CN109564222A - 利用钾离子通道蛋白的诊断癌症用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用钾离子通道蛋白的诊断癌症用组合物、包括所述组合物的诊断癌症用试剂盒及诊断癌症用信息的提供方法。使用本发明中提供的诊断癌症用组合物或试剂盒，可以从个体的样本被处理的血管内皮细胞或从个体分离的红血球检测钾离子通道即KCa3.1通道、KCa2.3通道或其调节因子的表达水平，不管癌症的种类，皆可诊断其是否发生癌症，因此可以广泛用于各种癌症的发展水平(生长、转移、预后和复发)的判断。

Description

利用钾离子通道蛋白的诊断癌症用组合物
技术领域
本发明涉及利用钾离子通道蛋白的癌诊断用组合物、包括所述组合物的诊断癌症用试剂盒及诊断癌症用信息的提供方法。
背景技术
“肿瘤(tumor)”分为良性肿瘤(benign tumor)和恶性肿瘤(malignant tumor)，良性肿瘤生长速度缓慢，不会转移(metastasis)。相反经常称为癌的恶性肿瘤浸润周围组织的同时快速生长，转移到其它部位危害生命。根据韩国的统计，2013年癌症死亡人数占总死亡人数的28.3％，所占比例最大，每年癌症患者数量也达到20万名以上，并逐渐增多。假如韩国人的平均寿命接近81岁，则患癌的概率为36.2％，非常高。如此，癌症作为对人体健康影响最大的疾病，通过内窥镜或CT等影像医学方法发现癌块，用组织学方法确认诊断。这种传统方法是在癌块长大到可发现的大小以后，就是说癌症发展到某种程度以后才可能发现。但癌症应该在发生初期发现并及时合理治疗尤为重要。因此可以早期查出癌症或复发的研究也展开得很多。
作为早期发现癌的方法，利用肿瘤标志物等特定癌标志物的方法的研究开展得很多，这种种瘤标志物包括大肠癌的癌胚抗原(carcinoembryonic antigen；CEA)、肝癌的甲胎蛋白(α-fetoprotein；AFP)等。韩国公开专利第10-2009-0029868号公开了一种利用肝癌患者的体液中钙磷脂结合蛋白II的超表达现象，进行简单分析而提升肝癌诊断精确性的肝癌标志物及利用所述标志物诊断肝癌的方法。韩国注册专利第10-1058783号公开了一种将亲环蛋白A编码的基因作为诊断肝癌的标志物使用以诊断肝癌的方法。韩国注册专利第10-1071219号公开了一种根据存在于TGFβRIII基因外显子部位的多态性的诊断肝癌用多态性标志物及利用所述标志物诊断肝癌的方法。这种利用肿瘤标志物的癌症诊断方法是有一部分已作为辅助诊断方法用以癌症的早期诊断或者正在开发中。
本研究人员发现KCa2.3和KCa3.1蛋白质的表达水平在肝癌、肺癌和胰腺癌等癌症中增加很多。这种KCa2.3和KCa3.1蛋白质的表达水平是因癌细胞为癌组织生长而分泌的VEGF等血管生长因子而增加，而且使正常血管内皮细胞在患者血清里暴光不到24个小时仍然发生，由此可知，这种K+通道蛋白质表达是在极快时间内增加的。调节该K+通道蛋白质表达的诸多因子(网格蛋白等)的表达也被极快地调节。根据这些结果认为，KCa2.3和KCa3.1蛋白以及该K+通道蛋白的表达调节因子的表达水平很好地反映了血管生长因子的水平。而且患者红血球中KCa3.1蛋白表达也增加了。血管内皮细胞和红血球暴露于同一个血清，因此认为血管内皮细胞的KCa3.1表达水平可以被红血球中的表达水平替代。
在这种背景下，本发明人员为了发明通过检测血管新生相关因子的表达水平来有效诊断癌症的方法而努力进行研究的结果，在血管内皮细胞或红血球中检测KCa3.1蛋白或调节该通道表达的诸多因子的表达水平，能够有效地早期诊断癌症发生与否，从而完成本发明。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种诊断癌症用组合物。
本发明的另一目的在于提供一种包括所述组合物的诊断癌症用试剂盒。
本发明的又另一目的在于提供一种诊断癌症用信息的提供方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明一个实施例提供一种可以检测从将钾离子通道蛋白或者所述蛋白编码的基因表达的mRNA表达水平的制剂的诊断癌症用组合物。所述钾离子通道蛋白可以是Kca2.3通道、KCa3.1通道或这些组合。
癌症患者的血清被处理的正常血管内皮细胞或癌症患者的红血球中钾离子通道(Kca2.3通道或KCa3.1通道)的表达水平增加，因此利用包括可检测所述通道的制剂的本发明的组合物检测所述血管内皮细胞或红血球中钾离子通道(Kca2.3通道或KCa3.1通道)的表达水平后可以如下应用到癌症诊断。就是说，据悉KCa2.3通道或者KCa3.1通道的表达程度会影响到癌症转换和预后，因此根据该通道的表达程度可以判断预后和转换的可能性，治疗癌症后减少的该通道的表达重新增加时，可能是因由复发的癌细胞分泌的VEGF而使表达增加，因此可以应用于癌复发的诊断。
不仅如此，从肝炎到肝硬化，从肝硬化到肝癌发展的过程中表达也会增加，故本发明的诊断用组合物可以非常有效地利用于癌的发展(生长、转移、预后和复发)等方面的判断。
如上所述的通过检测个体的血液样本被处理的血管内皮细胞或个体的红血球中钾离子通道(Kca2.3通道或KCa3.1通道)或其调节因子的表达水平而诊断癌症的技术至今尚未公开，是由本发明人首次开发。
本发明提供的癌症诊断技术预计可以有效利用于治疗癌症后复发可能性的早期诊断。也展开很多对治疗癌症后复发可能性的早期诊断方法的研究，因为癌患者中复发的较多，癌细胞扩散之前着手治疗就可以提升痊愈的可能性。最近英国的癌症研究所开发了一种诊断复发可能性的方法，该方法可以检测出乳腺癌的血液中残留癌细胞渗透其它组织之前释放的DNA。通过该方法估计可在用CT、MRI等传统方法检测复发的癌块的几个月之前就可以诊断出复发的可能性。癌症复发之前，就是说癌块变大之前，会分泌血管新生因子且因而造成的KCa2.3、KCa3.1表达会增加，因此认为对癌症复发的诊断有用。此外预计对癌转移可能性和预后诊断等判断非常有用。据报告，一些癌的KCa3.1表达增加会提升癌转换的可能性并降低生存的可能性，肝癌也是使KCa2.3和KCa3.1表达增加的VEGF受体增加则视为预后不良，因此KCa2.3和KCa3.1表达程度在癌转移可能性和预后判定具有很大帮助。
通过所述组合物可以诊断的癌症是，由于发生癌症使血管内皮细胞或红血球的KCa3.1通道或KCa2.3通道的蛋白质或mRNA水平增加时，不会特别限制于此，但具体地，可能是肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、子宫癌、宫颈癌、脑癌、口腔癌、大肠癌、胆道癌、骨癌、皮肤癌等癌症种类单独或复合发病。
本发明的用词“钾离子通道蛋白(potassium channel protein)”是指既存在于细胞膜又能使离子在细胞内外通过的膜蛋白质的一种即离子通道蛋白(ion channelprotein)中使K+离子通过的通道蛋白。离子通道蛋白根据通过离子的种类大概分为Na+通道、Ca2+通道、K+通道，其中钾离子通道蛋白是调节通过细胞膜的离子流而决定膜电位，进而对调节细胞内Ca2+浓度和兴奋性等细胞功能产生较大影响。通过细胞内Ca2+被激活的K+通道有多个种类，血管内皮细胞则包括KCa1.1通道、KCa2.3通道、KCa3.1通道等。
根据本发明，所述钾离子通道蛋白并不限于此，但可以将KCa3.1通道蛋白或KCa2.3通道蛋白单独或组合使用。具体是，所述钾离子通道是如果血管内皮细胞则可能是KCa3.1或者KCa2.3，如果是红血球则可能是KCa3.1，但并不限于此。
本发明的用词“KCa3.1通道(intermediate conductance calcium-activatedpotassium channel(中间电导钙激活钾离子通道),subfamily N,member 4)”是指从KCNN4基因表达且被细胞内钙激活的异源四聚体(heterotetramer)形态的电位-非依赖性钾离子通道蛋白。血管内细胞KCa3.1通道可以诱发超极化，超极化被诱发会增加细胞内Ca2+的流入，促进通过eNOS的NO的生成，从而缓解血管。所述KCa3.1通道可以促进血管内皮细胞增殖，进而诱发血管新生。所述KCa3.1通道的序列信息可从美国国立生物信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information；NCBI)等公知的数据库获得。例如。本发明的KCa3.1通道可能是NCBI GenBank Acession NO.NM_002250、NM_001163510、NP_002241或NP_001156982，但并不限于此。
本发明的用词“KCa2.3通道”也称为SK3(small conductance calcium-activatedpotassium channel 3：小电导钙激活钾通道3)，是指从KCNN3基因表达的钾离子通道蛋白。所述血管内皮细胞KCa2.3通道和KCa3.1通道同样，可以诱发超极化以及促进通过eNOS的NO的生成，使血管得到缓解，促进血管内皮细胞增殖，诱发血管新生。所述KCa2.3通道的序列信息可从美国国立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)等公知的数据库获取。例如，本发明的KCa2.3通道可能是NCBI GenBank AcessionNO.NM_001204087、NM_080466、NP_001191016或者NP_536714，但并不限于此。
本发明的组合物还可以包括钾离子通道调节因子即网格蛋白(clathrin)、小窝蛋白1(caveolin1)、EEA、Rab5C等蛋白质或可检测从编码所述蛋白质的基因表达的mRNA表达水平的制剂。
所述钾离子通道调节因子即网格蛋白、小窝蛋白1、EEA、Rab5C等是癌症患者的血清在血管内皮细胞中被处理时，所述血管内皮细胞中的表达水平减少或者在来自于癌症患者的红血球中表达水平减少，因此将调节因子的表达水平与对照组比较即可诊断癌，因此在诊断癌症用组合物中添加可以检测所述钾离子通道调节因子的蛋白质或mRNA水平的制剂，可以提升诊断癌症的准确性。
本发明用词“小窝蛋白1(caveolin1)”是指可从大部分细胞类中看到的小窝细胞膜(caveolae plasma membrane)的主要构成要素，与Ras-ERK路径中整合素结合的初始步骤及细胞周期进程关联。所述小窝蛋白1序列信息是可从美国国立生物信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information；NCBI)等公知的数据库获取。例如，本发明的小窝蛋白1可能是NCBI GenBank Acession NO.NM_001172897.1、NM_001243064.1、NM_031556.3或者NM_001135818.1，但并不限于此。
本发明的用词“网格蛋白(clathrin)”是包装囊泡的蛋白质的一种，是指由三个重链和三个轻链构成的呈现具有三个枝的三曲枝形态的蛋白质。所述三个枝可以相互作用形成包住囊泡的多面格(polyhedral lattice)。所述网格蛋白序列信息是可从美国国立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)等公知的数据库中获取。例如，本发明的网格蛋白可能是NCBI GenBank Acession NO.NM_001288653.1、NM_001003908.1、NM_019299.1或者XM_001136053.4，但不限于此。
本发明中使用的用词“Rab5C”是GTP水解酶(GTPase)的一种，表示通过调节早期胞内体(early endosomes)和细胞膜(plasma membrane)之间的融合而调节细胞膜运输(membrane traffic)的蛋白质。本发明的Rab5C序列信息是可从美国国立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)等公知的数据库获取。例如，本发明的Rab5C可能是NCBI GenBank Acession NO.CR541901.1、AB232595.1、NM_001105840.2或者NM_001246383.1，但不限于此。
本发明中使用的用词“EEA1(Early Endosome Antigen 1)”位于早期胞内体，在胞内体运输(endosomal trafficking)中起到重要作用。本发明的EEA1序列信息是可从美国国立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)等公知的数据库中获取。例如，本发明的EEA1可能是NCBI GenBank Acession NO.NM_003566.3、NM_001001932.3、NM_001108086.1或者XM_522610.5，但不限于此。
本发明的用词“可检测蛋白质水平的制剂”是可以特异地与目的蛋白质结合，容易检测该水平的制剂，使用所述制剂则容易准确检测目的蛋白质的水平。
根据本发明，所述可检测蛋白质水平的制剂可以解释成其指的是对血管内皮细胞或红血球中表达的KCa3.1通道、KCa2.3通道或其调节因子的蛋白质水平的检测方法上使用的制剂，作为一例，可与蛋白质印迹法(westernblotting)、ELISA(enzyme linkedimmunosorbent assay)、放射免疫分析(RIA:Radioimmunoassay)、放射免疫扩散法(radioimmunodiffusion)、琼脂双向免疫扩散法(Ouchterlony)、单向定量(rocket)免疫电泳、免疫组化、免疫沉淀技术(Immunoprecipitation Assay)、补体结合分析法(ComplementFixation Assay)、FACS和蛋白质芯片分析法(protein chip assay)等方法上使用的目标蛋白质特异结合的抗体或核酸适配体。
本发明的用词“抗体”是指可以特异地与蛋白质或肽分子的抗原性部位结合的蛋白质性分子，这种抗体是将各基因以通常方法克隆到表达载体，获取被所述标志物基因编码的蛋白质，然后通过所获蛋白质按通常方法制成。所述抗体的形态没有特别限制，单克隆抗体或多克隆抗体或具有抗原结合性的则这些一部分也包括在本发明的抗体，并包括所有免疫球蛋白抗体，还可以包括人源化抗体等特殊抗体。而且所述抗体包括具有两个全长轻链和两个全长重链的完全形态，乃至抗体分子的功能片段。抗体分子的功能片段是指至少具有抗原结合功能的片段，如Fab、F(ab')、F(ab')2和Fv等。
根据本发明，所述抗体可以是特异地与KCa3.1通道、KCa2.3通道或其调节因子结合的抗体，作为一例，是特异地与KCa3.1通道或者KCa2.3通道蛋白结合的多克隆抗体、单克隆抗体或其一部分。
本发明的用词“核酸适配体(aptamer)”是指可以特异地与样本内要检测的靶点物质结合的物质，其本身指具有稳定的三维结构的单链核酸(DNA、RNA或变形核酸)，通过所述结合可以特别确认样本内的靶向物质的存在。所述核酸适配体的制造是根据普通核酸适配体的制造方法决定对于靶向蛋白质具有选择性以及高度结合力的寡核苷酸序列并合成以后，为了使寡核苷酸的5’末端或3’末端结合于连接肽作用器，变形成-SH、-COOH、-OH或-NH2而成。
根据本发明，所述核酸适配体可以是特异地与KCa3.1通道、KCa2.3通道或其调节因子结合的核酸适配体，作为一例，可以是特异地与KCa3.1通道、KCa2.3通道或其调节因子结合的DNA核酸适配体。
本发明的用词“检测mRNA水平的制剂”是指为了确认样本中包含的靶点基因表达与否而检测从所述靶向基因转录的mRNA的水平的方法上使用的制剂。没有特别限制，但作为一例，可以是特异地与用于RT-PCR、竞争性RT-PCR(Competitive RT-PCR)、实时RTPCR(Real-time RT-PCR)、RNase保护分析法(RPA；RNase protection assay)、诺瑟杂交(Northern blotting)、DNA芯片分析法等方法的靶向基因结合的探针、引物或反义寡核苷酸。
本发明的用词“引物”是指具有游离3’羟基(free 3'hydroxyl group)的较短的核苷酸序列，其能够与互补模板(template)形成碱基对(base pair)，且作为用于复制模板链的起始点来发挥作用。引物可以在存在适当缓冲溶液和温度下用于聚合反应(就是DNA聚合酶或逆转录酶)的试剂或不同的核苷三磷酸的条件下开始DNA合成。PCR条件、上游和下游引物的长度是可在本领域公知的基础上变形。
根据本发明，所述引物是通过从被怀疑发生癌症的个体的红血球或血清样本被处理的血管内皮细胞中获取的mRNA合成cDN后，使所述cDNA中包括的KCa3.1通道、KCa2.3通道或其调节因子的基因扩增而检测出的手段，可以使用所述引物。此时，所述引物只要可以使所述cDNA中包含的KCa3.1通道、KCa2.3通道或其调节因子的基因扩增的条件下，其多聚核苷酸序列不会受到特别限制。
本发明的用词“探针”是指可与基因或mRNA特别结合的相当于短则几碱基长则几百碱基的RNA或DNA等核酸片段。可以制成寡核苷酸(oligonucleotide)探针、单链DNA(single stranded DNA)探针、双链DNA(double stranded DNA)探针、RNA探针等形态，为了更加容易地检测，可以用各种手段标志。
根据本发明，所述探针是通过从怀疑发生癌症的个体红血球或血清样本已被处理的血管内皮细胞中获取的mRNA合成cDNA后，用来检测所述cDNA中包含的KCa3.1通道、KCa2.3通道或其调节因子的基因。此时，所述探针只要可以使所述cDNA中包含的KCa3.1通道、KCa2.3通道或其调节因子的基因扩增，则其多聚核苷酸序列不会受到特别限制。
本发明的用词“反义寡核苷酸”是指特定mRNA序列中包含互补的核酸序列的DNA或RNA或者这些衍生物。所述反义寡核苷酸是与mRNA内的互补序列结合，阻碍mRNA向蛋白质的翻译。反义寡核苷酸序列是指与所述基因的mRNA互补并可与所述mRNA结合的DNA或RNA序列，可以阻碍所述基因mRNA的翻译、向细胞质内的转移(translocation)、成熟maturation)或对其它一切总体生物学功能的必需活性。
反义寡核苷酸的长度是6至100碱基，具体是8至60碱基，进一步具体是10至40碱基。所述反义寡核苷酸是用通常方法在试验管内合成后投入到生物体内，或者可以使反义寡核苷酸在生物体内合成。在试验管内合成反义寡核苷酸的一个例子是利用RNA聚合酶1。在生物体内使反义RNA合成的一个例子是，使用在多克隆重位点(MCS)的起源相反方向的载体，使反义RNA被转录。所述反义RNA是使序列内存在暂停翻译密码子，阻止被翻译成肽序列。
本发明的用词“诊断”是指确认病理状态的存在或特征的过程。根据本发明，所述诊断包括治疗癌后对复发可能性的诊断、对癌转移可能性的诊断、治疗癌症后预后诊断等。
本发明的另一个实施例是提供一种包括所述组合物的诊断癌症用试剂盒。
本发明的试剂盒可以用来检测怀疑发生癌症的个体红血球或血清被处理的血管内皮细胞中表达的KCa3.1通道或KCa2.3通道基因的蛋白质水平或者mRNA，进行诊断是否发生癌症，且不限于此，但可以包括用来检测由所述基因表达的蛋白质水平或mRNA水平的引物、探针或抗体，乃至适用于分析方法的种类或其以上的其它组成成分组合物、溶液或装置。此时可以使用的试剂盒是RT-PCR(Reverse transcription polymerase chainreaction)试剂盒、DNA芯片试剂盒、ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)试剂盒、蛋白质芯片试剂盒、快速(rapid)试剂盒、MRM(Multiple reaction monitoring)试剂盒等。
作为一具体实施例，本发明的用来检测KCa3.1通道或KCa2.3通道基因的mRNA表达水平的试剂盒可以是包括用来执行RT-PCR而所需的必需要素的试剂盒。RT-PCR试剂盒是除了对所述基因具有特异性的各个引物对之外，包括试管或其它适当的容器、反应缓冲液(pH和镁浓度不同)、脱氧核苷酸(dNTPs)、Taq-聚合酶和逆转录酶等酶、DNase、RNAse抑制剂、DEPC-水(DEPC-water)、无菌水等。还可以包括对用作定量对照组的基因特异的引物对。
另一例是，本发明的试剂盒可以包括执行DNA芯片分析法所需的必需要素。用于DNA芯片分析的试剂盒可以包括与基因或者其片段对应的cDNA被粘贴成探针的基板；用来制作荧光探针的试剂、制剂、酶等。基板可以包括与定量参照组基因或其片段相应的cDNA。
另一例是，本发明的试剂盒可以是用来检测由KCa3.1通道或KCa2.3通道基因表达的蛋白质水平的蛋白质芯片分析用试剂盒，所述试剂盒并不限于此，但为了对抗体的免疫学检测，可以包括器材、适当的缓冲溶液、发色酶或用荧光物质标志的二次抗体、发色底物等。此时所述底物并不特别限制于此，但可以使用由硝酸纤维素膜和聚乙烯树脂合成的96孔板、由聚苯乙烯树脂合成的96孔板以及用玻璃形成的玻璃载片等，所述发色酶没有特别限制，但可以使用过氧化物酶(peroxidase)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)。所述荧光物质没有特别限制于此，但可以是FITC(Fluorescein isothiocyanate：异硫氰酸荧光素)、RITC(Rhodamine B-isothiocyanate)等，发色底物液不是特别限制于此，但可以是ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid))、OPD(o-phenylenediamine)、TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)等。
作为本发明的又另一实施例，提供一种采用由被怀疑患癌的个体分离的生物学样本提供用来诊断癌的信息的方法。
具体是，本发明提供的用于诊断癌的信息的提供方法是包括：(a)从由被怀疑患癌的个体分离的生物学样本中检测钾离子通道蛋白或者由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA表达水平的步骤；(b)将在所述(a)步骤检测的蛋白质或mRNA的表达水平与正常对照组样本中检测的表达水平进行比较的步骤。
根据所述方法，在所述(a)步骤检测的表达水平高于在正常对照组样本中检测的表达水平时，可以判断获取所述生物学样本的个体发生癌症的可能性大或者已发生癌症。
此时，所述生物学样本是，只要可以检测钾离子通道蛋白或由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平，并不是特别限制于此，但作为一例，可以使用血液样本，另一例是，可以使用包含红血球的样本。检测所述钾离子通道蛋白、所述蛋白质或由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平的方法等是与上述的同样。
本发明的用词“个体”可以无限制地包括将发生癌症的人乃至小鼠、家畜等包括的哺乳动物、养殖鱼类等。
所述方法还可以包括：(c)在所述生物学样本中检测网格蛋白、小窝蛋白1、EEA或者Rab5C的蛋白质或由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平的步骤；(d)将在所述(c)步骤检测的蛋白质或mRNA的表达水平与在正常对照组样本中检测的表达水平进行比较的步骤。此时在所述(c)步骤检测的表达水平低于在正常对照组样本中检测的表达水平时，可以判断获取所述生物学样本的个体已发生癌症。
所述方法还可以包括：(c)在所述生物学样本中检测网格蛋白、小窝蛋白1、EEA或者Rab5C的蛋白质或由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平的步骤；(d’)将在所述(a)步骤检测的表达水平的检测值用在所述(c)步骤检测的表达水平的检测值除以而算出所述各检测值的比率，将此与在正常对照组样本中算出的检测值的比率进行比较的步骤。此时在所述(d’)步骤算出的检测值的比率高于在正常对照组样本中算出的检测值的比率时，可以判断获取所述生物学样本的个体发生癌症的可能性大或者已发生癌症。
根据本发明的一实施例，肝癌患者的红血球中KCa3.1通道的表达水平增加(图2a)，肝硬化患者的红血球中KCa3.1通道的表达水平增加(图2b)，将在肝癌患者和肝硬化患者的红血球中检测的钾离子通道调节因子即网格蛋白的表达水平进行比较的结果，网格蛋白的表达水平均减少(图2c)，胰腺癌患者的红血球中KCa3.1通道的表达水平增加，相反网格蛋白的表达水平是减少(图2)，在肝癌患者、肝硬化患者或者胰腺癌患者的红血球中检测的KCa3.1通道的表达水平和调节因子(网格蛋白或小窝蛋白1)的表达水平比率是均显示明显高于在对照组中检测的比率(约1)(图5a和图5b)。
本发明的又另一实施例是，提供采用从怀疑发生癌症的个体分离的样本被处理的血管内皮细胞提供可以诊断癌症的信息的方法。
具体是，本发明提供的可以诊断癌症的信息的提供方法包括：(a)将由怀疑发生癌症的个体分离的样本在血管内皮细胞中处理的步骤；(b)在所述(a)步骤中处理的血管内皮细胞中检测钾离子通道蛋白或由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平的步骤；以及(c)将所述检测的蛋白质或mRNA的表达水平与在正常对照组样本中检测的表达水平进行比较的步骤。
根据所述方法，在所述(b)步骤中检测的表达水平高于在正常对照组样本中检测的表达水平时，可以判断获取所述生物学样本的个体发生癌症的可能性高或者已发生癌症。
此时所述生物学样本是只要可以检测钾离子通道蛋白或者由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平，不会特别限制于此，但具体地，可以使用血液样本，进一步具体地，可以使用包括血液、血清、血浆等的样本。检测所述钾离子通道蛋白、所述蛋白质或由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平的方法、个体等是和上述的同样。
所述方法还可以包括：(d)在所述(a)步骤中处理的血管内皮细胞中检测网格蛋白、小窝蛋白1、EEA或Rab5C的蛋白质或者由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平的步骤；以及(e)将在所述(d)步骤检测的蛋白质或者mRNA的表达水平与在正常对照组样本中检测的表达水平进行比较的步骤。此时在所述(d)步骤中检测的表达水平比在正常对照组样本中检测的表达水平低时，可以判断获取所述样本的个体已发生癌症。
所述方法还可以包括：(d)在所述(a)步骤中处理的血管内皮细胞中检测网格蛋白、小窝蛋白1、EEA或Rab5C的蛋白质或者由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平的步骤；以及(e’)将在所述(b)步骤中检测的表达水平的检测值用所述(d)步骤中检测的表达水平的检测值除以而算出所述各检测值的比率，将此与在正常对照组中算出的检测值的比率进行比较的步骤。此时在所述(e’)步骤中算出的检测值的比率高于在正常对照组中算出的检测值的比率时，可以判断获取所述样本的个体发生癌症的可能性大或者已发生癌症。
根据本发明的一实施例，已确认肝癌患者的血清已被处理的血管内皮细胞中KCa3.1通道和KCa2.3通道的表达水平增加(图1)，小窝蛋白-1和EEA的表达水平减少(图4)。
另外，确认肝癌患者的红血球中KCa3.1通道的表达水平增加，高于正常人的红血球(图2a)，肝癌患者和肝硬化患者的红血球中网格蛋白的表达水平减少(图2b)，胰腺癌患者的红血球中KCa3.1通道的表达水平增加，高于正常人的红血球(图3)。
不仅如此，在肝癌模型小鼠的肝组织中也确认KCa3.1通道和KCa2.3通道的表达水平增加(图6)。
因此利用怀疑是否发生癌症的患者的血液样本被处理的血管内皮细胞或者在患者的红血球中检测的钾离子通道或者其调节因子的蛋白质的表达水平或者所述各表达水平的比率，就可以诊断所述患者是否发生癌症，而且在发生癌症之前可以早期诊断发生癌症的可能性。
有益效果
本发明的有益效果在于，使用本发明提供的诊断癌症用组合物或试剂盒，则可以检测个体的样本被处理的血管内皮细胞或从个体分离的红血球中钾离子通道即KCa3.1通道、KCa2.3通道或其调节因子的表达水平，不管癌症种类，皆可诊断是否发病，因此可以广泛应用于各种癌症的发展水平(生长、转移、预后和复发)的判断。
附图说明
图1是显示将肝癌患者的血液样本(血清)在血管内皮细胞中处理，将在所述血管内皮细胞中检测的钾离子通道即KCa3.1通道和KCa2.3通道的表达水平进行比较的结果的蛋白免疫印迹实验分析图片，以及显示将所述钾离子通道的表达水平定量分析的结果的图表；
图2a是显示将在肝癌患者的红血球中检测的钾离子通道即KCa3.1通道的表达水平进行比较的结果的蛋白免疫印迹实验分析图片，以及显示将所述钾离子通道的表达水平定量分析的结果的图表；
图2b是显示将在肝硬化患者的红血球中检测的钾离子通道即KCa3.1通道的表达水平进行比较的结果的蛋白免疫印迹实验分析图片，以及显示将所述钾离子通道的表达水平定量分析的结果的图表；
图2c是显示将在肝癌患者和肝硬化患者的红血球中检测的钾离子通道调节因子即网格蛋白的表达水平进行比较的结果的蛋白免疫印迹实验分析图片，以及显示将所述网格蛋白的表达水平定量分析的结果的图表；
图3是显示将在胰腺癌患者的红血球中检测的KCa3.1通道及其调节因子即网格蛋白的表达水平进行比较的结果的蛋白免疫印迹实验分析图片，以及将所述KCa3.1通道和网格蛋白的表达水平定量分析的结果的图表；
图4是显示将肝癌患者的血液样本(血清)稀释后在血管内皮细胞中处理，将在所述血管内皮细胞中检测的钾离子通道即KCa3.1通道和KCa2.3通道、小窝蛋白1、EEA1的表达水平进行比较的结果的蛋白免疫印迹实验分析图片；
图5a是显示将在肝癌患者和肝硬化患者的红血球中检测的KCa3.1通道和网格蛋白的表达水平比率进行比较的结果的图表；
图5b是显示将在胰腺癌患者的红血球中检测的KCa3.1通道以及网格蛋白的表达水平比率进行比较的结果的图表；
图6是显示将编码神经酰胺合成酶2(ceramide synthase 2)的基因缺失而诱发肝癌的肝癌模型小鼠(CerS2)的肝组织中表达的KCa3.1通道或者KCa2.3通道的表达水平进行比较的结果的蛋白免疫印迹实验分析图片，以及显示将KCa3.1通道的表达水平定量分析的结果的图表。
最佳实施方式
下面结合实施例详述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明，并不是限定本发明的范围。
实施例1：肝癌患者的血液样本对血管内皮细胞的钾离子通道产生的效果
通过肝癌患者的血液样本处理确认血管内皮细胞中KCa3.1通道和KCa2.3通道的表达水平是否发生变化。
就是说，从肝癌患者身上获取的血清获取血清样本，将所述血清样本在人血管内皮细胞株中处理以后培养24小时，培养结束后，通过蛋白免疫印迹实验分析检测在所述血管内皮细胞中表达的钾离子通道即KCa3.1通道和KCa2.3通道的表达水平后进行了比较(图1)。此时对照组使用将正常人的血清样本处理的血管内皮细胞株，利用RQVRLKHRKLREQV(序列号1)的氨基酸序列的抗体检测KCa3.1通道蛋白质的表达水平，KCa2.3通道蛋白的表达水平是与KCa2.3通道蛋白特别结合，利用包括LHSSPTAFRAPPSSNSTAILHPSSRQGSQLNLNDHLLGHSPSSTA(序列号2)的氨基酸序列的抗体进行检测，将GAPDH作为内部对照组使用。
如图1所示，与将正常人的血清样本处理的血管内皮细胞不同，确认将肝癌患者的血清样本处理的血管内皮细胞中KCa3.1通道和KCa2.3通道的表达水平增加。
实施例2：肝癌和肝硬化患者的红血球中表达的钾离子通道及其调节因子的表达水平分析
根据所述实施例1的结果确认了将肝癌患者的血清样本处理的血管内皮细胞中KCa3.1通道和KCa2.3通道的表达水平增加，因此以所述肝癌患者的红血球为对象分析了钾离子通道及其调节因子的表达水平。
实施例2-1：肝癌和肝硬化患者的红血球中表达的钾离子通道的发表达水平分析
通过蛋白免疫印迹实验分析确认肝癌患者的红血球中KCa3.1通道蛋白的表达水平是否增加(图2a)。此时将正常人的红血球作为对照组使用，将GAPDH作为内部对照组使用。
如图2a中所示，肝癌患者的红血球中KCa3.1通道表达水平高于正常人的红血球。
而且通过蛋白免疫印迹实验分析确认了在肝硬化患者而非肝癌患者的红血球中所述KCa3.1通道蛋白的表达水平是否增加(图2b)。此时使用正常人的红血球作为对照组，使用GAPDH作为内部对照组。
如图2b所示，在肝硬化患者的红血球中也确认KCa3.1通道的表达水平高于正常人的红血球。
实施例2-2：肝癌和肝硬化患者的红血球中表达的钾离子通道调节因子的表达水平分析
利用具有PQLMLTAGPSVAVPPQAPFGYGYTAPPYGQPQPGFGYS(序列号3)的氨基酸序列的抗体，通过蛋白免疫印迹实验分析对所述实施例2-1中使用的从肝癌患者和肝硬化患者的血液样本中获取的红血球中作为KCa3.1通道和KCa2.3通道调节因子的网格蛋白的表达水平进行检测和比较(图2c)。此时使用正常人的红血球作为对照组，使用GAPDH作为内部对照组。
如图2c所示，KCa3.1通道的表达水平增加的肝癌患者和肝硬化患者的红血球中确认了钾离子通道调节因子即网格蛋白的表达水平减少。
实施例3：胰腺癌患者的红血球中表达的钾离子通道及其调节因子的表达水平分析
从所述实施例2的结果中确认肝癌患者的红血球中KCa3.1通道蛋白的表达水平增加，其调节因子即网格蛋白的表达水平减少，并欲确认从其它癌症即胰腺癌患者中是否可以获得同样的结果。
为此，从向胰腺癌患者获得的血液中获取红血球，通过蛋白免疫印迹实验分析对所述红血球中表达的KCa3.1通道和网格蛋白的表达水平进行检测和比较(图2)。此时使用正常人的红血球作为对照组，使用GAPDH作为内部对照组。
如图3所示，在胰腺癌患者的红血球中KCa3.1通道的表达水平增加，与肝癌患者的红血球同样，同时确认网格蛋白的表达水平减少。
实施例4：肝癌患者血液样本的稀释程度对血管内皮细胞钾离子通道产生的影响
从肝癌患者的血液中获取血清样本，将所述血清样本稀释成培养液后在血管内皮细胞株内处理，然后培养，培养结束后，通过蛋白免疫印迹实验分析对于在所述血管内皮细胞中表达的钾离子通道即KCa3.1、KCa2.3通道和作为所述钾离子通道调节因子的小窝蛋白1和EEA1的表达水平进行检测和比较。小窝蛋白1和EEA1的表达水平是分别利用具有MADELSEKQVYDAHTKEID(序列号4)和FCAECSAKNALTPSSKKPVR(序列号5)的氨基酸序列的抗体，通过蛋白印迹分析进行检测，使用GAPDH作为内部对照组。
如图4所示，确认将肝癌患者的血清处理的血管内皮细胞中KCa3.1通道和KCa2.3通道的表达水平增加，同时小窝蛋白-1和EEA1的表达水平减少。
实施例5：血液样本被处理的血管内皮细胞中钾离子通道和钾离子通道调节因子的表达水平比率分析
所述实施例1至4中使用的肝癌患者、肝硬化患者及胰腺癌患者的血液样本(红血球或血清样本)在血管内皮细胞株内处理并培养后，检测所述血管内皮细胞中表达的钾离子通道即KCa3.1通道和所述钾离子通道的调节因子即网格蛋白的表达水平，将检测的值应用到下式中计算出通道蛋白的表达水平检测值和调节因子的表达水平检测值的比率，将算出的比率与正常对照组中算出的检测值的比率进行比较(图5a和图5b)。此时正常对照组是使用了对正常人的血液样本进行处理的血管内皮细胞株。
检测值比率＝KCa3.1通道表达水平检测值/钾离子通道调节因子表达水平检测值
如图5a和5b所示，观察到从正常对照组中算出的检测值的比率约显示为1.0，相反从各血液样本(红血球或血清样本)被处理的血管内皮细胞株中算出的检测值的比率达2.0以上。
如此将钾离子通道或钾离子通道调节因子的表达水平单独检测比较时，如果对癌症患者和正常人检测的值相似，则诊断结果会出现错误，相反将钾离子通道和钾离子通道调节因子的表达水平一起检测，算出该比率时，检测值仍然相似，则对癌症患者和正常人算出的各检测值的比率有明显区别，从而显著减少诊断结果上发生错误的可能性。
因此分析出所述钾离子通道和钾离子通道调节因子的表达水平的比率可以有效应用于癌症的诊断和预后评估。
实施例6：肝癌模型小鼠的肝细胞中钾离子通道的表达水平分析
如所述实施例所示，肝癌患者或胰腺癌患者的红血球中观察到KCa3.1通道或KCa2.3通道的表达水平增加，在肝癌模型鼠的肝组织中检测了所述钾离子通道的表达水平。
具体是，获取将神经酰胺合成酶2(ceramide synthase 2)编码的基因缺失而诱发肝癌的肝癌模型小鼠(CerS2)的肝组织，通过蛋白免疫印迹实验分析检测所述获取的肝组织中表达的KCa3.1通道或KCa2.3通道的表达水平，并定量分析(图6)。并使用正常小鼠的肝组织作为对照组，使用α微管蛋白作为内部对照组。
如图6所示，肝癌模型小鼠的肝组织中观察到KCa3.1通道和KCa2.3通道的表达水平增加。
将所述实施例的结果综合起来就可以得知，使用癌症患者的血液样本被处理的血管内皮细胞或癌症患者的红血球中钾离子通道蛋白的表达水平、所述通道蛋白调节因子的表达水平或使用所述各表达水平的比率可以对癌症患者和正常人进行区别。
而且虽然肝癌没有发生但从发生肝癌的可能性较高的肝硬化患者身上也可以获得相似结果。
从以上说明可以得知，利用从怀疑是否发生癌症的患者的血液样本被处理的血管内皮细胞或患者的红血球中检测的钾离子通道或其调节因子的蛋白表达水平或所述各表达水平的比率，诊断所述患者是否发生癌症，还可以在发生癌症之前早期诊断发生癌症的可能性。
对于本发明的技术领域普通技术人员可以充分识别和类推的内容，在本说明书中予以省略，除了本说明书中的具体实施例，在不改变本发明的技术方案或必需结构的范围内还可以进行各种变形。显然，本领域的普通技术人员也可以用与本说明书中说明的示例不同的方式实施。
<Sequence Listing>
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<120> Composition for diagnosing cancer using potassium channelproteins
<130> APP20180011US
<140> US 16/307,972
<141> 2018-12-07
<150> KR 10-2016-0076767
<151> 2016-06-20
<150> PCT/KR2017/006072
<151> 2017-06-12
<160> 5
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial antibody
<400> 1
Arg Gln Val Arg Leu Lys His Arg Lys Leu Arg Glu Gln Val
1 5 10
<210> 2
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial antibody
<400> 2
Leu His Ser Ser Pro Thr Ala Phe Arg Ala Pro Pro Ser Ser Asn Ser
1 5 10 15
Thr Ala Ile Leu His Pro Ser Ser Arg Gln Gly Ser Gln Leu Asn Leu
20 25 30
Asn Asp His Leu Leu Gly His Ser Pro Ser Ser Thr Ala
35 40 45
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial antibody
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1 5 10 15
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20 25 30
Pro Gly Phe Gly Tyr Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> artificial antibody
<400> 5
Phe Cys Ala Glu Cys Ser Ala Lys Asn Ala Leu Thr Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Lys Pro Val Arg
20

Claims (18)

1.一种诊断癌症用组合物，其特征在于，
包括：制剂，其可以检测钾离子通道蛋白或者由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA表达水平。
2.根据权利要求1所述的诊断癌症用组合物，其特征在于，
所述钾离子通道蛋白是Kca2.3通道蛋白、KCa3.1通道蛋白或者这些组合。
3.根据权利要求1所述的诊断癌症用组合物，其特征在于，
能够检测所述蛋白质水平的制剂是可特异地与所述蛋白质结合的抗体或者核酸适配体。
4.根据权利要求1所述的诊断癌症用组合物，其特征在于，
能够检测所述mRNA水平的制剂是可以特异地与所述基因结合的引物、探针或反义寡核苷酸。
5.根据权利要求1所述的诊断癌症用组合物，其特征在于，
所述诊断癌症用组合物还包括：制剂，其能够检测由网格蛋白、小窝蛋白1、EEA和Rab5C组成的组中选择的一个以上的蛋白质或编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平。
6.根据权利要求1所述的诊断癌症用组合物，其特征在于，
所述癌是从肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、子宫癌、宫颈癌、脑癌、口腔癌、大肠癌、胆道癌、骨癌、皮肤癌及由这些组合组成的组中选择的癌。
7.根据权利要求1所述的诊断癌症用组合物，其特征在于，
所述诊断是对治疗癌症后复发可能性的诊断、对癌症转移可能性的诊断或者治疗癌症后预后诊断。
8.一种诊断癌症用试剂盒，其特征在于，
包括权利要求1至权利要求7中的某一项组合物。
9.根据权利要求8所述的诊断癌症用试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒是RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction：反转录聚合酶链反应)试剂盒、DNA芯片试剂盒、ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay：酶联免疫吸附试验)试剂盒、蛋白质芯片试剂盒、快速(rapid)试剂盒或MRM(Multiplereaction monitoring：多反应监测)。
10.一种诊断癌症用信息的提供方法，其特征在于，
包括：在从怀疑发生癌症的个体分离的生物学样本中检测钾离子通道蛋白或者由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA表达水平的步骤；以及(b)将在所述(a)步骤中检测的蛋白质或者mRNA表达水平与在正常对照组样本中检测的表达水平进行比较的步骤。
11.根据权利要求10所述的诊断癌症用信息的提供方法，其特征在于，
所述钾离子通道是KCa3.1通道、KCa2.3通道或者其组合。
12.根据权利要求10所述的诊断癌症用信息的提供方法，其特征在于，
所述方法还包括：(c)在所述生物学样本中检测由网格蛋白、小窝蛋白1、EEA或者Rab5C的蛋白质组成的组中选择的一个以上的蛋白质或由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平的步骤；(d)将在所述(c)步骤检测的蛋白质或mRNA的表达水平与在正常对照组样本中检测的表达水平进行比较的步骤。
13.根据权利要求10所述的诊断癌症用信息的提供方法，其特征在于，
所述方法还包括：(c)在所述生物学样本中检测由网格蛋白、小窝蛋白1、EEA或者Rab5C组成的组中选择的一个以上的蛋白质或由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平的步骤；(d’)将在所述(a)步骤检测的表达水平的检测值用在所述(c)步骤检测的表达水平的检测值除以而算出所述各检测值的比率，将此与在正常对照组样本中算出的检测值的比率进行比较的步骤。
14.根据权利要求10所述的诊断癌症用信息的提供方法，其特征在于，
所述生物学样本是包括红血球的样本。
15.一种诊断癌症用信息的提供方法，其特征在于，
包括：(a)将由怀疑发生癌症的个体分离的样本在血管内皮细胞中处理的步骤；(b)在所述(a)步骤中处理的血管内皮细胞中检测钾离子通道蛋白或由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平的步骤；以及(c)将所述检测的蛋白质或mRNA的表达水平与在正常对照组样本中检测的表达水平进行比较的步骤。
16.根据权利要求15所述的诊断癌症用信息的提供方法，其特征在于，
所述钾离子通道是KCa3.1通道、KCa2.3通道或其组合。
17.根据权利要求15所述的诊断癌症用信息的提供方法，其特征在于，
所述方法还包括：(d)在所述(a)步骤中处理的血管内皮细胞中检测由网格蛋白、小窝蛋白1、EEA或Rab5C组成的组中选择的一个以蛋白质或者由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平的步骤；(e)将在所述(d)步骤检测的蛋白质或者mRNA的表达水平与在正常对照组样本中检测的表达水平进行比较的步骤。
18.根据权利要求15所述的诊断癌症用信息的提供方法，其特征在于，
所述方法还包括：(d)在所述(a)步骤中处理的血管内皮细胞中检测由网格蛋白、小窝蛋白1、EEA或Rab5C组成的组中选择的一个以上蛋白质或者由编码所述蛋白质的基因表达的mRNA的表达水平的步骤；(e’)将在所述(b)步骤中检测的表达水平的检测值用所述(d)步骤中检测的表达水平的检测值除以而算出所述各检测值的比率，将此与在正常对照组中算出的检测值的比率进行比较的步骤。
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