．ＮＭ＿００１２８８６５３．１、ＮＭ＿００１００３９０８．１、ＮＭ＿０１９２９９．１またはＸＭ＿００１１３６０５３．４であってもよいが、これに制限されない。
本発明で使用された用語「Ｒａｂ５Ｃ」は、ＧＴＰ加水分解酵素（ＧＴＰａｓｅ）の一つであって、初期エンドソーム（ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ）と細胞膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）との間の融合を調節して、膜輸送（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｆｆｉｃ）を調節する役割をする蛋白質を意味する。本発明のＲａｂ５Ｃの配列情報は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）のような公知のデータベースから得られる。例えば、本発明のＲａｂ５Ｃは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ．ＣＲ５４１９０１．１、ＡＢ２３２５９５．１、ＮＭ＿００１１０５８４０．２またはＮＭ＿００１２４６３８３．１であってもよいが、これに制限されない。
本発明で使用された用語「ＥＥＡ１（Ｅａｒｌｙ Ｅｎｄｏｓｏｍｅ Ａｎｔｉｇｅｎ １）」は、初期エンドソームに位置し、エンドソーム輸送（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）において重要な役割をする。本発明のＥＥＡ１の配列情報は、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）のような公知のデータベースから得られる。例えば、本発明のＥＥＡ１は、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ．ＮＭ＿００３５６６．３、ＮＭ＿００１００１９３２．３、ＮＭ＿００１１０８０８６．１またはＸＭ＿５２２６１０．５であってもよいが、これに制限されない。
本発明で使用された用語「蛋白質レベルを測定可能な製剤」とは、目的とする蛋白質と特異的に結合し、そのレベルを容易に測定可能な製剤を意味するが、前記製剤を用いる場合、目的蛋白質のレベルを容易かつ正確に測定することができる。
本発明において、前記蛋白質レベルを測定可能な製剤は、血管内皮細胞または赤血球で発現されるＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその調節因子の蛋白質のレベルを測定する方法に用いられる製剤を意味するものと解釈されるが、一例として、ウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射性免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、同位元素標識免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降アッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、補体結合アッセイ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ及び蛋白質チップアッセイ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ ａｓｓａｙ）等の方法に用いられる目的蛋白質に特異的に結合可能な抗体またはアプタマーとなってもよい。
本発明で使用された用語「抗体」とは、蛋白質またはペプチド分子の抗原性部位に特異的に結合可能な蛋白質性分子を意味するが、このような抗体は、各遺伝子を通常の方法により発現ベクターにクローニングして、前記マーカー遺伝子によりコードされる蛋白質を得ており、得られた蛋白質から通常の方法により製造される。前記抗体の形態は、特に制限されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗原結合性を有するものであれば、その一部も、本発明の抗体に含まれ、全ての免疫グロブリン抗体が含まれるのみならず、ヒト化抗体等の特殊抗体を含んでもよい。併せて、前記抗体は、二つの全長の軽鎖及び二つの全長の重鎖を有する完全な形態のみならず、抗体分子の機能的な単片を含む。抗体分子の機能的な単片とは、少なくとも抗原結合機能を有している単片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）、Ｆ（ａｂ'）２及びＦｖ等がある。
本発明において、前記抗体は、ＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその調節因子に特異的に結合可能な抗体となり、一例として、ＫＣａ３．１チャネルまたはＫＣａ２．３チャネル蛋白質に特異的に結合可能なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはその一部であってもよい。
本発明で使用された用語「アプタマー」とは、試料中の検出しようとする標的物質と特異的に結合可能な物質であって、それ自体で安定した三次構造を有する一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または変形核酸）を意味するが、前記結合によって特異的に試料中の標的物質の存在を確認することができる。前記アプタマーの製造は、一般のアプタマーの製造方法により、確認しようとする標的蛋白質に対して選択的で高い結合力を有するオリゴヌクレオチドの配列を決定して合成してから、オリゴヌクレオチドの５'末端や３'末端をリンカーの作用基に結合するように、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＨまたは−ＮＨ２に変形させることにより行われる。
本発明において、前記アプタマーは、ＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその調節因子に特異的に結合可能なアプタマーであり、一例として、ＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその調節因子に特異的に結合可能なＤＮＡアプタマーであってもよい。
本発明で使用された用語「ｍＲＮＡのレベルを測定する製剤」とは、試料に含まれた標的遺伝子の発現有無を確認するために、前記標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベルを測定する方法に用いられる製剤を意味し、特にこれに制限されないが、一例として、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、競合的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＤＮＡチップ分析等の方法に用いられる標的遺伝子に特異的に結合可能なプローブ、プライマー、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがある。
本発明で使用された用語「プライマー」とは、短い自由３末端水酸化基（ｆｒｅｅ ３'ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）を有する核酸配列であって、相補的な鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成でき、鋳型鎖コピーのための開始地点として機能をする短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度で重合反応（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）のための試薬及び異なる４種のヌクレオシドトリホスフェートの存在の下でＤＮＡ合成が開始できる。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）条件、センス及びアンチセンスプライマーの長さは、当業界に公知のものに基づいて変形してもよい。
本発明において、前記プライマーは、癌の発病が疑われる個体の赤血球または血清試料が処理された血管内皮細胞から得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成してから、前記ｃＤＮＡに含まれたＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその調節因子の遺伝子を増幅させて検出する手段として、前記プライマーを用いることができる。このとき、前記プライマーは、前記ｃＤＮＡに含まれたＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその調節因子の遺伝子を増幅させることができる限り、そのポリヌクレオチド配列は、特に制限されない。
本発明で使用された用語「プローブ」とは、遺伝子またはｍＲＮＡと特異的結合を達成できる、短くは数塩基乃至長くは数百塩基に該当するＲＮＡまたはＤＮＡ等の核酸断片を意味するが、オリゴヌクレオチドプローブ、単鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、二重鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブ等の形態で作製され、さらに容易に検出するために、多様な手段で標識されてもよい。
本発明において、前記プローブは、癌の発病が疑われる個体の赤血球または血清試料が処理された血管内皮細胞から得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成してから、前記ｃＤＮＡに含まれたＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその調節因子の遺伝子を検出するための手段として用いられる。このとき、前記プローブは、前記ｃＤＮＡに含まれたＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその調節因子の遺伝子を増幅させることができる限り、そのポリヌクレオチド配列は、特に制限されない。
本発明で使用された用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、特定のｍＲＮＡの配列に相補的な核酸配列を含有しているＤＮＡまたはＲＮＡ、またはこれらの誘導体を意味するが、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ内の相補的な配列に結合してｍＲＮＡの蛋白質への翻訳を阻害する作用をする。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、前記遺伝子のｍＲＮＡに相補的であり、前記ｍＲＮＡに結合することができるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を意味する。これは、前記遺伝子ｍＲＮＡの翻訳、細胞質内への転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）、成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）または他の全ての全体的な生物学的機能に必須な活性を阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは６〜１００塩基、好ましくは８〜６０塩基、より好ましくは１０〜４０塩基であってもよい。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常の方法で試験管内で合成され、生体内に投与するか、生体内でアンチセンスオリゴヌクレオチドが合成されるようにすることができる。試験管内でアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する１つの例は、ＲＮＡポリメラーゼＩを用いることである。生体内でアンチセンスＲＮＡが合成されるようにする一つの例は、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）の起源が反対方向にあるベクターを使ってアンチセンスＲＮＡが転写されるようにすることである。前記アンチセンスＲＮＡは、配列内に翻訳終止コドンが存在するようにしてペプチド配列に翻訳されないようにすることが望ましい。
本発明で使用された用語「診断」とは、病理状態の存在または特徴を確認する過程を意味する。本発明において、前記診断は、癌の治療後、再発可能性についての診断、癌の転移可能性についての診断、癌治療後の予後診断等であってもよい。
本発明は、他の一態様として、前記組成物を含む癌診断用キットを提供する。
本発明に係るキットは、癌の発病が疑われる個体の赤血球または血清が処理された血管内皮細胞で発現されるＫＣａ３．１チャネルまたはＫＣａ２．３チャネル遺伝子の蛋白質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定して癌の発病を診断するのに用いられ、特に制限されないが、前記遺伝子から発現される蛋白質レベルまたはｍＲＮＡレベルを測定するためのプライマー、プローブ、または抗体のみならず、分析方法に適した１種またはこれ以上の他の構成成分組成物、溶液または装置が含まれてもよい。このとき、用いられるキットとしては、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）キット、ＤＮＡチップキット、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キット、蛋白質チップキット、ラピッド（ｒａｐｉｄ）キット、ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）キット等がある。
具体的な一例として、本発明のＫＣａ３．１チャネルまたはＫＣａ２．３チャネル遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを測定するためのキットは、ＲＴ−ＰＣＲを行うために必要な必須要素を含むキットであってもよい。ＲＴ−ＰＣＲキットは、前記遺伝子への特異的なそれぞれのプライマー対以外にも、テストチューブまたは他の適切な容器、反応緩衝液（ｐＨおよびマグネシウム濃度は多様）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ−ポリメラーゼ、及び逆転写酵素のような酵素、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）抑制剤、ジエチルピロカーボネート水（ＤＥＰＣ−ｗａｔｅｒ）、滅菌水等が含まれてもよい。また、定量対照区として用いられる遺伝子に特異的なプライマー対を含んでもよい。
他の一例として、本発明に係るキットは、ＤＮＡチップ分析を行うために必要な必須要素を含んでもよい。ＤＮＡチップ分析用のキットは、遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡがプローブに付着されている基板、及び蛍光標識プローブを作製するための試薬、製剤、酵素等を含んでもよい。また、基板は、定量対照区遺伝子またはその断片に該当するｃＤＮＡを含んでもよい。
また他の一例として、本発明に係るキットは、ＫＣａ３．１チャネルまたはＫＣａ２．３チャネル遺伝子から発現される蛋白質のレベルを測定するための蛋白質チップ分析用キットであってもよく、前記キットは、特にこれに制限されないが、抗体の免疫学的検出のために、基材、適当な緩衝溶液、発色酵素、または蛍光物質で標識された二次抗体、発色基質等を含んでもよい。このとき、前記基材は、特にこれに制限されないが、ニトロセルロース膜、ポリビニル樹脂で合成された９６ウェルプレート、ポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレート、及びガラスからなるスライドガラス等が用いられてもよく、前記発色酵素は、特にこれに制限されないが、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が用いられてもよく、前記蛍光物質は、特にこれに制限されないが、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ＲＩＴＣ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）等があり、発色基質液は、特にこれに制限されないが、ＡＢＴＳ（２，２'−ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ））、ＯＰＤ（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＴＭＢ（３，３'，５，５'−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）等がある。
本発明は、また他の態様として、癌の発病が疑われる個体から分離された生物学的試料を用いて、癌診断のための情報を提供する方法を提供する。
具体的に、本発明で提供する癌診断のための情報の提供方法は、（ａ）癌の発病が疑われる個体から分離された生物学的試料において、カリウムチャネル蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、（ｂ）前記（ａ）段階で測定された蛋白質またはｍＲＮＡの発現レベルを、正常対照群試料で測定された発現レベルと比較する段階と、を含む。
前記方法によれば、前記（ａ）段階で測定した発現レベルが、正常対照群試料で測定された発現レベルよりも高いレベルを示すと、前記生物学的試料が得られた個体において癌が発病する可能性が高く、または癌が発病したと判断することができる。
このとき、前記生物学的試料は、カリウムチャネル蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定できる限り、特にこれに制限されないが、一例として、血液試料を用いてもよく、他の例として、赤血球を含む試料を用いてもよい。また、前記カリウムチャネル蛋白質、前記蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する方法等は、上述の通りである。
本発明で使用された用語「個体」とは、癌の発病したヒトをはじめとしてネズミ、家畜等を含めた哺乳動物、養殖魚類等を制限なく含んでもよい。
また、前記方法は、（ｃ）前記生物学的試料において、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、またはＲａｂ５Ｃの蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、（ｄ）前記（ｃ）段階で測定された蛋白質またはｍＲＮＡの発現レベルを、正常対照群試料で測定された発現レベルと比較する段階と、をさらに含んでもよいが、この場合は、前記（ｃ）段階で測定した発現レベルが、正常対照群試料で測定された発現レベルよりも低いレベルを示すと、前記生物学的試料が得られた個体において癌が発病したと判断することができる。
併せて、前記方法は、（ｃ）前記生物学的試料において、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、またはＲａｂ５Ｃの蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、（ｄ'）前記（ａ）段階で測定した発現レベルの測定値を、前記（ｃ）段階で測定した発現レベルの測定値で除算して、前記各測定値の比率を算出し、これを正常対照群試料で算出した測定値の比率と比較する段階と、をさらに含んでもよい。この場合は、前記（ｄ'）段階で算出した測定値の比率が、正常対照群試料で算出された測定値の比率よりも高いレベルを示すと、前記生物学的試料が得られた個体において癌が発病する可能性が高く、または癌が発病したと判断することができる。
本発明の一実施例によれば、肝癌患者の赤血球では、ＫＣａ３．１チャネルの発現レベルが増加され（図２ａ）、肝硬変患者の赤血球では、ＫＣａ３．１チャネルの発現レベルが増加され（図２ｂ）、肝癌患者及び肝硬変患者の赤血球で測定されたカリウムチャネル調節因子であるクラスリンの発現レベルを比較した結果、クラスリンの発現レベルが全て減少し（図２ｃ）、膵癌患者の赤血球では、ＫＣａ３．１チャネルの発現レベルは増加するのに対して、クラスリンの発現レベルは減少し（図３）、肝癌患者、肝硬変患者、または膵癌患者の赤血球で測定されたＫＣａ３．１チャネルの発現レベルと、調節因子（クラスリンまたはカベオリン１）の発現レベルとの比率は、全て対照群で測定された比率（約１）よりも顕著に高い水準を示すことが確認された（図５ａ及び図５ｂ）。
本発明は、また他の一態様として、癌の発病が疑われる個体から分離された試料が処理された血管内皮細胞を用いて、癌診断のための情報を提供する方法を提供する。
具体的に、本発明で提供する癌診断のための情報の提供方法は、（ａ）癌の発病が疑われる個体から分離された試料を、血管内皮細胞に処理する段階と、（ｂ）前記（ａ）段階で処理された血管内皮細胞において、カリウムチャネル蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、（ｃ）前記測定された蛋白質またはｍＲＮＡの発現レベルを、正常対照群試料で測定された発現レベルと比較する段階と、を含む。
前記方法によれば、前記（ｂ）段階で測定した発現レベルが、正常対照群試料で測定された発現レベルよりも高いレベルを示すと、前記生物学的試料が得られた個体において癌が発病する可能性が高く、または癌が発病したと判断することができる。
このとき、前記生物学的試料は、カリウムチャネル蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定できる限り、特にこれに制限されないが、具体的に、血液試料を用いてもよく、さらに具体的に、血液、血清、血漿等を含む試料を用いてもよい。また、前記カリウムチャネル蛋白質、前記蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する方法、個体等は、上述の通りである。
また、前記方法は、（ｄ）前記（ａ）段階で処理された血管内皮細胞において、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、またはＲａｂ５Ｃの蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、（ｅ）前記（ｄ）段階で測定された蛋白質またはｍＲＮＡの発現レベルを、正常対照群試料で測定された発現レベルと比較する段階と、をさらに含んでもよいが、この場合は、前記（ｄ）段階で測定した発現レベルが、正常対照群試料で測定された発現レベルよりも低いレベルを示すと、前記試料が得られた個体において癌が発病したと判断することができる。
併せて、前記方法は、（ｄ）前記（ａ）段階で処理された血管内皮細胞において、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、またはＲａｂ５Ｃの蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、（ｅ'）前記（ｂ）段階で測定した発現レベルの測定値を、前記（ｄ）段階で測定した発現レベルの測定値で除算して、前記各測定値の比率を算出し、これを正常対照群試料で算出した測定値の比率と比較する段階と、をさらに含んでもよい。この場合は、前記（ｅ'）段階で算出された測定値の比率が、正常対照群試料で算出された測定値の比率よりも高いレベルを示すと、前記試料が得られた個体において癌が発病する可能性が高く、または癌が発病したと判断することができる。
本発明の一実施例によれば、肝癌患者の血清が処理された血管内皮細胞では、ＫＣａ３．１チャネル及びＫＣａ２．３チャネルの発現レベルが増加され（図１）、カベオリン１とＥＥＡの発現レベルが減少したことが確認された（図４）。
一方、肝癌患者の赤血球では、正常人の赤血球よりも高いレベルでＫＣａ３．１チャネルの発現レベルが増加し（図２ａ）、肝癌患者と肝硬変患者の赤血球では、クラスリンの発現レベルが減少することが確認され（図２ｂ）、膵癌患者の赤血球でも、正常人の赤血球よりも高い水準にＫＣａ３．１チャネルの発現レベルが増加した（図３）。
それだけでなく、肝癌モデルマウスの肝組織でも、ＫＣａ３．１チャネル及びＫＣａ２．３チャネルの発現レベルが増加することが確認された（図６）。
したがって、癌の発病有無が疑われる患者の血液試料が処理された血管内皮細胞、または患者の赤血球で測定されたカリウムチャネル、またはその調節因子の蛋白質の発現レベル、または前記各発現レベルの比率を用いると、前記患者において、癌の発病有無を診断するだけでなく、癌の発病前に癌の発病可能性を早期診断できることが分かった。
本発明で提供する癌診断用組成物またはキットを用いると、個体の試料が処理された血管内皮細胞または個体から分離された赤血球において、カリウムチャネルであるＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその調節因子の発現レベルを測定して、癌の種類にかかわらず、その発病有無を診断することができるので、多様な癌の進行水準（成長、転移、予後、及び再発）の判断に広く活用されるであろう。
肝癌患者の血液試料（血清）を血管内皮細胞に処理し、前記血管内皮細胞で測定されたカリウムチャネルであるＫＣａ３．１チャネル及びＫＣａ２．３チャネルの発現レベルを比較した結果を示すウエスタンブロット分析写真、及び前記カリウムチャネルの発現レベルを定量分析した結果を示すグラフである。 肝癌患者の赤血球で測定されたカリウムチャネルであるＫＣａ３．１チャネルの発現レベルを比較した結果を示すウエスタンブロット分析写真、及び前記カリウムチャネルの発現レベルを定量分析した結果を示すグラフである。 肝硬変患者の赤血球で測定されたカリウムチャネルであるＫＣａ３．１チャネルの発現レベルを比較した結果を示すウエスタンブロット分析写真、及び前記カリウムチャネルの発現レベルを定量分析した結果を示すグラフである。 肝癌患者及び肝硬変患者の赤血球で測定されたカリウムチャネル調節因子であるクラスリンの発現レベルを比較した結果を示すウエスタンブロット分析写真、及び前記クラスリンの発現レベルを定量分析した結果を示すグラフである。 膵癌患者の赤血球で測定されたＫＣａ３．１チャネル及びその調節因子であるクラスリンの発現レベルを比較した結果を示すウエスタンブロット分析写真、及び前記ＫＣａ３．１チャネル及びクラスリンの発現レベルを定量分析した結果を示すグラフである。 肝癌患者の血液試料（血清）を希釈して血管内皮細胞に処理し、前記血管内皮細胞で測定されたカリウムチャネルであるＫＣａ３．１チャネル及びＫＣａ２．３チャネル、カベオリン１、ＥＥＡ１の発現レベルを比較した結果を示すウエスタンブロット分析写真である。 肝癌患者及び肝硬変患者の赤血球で測定されたＫＣａ３．１チャネル及びクラスリンの発現レベルの比率を比較した結果を示すグラフである。 膵癌患者の赤血球で測定されたＫＣａ３．１チャネル及びクラスリンの発現レベルの比率を比較した結果を示すグラフである。 セラミド合成酵素２（ｃｅｒａｍｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ２）をコードする遺伝子が欠失され、肝癌が引き起こされる肝癌モデルマウス（ＣｅｒＳ２）の肝組織細胞で発現されるＫＣａ３．１チャネルまたはＫＣａ２．３チャネルの発現レベルを比較した結果を示すウエスタンブロット分析写真、及びＫＣａ３．１チャネルの発現レベルを定量分析した結果を示すグラフである。
以下、本発明の好適な実施例について詳述する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：肝癌患者の血液試料が血管内皮細胞のカリウムチャネルに及ぼす効果
肝癌患者の血液試料の処理によって、血管内皮細胞においてＫＣａ３．１チャネル及びＫＣａ２．３チャネルの発現レベルが変わるか否かを確認しようとした。
すなわち、肝癌患者から得られた血液から血清試料を収得し、前記血清試料をヒト血管内皮細胞株に処理した上で、２４時間の間培養し、培養が終了してから、前記血管内皮細胞で発現されたカリウムチャネルであるＫＣａ３．１チャネル及びＫＣａ２．３チャネルの発現レベルを、ウエスタンブロット分析によって測定して比較した（図１）。このとき、対照群としては、正常人の血清試料を処理した血管内皮細胞株を用いており、ＫＣａ３．１チャネル蛋白質の発現レベルは、ＲＱＶＲＬＫＨＲＫＬＲＥＱＶ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する抗体を用いて測定し、ＫＣａ２．３チャネル蛋白質の発現レベルは、ＫＣａ２．３チャネル蛋白質に特異的に結合し、ＬＨＳＳＰＴＡＦＲＡＰＰＳＳＮＳＴＡＩＬＨＰＳＳＲＱＧＳＱＬＮＬＮＤＨＬＬＧＨＳＰＳＳＴＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む抗体を用いて測定し、内部対照群としてはＧＡＰＤＨを用いた。
図１に示すように、正常人の血清試料を処理した血管内皮細胞とは異なり、肝癌患者の血清試料を処理した血管内皮細胞では、ＫＣａ３．１チャネル及びＫＣａ２．３チャネルの発現レベルが増加することが確認された。
実施例２：肝癌及び肝硬変患者の赤血球で発現されるカリウムチャネル及びその調節因子の発現レベルの分析
前記実施例１の結果から、肝癌患者の血清試料を処理した血管内皮細胞では、ＫＣａ３．１チャネル及びＫＣａ２．３チャネルの発現レベルが増加することが確認されたので、前記肝癌患者の赤血球を対象として、カリウムチャネル及びその調節因子の発現レベルを分析した。
実施例２−１：肝癌及び肝硬変患者の赤血球で発現されるカリウムチャネルの発現レベルの分析
肝癌患者の赤血球においてＫＣａ３．１チャネル蛋白質の発現レベルが増加しているかを、ウエスタンブロット分析によって確認した（図２ａ）。このとき、対照群としては、正常人の赤血球を用いており、内部対照群としてはＧＡＰＤＨを用いた。
図２ａに示すように、肝癌患者の赤血球には、正常人の赤血球よりも高いレベルにＫＣａ３．１チャネルが発現されることが確認された。
また、肝癌患者ではなく、肝硬変患者の赤血球でも、前記ＫＣａ３．１チャネル蛋白質の発現レベルが増加しているかを、ウエスタンブロット分析によって確認した（図２ｂ）。このとき、対照群としては、正常人の赤血球を用いており、内部対照群としてはＧＡＰＤＨを用いた。
図２ｂに示すように、肝硬変患者の赤血球でも、正常人の赤血球よりも高いレベルにＫＣａ３．１チャネルが発現されることが確認された。
実施例２−２：肝癌及び肝硬変患者の赤血球で発現されるカリウムチャネルの調節因子の発現レベルの分析
上記した実施例２−１で用いられた肝癌患者及び肝硬変患者の血液試料から得られた赤血球において、ＫＣａ３．１チャネル及びＫＣａ２．３チャネルの調節因子として知られたクラスリンの発現レベルを、ＰＱＬＭＬＴＡＧＰＳＶＡＶＰＰＱＡＰＦＧＹＧＹＴＡＰＰＹＧＱＰＱＰＧＦＧＹＳ（配列番号３）のアミノ酸配列を有する抗体を用いて、ウエスタンブロット分析によって測定して比較した（図２ｃ）。このとき、対照群としては、正常人の赤血球を用いており、内部対照群としてはＧＡＰＤＨを用いた。
図２ｃに示すように、ＫＣａ３．１チャネルの発現レベルが増加した肝癌患者及び肝硬変患者の赤血球では、カリウムチャネル調節因子であるクラスリンの発現レベルが減少することが確認された。
実施例３：膵癌患者の赤血球で発現されるカリウムチャネル及びその調節因子の発現レベルの分析
上記した実施例２の結果から、肝癌患者の赤血球においてＫＣａ３．１チャネル蛋白質の発現レベルが増加し、その調節因子であるクラスリンの発現レベルが減少することが確認されたので、他の癌種である膵癌患者でも、同一の結果が得られるかを確認しようとした。
ここに、膵癌患者から得られた血液から赤血球を収得し、前記赤血球で発現されるＫＣａ３．１チャネル及びクラスリンの発現レベルを、ウエスタンブロット分析によって測定して比較した（図３）。このとき、対照群としては、正常人の赤血球を用いており、内部対照群としてはＧＡＰＤＨを用いた。
図３に示すように、膵癌患者の赤血球でも、肝癌患者の赤血球と同様に、ＫＣａ３．１チャネルの発現レベルが増加し、同時にクラスリンの発現レベルが減少することが確認された。
実施例４：肝癌患者の血液試料の希釈程度が血管内皮細胞のカリウムチャネルに及ぼす効果
肝癌患者から得られた血液から血清試料を収得し、前記血清試料を培養液で希釈して血管内皮細胞に処理した上で、培養し、培養が終了してから、前記血管内皮細胞で発現されたカリウムチャネルであるＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、及び前記カリウムチャネルの調節因子として知られたカベオリン１とＥＥＡ１の発現レベルを、ウエスタンブロット分析によって測定して比較した。カベオリン１とＥＥＡ１の発現レベルは、それぞれＭＡＤＥＬＳＥＫＱＶＹＤＡＨＴＫＥＩＤ（配列番号４）とＦＣＡＥＣＳＡＫＮＡＬＴＰＳＳＫＫＰＶＲ（配列番号５）のアミノ酸配列を有する抗体を用いて、ウエスタンブロット分析によって測定しており、内部対照群としてはＧＡＰＤＨを用いた。
図４に示すように、肝癌患者の血清を処理した血管内皮細胞でも、ＫＣａ３．１チャネル及びＫＣａ２．３チャネルの発現レベルが増加し、同時にカベオリン１とＥＥＡ１の発現レベルが減少することが確認された。
実施例５：血液試料が処理された血管内皮細胞において、カリウムチャネルとカリウムチャネル調節因子の発現レベルの比率の分析
上記した実施例１乃至４で用いられた肝癌患者、肝硬変患者、及び膵癌患者の血液試料（赤血球または血清試料）を血管内皮細胞株に処理し、培養してから、前記血管内皮細胞で発現されたカリウムチャネルであるＫＣａ３．１チャネル及び前記カリウムチャネルの調節因子であるクラスリンの発現レベルを測定し、測定された値を下記式に適用して、チャネル蛋白質の発現レベルの測定値と調節因子の発現レベルの測定値の比率を算出しており、算出された比率を正常対照群において算出された測定値の比率と比較した（図５ａ及び図５ｂ）。このとき、正常対照群は、正常人の血液試料が処理された血管内皮細胞株を用いた。
測定値の比率＝ＫＣａ３．１チャネルの発現レベルの測定値／カリウムチャネル調節因子の発現レベルの測定値
図５ａ及び図５ｂに示すように、正常対照群において算出された測定値の比率は、約１．０を示すのに対して、各血液試料（赤血球または血清試料）が処理された血管内皮細胞において算出された測定値の比率は、２．０以上を示すことが確認された。
このように、カリウムチャネルまたはカリウムチャネル調節因子の発現レベルを単独で測定して比較する場合は、癌患者と正常人で測定された値が類似したら、診断結果に誤謬が生じ得るのに対して、カリウムチャネル及びカリウムチャネル調節因子の発現レベルを一緒に測定し、その比率を算出した場合は、測定値が類似していても、癌患者と正常人で算出された各測定値の比率が明確に区別されるので、診断結果に誤謬が生じる可能性を顕著に減少させることができる。
したがって、前記カリウムチャネル及びカリウムチャネル調節因子の発現レベルの比率は、癌の診断及び予後予測に有用に活用されるものと分析された。
実施例６：肝癌モデルマウスの肝細胞において、カリウムチャネルの発現レベルの分析
上記した実施例から分かるように、肝癌患者または膵癌患者の赤血球において、ＫＣａ３．１チャネルまたはＫＣａ２．３チャネルの発現レベルが増加することが確認されたので、肝癌モデルマウスの肝組織において、前記カリウムチャネルの発現水準を測定した。
具体的に、セラミド合成酵素２（ｃｅｒａｍｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ２）をコードする遺伝子が欠失され、肝癌が引き起こされる肝癌モデルマウス（ＣｅｒＳ２）から肝組織を収得し、前記得られた肝組織で発現されるＫＣａ３．１チャネルまたはＫＣａ２．３チャネルの発現レベルを、ウエスタンブロット分析によって測定して定量分析した（図６）。このとき、対照群としては、正常マウスの肝組織を用いており、内部対照群としては、α−チューブリンを用いた。
図６に示すように、肝癌モデルマウスの肝組織では、ＫＣａ３．１チャネル及びＫＣａ２．３チャネルの発現レベルが増加することが確認された。
上記した実施例の結果をまとめると、癌患者の血液試料が処理された血管内皮細胞または癌患者の赤血球において、カリウムチャネル蛋白質の発現レベル、前記チャネル蛋白質調節因子の発現レベル、または前記各発現レベルの比率を用いて、癌患者と正常人を区別できることが分かった。
また、肝癌が発病されてはいないが、肝癌が発生する可能性が高い肝硬変患者でも、類似した結果が得られた。
以上の説明から、癌の発病有無が疑われる患者の血液試料が処理された血管内皮細胞または患者の赤血球において測定されたカリウムチャネルまたはその調節因子の蛋白質の発現レベル、または前記各発現レベルの比率を用いると、前記患者において癌の発病有無を診断できるのみならず、癌の発病前に癌の発病可能性を早期診断できることが分かった。
本明細書は、本発明の技術分野における通常の知識を有する者が充分に認識して類推できる内容は、その詳細な記載を省略し、本明細書に記載された具体的な例示以外に、本発明の技術的思想や必須的構成を変更しない範囲内で、さらに多様な変形が可能である。したがって、本発明は、本明細書で具体的に説明して例示したものとは異なる方式で実施されてもよく、これは、本発明の技術分野における通常の知識を有する者であれば、理解することができる事項である。
本発明で使用された用語「プローブ」とは、遺伝子またはｍＲＮＡと特異的結合を達成できる、短くは数塩基から長くは数百塩基に該当するＲＮＡまたはＤＮＡ等の核酸断片を意味するが、オリゴヌクレオチドプローブ、単鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、二重鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブ等の形態で作製され、さらに容易に検出するために、多様な手段で標識されてもよい。
上記した実施例１から４で用いられた肝癌患者、肝硬変患者、及び膵癌患者の血液試料（赤血球または血清試料）を血管内皮細胞株に処理し、培養してから、前記血管内皮細胞で発現されたカリウムチャネルであるＫＣａ３．１チャネル及び前記カリウムチャネルの調節因子であるクラスリンの発現レベルを測定し、測定された値を下記式に適用して、チャネル蛋白質の発現レベルの測定値と調節因子の発現レベルの測定値の比率を算出しており、算出された比率を正常対照群において算出された測定値の比率と比較した（図５ａ及び図５ｂ）。このとき、正常対照群は、正常人の血液試料が処理された血管内皮細胞株を用いた。
本明細書は、本発明の技術分野における通常の知識を有する者が充分に認識して類推できる内容は、その詳細な記載を省略し、本明細書に記載された具体的な例示以外に、本発明の技術的思想や必須的構成を変更しない範囲内で、さらに多様な変形が可能である。したがって、本発明は、本明細書で具体的に説明して例示したものとは異なる方式で実施されてもよく、これは、本発明の技術分野における通常の知識を有する者であれば、理解することができる事項である。
［項目１］
カリウムチャネル蛋白質または上記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定可能な製剤を含む癌診断用組成物。
［項目２］
上記カリウムチャネル蛋白質は、ＫＣａ２．３チャネル蛋白質、ＫＣａ３．１チャネル蛋白質、またはこれらの組合せであるものである項目１に記載の癌診断用組成物。
［項目３］
上記蛋白質レベルを測定可能な製剤は、上記蛋白質に特異的に結合可能な抗体またはアプタマーであるものである項目１に記載の癌診断用組成物。
［項目４］
上記ｍＲＮＡのレベルを測定可能な製剤は、上記遺伝子に特異的に結合可能なプライマー、プローブ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドであるものである項目１に記載の癌診断用組成物。
［項目５］
上記癌診断用組成物は、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、及びＲａｂ５Ｃからなる群より選ばれる一つ以上の蛋白質または上記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定可能な製剤をさらに含むものである項目１に記載の癌診断用組成物。
［項目６］
上記癌は、肝癌、肺癌、胃癌、膵癌、腎癌、子宮癌、子宮頸癌、脳癌、口腔癌、大腸癌、胆道癌、骨癌、皮膚癌、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる癌であるものである項目１に記載の癌診断用組成物。
［項目７］
上記診断は、癌の治療後、再発可能性についての診断、癌の転移可能性についての診断、または癌治療後の予後診断であるものである項目１に記載の癌診断用組成物。
［項目８］
項目１乃至項目７のいずれか一項に記載の組成物を含む癌診断用キット。
［項目９］
上記キットは、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）キット、ＤＮＡチップキット、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キット、蛋白質チップキット、ラピッド（ｒａｐｉｄ）キット、またはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）キットであるものである項目８に記載の癌診断用キット。
［項目１０］
（ａ）癌の発病が疑われる個体から分離された生物学的試料でカリウムチャネル蛋白質または上記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、
（ｂ）上記（ａ）段階で測定された蛋白質またはｍＲＮＡの発現レベルを、正常対照群試料で測定された発現レベルと比較する段階と、を含む癌診断のための情報の提供方法。
［項目１１］
上記カリウムチャネルは、ＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその組合せであるものである項目１０に記載の癌診断のための情報の提供方法。
［項目１２］
上記方法は、（ｃ）上記生物学的試料において、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、及びＲａｂ５Ｃからなる群より選ばれる一つ以上の蛋白質または上記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、
（ｄ）上記（ｃ）段階で測定された蛋白質またはｍＲＮＡの発現レベルを、正常対照群試料で測定された発現レベルと比較する段階と、をさらに含むものである項目１０に記載の癌診断のための情報の提供方法。
［項目１３］
上記方法は、（ｃ）上記生物学的試料において、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、及びＲａｂ５Ｃからなる群より選ばれる一つ以上の蛋白質または上記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、
（ｄ'）上記（ａ）段階で測定した発現レベルの測定値を、上記（ｃ）段階で測定した発現レベルの測定値で除算して、上記各測定値の比率を算出し、これを正常対照群試料で算出された測定値の比率と比較する段階と、をさらに含むものである項目１０に記載の癌診断のための情報の提供方法。
［項目１４］
上記生物学的試料は、赤血球を含む試料であるものである項目１０に記載の癌診断のための情報の提供方法。
［項目１５］
（ａ）癌の発病が疑われる個体から分離された試料を、血管内皮細胞に処理する段階と、
（ｂ）上記（ａ）段階で処理された血管内皮細胞において、カリウムチャネル蛋白質または上記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、
（ｃ）上記測定された蛋白質またはｍＲＮＡの発現レベルを、正常対照群試料で測定された発現レベルと比較する段階と、を含む癌診断のための情報の提供方法。
［項目１６］
上記カリウムチャネルは、ＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその組合せであるものである項目１５に記載の癌診断のための情報の提供方法。
［項目１７］
上記方法は、（ｄ）上記（ａ）段階で処理された血管内皮細胞において、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、及びＲａｂ５Ｃからなる群より選ばれる一つ以上の蛋白質または上記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、
（ｅ）上記（ｄ）段階で測定された蛋白質またはｍＲＮＡの発現レベルを、正常対照群試料で測定された発現レベルと比較する段階と、をさらに含むものである項目１５に記載の癌診断のための情報の提供方法。
［項目１８］
上記方法は、（ｄ）上記（ａ）段階で処理された血管内皮細胞において、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、及びＲａｂ５Ｃからなる群より選ばれる一つ以上の蛋白質または上記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、
（ｅ'）上記（ｂ）段階で測定した発現レベルの測定値を、上記（ｄ）段階で測定した発現レベルの測定値で除算して、上記各測定値の比率を算出し、これを正常対照群試料で算出された測定値の比率と比較する段階と、をさらに含むものである項目１５に記載の癌診断のための情報の提供方法。

Claims (18)

  1. カリウムチャネル蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定可能な製剤を含む癌診断用組成物。
  2. 前記カリウムチャネル蛋白質は、ＫＣａ２．３チャネル蛋白質、ＫＣａ３．１チャネル蛋白質、またはこれらの組合せであるものである請求項１に記載の癌診断用組成物。
  3. 前記蛋白質レベルを測定可能な製剤は、前記蛋白質に特異的に結合可能な抗体またはアプタマーであるものである請求項１に記載の癌診断用組成物。
  4. 前記ｍＲＮＡのレベルを測定可能な製剤は、前記遺伝子に特異的に結合可能なプライマー、プローブ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドであるものである請求項１に記載の癌診断用組成物。
  5. 前記癌診断用組成物は、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、及びＲａｂ５Ｃからなる群より選ばれる一つ以上の蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定可能な製剤をさらに含むものである請求項１に記載の癌診断用組成物。
  6. 前記癌は、肝癌、肺癌、胃癌、膵癌、腎癌、子宮癌、子宮頸癌、脳癌、口腔癌、大腸癌、胆道癌、骨癌、皮膚癌、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる癌であるものである請求項１に記載の癌診断用組成物。
  7. 前記診断は、癌の治療後、再発可能性についての診断、癌の転移可能性についての診断、または癌治療後の予後診断であるものである請求項１に記載の癌診断用組成物。
  8. 請求項１乃至請求項７のいずれか一項に記載の組成物を含む癌診断用キット。
  9. 前記キットは、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）キット、ＤＮＡチップキット、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）キット、蛋白質チップキット、ラピッド（ｒａｐｉｄ）キット、またはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）キットであるものである請求項８に記載の癌診断用キット。
  10. （ａ）癌の発病が疑われる個体から分離された生物学的試料でカリウムチャネル蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、
    （ｂ）前記（ａ）段階で測定された蛋白質またはｍＲＮＡの発現レベルを、正常対照群試料で測定された発現レベルと比較する段階と、を含む癌診断のための情報の提供方法。
  11. 前記カリウムチャネルは、ＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその組合せであるものである請求項１０に記載の癌診断のための情報の提供方法。
  12. 前記方法は、（ｃ）前記生物学的試料において、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、及びＲａｂ５Ｃからなる群より選ばれる一つ以上の蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、
    （ｄ）前記（ｃ）段階で測定された蛋白質またはｍＲＮＡの発現レベルを、正常対照群試料で測定された発現レベルと比較する段階と、をさらに含むものである請求項１０に記載の癌診断のための情報の提供方法。
  13. 前記方法は、（ｃ）前記生物学的試料において、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、及びＲａｂ５Ｃからなる群より選ばれる一つ以上の蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、
    （ｄ'）前記（ａ）段階で測定した発現レベルの測定値を、前記（ｃ）段階で測定した発現レベルの測定値で除算して、前記各測定値の比率を算出し、これを正常対照群試料で算出された測定値の比率と比較する段階と、をさらに含むものである請求項１０に記載の癌診断のための情報の提供方法。
  14. 前記生物学的試料は、赤血球を含む試料であるものである請求項１０に記載の癌診断のための情報の提供方法。
  15. （ａ）癌の発病が疑われる個体から分離された試料を、血管内皮細胞に処理する段階と、
    （ｂ）前記（ａ）段階で処理された血管内皮細胞において、カリウムチャネル蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、
    （ｃ）前記測定された蛋白質またはｍＲＮＡの発現レベルを、正常対照群試料で測定された発現レベルと比較する段階と、を含む癌診断のための情報の提供方法。
  16. 前記カリウムチャネルは、ＫＣａ３．１チャネル、ＫＣａ２．３チャネル、またはその組合せであるものである請求項１５に記載の癌診断のための情報の提供方法。
  17. 前記方法は、（ｄ）前記（ａ）段階で処理された血管内皮細胞において、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、及びＲａｂ５Ｃからなる群より選ばれる一つ以上の蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、
    （ｅ）前記（ｄ）段階で測定された蛋白質またはｍＲＮＡの発現レベルを、正常対照群試料で測定された発現レベルと比較する段階と、をさらに含むものである請求項１５に記載の癌診断のための情報の提供方法。
  18. 前記方法は、（ｄ）前記（ａ）段階で処理された血管内皮細胞において、クラスリン、カベオリン１、ＥＥＡ、及びＲａｂ５Ｃからなる群より選ばれる一つ以上の蛋白質または前記蛋白質をコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡの発現レベルを測定する段階と、
    （ｅ'）前記（ｂ）段階で測定した発現レベルの測定値を、前記（ｄ）段階で測定した発現レベルの測定値で除算して、前記各測定値の比率を算出し、これを正常対照群試料で算出された測定値の比率と比較する段階と、をさらに含むものである請求項１５に記載の癌診断のための情報の提供方法。
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