CN102272152A

CN102272152A - 通过中电导钙激活钾通道调控细胞-细胞融合的组合物及方法

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Publication number: CN102272152A
Application number: CN2009801541312A
Authority: CN
Inventors: 李军; 阿格尼斯.维格纳里
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH; Yale University
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH; Yale University
Priority date: 2008-11-10
Filing date: 2009-11-10
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2029-11-10
Also published as: CN102272152B; WO2010053584A3; IL212543A0; KR20110096541A; AU2009311585A1; EP2358750A2; EP2358750B1; US20110300152A1; JP5783903B2; WO2010053584A2; MX2011004946A; CA2742610A1; JP2012508010A; US9428568B2

Abstract

本发明提供通过利用调节中电导钙激活钾(SK4)通道表达、活性或功能的试剂用于调控细胞-细胞融合的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明所述的组合物和方法抑制多核破骨细胞形成和细胞-细胞融合，尤其是涉及巨噬细胞的细胞融合。在此类实施方案中，所述组合物可包括SK4通道的抑制性核酸、单克隆抗体或者小分子抑制剂，可用于预防和/或治疗多种疾病或障碍，包括骨丢失、自身免疫和炎性疾病或障碍、植入物和移植排斥，以及癌症转移。在其他实施方案中，本发明所述的组合物和方法激活细胞-细胞融合。本发明还提供筛选SK4通道调节剂(抑制剂或激活剂)的方法，所述SK4通道调节剂调控细胞-细胞融合(特别是巨噬细胞的细胞融合)。

Description

通过中电导钙激活钾通道调控细胞-细胞融合的组合物及方法

技术领域

本发明总的涉及调控细胞-细胞融合(也称为细胞内摄作用(cellocytosis))的组合物和方法，更具体地涉及调控巨噬细胞同型和异型细胞-细胞融合的组合物和方法。本发明因此提供组合物和方法，其用于调控细胞融合，以及与多种疾病或障碍相关的破骨细胞分化和功能。

背景技术

细胞融合是重要的生物学事件，对于多种发育和稳态过程是必要的。尽管众所周知在细胞器转运(organelle trafficking)期间胞内膜融合，但对于介导精子-卵母细胞、成肌细胞-成肌细胞的细胞-细胞融合，以及巨噬细胞-巨噬细胞融合还知之甚少。参见Vignery(2000)Int.J.Exp.Pathol.81：291-304。

就巨噬细胞而言，这些细胞在组织中可与其自身融合(即同型融合)从而形成巨细胞，巨细胞与慢性炎性疾病有关。参见MacLauchlan等，(2009)J.Leukoc.Biol.85：617-626；和上述Vignery(2000)。另外，巨噬细胞在骨中可与其自身融合从而形成破骨细胞，破骨细胞介导骨质吸收。最近，人们认为巨噬细胞可与体细胞或癌细胞融合(即异型融合)。参见Vignery(2005)TrendsCell Biol.15：188-193。

遗憾的是，巨噬细胞通过何种机制与其自身及其他细胞融合在很大程度上仍然是未知的。参见上述MacLauchlan等，(2009)；和上述Vignery(2005)。当这些细胞以不适当或未经调控的方式融合时，了解该过程可能有助于调节巨噬细胞功能，还可能限制由炎性和感染性疾病引起的损伤。基于上述原因，需要抑制巨噬细胞融合的组合物和方法。

破骨细胞通过单核细胞-巨噬细胞细胞系的细胞融合而形成。破骨细胞是一类大细胞，特征在于多细胞核以及高浓度小泡(vesicle)和液泡(vacuole)。破骨细胞在骨质吸收活跃的部位形成特殊的细胞膜，促进移除骨基质(bonymatrix)。该机制引起骨质疏松症(osteoporosis)或骨质减少(osteopenia)(骨矿物质密度低于正常水平，但并没有足够低至界定成骨质疏松)。由于破骨细胞增加骨质吸收，类类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis)通常合并全身骨质减少。因此，存在对组合物和方法的需要，其用于调控，特别是抑制，破骨细胞分化和功能。

发明概述

本发明总的涉及调控细胞-细胞融合的组合物和方法，通过利用调控中电导(intermediate-conductance)钙激活钾通道(calcium-activated potassiumchannel)(SK4通道或IK通道或KCNN4通道或KCa3.1通道或IKCa1通道)表达、活性或功能的试剂。本发明的组合物包括有效量的SK4通道调节剂(抑制剂或激活剂)，单独或与其他治疗剂组合。在一个实施方案中，本发明的方法包括向具有融合可能性的细胞或正活跃融合的细胞提供有效量的SK4通道抑制剂。任选地，所述方法包括随SK4通道抑制剂一起联合提供治疗剂。还包括鉴定能够抑制细胞-细胞融合的SK4通道抑制剂的方法。

在另一个实施方案中，本发明涉及激活细胞-细胞融合。因此，方法包括向具有融合可能性的细胞或正活跃融合的细胞提供有效量的SK4通道激活剂。还包括鉴定能够促进细胞-细胞融合的SK4通道激活剂的方法。

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法提供巨噬细胞融合的调控。在其他实施方案中，所述组合物和方法提供破骨细胞分化和功能的调控，包括其抑制作用。

本发明的组合物和方法用于预防或治疗由源自巨噬细胞的多核细胞介导的疾病或障碍，包括与破骨细胞、巨细胞或转移癌细胞有关的疾病。

本发明包括以下实施方案。

1.一种调控表达中电导钙激活钾(SK4)通道的细胞的细胞融合的方法，所述方法包括使细胞与有效量的SK4通道抑制剂或激活剂接触的步骤，其中细胞融合受到调控。

2.实施方案1的方法，其中细胞融合受到抑制。

3.实施方案1的方法，其中所述细胞为造血细胞。

4.实施方案1的方法，其中所述细胞选自：巨噬细胞、树突细胞和B细胞。

5.实施方案1的方法，其中所述细胞为巨噬细胞。

6.实施方案1的方法，其中所述细胞融合为同型或异型。

7.实施方案1的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

8.实施方案7的方法，其中所述抑制性核酸靶向包含SEQ ID NO：2所示序列的SK4通道的表达。

9.实施方案7的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区(poreregion)或小分子结合区。

10.实施方案7的方法，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

11.实施方案7的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

12.实施方案7的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

13.实施方案7的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

14.实施方案7的方法，进一步包括测定细胞中SK4通道表达或活性的步骤。

15.实施方案1的方法，其中所述方法为体内方法，其中所述的SK4通道抑制剂的有效量为向已有或者怀疑有异常细胞融合的受试者提供的治疗有效量。

16.实施方案15的方法，进一步包括向受试者联合提供治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂(anti-bone-loss agent)、免疫抑制剂，或者化疗剂。

17.一种调控破骨细胞分化和功能的方法，所述方法包括使破骨细胞或破骨细胞前体与有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂或激活剂接触的步骤。

18.实施方案17的方法，其中破骨细胞形成受到抑制。

19.实施方案17的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

20.实施方案19的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。

21.实施方案19的方法，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

22.实施方案19的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

23.实施方案19的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

24.实施方案19的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

25.实施方案17的方法，其中所述方法为体内方法，其中所述的SK4通道抑制剂的有效量为向已有或者怀疑有异常破骨细胞分化或功能的受试者提供的治疗有效量。

26.实施方案25的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。

27.一种预防或治疗易患或已患骨丢失的受试者中骨丢失的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂从而抑制破骨细胞形成的步骤，其中受试者中骨丢失得到预防或减少。

28.实施方案27的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

29.实施方案28的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。

30.实施方案28的方法，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

31.实施方案28的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

32.实施方案28的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

33.实施方案28的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

34.实施方案27的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。

35.一种预防或治疗易患或已患炎性疾病或自身免疫疾病的受试者中特征在于巨细胞形成的炎性疾病或自身免疫疾病的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂以抑制巨细胞形成的步骤，其中受试者中所述炎性疾病或自身免疫疾病得到预防或治疗。

36.实施方案35的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

37.实施方案36的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。

38.实施方案36的方法，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

39.实施方案36的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

40.实施方案36的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

41.实施方案36的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

42.实施方案35的方法，进一步包括向受试者联合给药(co-administering)治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。

43.一种预防在有植入物或移植物位于其体内部位的受试者中，植入物或移植物排斥的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾通道抑制剂以抑制巨细胞在该部位或该部位附近形成的步骤，其中受试者中植入物或移植物的排斥得到预防。

44.实施方案43的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

45.实施方案44的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。

46.实施方案44的方法，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

47.实施方案44的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

48.实施方案44的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

49.实施方案44的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

50.实施方案43的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂或免疫抑制剂。

51.实施方案43的方法，其中所述移植物为细胞、器官或组织移植物。

52.一种预防患癌症的受试者中癌症转移的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂从而抑制转移癌细胞形成的步骤，其中受试者中癌症转移得到预防。

53.实施方案52的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

54.实施方案53的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。

55.实施方案53的方法，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

56.实施方案53的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

57.实施方案53的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

58.实施方案53的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

59.实施方案52的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。

60.一种鉴定抑制细胞-细胞融合的中电导钙激活钾(SK4)通道的抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤：

使细胞群与候选SK4通道抑制剂接触；和

确定是否候选试剂抑制细胞群内的细胞-细胞融合。

61.实施方案60的方法，其中所述细胞群包括巨噬细胞，所述SK4通道抑制剂抑制巨噬细胞的细胞-细胞融合。

62.实施方案60的方法，其中所述细胞群包括至少两种细胞类型，其中一种为巨噬细胞。

63.组合物，包括：

有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂；和

治疗剂，其中所述治疗剂选自：抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂和化疗剂。

64.实施方案63的组合物，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

65.实施方案64的组合物，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。

66.实施方案64的组合物，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

67.实施方案64的组合物，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

68.实施方案64的组合物，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

69.实施方案64的组合物，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

70.实施方案63的组合物，进一步包括药学可接受载体。

71.一种鉴定激活细胞-细胞融合的中电导钙激活钾(SK4)通道的激活剂的方法，所述方法包括以下步骤：

使细胞群与候选SK4通道激活剂接触；和

确定候选试剂是否激活该细胞群内的细胞-细胞融合。

72.实施方案71的方法，其中所述细胞群包括巨噬细胞，所述SK4通道激活剂激活巨噬细胞的细胞-细胞融合。

73.实施方案71的方法，其中所述细胞群包括至少两种细胞类型，其中一种为巨噬细胞。

附图说明

参考本发明下文的详细描述，本发明将得到更好理解，而且除了上文所述的那些之外的特征、方面和优势将更加显而易见。所述详细描述参考以下附图，其中：

图1A显示新近接种到平板的大鼠肺泡巨噬细胞的照片；图1B显示在成融条件(fusogenic condition)下培养5天后，从融合的大鼠肺泡巨噬细胞形成的多核细胞的照片。

图2显示，在成融条件下，24小时大鼠肺泡巨噬细胞中SK4通道mRNA表达上调，其持续至第5天(x轴代表在0小时、1小时、24小时或120小时平行测定肺泡巨噬细胞样本)。数据显示为3个单个样本的平均信号(+标准差)，利用

RAT230 Plus Array experiments(Probe ID1368930_at)得到。

图3A显示，在M-CSF和RANKL刺激下，人外周血单核细胞(PBMCs)分化成破骨细胞期间，SK4通道表达上调(x轴代表在0小时、3天、7天、14天或21天平行测定人PBMC样本)。数据显示为4个单个样本的平均信号(+标准差)，利用

U133 Plus 2 Array chips得到。图3B显示利用Real-Time RT-PCR进一步证实

数据(x轴代表在0小时、3天、7天、14天或21天平行测定人PBMC样本)。图3C显示与其他细胞相比，SK4/IK在人B细胞、树突细胞和巨噬细胞中的高mRNA表达。图3C的数据来自于

RAT230 Plus Array芯片，显示为细胞样本的平均信号。细胞采样和平行测定的次数在图3C中标明。

图4A显示，与纯合野生型(WT；sk4^+/+)小鼠相比，SK4通道在M-CSF和RANKL下培养7天，杂合(sk4^+/-)和纯合敲除(sk4^-/-)小鼠的脾细胞产生的破骨细胞样细胞(即TRAP⁺)减少。图4B显示与WT小鼠相比，这些细胞的表面积减少。

图5显示，与WT(sk4^+/+)小鼠相比(上图)，SK4通道缺乏不明显影响来自纯合敲除(sk4^-/-)小鼠(下图)的巨噬细胞的相对比例。FACS图从左至右显示不同组合(全部细胞、CD11b/F480、CD11C/F480、CD11C/CD11b)。

图6A显示，与WT(sk4^+/+)小鼠相比，由在成融条件(M-CSF+RANKL)下培养7天的纯合敲除(sk4^-/-)小鼠骨髓来源的巨噬细胞产生的破骨细胞样细胞(即TRAP⁺)减少。图6B显示与WT小鼠相比，这些细胞的总表面积减少。

图7A-B显示，两种不同的SK4通道抑制剂(ICA-17043，图7A；和TRAM-34，图7B)以剂量依赖性方式，阻止WT小鼠骨髓来源的巨噬细胞中破骨细胞形成(osteoclastogenesis)。评估了TRAP⁺破骨细胞样细胞的表面积(POC是相对于无化合物对照的百分比)。数据来自于5次平行测定，误差线代表标准差。图7C显示ICA-17043治疗的样本的TRAP-染色图。

图8A-B显示，在抗胶原抗体诱导的关节炎模型中，与WT小鼠(M和F)相比，纯合敲除(sk4^-/-)小鼠(雄性(M)和雌性(F))的关节炎评分明显降低。显示了两次单独实验的数据。各研究组中动物的数量在图8A-B中标明，误差线代表平均值的标准差。

图9A显示，在抗胶原抗体诱导的关节炎模型中(图8，实验2)，与WT小鼠相比，纯合敲除(sk4^-/-)小鼠(雌性(F))的骨损伤、软骨损伤、血管翳(pannus)和爪关节炎症的组织学评分明显降低。图9B显示，在抗胶原抗体诱导的关节炎模型中，与WT小鼠相比，纯合敲除(sk4^-/-)小鼠(雄性(M))的骨损伤评分明显降低。

图10A-B显示，两种不同的SK4通道抑制剂(ICA-17043和TRAM-34，分别为图10A和图10B)以剂量依赖性方式，预防在M-CSF+RANKL刺激下人PBMCs中的破骨细胞形成。评估了TRAP+破骨细胞样细胞的表面积(POC是相对于无化合物对照的百分比)。数据来自于4次平行测定，误差线代表标准差。

图11A显示，SK4-缺乏的破骨细胞在吸收骨矿物质方面有缺陷。源自sk4^+/+和sk4^-/-小鼠的骨髓来源巨噬细胞在M-CSF(20ng/ml)和RANKL(100ng/ml)存在下，在涂有由磷酸钙晶体构成的人工骨的BioCoat^TMOsteologic^TM载玻片上培养20天。通过记录每孔溶解的磷酸钙表面积估计破骨细胞活性。结果代表3次独立实验(n＝3；SD)。图11B显示sk4^+/+和sk4^-/-小鼠的骨吸收陷窝(resorption pits)的典型图像。

图12显示，SK4-缺乏的小鼠的小梁骨密度(trabecular bone density)增加。雄性和雌性sk4^-/-小鼠股骨远端骨的小梁骨密度比sk4^+/+小鼠更高。8周龄雄性和雌性sk4^-/-和sk4^+/+小鼠的股骨远端利用pQCT扫描(n＝8；SD)。

图13显示小鼠头部的背外侧解剖图。箭头代表在体内的破骨细胞形成试验中，颅盖以上局部皮下注射脂多糖(lipolysaccharide，LPS)的部位。注射LPS引起局部、迅速、有效的炎症应答，导致吸收骨质的破骨细胞形成。

图14显示，SK4缺乏显著阻止应答在颅盖之上局部皮下注射LPS的骨吸收。向8周龄sk4^+/+和sk4^-/-雄性和雌性小鼠右颅盖的骨膜中注射2μl体积25μg LPS(见图13)。头部经显微CT扫描。记录SK4-缺乏的小鼠对LPS应答的缺乏(n＝5)。

图15A-C显示，sk4^+/+相对于SK4-缺乏(sk4^-/-)的颅盖3D参数的体内反应，以应答在颅盖之上局部皮下注射LPS。颅盖骨表面密度(骨表面积相对于骨体积，图15A)；骨厚度(图15B)；以及骨密度(图15C)。SK4-缺乏的小鼠在注射LPS 5天后，保持较高的颅盖骨厚度和密度，以及较少的吸收的骨表面。

发明详述

本发明涉及在细胞-细胞融合期间，尤其是在涉及巨噬细胞的同型和异型融合期间，增加的中电导钙激活钾(SK4或KCNN4或IK)通道表达的鉴定。本发明包括利用SK4抑制剂或激活剂调节细胞-细胞融合。即，本发明提供组合物和方法，通过调节SK4通道表达、活性或功能，从而调控细胞-细胞融合。因此，SK4通道表达、活性或功能可能减少(即抑制)或增加，以分别降低(即抑制)或增加细胞-细胞融合。特别感兴趣的是调节包括巨噬细胞的细胞-细胞融合。

例如，细胞(例如巨噬细胞)的融合可导致多核破骨细胞形成，其与骨发育、骨再塑和骨修复有关。功能失调的破骨细胞活性可能是骨疾病，例如骨质疏松症和类类风湿性关节炎的成因。同样，巨噬细胞的融合可导致多核巨细胞形成，用于应答异物例如病原体或植入物。本发明因此集中研究SK4通道在巨噬细胞融合中的作用。

在一些实施方案中，本发明提供抑制细胞-细胞融合的方法，更具体地为巨噬细胞的细胞-细胞融合。在此类实施方案中，SK4通道表达、活性或功能，以及该细胞-细胞融合，可例如通过使所研究细胞与有效量的SK4通道抑制剂接触而减少(即抑制)。通过这种方式，与适当对照相比，SK4通道表达、活性或功能在那些所研究细胞中可得到统计学显著的降低，包括但不限于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在其他实施方案中，可能需要细胞-细胞融合增加，例如巨噬细胞融合增加。因此，例如巨噬细胞融合增加和多核破骨细胞形成可能是对抗异常增加的骨密度或者治疗慢性感染或骨硬化症所需的。在此类实施方案中，巨噬细胞的SK4通道表达、活性或功能可增加，例如通过使巨噬细胞与有效量的SK4通道表达、活性或功能的激活剂接触。当所需结果是细胞-细胞融合增加时，与适当对照相比，SK4通道表达、活性或功能在那些所需细胞中可得到统计学显著量的增加，包括但不限于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％或更高。

本发明的组合物和方法通过调控破骨细胞和/或破骨细胞前体的SK通道表达、活性或功能，从而用于调控破骨细胞分化和功能。破骨细胞是同型、特化、多核的源自巨噬细胞的细胞，通过除去骨组织的矿化基质而溶解骨组织。通过调控破骨细胞前体例如巨噬细胞的破骨细胞形成，可能改变破骨细胞形成，并因此改变破骨细胞数量和/或破骨细胞表面积，从而改变总体破骨细胞功能。破骨细胞功能可经调节而改变，例如这些细胞的骨矿物质吸收活性。因此，在一些实施方案中，本发明提供调控破骨细胞分化和功能的方法，其中所述方法包括使破骨细胞和/或破骨细胞前体与有效量的SK4通道抑制剂或激活剂接触。

在一些实施方案中，利用SK通道抑制剂来抑制破骨细胞分化和/或功能。因此，当所需结果是降低破骨细胞分化和/或功能时，可以抑制破骨细胞前体例如巨噬细胞的SK4通道表达、活性或功能，以减少巨噬细胞融合，从而减少破骨细胞形成(包括减少破骨细胞数量和/或破骨细胞表面积)，这导致破骨细胞功能的总体降低。可抑制破骨细胞的SK4通道表达、活性或功能，从而降低破骨细胞功能，例如包括降低破骨细胞骨矿物质吸收活性。与适当对照相比，SK4通道表达、活性或功能在破骨细胞和/或破骨细胞前体中可得到统计学显著量的降低，包括但不限于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在本发明其他实施方案中，本方法利用SK通道激活剂，提供增加的破骨细胞分化和/或功能。这样，例如破骨细胞分化和/或功能增加可能是对抗异常增加的骨密度，或者治疗慢性感染或骨硬化症所需的。因此，当所需结果是破骨细胞分化和/或功能增加时，可增加破骨细胞前体例如巨噬细胞的SK4通道表达、活性或功能，以增加巨噬细胞融合，从而增加破骨细胞形成(包括增加破骨细胞数量和/或破骨细胞表面积)，这导致破骨细胞功能的总体增加，例如包括破骨细胞骨矿物质吸收活性的增加。可增加破骨细胞的SK4通道表达、活性或功能，从而增加破骨细胞功能，例如增加破骨细胞骨矿物质吸收活性。与适当对照相比，SK4通道表达、活性或功能在破骨细胞和/或破骨细胞前体中可得到统计学显著量的增加，包括但不限于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％或更高。

抑制细胞-细胞融合

不希望束缚于任何具体理论，但SK4通道抑制剂可调节SK4通道表达，SK4通道活性，或者正活跃融合的(actively fusing)细胞和/或新融合的多核细胞例如破骨细胞、巨细胞或转移癌细胞的上游或下游SK4通道效应物。因此，描述了以SK4通道抑制剂来抑制细胞-细胞融合的组合物和方法，更具体地抑制巨噬细胞融合，包括导致破骨细胞、巨细胞和转移癌细胞形成的同型和异型融合。

SK4通道抑制剂因此可在体内或体外提供以抑制细胞-细胞融合。当在体外提供时，所述SK4通道抑制剂可用于抑制细胞-细胞融合或筛选调节细胞-细胞融合的试剂。当在体内提供时，所述SK4通道抑制剂可用于预防和/或治疗涉及源自巨噬细胞的多核细胞，尤其是破骨细胞、巨细胞或转移癌细胞的多种疾病或障碍。特别地，所述SK4通道抑制剂可用于预防或减少骨吸收/骨丢失，预防或治疗自身免疫或者炎性疾病或障碍，预防植入物或移植物排斥，或者预防癌症转移。

如本文所用的，“中电导钙激活钾通道(intermediate-conductancecalcium-activated potassium channe)”，“SK4通道(SK4 channel)”指的是不依赖电压的、内向整流的钾通道，其电导小于100pS或在约12pS至约50pS之间(参见例如Christopherson(1991)J.Membr.Biol.119：75-83；和Tharp &Bowles(2009)Cardiovasc.Hematological Agents Med.Chem.7：1-11；在此将每一篇以其整体引入作为参考)，但通常在约30pS至约40pS之间。SK4通道受亚微摩尔(submicromolar)的胞内钙浓度(约100nmol/L至约300nmol/L)激活，受北非蝎毒素(charybdotoxin)和三芳基甲烷例如克霉唑，TRAM-34和ICA-15451阻断，但不受iberiotoxin、蜂毒明肽(apamin)或酮康唑阻断。SK4通道在本领域以不同方式被理解为中电导钙激活钾通道蛋白4、Gardos、fIK、hIK、mIK、IK、IK1、IKCa1、IKCA1、ImK、KCa4、KCA4、KCa3.1、KCNN4或SK4通道。参见例如Cho等，(2008)Expert Rev.Mol.Diagn.8：179-187；和Reich等，(2005)Eur.J.Immunol.35：1027-1036；在此将每一篇以其整体引入作为参考。因此，为了本发明的目的，术语“SK4通道”预期包括这些通道所理解的各种名称，包括KCNN4和SK4通道。

对于许多物种例如小鼠、大鼠和人类来说，SK4通道单体的核酸和氨基酸序列是已知的。参见例如Joiner等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：11013-11018；Logsdon等，(1997)J.Biol.Chem.272：32723-32726；Neylon等，(1999)Circ.Res.85：E33-E43；Vandorpe等，(1998)J.Biol.Chem.273：21542-21553；Warth等，(1999)Pflugers Arch.438：437-444；以及美国专利6,692,937和6,894,147；在此将每一篇以其整体引入作为参考；还参见SEQID NOS：1-6。SK4通道单体有6个跨膜片段(S1-S6)，在S5和S6之间有一个孔基序(pore motif)，其包含钾选择性氨基酸序列GYG。SK4通道单体在孔基序附近还有N-连接糖基化位点。

SK4通道的N端包含内质网滞留信号(endoplasmic retention signal)(上述Tharp & Bowles(2009))，C端包含感受细胞内钙的钙调蛋白结合区(Fanger等，(1999)J.Biol.Chem.274：5746-5754；和Joiner等，(2001)J.Biol.Chem.276：37980-37985；在此将每一篇以其整体引入作为参考)。C端还包含蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)和蛋白激酶G(PKG)磷酸化的许多共有序列(上述Joiner等，(1997))，以及酪氨酸磷酸化的共有序列(RLLQEAWMY；SEQ ID NO：7；上述Tharp & Bowles(2009))。SK4通道单体形成同源四聚体，以调节钾离子外流。

SK4通道在许多类型细胞中表达，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、红细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和上皮细胞，但该通道表达时机和作用在这些细胞中可能不同。然而，SK4通道在正在融合或最近融合的细胞中的表达和作用以前并未见报道。

如本文所用的，“巨噬细胞(macrophage)”指的是CD68⁺(人类)或F4/80⁺(小鼠)单核白细胞，在组织稳态以及先天免疫和获得性免疫中发挥作用。巨噬细胞还可为CD11b⁺。从形态学上，它们表现为大细胞(～25μm至50μm)，有圆形的核，包含一至两个核仁，聚集染色质，有液泡和许多嗜苯胺蓝颗粒(azurophilic granules)的丰富的细胞质。巨噬细胞位于身体各处组织中，源自循环的单核细胞(即血源性单核白细胞)。它们有两个主要作用：吞噬作用和抗原呈递。

作为吞噬细胞，巨噬细胞吞噬然后消化细胞碎片和病原体(例如细菌、真菌、原生动物、病毒和酵母)，刺激淋巴细胞和其他免疫细胞对这些病原体产生应答。作为抗原呈递细胞，巨噬细胞处理来自吞噬的病原体的抗原，并将其呈递到淋巴细胞和其他免疫细胞表面。巨噬细胞还分泌大量单核因子，包括酶、补体蛋白和调节因子，例如白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α。另外，巨噬细胞有淋巴因子受体，使它们活化成攻击性的病原体-和肿瘤-破坏细胞。

一些巨噬细胞集中(即固定)在特定器官或组织，尤其是可能出现病原体侵袭或尘埃聚集的区域。固定的巨噬细胞的功能是不同的，被认为是受微环境刺激素例如细胞因子和病原性产物的影响。固定的巨噬细胞的实例列于表1。

表1 固定的巨噬细胞命名

用于鉴定、分离和培养巨噬细胞(及它们的单核细胞前体)所必需的方法和材料是本领域公知的。参见例如Alabraba等，(2007)J.Immunol.Methods326：139-144；Borgmann et al.，″Isolation and HIV-1 infection of primary humanmicroglia from fetal and adult tissue，″49-70 In：Methods in Molecular Biology(Zhu ed.，Humana Press Inc.2005)；Buckley等，(1985)J.Immunol.134：2310-2315；Buckley et al.，″Human osteoclast culture from peripheral bloodmonocytes，″55-68 In：Methods in Molecular Medicine(Picot ed.，HumanaPress Inc.2^nd ed.2005)；Cline(1994)Blood 84：2840-2853；Davies & Gordon，″Isolation and culture of human macrophages，″105-116 In：Basic Cell CultureProtocols(Helgason & Miller eds.，Humana Press Inc.3^rd ed.2005)；Davies &Gordon，″Isolation and culture of murine macrophages，″91-103 In：Basic CellCulture Protocols(Helgason & Miller eds.，Humana Press Inc.3^rd ed.2005)；Fels & Cohn(1986)J.Applied Physiology 60：353-369；Gordon & Taylor(2005)Nat.Rev.Immunol.5：953-964；Havenith等，(1998)Glia 22：348-359；Rogler等，(1998)Clin.Exp.Immunol.112：205-215；Schuenke & Gelman(2003)J.Neurovirol.9：346-357；St-Laurent等，(2009)J.Asthma 46：1-8；Taylor等，(2005)Ann.Rev.Immunol.23：901-944；以及Wilson & Stewart，″Glomerularepithelial and mesangial cell culture and characterization，″269-282 In：Methods in Molecular Medicine(Picot ed.，Humana Press Inc.2^nd ed.2005)；在此将每一篇以其整体引入作为参考。

如上所述，巨噬细胞可通过与其自身融合(即同型融合)或与其他细胞融合(即异型融合)从而形成多核细胞。参见上述Vignery(2005)。尽管巨噬细胞通过何种机制融合尚未完全了解，但下文显示了涉及SK4通道上调和活性，阻断这样的上调或活性抑制细胞-细胞融合。本说明书中特别感兴趣的源自巨噬细胞的多核细胞是破骨细胞、巨细胞和转移癌细胞。

如本文所用的，“同型融合(homotypic fusion)”指的是相同类型的至少两个细胞之间的细胞-细胞融合，例如巨噬细胞之间的融合。与巨噬细胞同型融合的实例包括但不限于巨细胞、肌细胞、破骨细胞和合体滋养细胞。相反，“异型融合(heterotypic fusion)”指的是不同谱系的至少两个细胞之间的细胞-细胞融合，且至少一个细胞为巨噬细胞。与巨噬细胞异型融合的实例包括但不限于转移癌细胞。参见上述(See，id)。

如本文所用的，“破骨细胞(osteoclast)”指的是同型、特化、多核的源自巨噬细胞的细胞，通过除去骨组织的矿化基质溶解骨组织。这样的细胞可表达CD200、CT受体或DC-STAMP。从形态学上，它们是大的形状不规则细胞，有多个大小差不多相同的单独的核(约2个至约50个)。破骨细胞特征还在于耐酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)和组织蛋白酶K(cathepsin K)高表达，以及玻连蛋白(vitronectin)和降钙素受体(calcitonin receptors)的表达。破骨细胞通常位于骨组织中，当至少受核因子κβ(RANK)配体(RANKL)的激活剂和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激时，由巨噬细胞形成。

如本文所用的，“巨细胞(giant cell)”指的是同型、特化、多核的源自巨噬细胞的细胞，在组织稳态中发挥作用。这样的细胞可表达CD200或DC-STAMP。从形态学上，它们更像破骨细胞，因为它们是大的形状不规则细胞，有多个单独的核。人们认为，巨细胞增强了巨噬细胞的防御能力，由巨噬细胞形成，应答大的异物(尤其是医学植入物)和针对病原体的慢性炎症，以及肉芽肿病。白细胞介素-4或白细胞介素-13被认为是巨细胞形成所需的。

如本文所用的，“转移癌细胞(metastatic cancer cell)”指的是异型、多核的源自巨噬细胞和源自癌症的细胞。通常，所述细胞是杂合物，具有巨噬细胞的移动能力和癌细胞的分裂能力。因此，转移癌细胞可向远离肿瘤形成的原发部位迁移，定位至身体的其他部位。

如本文所用的，“源自巨噬细胞的多核细胞(macrophage-derivedmultinucleate cell)”指的是有至少两个或多个核的细胞，通过与巨噬细胞同型或异型融合产生。源自巨噬细胞的多核细胞的实例包括但不限于乳腺癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、破骨细胞、巨细胞和一些转移癌细胞。

本说明书中所述的组合物和方法用于预防和/或治疗涉及源自巨噬细胞的多核细胞(特别是破骨细胞、巨细胞和转移癌细胞)的多种疾病或障碍。具体地，所述SK4通道抑制剂可用于预防或减少骨吸收/骨丢失，预防或治疗自身免疫疾病或炎性疾病或障碍，预防植入物或移植物排斥，或者预防癌症转移。

因此，在本发明一些实施方案中，所述组合物和方法用于治疗或预防骨丢失及与骨丢失相关的疾病。关于骨丢失疾病，可出现异常的破骨细胞形成，其过度吸收骨质，降低骨矿物质密度(BMD)。可用本发明的组合物和方法预防或治疗的骨丢失疾病的实例包括但不限于骨质疏松症(osteoporosis)、骨软化症(osteomalacia)、佩吉特病(Paget′s disease)、牙周病(periodontal disease)、继发于其他病理条件的骨丢失(即酒精中毒(alcoholism)、乳糜泻(celiacdisease)、慢性肾病、慢性肝病、癫痫(epilepsy)、胃肠疾病、甲状旁腺功能亢进(hyperparathyroidism)、甲状腺功能亢进(hyperthyroidism)、性腺功能减退(hypogonadism)、白血病(leukemia)、淋巴瘤(lymphoma)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、坏血病(scurvy)、维生素D缺乏症(vitamin D deficiency))等。

在本发明其他实施方案中，所述组合物和方法用于治疗或预防自身免疫疾病，特别是那些涉及巨细胞形成的疾病。关于自身免疫疾病，可出现巨细胞形成，应答免疫系统不能识别其自身组成部分，导致细胞和组织破坏。异常的免疫应答可能局限于一些器官(即集中的；例如在甲状腺炎中)或者涉及不同部位的特定组织(例如肺出血肾炎综合征，其可能影响肺和肾中的基膜)或者可能是全身性的。因此，在自身免疫疾病中，预防、调节或抑制(即减少)巨细胞形成可改善细胞和组织损伤。

可用本发明的组合物和方法预防或治疗的自身免疫疾病的实例包括但不限于急性播散性脑脊髓炎(acute disseminated encephalomyelitis、ADEM)、阿狄森病(Addison′s disease)、脱发(alopecia)、强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)、抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid antibody syndrome)、自身免疫性内耳病(autoimmune inner ear disease)、自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia)、自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、查加斯病(Chagas disease)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonarydisease)、乳糜泻(celiac disease)、节段性回肠炎(Crohns Disease)、皮肌炎(dermatomyositis)、1型糖尿病(diabetes mellitus type 1)、子宫内膜异位症(endometriosis)、肺出血肾炎综合征(Goodpasture′s syndrome)、格雷夫斯病(Graves′disease)、急性感染性多神经炎(Guillain-Barrésyndrome，GBS)、桥本病(Hashimoto′s disease)、川崎病(Kawasaki disease)、特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura)、系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus)、多发性硬化(multiple sclerosis，MS)、重症肌无力(myastheniagravis)、银屑病(psoriasis)、原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、硬皮病(scleroderma)、综合征

syndrome)、颞动脉炎(temporal arteritis，也称为“巨细胞动脉炎(giant cell arteritis)”)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、血管炎(vasculitis)等。

在本发明的其他实施方案中，所述组合物和方法还用于治疗或预防炎性疾病，特别是那些涉及巨细胞形成的。关于炎性疾病，当体内免疫系统对刺激素例如病原体、损伤的细胞或者刺激剂过度反应时，可出现巨细胞形成。所述过度反应的免疫应答可能特征在于存在炎症细胞，包括多核巨细胞，其引发炎症，破坏健康细胞和组织。因此，在炎性疾病中，预防或抑制巨细胞形成可改善炎症和破坏的细胞及组织损伤。

可用本发明中所述的组合物和方法预防或治疗的炎性疾病的实例包括但不限于痤疮(acne)、哮喘(asthma)、关节硬化(arthrosclerosis)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease)、结肠炎(colitis)、皮炎(dermatitis)、肾小球肾炎(glomerulonephritis)、炎性肠病(inflammatory boweldisease)、湿疹(eczema)、瘢痕疙瘩(keloid)、狼疮(lupus)、肾炎(nephritis)、骨关节炎(osteoarthritis)、盆腔炎(pelvic inflammatory disease)、银屑病(psoriasis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、腱炎(tendinitis)等。为了更清楚，可将以上列出的一些自身免疫疾病分类为自身免疫和炎性疾病。

在本发明其他实施方案中，所述组合物和方法用于预防植入物和移植物排斥。可出现巨细胞形成，应答植入物或移植的细胞、器官或组织。接受者的免疫系统可将植入物(即医疗器械如起搏器)或移植的细胞、器官或组织识别为异物并排斥它们，排斥特征在于持续性的炎症细胞，包括巨细胞，其攻击植入物，引起植入物降解或破坏，或者攻击移植的细胞/器官/组织，如同其破坏感染的有机体例如细菌和病毒。因此，在植入或移植的部位预防巨细胞形成可预防或改善排斥。

如本文所用的，“植入物排斥(implant rejection)”指的是植入的医疗器械不被植入接受者的身体所接受的免疫状态。所需植入物包括但不限于人工耳蜗装置、人造膝关节、人工髋关节、骨接合剂、乳房植入物、心脏植入物(例如人工心脏瓣膜、除颤器、左心室辅助装置、起搏器)、皮肤植入物、胃带或囊、留置导尿管、胰岛素泵、宫内避孕器、神经刺激器、眼植入物、骨科植入物、阴茎勃起假体、支架、尿道吊带、语音假体等。鉴于上述观点，还考虑用本说明书中所述的组合物包被或浸渍可植入装置，以预防或减少排斥的可能。

如本文所用的，“移植物排斥(transplant rejection)”指的是移植的细胞、组织或器官不被移植接受者的身体所接受的免疫状态。在移植物排斥中，接受者的免疫系统作为异物攻击移植的器官/组织，试图将其破坏。

移植物排斥的实例包括但不限于骨和骨髓移植、角膜移植、心脏和心脏瓣膜移植、肠移植、肾移植、肢体移植、肝移植、肺移植、胰腺移植、血小板输注、红细胞输注、皮肤移植、干细胞移植、肌腱移植、血管移植、白细胞输注等。

在本发明其他实施方案中，所述组合物和方法用于预防转移细胞形成和癌症转移。关于转移，转移的细胞由融合巨噬细胞与癌细胞形成，接着其可从体内原始部位(即原发性肿瘤)迁移到身体的其他部分。事实上，所有癌症都能发生转移，其可以3种方式传播：(1)通过局部扩展从肿瘤到周围组织，(2)通过血流到远位，或者(3)通过淋巴系统到临近或远处淋巴结。因此，预防转移癌细胞形成可有益地预防癌症转移。

利用本发明的组合物和方法可防止其转移的癌症实例包括但不限于骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、喉癌、子宫癌等。

本发明包括组合物，其含有有效量的SK4通道抑制剂和任选地用于治疗由源自巨噬细胞的多核细胞介导的疾病或障碍的治疗剂。在一个实施方案中，提供一种组合物，包括有效量的SK4通道抑制剂和治疗剂。在其他实施方案中，提供一种药物组合物，包括治疗有效量的SK4通道抑制剂和治疗剂，还包括药学可接受载体。

如本文所用的，“SK4通道抑制剂(SK4 channel inhibitor或SK4 channelinhibiting agent)”指的是影响SK4通道表达(即翻译或转录)、SK4通道活性(即传导)，或者上游和下游SK4通道效应物(即启动子激活剂、诱导剂、抑制剂、阻抑剂、激酶等)的试剂。在一些实施方案中，所述SK4通道抑制剂可为抑制性核酸序列、抗-SK4通道抗体，或其他设计成结合SK4通道并调节其功能(即去极化或再极化能力)的蛋白。或者，所述SK4通道抑制剂可为小分子，特别地与SK4通道结合并阻止它们的活性或功能。

无论SK4通道抑制剂的真实性质如何，它都降低SK4通道表达、活性或功能的一个或多个。与适当对照相比，所述表达、活性或功能可得到统计学显著量的降低，包括但不限于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。优选地，所述SK4通道表达、活性或功能降低至少约10％或更多。反之，所述SK4通道抑制剂不应当在统计学上增加SK4通道表达、活性或功能。

影响SK4通道表达的试剂可包括抑制性核酸分子，其抑制SK4通道单体的表达。所述抑制性核酸分子可能通过阻止编码SK4通道单体的信使RNA的翻译(例如正义抑制/共抑制；反义抑制；通过小干扰RNA、微小RNA或短发夹RNA的双链RNA(dsRNA)干扰；扩增子介导的干扰；以及核酶)直接抑制单体的表达，或者通过编码多肽间接抑制单体的表达，所述多肽抑制编码SK4通道单体的基因或核酸序列的转录或翻译。抑制或消除哺乳动物细胞中基因产物表达的方法是本领域公知的，任何这样的方法都可用在本发明中来抑制SK4通道单体的表达。

对于正义抑制/共抑制，可将表达盒设计成表达共抑制核酸分子，所述共抑制核酸分子在“正义(sense)”方向与编码SK4通道单体的天然基因或核酸(例如包含SEQ ID NOS：1、3或5的基因或核酸序列，或者具有与SEQ IDNOS：1、3或5相同的重要序列的序列)一致。所述共抑制核酸分子可能相当于编码SK4通道单体的全部或部分基因或核酸，编码SK4通道单体的基因或核酸的全部或部分5′和/或3′非翻译区，或者编码SK4通道单体的基因或核酸的全部或部分编码序列和非翻译区。通常，所述共抑制核酸分子可包括至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、850或1000个核苷酸，或者可为任何大小达到和包括SK4通道单体的全长核酸序列。当所述共抑制核酸分子包括SK4通道单体的全部或部分编码区时，可将表达盒设计成除去起始密码子，以便没有功能性SK4通道单体会从共抑制核酸分子转录。共抑制核酸分子的过表达可导致编码SK4通道单体的基因或核酸的表达降低。利用共抑制来抑制哺乳动物离子通道的方法是本领域公知的。参见例如Bingham(1997)Cell 90：385-387；和国际专利申请公开WO/1999/063081；在此将每一篇以其整体引入作为参考。

对于反义抑制，可将表达盒设计成表达反义核酸分子，其与编码SK4通道单体的天然基因或核酸的全部或部分互补。所述反义核酸分子可能相当于编码SK4通道单体的基因或核酸的全部或部分互补物，编码SK4通道单体的基因或核酸的5′和/或3′非翻译区的全部或部分互补物，或者编码SK4通道单体的基因或核酸的编码序列和非翻译区的全部或部分互补物。所述反义核酸分子还可与编码SK4通道单体的基因或核酸完全互补(即与靶核酸序列的互补物同一性为100％)或部分互补(即与靶核酸序列的互补物同一性小于100％)。反义核酸分子的表达可导致编码SK4通道单体的基因或核酸的表达降低。

无论所使用的反义核酸分子是什么类型，都可使用至少25个核苷酸、50、100、200、300、400、450、500、550个核苷酸或更多个核苷酸的序列。利用反义核酸分子抑制哺乳动物离子通道表达的方法是本领域公知的。参见例如Eigel & Hadley(2001)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.281：H2184-H2190；Meiri等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4430-4434；Sasamura等，(2002)Jpn.J.Pharmacol.90：164-172；Si等，(2006)Brit.J.Pharmacol.148：909-917；Tao等，(2008)Am.J.Physiol.Cell Physiol.295：C1409-C1416；Tharp等，(2006)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.291：H2493-H2503；Wang等，(2007)Oncogene 26：5107-5114；和Waterhouse& Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；在此将每一篇以其整体引入作为参考。

通过在表达盒中反义序列3′部位包含poly-dT区及5′多腺苷酸化信号，可提高反义抑制的有效性。参见美国专利申请公开2002/0048814；在此将其以其整体引入作为参考。

对于dsRNA干扰，如同上述的共抑制的正义核酸分子和与正义核酸序列完全或部分互补的反义核酸分子在相同细胞中表达，导致编码SK4单体的天然基因或核酸的表达受到抑制。正义和反义核酸分子的表达可通过将表达盒设计成包括编码SK4通道单体的核酸的正义和反义序列来实现。或者，可将单独的表达盒用于正义和反义核酸分子。

无论用于dsRNA干扰的核酸分子是什么类型，都可使用至少25个核苷酸、50、100、200、300、400、450、500、550个核苷酸或更多个核苷酸的序列。利用dsRNA干扰抑制哺乳动物离子通道表达的方法是本领域公知的。参见例如Cotella等，(2005)Biochem.Biophys.Res.Commun.330：555-560；和Palmer等，(2006)Cell Biochem.Biophys.46：175-191；在此将每一篇以其整体引入作为参考。

对于扩增子介导的干扰，可将扩增子表达载体设计成含有核酸序列，所述核酸序列包括源自病毒的序列，其包含编码SK4通道单体的全部或部分天然基因或核酸。扩增子表达盒的转录产物中存在的病毒序列使得转录产物可指导其自我复制。由扩增子产生的转录物可为正义的或反义的，与编码SK4通道的基因或核酸序列有关。

无论所使用的核酸分子是什么类型，都可使用至少25个核苷酸、50、100、200、300、400、450、500、550个核苷酸或更多个核苷酸的序列。利用扩增子抑制或减少哺乳动物离子通道表达的方法是本领域公知的。参见例如White等，(2002)J.Neurophysiol.87：2149-2157；在此将其以其整体引入作为参考。

对于核酶，可将表达载体设计成表达核酸分子，所述核酸分子对由编码SK4通道的天然基因或核酸序列表达的mRNA具有催化活性。所述催化性核酸分子引起编码SK4通道的mRNA或核酸降解，导致SK4通道的表达降低。

无论所使用的催化性核酸分子是什么类型，都可使用至少25个核苷酸、50、100、200、300、400、450、500、550个核苷酸或更多个核苷酸的序列。利用核酶抑制或减少哺乳动物离子通道表达的方法是本领域公知的。参见例如Liu等，(2000)J.Biol.Chem.275：8711-8718；和美国专利4,987,071；在此将每一篇以其整体引入作为参考。

对于微小RNA(miRNA)干扰，可将表达载体(expression construct)设计成表达核酸分子，所述核酸分子与编码SK4通道单体的天然基因或核酸序列互补，以便miRNA被转录，但不被翻译成SK4通道单体(即非编码RNA)。将各个初级转录物(pri-miRNA)处理成短的茎环结构，称为前-miRNA(pre-miRNA)，最后成为功能性miRNA。miRNAs包含约22至约23个核糖核苷酸。成熟的miRNA高效抑制编码SK4通道单体的基因或核酸分子表达。由于成熟的miRNA分子与编码SK4通道单体的一个或多个核酸分子部分互补，所以它们通过抑制翻译或者有时促进编码SK4通道单体的核酸分子剪切从而下调基因表达。利用miRNA分子抑制哺乳动物离子通道表达的方法是本领域公知的。参见例如Lee等，(1993)Cell 75：843-854；和Xiao等，(2007)J.Biol.Chem.282：12363-12367；在此将每一篇以其整体引入作为参考。

对于短发夹RNA(shRNA)干扰，可将表达盒设计成表达核酸分子，所述核酸分子与编码SK4通道单体的天然基因或核酸互补，产生紧密发夹环，其可用于通过RNA干扰使基因表达沉默。shRNA干扰还可能是包含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰，其中可将表达盒设计成表达编码内含子被剪切掉的RNA的核酸，其具有发夹结构。

无论所使用的shRNA分子是什么类型，都可使用至少25个核苷酸、50、100、200、300、400、450、500、550个核苷酸或更多个核苷酸的序列。利用shRNA分子抑制哺乳动物中编码离子通道的表达基因的方法是本领域公知的。参见例如Weaver等，(2006)Glia 54：223-233；在此将其以其整体引入作为参考。

还可以设计用于shRNA干扰的表达盒，以便正义序列和反义序列与编码SK4通道的核酸序列不一致。相反，正义序列和反义序列侧面有环序列，其包括与编码SK4通道单体的全部或部分核酸序列一致的核苷酸序列。因此，环区决定RNA干扰的特异性。参见例如国际专利申请公开WO 02/00904；在此将其以其整体引入作为参考。

另外，转录基因沉默(transcriptional gene silencing，TGS)可通过应用shRNA分子来实现，其中发夹的反向重复与待沉默的编码SK4通道单体的基因或核酸的启动子区有序列一致性。将shRNA处理成可与同源启动子区相互作用的短RNAs可引发降解或甲基化，导致沉默(参见Aufsatz等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99：16499-16506；和Mette等，(2000)EMBO J.19：5194-5201；在此将每一篇以其整体引入作为参考)。

影响SK4通道活性或功能的其他试剂可包括调节SK4通道活性或功能的肽、蛋白或小分子。所述肽、蛋白或小分子可抑制SK4通道的传导或例如钙调蛋白的活性(参见Fanger等，(1999)J.Biol.Chem.274：5746-575；在此将其以其整体引入作为参考)或者调节SK4通道的激酶(参见Gerlach等，(2000)J.Biol.Chem.275：585-598；在此将其以其整体引入作为参考)。或者，所述肽、蛋白或小分子可调节本身受SK4通道活化调节的辅助分子的活性或功能。

对于抑制性肽或蛋白，其可为结合SK4通道单体或SK4通道同源四聚体的抗体。如本文所用的，“抗体(antibody)”指的是免疫球蛋白分子，其与特定抗原或抗原表位发生免疫反应。该术语还包括基因工程形式，例如嵌合抗体(如人源化鼠抗体)以及异源结合抗体(如双特异性抗体)。该术语还包括二价或双特异性分子、双体、三体和四体。二价和双特异性分子例如描述于Kostelny等，(1992)J.Immunol.148：1547-1553；Pack & Pluckthun(1992)Biochemistry 31：1579-1584；Zhu等，(1997)Protein Sci.6：781-788；Hu等，(1996)Cancer Res.56：3055-3061；Adams等，(1993)Cancer Res.53：4026-4034；和McCartney等，(1995)Protein Eng.8：301-314；在此将每一篇以其整体引入作为参考。

抗体还包括抗原结合形式的抗体，包括有抗原结合能力的片段(例如Fab′、F(ab′)₂、Fab、Fv和rIgG)。用蛋白水解酶(例如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)处理抗体产生这些抗体片段，尤其是抗-SK4通道抗体片段。抗体还指的是重组单链Fv片段(scFv)。优选地，用于实践本说明书中所述方法的抗体与其靶蛋白结合，亲和性(结合常数)等于或大于10⁷M^-1。

抗体可为单克隆或多克隆抗体，可属于任何抗体种类(即IgG、IgM、IgA等)。用于制备单克隆抗体(mAb)的方法是本领域公知的。例如，本领域普通技术人员可通过分离淋巴细胞并使它们与骨髓瘤细胞融合从而产生杂交瘤，来制备单克隆抗体。参见例如，Milstein，In：Handbook of ExperimentalImmunology(Blackwell Scientific Publishing 1986)；和Goding，In：MonoclonalAntibodies：Principles and Practice(Academic Press 1983)；在此将每一篇以其整体引入作为参考。接着筛选克隆的杂交瘤，制备例如抗-SK4通道单体或同源四聚体抗体(即优选与SK4通道单体、同源四聚体或其片段结合的抗体)。单克隆抗体因此不受抗体以何种方法产生，这样的产生是否在原处的限制。

或者，可利用重组DNA技术制备抗体，包括但不限于在细菌、酵母、植物、昆虫细胞系或哺乳动物细胞系中表达。例如，本领域普通技术人员可利用常规方法容易地对编码单克隆抗体的核酸序列进行分离和测序(例如，利用能与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可作为核酸序列DNA的优选来源。核酸序列一经分离，就可置于表达载体中，接着将表达载体转染到宿主细胞中，例如不另外产生抗体的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤细胞或植物细胞，以使单克隆抗体在重组宿主细胞中得以合成。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述包括下列：Skerra(1993)Curr.Opin.Immunol.5：256-262；和Phickthun(1992)Immunol.Rev.130：151-188；在此将每一篇以其整体引入作为参考。

或者，抗体可在细胞系例如CHO细胞系中产生。参见例如美国专利5,545,403；5,545,405和5,998,144；在此将每一篇以其整体引入作为参考。简言之，本领域普通技术人员可分别用能够表达轻链和重链的载体转染细胞系。通过转染单个载体上两种蛋白链，可制备嵌合抗体。利用CHO细胞的另一个优点是抗体的正确糖基化。

同样，制备多克隆抗体的方法是本领域公知的。例如，本领域普通技术人员可通过用免疫原(例如SK4通道单体、SK4通道同源四聚体或其片段)免疫适当的宿主动物(例如兔)和利用适当稀释的血清或从血清中分离免疫球蛋白，来制备多克隆抗体。因此，可用免疫原接种动物，随后从动物体内取血，纯化IgG片段。其他合适的宿主动物包括鸡、山羊、绵羊、豚鼠、大鼠或小鼠。若需要，可将免疫原以结合物给药，在其中，免疫原例如通过其一个氨基酸残基的侧链与合适的载体偶联。载体分子通常为生理学可接受载体。可将得到的抗体纯化，纯度达约70％、80％、90％、95％、99％或100％。

制备抗-SK4通道单体或同源四聚体抗体的方法是本领域公知的。参见例如Boettger等，(2002)Brain 125：252-263；Furness等，(2004)Autonom.Neurosci.112：93-97；Ghanshani等，(2000)J.Biol.Chem.275：37137-37149；和Hoffman等，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：7366-7371；在此将每一篇以其整体引入作为参考。可市售获得的抗-SK4通道抗体也适用于本说明书，可分别从例如Alomone Labs(Jerusalem，Israel)；Millipore(Billerica，MA)，Sigma Aldrich(St.Louis，MO)和Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)获得。还参见Sandow等，(2006)J.Anat.209：689-698；和Wulff等，(2001)J.Biol.Chem.276：32040-32045。

或者，所述SK4通道抑制剂可为设计成结合SK4通道单体或同源四聚体的蛋白。如本文所用的，“设计成结合SK4通道单体或同源四聚体的蛋白(protein designed to bind SK4 channel monomers or homotetramers)”指的是设计成结合SK4通道单体或同源四聚体的蛋白，其中所述结合抑制(即降低)SK4通道表达、活性或功能，如本说明书上文所述。抑制性肽是本领域公知的。参见例如Wulff等，(2007)Curr.Med.Chem.14：1437-1457；在此将其以其整体引入作为参考。

或者，SK4通道抑制剂可为小分子，其与SK4通道单体结合，阻止其形成部分同源四聚体，或者与同源四聚体结合，妨碍其活性或功能。如本文所用的，“与SK4通道单体结合的小分子(small molecule that binds to an SK4channel monomer)”或“与SK4通道同源四聚体结合的小分子(small moleculethat binds to an SK4 homotetramer)”指的是与抑制SK4通道单体或同源四聚体表达、活性或功能的药物中普遍使用的那些分子大小可比较的分子。优选的小分子范围大小可达约5000Da，更优选达约2000Da，最优选达约1000Da。

本说明书中使用的小分子的非限制性实例包括化合物、无机分子、有机分子、包含无机成分的有机分子、包括放射性原子的分子、合成分子和肽模拟物(如模拟最普遍的肽基序如α-螺旋或β-折叠的短的肽片段)。作为SK4通道抑制剂，小分子可能比大分子对细胞更具渗透性，对降解更不敏感，更不易于引出不需要的免疫应答。

对于小分子，其可为可结合SK4通道单体或同源四聚体的化合物。本说明书中所使用的其中一类小分子为三芳基甲烷。三芳基甲烷可具有以下结构式：

其中X、Y和Z可相同或不同，可分别选自CH2、O、S、NR₁、N＝CH、CH＝N和R₂-C＝C-R₃；

R可以为H、卤素、三卤代烷基、羟基、酰氧基、烷氧基、烯氧基、硫基、烷硫基、硝基、氰基、脲基、酰基、羧基、烷氧羰基、N-(R₄)(R₅)以及1-20个碳原子的饱和或不饱和、手性或非手性、环状或非环状、直链或支链烃基，任选地被羟基、卤素、三卤代烷基、烷硫基、烷氧基、羧基、烷氧羰基、氧代烷基、氰基和N-(R₄)(R₅)基团取代；

R₁可为H、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、酰基和芳酰基，任选地被羟基、氨基、取代氨基、氰基、烷氧基、卤素、三卤代烷基、硝基、硫基、烷硫基、羧基和烷氧羰基取代；

R₂和R₃可为H或者可组合形成饱和或不饱和碳环或杂环，任选地以一个或多个R基团取代；

R₄和R₅可为H、烷基、烯基、炔基、环烷基和酰基，或者R₄和R₅可组合形成环，其中碳可任选地被选自O、S或N-R₆的杂原子取代。

R₆可为H、烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基烷基或羧基烷基；n可为1-5；m可为1或2，条件是当m可为1时，Q可为OH、CN、羧基烷基′、N-(R₇)(R₈)，其中R₇和R₈可为H、低级烷基(1-4C)、环烷基、芳基、酰基、酰氨基，或者R₇和R₈可组合形成饱和或不饱和杂环，任选地由达3个另外的杂原子例如N、O和S取代；或者-NH-杂环，其中杂环可为噻唑、

唑、异

唑、吡啶、嘧啶和嘌呤；当m可为2时，Q可为2-10个碳的间隔基，为直链或支链、手性或非手性、环状或非环状、饱和或非饱和烃基例如苯基。

本说明书中所使用的三芳基甲烷的实例包括但不限于1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑(克霉唑；上述Ishii等，(1997)；上述Joiner等，(1997)；和上述Logsdon等，(1997))；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺(ICA-17043；Stocker等，(2003)Blood 101：2412-2418)；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑(TRAM-34；Wulff等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：8151-8156；在此将其以其整体引入作为参考)；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；和1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。其他小分子是本领域公知的。参见McNaughton-Smith等，(2008)J.Med.Chem.51：976-982；上述Wulff(2007)；和国际专利申请公开WO 2007/033307；在此将每一篇以其整体引入作为参考)。

所需化合物可包括2，2-双-(4-氟苯基)-3-甲基-丁酰胺(下图)，公开于WO03/059873(授权的美国专利7,208,527 B2)和(WO09/027292)，在此将其引入作为参考：

本发明的K_ATP通道阻断剂可包括以下结构式的化合物：

其中R₁、R₂、R₃和R₄可分别选自金刚烷基、氢、1-8个碳原子的烷基，包括，5-8个碳原子的环烷基，包括，苯基、苯烷基，其中烷基可为1-3个碳原子，包括，单取代或二取代苯基或苯烷基的苯基部分，其中取代基可相同或不同地选自以下基团：1-3个碳原子的烷基，包括，卤素、三氟甲基和1-3个碳原子的烷氧基，包括，卤素和三氟甲基；氢和1-8个碳原子的烷基，包括，5-8个碳原子的环烷基，包括，当与它们所连接的氮原子一起时形成具有亚甲基的饱和杂环时，或者氮原子与氢或1-3个碳原子的烷基偶联时，包括，氧；或硫。当杂环具有亚甲基时，所述杂环可有4-6个碳原子。当杂环具有氧或硫时，所述杂环可为哌嗪子基(piperazino)、N-烷基哌嗪子基(N-alkylpiperazino)、吗啉代或硫吗啉代，以及其药学可接受酸加成盐。

这些K_ATP通道阻断剂可包括选自下列：2，3-丁二酮单肟；4-氨基吡啶(4-AP)；5-羟基癸酸酯；7-硝基吲唑；8-氧代-小檗碱(8-oxo-berberine)；A-184209；乙酰卡尼(acecainide)；腺苷(ATP)；真菌毒素类(Aflatrem)；ω-Agatoxin；Agitoxin-1；Agitoxin-2；Agitoxin-3；AL 275；烯丙尼定(Alinidine)ST 567；阿莫兰特(Almokalant)H 234/09；α-树突毒素(Alpha-dendrotoxin)；AM 92016；氨巴利特(Ambasilide)；氨巴利特(Ambasilide)LU 47110；AN 132；抗氧化剂；蜂毒明肽(Apamin)；ARH 050642；ATI 2042；ATP；AWD 12-260；AWD 160275；AWD 23-111；AZD 7009；AZDF 265；阿齐利特(Azimilide)；氯化钡(Barium chloride)；Bay K8644(R)-(+)-型；BDS-I；BDS-II；苄普地尔(Bepridil)；小檗浸碱(Berlambine)；柏托沙米(Bertosamil)；β-银环蛇毒素(Beta-bungarotoxin)(beta-BuTX)；β-树突毒素(Beta-dendrotoxin)；BHA 0388；BMS 208782；BMS 208783；BRBI 28；溴苄胺(Bretylium)；BRL 32872；溴化树突毒素(Bromide dendrotoxin)；BTS 67582；布比卡因(Bupiva-caine)；琥珀酸卡沙群(Carsatrin Succinate)RWJ 24517；华厚壳桂碱(Caryachine)；CGX1007；常咯啉(Changrolin pyrozoline)；北非蝎毒素(Charybdotoxin)；Charylotoxin；CHF 1522格列本脲环糊精复合物(CHF 1522 Cyclo-dextrincomplex of glibenclamide)；氯磺丙脲(Chiorpropamide)；色原烷醇293异构体(Chromanol 293 isomer)；色原烷醇293 B(Chromanol 293B)；西苯唑啉(Cibenzoline)；苯嘧吲哚(Ciclazindol)；氯米卡兰HMR 1098(Clamikalant HMR1098)；氯米卡兰HMR 1883(Clamikalant HMR 1883)；黄皮酰胺(-型)(Clausenamide(-form))；黄皮酰胺(消旋)(Clausenamide(racemic))；氯非铵LY 150378(Clofilium LY 150378)；甲苯磺酸氯非铵(Clofilium tosylate)；Clotrimaxole；克霉唑(Clotrimazole)；CNS 1237；CP 308408；CP 339818；CP 366660；CP 92713；CPU 86017；氰基胍(Cyanoguanidine)；树突毒素(Dendrotoxin，DTX)；树突毒素I(Dendrotoxin I，DTX-I)；树突毒素K(Dendrotoxin K，DTX-K)；地喹氯铵(Dequalinium chloride)；右索他洛尔BMY(Dexsotalol BMY)；057631D d-索他洛尔(057631D d-sotalol)；荷包牡丹碱(Dicentrine)；二甲亚砜；(DKAH 269)；(DMP 543)；多非利特(Dofetilide)；DPC 543；DPI 201106；决奈达隆SR 33589(Dronedarone SR 33589)；DTX，α-型(DTX，α-type，α-DTX)；DTX，β-型(DTX，β-type，β-DTX)；DTX，γ-型(DTX，γ-type，γ-DTX)；DTX，σ-型(DTX，σ-type，σ-DTX)；E-4031；依法克生(Efaroxan)；EGIS 7229；恩格列酮(Englitazone)；艾生利特(+/-型)(Ersentilide(+/-form))；艾生利特S-型(Ersentilide(S-form))；乙醇；吴茱萸胺(S)(Evodiamine(S))；氨吡啶4-氨基比林EL 970(Fampridine 4-aminopyridine EL970)；福辛普利拉(Fosinoprilat)；γ-树突毒素(Gamma-dendrotoxin)；GEA 857；格来色林MDL 11939(Glemanserin MDL 11939)；GLG V 13；格列本脲(Glibenclamide)；格列美脲(Glimepiride)；格列吡嗪(Glipizide，GLP)；格列吡嗪K 4024(Glipizide K 4024)；格列吡嗪TK 1320(Glipizide TK 1320)；胰高血糖素拮抗剂(Glucagons antagonists)；格列本脲(Glybenclamide)；格列本脲(Glyburide)；胍乙啶(Guanethidine)；胍盐部分(Guanidinium moieties)；GYKI16638；HA 7；HMR 1372；HMR 1402；HMR 1556；HMR 1883；羟基；伊比利亚蝎毒素(Iberiotoxin)；伊布利特(Ibutilide)；伊布利特U 70226(IbutilideU 70226)；ICA 17043；ICI 181037；SK4通道阻断剂(SK4 Channel Blocker)；IMID-1M；IMID-26F；IMID-4F；IMID-4F盐酸盐(IMID-4F hydrochloride)；咪唑啉部分(Imidazoline moieties)；lpazilide WIN 54177；伊匹达克林NIK 247(Ipidacrine NIK 247)；伊伐布雷定(Ivabradine)；JKL 1073A氧化小檗碱(JKL1073A oxy-berberine)；JTV 519；卡利蝎毒素(Kaliotoxin)；KCB 328；KMC IV84；KW 3407；L 691121；L 702958；L 706000；L 735821；L 742084；L 768673；L755860及相关化合物；左司莫地尔SA 3212(Levosemotiadil SA 3212)；左司莫地尔SD 3212(Levosemotiadil SD 3212)；Limbatoxin；Limbatustoxin；鹅掌揪碱(Liriodenine)；Lq2；LQE 908匹诺卡兰(LQE 908 Pinokalant)；LY190147；LY 97241；玛格(斑蝎)毒素(Margatoxin)；米格列奈(Mitiglinide KAD1229 S-21403)；MK 499；N 3601；N-allyl secoboldine；那格列奈(Nateglinide)；那格列奈AY 4166(Nateglinide AY 4166)；神经肽Y(Neuropeptide Y)；Nibentan；尼非卡兰MS 551(Nifekalant MS 551)；盐酸尼古地平S(+)-型(Niguldipine hydrochloride S(+)-form)；NIP 142；NOS抑制剂；Noxiustoxin；NS 004；NS 1546；OPC 88117；ORG 20781；Pandinotoxin-Kα；雀裨麦角生物碱(Paspalitrem)；Paxilline；PD 157667；震颤毒素-A(Penitrem A)；PGE844384；苯环利定(Phencyclidine)；酚妥拉明(Phentolamine)；酚妥拉明(Phentolamine)；吡美诺Cl845(Pirmenol Cl845)；Pirocixan；PNU 18177A；PNU 37883A；PNU 89692；PNU 94126；PNU 94158；PNU 94563；PNU 94750；PNU 96179；PNU 96293；PNU 97025E；PNU 99963；吡啶并三唑(Pyridotriazoles)；奎尼丁(Quinidine)；奎宁(Quinine)；奎宁半硫酸盐(Quininehemisulfate salt)；瑞格列奈AGEE 623(Repaglinide AGEE 623)；瑞格列奈NN623(Repaglinide NN 623)；瑞格列奈(Repaglinide)；利莫那班SR 141716(Rimonabant SR 141716)；利索利特(Risotilide)；Ro034563；罗哌卡因AL 281(Ropivacaine AL 281)；罗哌卡因LEA 103(Ropivacaine LEA 103)；RP 58866；RP 66784 RSD 1000；RSD 1019；吴茱萸次碱(Rutaecarpine)；RWJ 28810；RX 871024；S 16260；S 9947；水杨醛肟(Salicylaldoxime)；海藻毒素(Saxitoxin)；SB 237376；Scyllatoxin；SDZ DNJ 608；司美利特(Sematilide)；司美利特CK 1752(Sematilide CK 1752)；司美利特ZK 110516(Sematilide ZK110516)；辛那米宁(Sinominine)；5-羟基癸酸钠(Sodium 5-hydroxydecanoate)；索他洛尔(Sotalol)；SPM 928；螺朵林(Spriadoilne)；SSR 149744B；Stichodactylatoxin；磺酰脲(Sulfonylureas)；四乙铵(TEA，tetraethylammonium)；替地沙米(Tedisamil)；替地沙米KC 8857(Tedisamil KC 8857)；特立卡兰RP 62719(Terikalant RP 62719)；Tertiapin；Tertiapin-Q；氯化四乙铵(Tetraethylammonium chloride)；四乙铵离子(Tetraethylammonium ions)；河豚毒素(Tetrodotoxin)；TH 9121；TH 9122；Tityustoxin K；Tityustoxin-Kα；TMB-8；TN 871；妥拉磺脲(Tolazamide)；甲苯磺丁脲(Tolbutamide)；毒素治疗剂BRI 6906；TRAM 30；曲格列酮(Troglitazone)；U 37883A；U 50488H；U-37883A；U-45194A；UCL 1439；UCL 1530；UCL 1559；UCL1608；UCL1684；UK 66914；UK 78282；WAY 123223；WAY 123398；WIN 17317-3；WIN 61773；XE 991；Y 39677；YM 026；YM 19348外消旋体(YM 19348Racemate)；YM 193489-R；YM 193489-S；YT 1；扎替雷定(zatebradine)；ZM 181037；ZM 181037；ZM 244085。参见WO 2007/009462，在此将其引入作为参考。

所研究化合物还可包括具有以下结构式的那些化合物：

其中m、n和p可分别选自0和1，且m、n和p中至少一个可为1。

在一个例示性实施方案中，当m、n和p都为1时，环1和环2的氟取代基分别位于乙酰胺取代基的邻位、乙酰胺取代基的间位和乙酰胺取代基的对位的位置，环3的取代基位于乙酰胺取代基的邻位、乙酰胺取代基的对位的位置。在另一个例示性实施方案中，当p为0，m为1，n为1时，环1的氟取代基为乙酰胺取代基的对位，环2的取代基位于选自乙酰胺取代基邻位和乙酰胺取代基对位的位置。参见WO 2007/075849，在此将其引入作为参考。

所研究化合物还可包括具有以下结构式的那些：

其中环体系Z可为取代或未取代的芳基，以及取代或未取代的五元杂环。符号A代表-NHS(O)₂-、-S(O)₂NH-、-C(R³R⁴)S(O)_n-或-S(O)_n，C(R³R⁴)-，其中R³和R⁴分别选自氢、取代或未取代的低级烷基、OR⁵和-CF₃。符号R⁵代表氢、取代或未取代的低级烷基或-CF₃。整数n选自0-2。符号R¹代表取代或未取代的芳基，取代或未取代的杂芳基，取代或未取代的(C₅-C₇)碳环或者取代或未取代的(C₅-C₇)杂环；

其中环体系Z可选自取代或未取代的芳基，以及取代和未取代的五元杂环。符号R¹代表取代或未取代的芳基，取代或未取代的杂芳基，取代或未取代的(C₅-C₇)碳环或者取代或未取代的(C₅-C₇)杂环。符号R²代表COOR⁶，取代或未取代的2-呋喃，取代或未取代的2-噻唑或者

符号R⁶代表取代或未取代的C₁-C₄烷基，例如甲基、乙基和-CF₃。X代表-N＝N-、-N＝C(R⁷)-、-C(R⁷R⁸)-C(R⁷R⁸)-或-C(R⁷)＝C(R⁸)-，其中R⁷和R⁸分别代表氢、取代和未取代的低级烷基或者-CF₃。符号Y代表O、NR⁹或S，其中R⁹为H、低级烷基或-CF₃；

其中，m、n和p可分别选自0和1，且m、n和p中至少一个为1；当m、n和p都为1时，环1和环2的氟取代基分别位于乙酰胺取代基的邻位、乙酰胺取代基的间位和乙酰胺取代基的对位的位置，环3的取代基可位于乙酰胺取代基的邻位、乙酰胺取代基的对位的位置；当p为0，m为1，n为1时，环1的氟取代基为乙酰胺取代基的对位，环2的取代基位于乙酰胺取代基的邻位和乙酰胺取代基的对位的位置；

其中，m、n和p可分别选自0和1，且m、n和p中至少一个为1。

其中m为0或者1；

所研究化合物还可包括具有以下结构式的那些：

其中，环体系Z可选自取代或未取代的芳基，5-7元未取代的碳环，4-8元取代或未取代的碳环，4-8元取代或未取代的杂环，以及4-8元取代或未取代的杂芳基；X可选自-NHS(O)₂-、-S(O)₂NR³-和NHC＝NR³基团，其中R³可选自H，及取代或未取代的(C₁-C₄)烷基；

R1可选自取代或未取代的芳基，取代或未取代的杂芳基，取代或未取代的(C₅-C₇)碳环，以及取代或未取代的(C₅-C₇)杂环；R²可为选自-Cl、-CF₃、-CO₂R⁴、取代或未取代的芳基、5-6元取代或未取代的杂环，以及5-6元取代或未取代的杂芳基的成员，其中R⁴可为取代或未取代的(C₁-C₄)烷基，其任选地与环体系Z连接，形成5-7元内酯；其中标记*的两个碳之间的双键可为环体系Z内环的。参见WO 03/074038，在此将其引入作为参考。

用于本发明中的羰基氨基衍生物包括：

其任何对映异构体或者对映异构体的任何混合物，或者其药学可接受加成盐，其中A可为CH或N；R可为氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基-烷基、烷氧基或CF₃；Y代表氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烷基-烷基或者下式的基团：

其中R¹、R²和R³彼此独立，可为氢、卤素、CN、NO₂或CF₃；I可为0、1、2、3、4、5或6；m、n和o彼此独立，可为0、1或2。

或者，m、n和o彼此独立，可为0或1；

其中I、m、n、Y、R、R¹和R²如上述定义。

或者，本发明的羰基氨基衍生物可为式II的化合物，其中Y可为烷基、环烷基、环烷基-烷基或烯基；I可为0；m和n彼此独立，可为0或1；R代表氢。

或者，式II的羰基氨基衍生物可为N-戊基-2，2-二苯基-乙酰胺；N-己基-2，2-二苯基-乙酰胺；N-环丙基甲基-2，2-二苯基-乙酰胺；或N-己-2-烯基-2，2-二苯基-乙酰胺；或者其药学可接受加成盐；

其中R¹、R²和R³如上述定义。

或者，本发明的羰基氨基衍生物可为式III的三芳基甲烷，其中R¹、R²和R³彼此独立，可为氢或氟。

或者，所述三芳基甲烷衍生物可选自：2，2，2-三苯基-乙酰胺；2-(2-氟-苯基)-2，2-二苯基-乙酰胺；2-(2-氟-苯基)-2，2-二苯基-乙酰胺；2-(4-氟-苯基)-2，2-二苯基-乙酰胺；2，2-双-(2-氟-苯基)-2-二苯基-乙酰胺；2-苯基-2-(2-氟-苯基)-2-(4-氟-苯基)-乙酰胺；2，2-双-(2-氟-苯基)-2-苯基-乙酰胺；2，2-双-(4-氟-苯基)-2-苯基-乙酰胺；或者其药学可接受加成盐；

其中式R¹、R²和R³如上述定义。

或者，本发明的三芳基甲烷可为式IV，其中R¹、R²和R³彼此独立，代表氢或氟。

或者，本发明的三芳基甲烷衍生物可选自2，2，2-三-(2-氟-苯基)-乙酰胺；2，2-双-(2-氟-苯基)-2-(4-氟-苯基)-乙酰胺；2，2-双-(4-氟-苯基)-2-(2-氟-苯基)-乙酰胺；2，2，2-三-(4-氟-苯基)-乙酰胺；或者其药学可接受加成盐；

其中I、m、n、Y、R、R¹和R²如上述定义。

或者，本发明的羰基烷基衍生物可为式V，其中Y代表烷基、环烷基、环烷基-烷基或烯基；I可为0；m和n彼此独立，可为0或1；R可为氢；R¹和R²彼此独立，可为氢或氟。

羰基氨基衍生物因此可选自(RS)-N-环丙基甲基-2-苯基-2-吡啶-2-基-乙酰胺；(RS)-2-(3，4-二氟-苯基)-N-己基-2-吡啶-2-基-乙酰胺；或(RS)-N-己基-2-(4-硝基苯基)-2-吡啶-3-基-乙酰胺；或其药学可接受加成盐。参见WO03/004101，在此将其引入作为参考。

所研究化合物还可包括具有以下结构式的那些化合物：

其中，m、n和p可分别选自0和1，且m、n和p中至少一个为1；当m、n和p都为1时，环1和环2的氟取代基可分别位于乙酰胺取代基的邻位、乙酰胺取代基的间位和乙酰胺取代基的对位的位置，环3的取代基可位于乙酰胺取代基的邻位、乙酰胺取代基的对位的位置；当p为0，m为1，n为1时，环1的氟取代基可为乙酰胺取代基的对位，环2的取代基可位于乙酰胺取代基的邻位和乙酰胺取代基的对位的位置；

其中，m、n和p可分别选自0和1，且m、n和p中至少有一个为1；

其中m可为0或1。参见WO 00/50026，在此将其引入作为参考。

用于本发明中的其他小分子可包括：莫鲁蝎毒素(maurotoxin)(Castle等，(2003)Mol.Pharmacol.63：409-418)。用于本说明书中的其他小分子还可包括国际专利申请公开WO 97/034589、WO 99/026628、WO 99/026929、WO2000/050026、WO 2000/069439、WO 2000/069794、WO 2000/069823、WO2001/049663、WO 2004/016221、WO 2005/003094、WO 2005/003143、WO2006/084031和WO 2009/027292中公开的那些；在此将每一篇以其整体引入作为参考。

如本文所用的，“有效量(effective amount)”或“治疗有效量(therapeuticallyeffective amount)”(即剂量(dosage))指的是体外或体内分别提供的SK4通道抑制剂的量，其足以与编码SK4通道的核酸接触并可与其形成复合物，足以与SK4通道亚单位多肽或同源四聚体接触并可与其形成复合物(共价或非共价)，或者足以与SK4通道的上游(例如增强子、启动子等)或下游(例如激酶(MEK/ERK)、磷酸酶或磷酸化酶)效应物接触并可与其形成复合物。此外，SK4通道抑制剂的有效量或治疗有效量是足以实现预期作用的量，例如减少SK4通道mRNA，降低SK4通道活性，或降低SK4通道下游区元件的功能的量。例如，这可能是用于预防或克服多种免疫疾病例如关节炎、过敏症或哮喘的SK4通道抑制剂的量。SK4通道抑制剂的治疗有效量将取决于欲治疗的受试者，障碍或疾病的严重程度，以及给药方式。或者，该剂量可为达到类似于体外产生所述效应的靶组织浓度的量。

关于SK4通道抑制剂的治疗有效量，可通过体外或体内动物研究来确定。可向受试者给药治疗有效量(即剂量)，以提供类似于在动物试验中显示有效的靶组织浓度。预期基因修饰动物对于增加SK4通道表达、活性和功能可能是有用的。可利用的基因修饰动物的实例包括但不限于SK4^-/-动物等。参见例如Begenisich等，(2004)J.Biol.Chem.279：47681-47687；在此将其以其整体引入作为参考。

SK4通道抑制剂的有效和治疗有效量可以并根据提供的试剂类型而变化。例如，抗-SK4通道抗体或小分子抑制剂治疗免疫系统疾病的治疗有效量可为每天约0.0001mg/kg至约200mg/kg体重，或者为每天每个受试者约0.1mg至约20g。例如，通过每天每公斤体重给药约0.001mg至约100mg小分子(例如三芳基甲烷)，或者每天每个受试者约0.5mg至约10g，可有效治疗骨质疏松症。

如上所述，所述组合物还可包括治疗剂或其组合。治疗剂的实例包括但不限于抗骨丢失剂、抗炎剂、免疫抑制剂和化疗剂。

抗骨丢失剂的实例包括但不限于钙和维生素D；双磷酸盐(如阿仑膦酸钠

Merck & Co.，Inc.；Whitehouse Station，NJ)、利塞膦酸盐

Procter & Gamble Pharmaceuticals；Cincinnati，OH)，和伊班膦酸盐

Hoffman-La Roche Inc.；Nutley，NJ))；雌激素替代疗法(estrogenreplacement therapy)；甲状旁腺激素(parathyroid hormone)和特立帕肽(teriparatide)

Eli Lilly & Co.；Indianapolis，IN)；雷尼酸锶(strontiumranelate)或

Servier Laboratories；Neuilly，France)；选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulators)如雷洛昔芬(raloxifene)

Eli Lilly & Co.)等。

抗炎剂的实例包括但不限于甾类(steroids)，如糖皮质激素(glucocorticoids)(如皮质醇(cortisol)、泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednislone)和氢化可的松(hydrocortisone))；非甾类抗炎剂，如对乙酰氨基酚、阿司匹林、布洛芬、吲哚美辛(indomethacin)、双氯芬酸(diclofenac)、联苯吡胺(difenpiramide)、芬布芬(fenbufen)、氟芬那酸(flufenamic acid)、酮洛芬(ketoprofen)、甲氯灭酸钠(meclofenamate sodium)、甲芬那酸(mefenamic acid)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、吡罗昔康(piroxicam)、舒洛芬(suprofen)和噻洛芬酸(tiaprofenic acid)；具有抗炎性质的草药如牛膝草(hyssop)、姜(ginger)、姜黄根(turmeric)、山金车(Arnica montana)(其包含锦鸡菌素(helenalin)，倍半萜内酯)、柳树皮(willow bark)(其包含水杨酸)等。

免疫抑制剂的实例包括但不限于神经钙蛋白(calcineurin)抑制剂如环孢菌素(cyclosporine)和他克莫司(tacrolimus)；降钙素基因相关肽(calcitoningene-related peptide)(参见美国专利5,635,478和5,858,978，在此将这两篇以其整体引入作为参考)；mTOR抑制剂如西罗莫司(sirolimus)和依维莫司(everolimus)；抗增殖剂如硫唑嘌呤(azathioprine)和麦考酚酸(mycophenolicacid)；皮质类固醇如泼尼松龙(prednisolone)和氢化可的松(hydrocortisone)；抗体如单克隆抗-IL-2Rα受体抗体(例如巴利昔单抗(Basiliximab)(

Novartis Pharmaceutical Corp.；East Hanover，NJ)，和达克珠单抗(Daclizumab)

Hoffman-La Roche Inc.))；多克隆抗-T-细胞抗体；抗胸腺细胞球蛋白(ATG)；抗淋巴细胞球蛋白(ALG)等。

化疗剂的实例包括但不限于烷化剂如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氮芥(mechlorethamine)和奥沙利铂(oxaliplatin)；针对肿瘤抗原的抗体；抗代谢药如硫唑嘌呤(azathioprine)和巯嘌呤(mercaptopurine)；蒽环类如柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)和戊柔比星(valrubicin)；植物生物碱如鬼臼毒素(podophyllotoxin)、紫杉烷(taxanes)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)和长春地辛(vindesine)；拓扑异构酶抑制剂例如I型拓扑异构酶抑制剂(如喜树碱(amptothecins)、伊立替康(irinotecan)和托泊替康(topotecan))和II型拓扑异构酶抑制剂(如安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)和替尼泊苷(teniposide))；其他抗肿瘤剂如放线菌素D(dactinomycin)、博来霉素(bleomycin)及其他；等。

细胞-细胞融合的激活

在一些情况下，可用SK4通道激活剂刺激SK4通道活性或功能以促进细胞融合，尤其是在其可能用于增加融合细胞(破骨细胞)的情况下。这样的情况包括骨密度异常增加的患者、患慢性感染的患者或者患骨硬化症的患者。骨硬化症也称为大理石状骨病(marble bone disease)和阿耳伯斯·尚堡病(Albers-Schonberg disease)，它是一种罕见的遗传疾病，其中骨变硬，密度增高。患骨硬化症的患者的骨容易比正常人的骨更脆。

SK4通道活性或功能的激活剂的实例包括但不限于1-乙基-2-苯基咪唑啉酮。

本发明包括组合物，其含有有效量的SK4通道激活剂，任选地含有治疗由源自巨噬细胞的多核细胞介导的疾病或障碍的治疗剂。在一个实施方案中，提供一种组合物，其包括有效量SK4通道激活剂和治疗剂。在其他实施方案中，提供一种药物组合物，其包括治疗有效量的SK4激活剂和治疗剂，以及药学可接受载体。

如本文所用的，“SK4通道激活剂(SK4 channel activator或SK4 channelactivating agent)”指的是影响SK4通道表达(即翻译或转录)、SK4通道活性(即传导)，或者上游和下游SK4通道效应物(即启动子激活剂、诱导剂、抑制剂、阻抑剂、激酶等)以促进SK4通道活性的试剂。在一些实施方案中，所述SK4通道激活剂可以是设计成结合SK4通道并调节其功能(即去极化或再极化的能力)的蛋白。或者，所述SK4通道激活剂可以是特异性结合SK4通道并促进其活性或功能的小分子。

无论SK4通道激活剂的真实性质如何，它都增加SK4通道表达、活性或功能的一个或多个。与适当对照相比，表达、活性或功能统计学显著量的增加包括但不限于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％。优选地，所述SK4通道表达、活性或功能增加至少约10％或更多。反之，SK4通道激活剂不应当在统计学上降低SK4通道表达、活性或功能。

包含抑制剂或激活剂的药物组合物

当组合物为药物组合物时，其还可包括药学可接受载体。如本文所用的，“药学可接受载体”指的是非生物学、非生理学材料，否则不可取，即所述材料可以在处方或组合物中向受试者给药而不引起任何不需要的生物学或生理学效应，或不以有害方式与包含其的组合物的任何成分相互作用。

应用的药学可接受载体可为固体、液体或气体。固体载体的实例包括但不限于乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体的实例包括但不限于糖浆、花生油、橄榄油、水和盐水。气体载体的实例包括但不限于二氧化碳和氮气。

除了药学可接受载体之外，所述药物组合物可适当包括一种或多种另外的添加物，例如稀释剂、缓冲剂、调味剂、粘合剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等。此外，可包括其他佐剂，使得静脉注射给药处方与受试者血液等渗。

所需添加物包括但不限于pH控制剂，如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸等。此外，可包括局部麻醉药(如苯甲醇)，等渗剂(如氯化钠、甘露醇或山梨醇)，吸附抑制剂(如)、增溶剂(如环糊精及其衍生物)、稳定剂(如血清白蛋白)、还原剂(如谷胱甘肽)以及防腐剂(如抗菌剂和抗氧化剂)。

口服的药物组合物可以以本领域公知的任何形式制备。例如可以利用水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等形成口服液体制剂，如悬浮液、酏剂和溶液，而可以利用载体例如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等形成口服固体制剂如粉剂、胶囊剂和片剂。

在片剂中，SK4通道抑制剂或激活剂可通过压缩或模压制备，任选地含一种或多种辅助成分或佐剂。可通过在合适的机器中压缩散粒形式(例如粉末或颗粒)的SK4通道抑制剂或激活剂来制备压缩片剂，非强制性选择与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂或者其他这样的赋形剂混合。这些辅料可例如为惰性稀释剂如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒和崩解剂如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可为无包衣片，或者可利用已知技术将片剂包衣以延缓在胃肠道中崩解和吸收，从而提供较长时间的持久作用，尤其是用于治疗免疫系统疾病例如炎性肠病(IBD)或过敏性肠综合征(IBS)。例如，可使用时间延迟材料如单硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯。

在硬胶囊中，SK4通道抑制剂或激活剂可与惰性、固体稀释剂混合，例如碳酸钙、磷酸钙或白陶土。相反，在软胶囊中，SK4通道抑制剂或激活剂可与水或油介质混合，例如花生油、液状石蜡或橄榄油。可通过在合适的机器中，模压润湿的粉末SK4通道抑制剂或激活剂与惰性液体稀释剂的混合物来制备模压片。

例如，意欲向人类受试者口服给药的药物组合物可包含约0.5mg至约5g SK4通道抑制剂或激活剂，与适当且合适量的药学可接受载体混合，所述药学可接受载体可在总组合物的约5％至约95％之间变化。单位剂型通常将包含约1mg至约2g的SK4通道抑制剂或激活剂，通常约25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg的SK4通道抑制剂或激活剂。

胃肠外给药的药物组合物可制备成含SK4通道抑制剂或激活剂的水溶液或悬液。合适的表面活性剂可包括例如羟丙基纤维素。药物组合物还可以以甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物来制备。或者，所述药物组合物可以脂质体制备。参见例如Langer(1990)Science 249：1527-1533；和Treat etal.，353-365 In：Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer(Lopez-Berestein & Fidler eds.，Liss，N.Y.1989)。此外，可包括防腐剂以预防微生物的有害生长。

同样，用于注射的药物组合物可制备成无菌水溶液或分散液。或者，所述组合物可以以无菌粉末的形式用于无菌可注射溶液或分散液。最终可注射形式必须是无菌的，必须是易于给药的有效液体。所述药物组合物在制备和储存的条件下必须稳定，因此优选地应保存防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。这样，所述药学可接受载体可为溶剂或分散剂，包含例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、植物油及其适当的混合物。

例如，意欲向人类受试者胃肠外给药或注射的药物组合物可包含约0.5mg至约5g的SK4通道抑制剂或激活剂，与适当且合适量的药学可接受载体混合，所述药学可接受载体可在总组合物的约5％至约95％之间变化。单位剂型通常将包含约1mg至约2g的SK4通道抑制剂或激活剂，通常约25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg的SK4通道抑制剂或激活剂。

局部给药的药物组合物可例如制备成气雾剂、乳膏、软膏剂、洗剂、扑粉(dusting powder)等。或者，所述药物组合物可为适合于用于透皮设备中的形式。这些药物组合物可用本领域公知的方法制备。例如，乳膏或软膏剂可通过混合水制备，与约5wt％至约10wt％的粘合剂一起，以制备具有所需稠度的乳膏或软膏剂。

例如，意欲向人类受试者局部给药的药物组合物可包含约0.5mg至约5g的SK4通道抑制剂或激活剂，与适当且合适量的药学可接受载体混合，所述药学可接受载体可在总组合物的约5％至约95％之间变化。单位剂型通常将包含约1mg至约2g的SK4通道抑制剂或激活剂，通常约25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg的SK4通道抑制剂或激活剂。

直肠给药的药物组合物可与固体药学可接受载体一起制备。优选地，混合物形成单位剂量栓剂。合适的药学可接受载体包括可可脂和其他本领域通常使用的增稠剂。首先将组合物与软化或融化的药学可接受载体混合，然后在模具中冷却并成型，方便地得到栓剂。

例如，意欲向人类受试者直肠给药的药物组合物可包含约0.5mg至约5g的SK4通道抑制剂或激活剂，与适当且合适量的药学可接受载体混合，所述药学可接受载体可在总组合物的约5％至约95％之间变化。单位剂型通常将包含约1mg至约2g的SK4通道抑制剂或激活剂，通常约25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg的SK4通道抑制剂或激活剂。

吸入给药的药物组合物可以剂型制备，利用本领域已知的载体。参见例如Zeng et al.，In：Particulate Interactions in Dry Powder Formulations forInhalation(Informa HealthCare 1^st ed.2000)。

例如，意欲向人类受试者吸入给药的药物组合物可包含约0.5mg至约5g的SK4通道抑制剂或激活剂，与适当且合适量的药学可接受载体混合，所述药学可接受载体可在总组合物的约5％至约95％之间变化。单位剂型通常将包含约1mg至约2g的SK4通道抑制结合剂(inhibiting binding agent)，通常约25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg的SK4通道抑制剂或激活剂。

除了SK4通道抑制剂或激活剂之外，所述组合物和药物组合物可包括一种或多种其他治疗剂，以治疗潜在疾病或障碍，将在下文详细讨论。用于本说明书中的其他治疗剂的实例包括但不限于抗炎剂(即甾体和非甾体抗炎剂)、抗骨丢失剂和化疗药物(即烷化剂、抗代谢药、植物生物碱和萜类化合物以及拓扑异构酶抑制剂)。

所述组合物和药物组合物可包括诱变的巨噬细胞，在SK4通道基因中携带突变，其中所述突变降低或排除SK4通道单体的表达，或抑制编码的SK4通道单体的活性。

关于本发明组合物的上述讨论，术语“约”指的是在统计学上有意义的范围值之内，例如一定的浓度范围、剂量或组合物中成分的值。这样的范围可在一个数量级之内，通常在给定值或范围的20％内，更通常仍在10％内，甚至更通常在5％内。术语“约”包括的允许偏差将取决于该术语使用的特定语境，可容易地被本领域普通技术人员理解。

调节细胞-细胞融合的方法及其治疗和筛选应用

在一些实施方案中，本发明的方法包括使巨噬细胞与有效量的SK4通道抑制剂或激活剂接触，从而分别降低或增加巨噬细胞融合。如上文所述，SK4通道抑制剂或激活剂可为影响SK4通道表达(即翻译或转录)、SK4通道活性(即传导)，或者上游和下游SK4通道效应物(即启动子激活剂、诱导剂、抑制剂、阻抑剂、激酶等)的试剂，只要其有效降低或增加SK4通道表达、活性或功能。

在抑制SK4通道活性中，不受任何理论或作用机制的约束，在有融合可能性或正处于融合过程中的巨噬细胞内，SK4通道抑制剂对SK4通道表达、活性或功能的抑制作用导致巨噬细胞融合减少。“融合可能性(potential tofuse)”指的巨噬细胞存在于有助于巨噬细胞融合的周围环境内。例如，在体外条件下，例如将用于筛选方法中(如本说明书下文所述的筛选方法)，有融合可能性的巨噬细胞将包括先前未融合但当前暴露于成融条件(即促进或助长巨噬细胞融合的条件，如本说明书下文所述)的巨噬细胞群。在体内条件下，有融合可能性的巨噬细胞将包括先前未融合的巨噬细胞群，其暴露于促进或助长巨噬细胞融合的体内环境。因此，有融合可能性的巨噬细胞可为位于体内环境中的静止的(stationary)(即固定的(fixed))巨噬细胞，或者可为迁移到体内环境中的巨噬细胞。类似地，在体内条件下，正处于融合过程中的巨噬细胞可包括存在于体内环境中的静止的巨噬细胞，和/或移动至体内环境的巨噬细胞，其中所述环境促进或助长巨噬细胞融合。

本说明书中上述的任何SK4通道抑制剂或激活剂可方便地用于本发明的方法中，以降低(即抑制)或增加巨噬细胞融合，或者在体外环境或者在体内环境。巨噬细胞融合将在体内环境中被抑制时，使目标在于降低细胞融合的巨噬细胞与治疗有效量的SK4通道抑制剂接触，其中所述治疗有效量根据所需结果(例如治疗由源自巨噬细胞的多核细胞介导的疾病或障碍)确定。同样，巨噬细胞融合将在体内环境中被增加或激活时，使目标在于增加细胞融合的巨噬细胞与治疗有效量的SK4通道激活剂接触，其中所述治疗有效量根据所需结果确定。

因此，在本发明一些实施方案中，抑制巨噬细胞融合的方法包括向有融合可能性的巨噬细胞提供有效量的SK4通道抑制剂，从而阻止或降低这些细胞的融合。在其他实施方案中，抑制巨噬细胞融合的方法包括向正处于融合过程中的巨噬细胞提供有效量的SK4通道抑制剂，从而阻止或降低这些细胞的进一步融合。抑制巨噬细胞融合的方法可针对静止的(即固定的)巨噬细胞，和/或迁移到特定体内环境的巨噬细胞，可针对巨噬细胞的同型或异型融合。因此，这些方法可针对巨噬细胞-巨噬细胞融合，例如发生在破骨细胞(在骨中)和巨细胞(在多种类型其他组织中)形成中，或者针对巨噬细胞与其他类型细胞融合，例如巨噬细胞与癌细胞之间的融合，这导致转移癌细胞形成。

在一些实施方案中，与适当的对照样本相比，有效量SK4通道抑制剂降低巨噬细胞融合至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％，其中适当的对照样本包括在相同环境条件下无SK4通道抑制剂时可比较的巨噬细胞。在其他实施方案中，与适当的对照样本相比，有效量SK4通道抑制剂降低巨噬细胞融合至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(即巨噬细胞融合被阻止)。测定巨噬细胞融合的方法是本领域已知的。参见例如上述Vignery(2000)；MacLauchlan等，(2009)J.Leukoc.Biol.85：617-626；测定在本说明书下文实施例部分描述。

如本说明书上文所述，不适当或未经调节的(即异常的)巨噬细胞融合可能与炎性疾病或感染性疾病中细胞和组织损伤有关。本说明书中所述的抑制巨噬细胞融合的方法应用于治疗方法中，目的在于预防或治疗由源自巨噬细胞的多核细胞介导的疾病，包括与异常破骨细胞形成(例如骨质疏松症)、巨细胞形成(例如慢性炎性疾病)，以及转移癌细胞形成(其可触发癌症转移)有关的疾病。

如本文所用的，“预防”指的是向受试者施用或给药SK4通道抑制剂，或者向受试者施用或给药包含SK4通道抑制剂的药物组合物，其中所述受试者有针对某种疾病或医学状况(medical condition)的患病倾向，目的在于阻止受试者产生所述疾病或医学状况。例如，可向受试者给药SK4通道抑制剂或包含SK4通道抑制剂的药物组合物，所述受试者接受或将接受植入或移植手术，目的在于预防植入或移植手术的排斥。另一个实例，可向受试者给药SK4通道抑制剂，所述受试者易患骨质疏松症，目的在于预防过度骨丢失和发生骨质疏松。

在激活SK4通道的实施方案中，所述方法包括向巨噬细胞提供有效量的SK4通道激活剂，以增加细胞的融合。用于激活巨噬细胞融合的方法可针对静止的巨噬细胞，和/或迁移到特定体内环境的巨噬细胞，可针对巨噬细胞的同型或异型融合。与适当对照相比，有效量的SK4通道激活剂增加巨噬细胞融合至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％或150％。测定巨噬细胞融合的方法是公知的，如上所述。

如本文所用的，“治疗”指的是向个体施用或给药SK4通道抑制剂或激活剂，或者向受试者施用或给药包含SK4通道抑制剂或激活剂的药物组合物，其中所述受试者患有疾病或有疾病的症状，目的在于治疗(cure)、治愈(heal)、缓和(alleviate)、减轻(relieve)、改变(alter)、纠正(remedy)、改善(ameliorate)、改进(improve)或影响(affect)疾病或疾病的症状。

在本发明的一些实施方案中，抑制巨噬细胞融合的方法是直接抑制体内破骨细胞的形成，治疗目标在于预防或治疗骨丢失。通过抑制破骨细胞形成，降低了破骨细胞数量和/或破骨细胞表面积，导致破骨细胞功能整体降低，如本说明书上文所述。此外，通过抑制破骨细胞的SK4表达、活性或功能，可改变破骨细胞的功能，例如降低破骨细胞骨矿物质吸收活性。通过降低破骨细胞形成和功能，可有利地增加骨密度和/或骨厚度。这样，本发明提供预防或治疗易患或已患骨丢失的受试者中骨丢失的方法，其中所述方法包括向受试者给药治疗有效量的SK4通道抑制剂，以抑制破骨细胞形成，从而预防或降低受试者的骨丢失。这种治疗方法用于维持易患或已患骨密度丢失的受试者中的骨密度。在一个相关实施方案中，预防或治疗骨丢失的方法可包括与至少一种抗骨丢失剂联合治疗。SK4通道抑制剂和抗骨丢失剂的给药途径将受骨丢失倾向的潜在原因或实际骨丢失的影响，但可口服、静脉，甚至直接递送至骨。

其中本发明的方法可用于预防或治疗受试者中骨丢失的例示性疾病包括但不限于骨质疏松症、骨软化症、佩吉特病、牙周病和继发于其他病理状况的骨丢失(即酒精中毒、乳糜泻、慢性肾病、慢性肝病、癫痫、胃肠疾病、甲状腺功能亢进、性腺功能减退、白血病、淋巴瘤、类风湿性关节炎、坏血病和维生素D缺乏症)等。

在本发明其他实施方案中，抑制巨噬细胞融合的方法是直接抑制体内巨细胞的形成，治疗目标在于预防或治疗受试者中自身免疫或者炎性疾病或障碍。这样，本发明提供一种方法，用于预防或治疗易患或已患自身免疫或者炎性疾病的受试者中的所述疾病或障碍，其中所述方法包括向受试者给药治疗有效量的SK4通道抑制剂，以抑制巨细胞形成，从而预防或治疗受试者中自身免疫或者炎性疾病或障碍。在一个相关实施方案中，预防或治疗自身免疫或者炎性疾病或障碍的方法可包括与至少一种抗炎剂的组合治疗。SK4通道抑制剂和抗炎剂的给药途径将受自身免疫或者炎性疾病或障碍倾向的潜在原因或实际自身免疫或者炎性疾病或障碍的影响，但可口服、静脉、局部，甚至直接注射例如至发炎部位。

其中本发明的方法可用于预防或治疗自身免疫疾病或障碍的例示性疾病包括但不限于急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、阿狄森病、脱发、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性内耳病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、查加斯病、慢性阻塞性肺疾病、乳糜泻、节段性回肠炎、皮肌炎、1型糖尿病、子宫内膜异位症、肺出血肾炎综合征、格雷夫斯病、急性感染性多神经炎(GBS)、桥本病、川崎病、特发性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、多发性硬化(MS)、重症肌无力、银屑病、原发性胆汁性肝硬变、类风湿性关节炎、硬皮病、

综合征、颞动脉炎(也称为“巨细胞动脉炎”)、溃疡性结肠炎、血管炎等。其中本发明的方法可用于预防或治疗炎性疾病或障碍的例示性疾病包括但不限于痤疮、哮喘、关节硬化、慢性阻塞性肺疾病、结肠炎、皮炎、肾小球肾炎、炎性肠病、瘢痕疙瘩、肾炎、骨关节炎、盆腔炎、银屑病、类风湿性关节炎、肌腱炎等。

在本发明其他实施方案中，抑制巨噬细胞融合的方法是直接抑制体内巨细胞的形成，治疗目标在于预防受试者中植入物或移植物排斥。这样，本发明提供一种方法，用于预防受试者中植入物或移植物排斥，所述受试者经受或将经受植入或移植手术，其中所述方法包括向受试者给药治疗有效量的SK4通道抑制剂，以抑制巨细胞形成，从而预防植入物或移植物的排斥。在一个相关实施方案中，这种治疗方法可包括与至少一种免疫抑制剂的组合治疗。在适用情况下，这些方法中任一种都可包括与至少一种抗骨丢失剂的组合治疗，例如在植入物直接治疗骨相关疾病或障碍的情况下。SK4通道抑制剂以及免疫抑制剂和/或抗骨丢失剂的给药途径将受植入物或器官/组织移植物的类型影响，但可口服、静脉、局部、直接递送植入物，或者包被或浸渍植入物。

其中本发明的方法可用于预防排斥的例示性植入物包括但不限于人工耳蜗装置、人造膝关节、人工髋关节、骨接合剂、乳房植入物、心脏植入物(例如人工心脏瓣膜、除颤器、左心室辅助装置和起搏器)、皮肤植入物、胃带或囊、留置导尿管、胰岛素泵、宫内避孕器、神经刺激器、眼植入物、骨科植入物、阴茎勃起假体、支架、尿道吊带、语音假体等。本发明的方法可用于预防排斥的例示性移植物包括但不限于骨和骨髓移植、角膜移植、心脏和心脏瓣膜移植、肠移植、肾移植、肢体移植、肝移植、肺移植、胰腺移植、血小板输注、红细胞输注、皮肤移植、干细胞移植、肌腱移植、血管移植、白细胞输注等。

在本发明其他实施方案中，抑制巨噬细胞融合的方法是直接抑制体内转移细胞的形成，治疗目标在于预防受试者中癌症转移。这样，本发明提供一种方法，用于预防易于发生转移癌的受试者中的癌症转移，其中所述方法包括向受试者给药治疗有效量的SK4通道抑制剂，以抑制转移癌细胞形成，从而预防癌症转移。在一个相关实施方案中，这种治疗方法可包括与至少一种其他形式的抗癌治疗的组合治疗，所述其他形式的抗癌治疗例如手术或外科手术，或者给药另一种抗癌治疗剂，如化疗剂、抗癌抗体、基于小分子的癌症治疗或者基于疫苗/免疫疗法的癌症治疗。SK4通道抑制剂以及其他抗癌治疗剂(如果给药)的给药途径将受原发肿瘤的类型和位置以及转移的可能部位的影响，但可口服、静脉、局部，或直接递送至原发肿瘤。

本发明的方法可用于预防其转移的例示性癌症包括但不限于骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、喉癌、子宫癌等。

取决于接受治疗的疾病或障碍、对SK4通道抑制剂或SK4通道激活剂的临床反应、单独或与另一种治疗剂或方案组合，可利用本领域已知的任何可接受方法评估，包括但不限于筛选方法例如磁共振成像(MRI)扫描，x射线成像，显微CT，计算机断层(CT)扫描，生物发光成像如荧光素酶成像，骨扫描成像，肿瘤活检取样包括骨髓穿刺(BMA)、流式细胞术或者荧光激活细胞分类仪(FACS)分析，组织学，肉眼病理学和血液化学，包括但不限于利用ELISA、RIA、色谱法等可检测到的变化。

在以上所述的任何治疗方法中，SK4通道抑制剂或激活剂的治疗有效量在整个治疗期中可以以大约相同的治疗有效量(即剂量)给药，以递增剂量方案或负荷剂量方案(例如，其中负荷剂量高于维持剂量)给药。或者，SK4通道抑制剂或激活剂的治疗有效量可在治疗期间变化，根据受试者欲治疗的疾病、对治疗的明显反应，和/或由本领域技术人员判断的其他因素。还可考虑以SK4通道抑制剂或激活剂的治疗有效量长期治疗。

此外，本发明的方法包括组合治疗方案时，可同时给药这些治疗，即SK4通道抑制剂或激活剂与其他治疗方案同时给药或者与其他治疗方案在相同的时间范围内给药(即治疗同时进行，但SK4通道抑制剂或激活剂不精确地与其他治疗同时给药)。或者，还可以在其他治疗之前或之后给药SK4通道抑制剂或激活剂。当联合治疗包括同时给药SK4通道抑制剂或激活剂与至少一种其他治疗剂时，所述SK4通道抑制剂或激活剂以及其他治疗剂可以以分开的药物组合物给药，或者处方在一起，以单一药物组合物给药。

此外，给药SK4通道抑制剂或激活剂可在受试者诊断为或怀疑患有疾病或障碍时开始。可接受的SK4通道抑制剂或激活剂的治疗有效量在上文讨论，将根据受试者年龄和体重、欲治疗的特定疾病或障碍、欲治疗疾病或障碍的严重程度以及给药途径而变化。本发明的治疗方法可包括单次给药治疗有效量的SK4通道抑制剂或激活剂，或者多次给药治疗有效量的SK4通道抑制剂或激活剂。

为了更清楚，按照本发明的方法治疗的受试者不是患哮喘或镰状细胞病的受试者。

本发明还提供用于鉴定通过抑制中电导钙激活钾通道(SK4通道)的表达、活性或功能从而抑制细胞-细胞融合的试剂的方法，或者用来鉴定激活细胞-细胞融合的试剂的方法。所述方法包括使细胞群与候选SK4通道抑制剂或激活剂接触，确定是否候选试剂抑制或激活细胞群内的细胞-细胞融合。特别感兴趣的是鉴定抑制巨噬细胞融合的SK4通道抑制剂，从而抑制源自巨噬细胞的多核细胞形成，包括但不限于破骨细胞、巨细胞和转移癌细胞。因此，在一些实施方案中，细胞群包括巨噬细胞；在其他实施方案中，细胞群包括至少两种细胞类型，其中一种是巨噬细胞。在一些实施方案中，细胞群包括巨噬细胞，存在于群内的第二种类型的细胞为体细胞或癌细胞。参见Vignery，″Methods to fuse macrophages in vitro，″383-395 In：Methods inMolecular Biology，Cell Fusion(Chen ed.，Humana Press 2008)；在此将其以其整体引入作为参考。

优选地，这种筛选方法在成融条件下进行。如本文所用的，“成融条件(″fusogenic conditions)”指的是有助于细胞(尤其是巨噬细胞)同型或异型融合的条件。成融条件可包括在M-CSF、RANKL和/或IL-4存在下培养细胞。

通过以下非限制性实施例，本发明将得到更充分的理解。

实施例

全基因组(genome-wide)cDNA微阵列用于鉴定属于融合机制(fusionmachinery)的基因，经鉴定KCNN4/SK4在破骨细胞和巨细胞中高表达，但仅是在巨噬细胞融合的开始时。

材料及方法

动物和细胞。如先前所述，在混合的129J/C57BL6基础上得到sk4^-/-小鼠，饲养，并进行基因分型(Begenisich等，(2004)J.Biol.Chem.279(46)：47681-47687)。将动物安置在12小时光照周期的标准笼子中，向其提供自由取用的啮齿类动物食物(Harlan Teklad#2018)和水。8周龄时将小鼠处死。小鼠第8天接受两次和处死前接受一次腹腔内(i.p.)注射钙黄绿素(5mg/kg/day)，用于动态组织形态测定分析。

试剂。MSC-F和RANKL购自PreproTech(Rocky Hill，NJ)。Phalloidin-Alexa fluor 568购自Invitrogen(Carlsbad，CA)，osteologic slides购自BD(Franklin Lakes，NJ)。组织培养所有辅助材料和试剂都是无内毒素的。除非另有说明，所有化学药品都来自于Sigma Chemical Co.(St Louis，MO)。

慢性炎性关节炎(CIA)。在第0天，通过腹膜内注射7mg(700μl)Arthrogen CIA单克隆抗体(ArthoMAB)混合物(Millipore；Billerica，MA)，在两月龄小鼠中诱导CIA。这种单克隆抗体的混合剂直接针对II型胶原的CB11区中识别的表位。在第3天，腹膜内给药50μg(＜100μl体积)脂多糖(LPS)。第4天开始，每天监测动物CIA的发病和进展，评估每只动物注射部位的感染体征，例如发热、发红和/或渗血。感觉到“冷(cold)”的小鼠可能遭受应答LPS的恶病质，使其s.c.(皮下)接受500μl温暖的林格溶液。利用可视评分系统(visual scoring system)，每天监测关节炎的严重程度。所述评分系统为0＝正常；1＝1-2个足趾的红斑和水肿；2＝＞2个足趾的红斑和水肿或者轻度红斑和水肿，通常在踝关节中；3＝中度红斑和水肿，包括跗关节；4＝重度红斑和水肿，包括跗关节和跖关节。

CIA的组织病理学评价。将福尔马林固定的关节(右侧和左侧前爪和后爪，双踝和双膝)在5％甲酸中脱钙2-3天；剪下组织，处理，用于石蜡包埋，切成8μm的切片，用甲苯胺蓝染色。对两只后爪、两只前爪和双膝进行包埋，正面切开，而踝关节在矢状面切开，或者踝关节可以在后爪正面切开。在不知晓治疗组时对所有切片评分。随后对各组做如下鉴定。当以关节炎损害来对小鼠爪或踝关节评分时，必须考虑变化的严重程度以及受影响的各关节的数量。当可能的许多掌骨/跖骨/足趾或跗骨/胫骨-跗骨关节中仅有1-3个爪或踝关节的关节受影响时，根据变化的严重程度给出针对以下参数的最高分数1、2或3的任意赋值。如果涉及超过3个关节，以下标准应用到受影响最严重的/大多数关节。炎症：0＝正常；1＝受影响关节的滑膜和关节周围组织中炎症细胞极轻浸润；2＝炎症细胞轻度浸润。如果指的是爪，通常限定在受影响的关节(1-3个受影响的)；3＝中度浸润伴有中度水肿。如果指的是爪，限定在受影响的关节，通常3-4个关节+腕或踝；4＝影响多个区域的明显的浸润伴有明显水肿，可能存在1个或2个未受影响的关节；5＝重度弥漫性浸润伴有重度水肿，影响所有关节和关节周围组织。血管翳：0＝正常；1＝软骨和软骨成骨血管翳极轻浸润，边缘区；2＝轻度浸润，受影响关节中硬组织的边缘区破坏；3＝中度浸润，受影响关节中有中度硬组织破坏；4＝明显浸润，关节结构有明显破坏，影响多数关节；5＝重度浸润，与关节结构全部或接近全部破坏相关，影响所有关节。软骨损伤：0＝正常；1＝极轻＝甲苯胺染色通常极轻至轻度缺失，受影响关节中无明显的软骨细胞缺失或胶原破坏；2＝轻度＝甲苯胺染色通常轻度缺失，在一些受影响关节中局灶区软骨细胞缺失和/或胶原破坏；3＝中度＝甲苯胺染色通常中度缺失，在受影响关节中有多病灶软骨细胞缺失和/或胶原破坏，一些基质残留在任何受影响的表面，有严重基质缺失的区域；4＝显著＝甲苯胺染色明显缺失，在多数关节中有多病灶明显的(深入至深层)软骨细胞缺失和/或胶原破坏，如果单膝表面有全部或接近全部软骨缺失；5＝重度＝甲苯胺染色严重弥散性缺失，在所有关节中有多病灶严重的(深入至潮标(tide mark))软骨细胞缺失和/或胶原破坏，如果双膝或更多的区域有全部或接近全部软骨缺失。骨质吸收：0＝正常；1＝极轻＝小面积吸收，在低倍显微镜上不明显，在受影响关节中少见破骨细胞，限定在边缘区；2＝轻度＝更大面积的吸收，在低倍显微镜上不明显，在受影响关节中破骨细胞更多，限定在边缘区；3＝中度＝髓骨小梁和皮质骨的明显吸收，无皮质全层缺损，一些髓骨小梁缺失，在低倍显微镜上损害明显，在受影响关节中破骨细胞更多；4＝显著＝皮质骨全层缺损，经常有残余皮质表面轮廓的变形，髓骨明显缺失，很多破骨细胞，影响多数关节；5＝重度＝皮质骨全层缺损，所有关节的关节结构破坏。对于每只动物，针对8个关节的每一个确定炎症、血管翳、软骨损伤和骨损伤评分。确定总计(所有8个关节)动物评分和8个关节的平均动物评分，以及各参数每一个的总和及平均值。接着利用学生t检验(Student’s t test)或其他适当分析方法比较各组与组A(载体)的参数，显著性设置为p≤0.05。

颅盖LPS/体内骨吸收测定。为了评估体内破骨细胞形成和活性，单次局部皮下颅盖注射给药脂多糖(2μl含25μg；Sigma)(见图13)。5天后处死小鼠，颅盖接受显微CT，接着经组织形态测定分析，以记录每只小鼠每一颅盖侵蚀骨质表面的百分比、颅盖密度及颅盖厚度。实验的5天中每天检查动物，包括周末和假日(若有的话)。显示出疼痛迹象的那些动物(例如，由于给药LPS预期的不良反应，可能的食欲不佳、昏睡、与同笼伙伴分离，LPS可诱导发热和体重减轻)，根据咨询兽医给药镇痛药。

骨X射线照相。利用MX-20(Faxitron X-ray Corporation，Wheeling，IL)30kV 3秒，对切断的股骨进行X射线照射。利用Epson Perfection 4870扫描X射线。

骨密度与微结构。如以前所述，利用周边定量计算机体层摄影(quantitative computed tomography)(pQCT；XCT Research M；Norland MedicalSystems，Fort Atkinson，WI)测定股骨远端距生长面0.25mm的实际1mm横截面的骨密度(Ballica等，(1999)J.Bone Mineral Res.14：1067-1074)。此外，利用微型CT扫描仪(MicroCT 40；Scanco，Bassersdorf，Switzerland)，2,048x2,048矩阵，各向同性分辨率9μm³，12μm三维像素尺寸扫描股骨远端。次级海绵骨中三维小梁的测定直接进行，如以前所述(Li等，(2005)J.Exp.Med.201：1169-1177)。

DNA微阵列。利用

Kit(Qiagen；Hilden，Germany)，从细胞样品中分离了总RNA，用于微阵列杂交，利用Affymetrix(Santa Clara，CA)的基因芯片。利用Affymetrix表达规程，使用总RNA合成cRNA。使10μg标记的片段cRNA与HG-U133Plus2.0 Array或RAT230 Plus Arrays杂交，根据厂商的使用说明书进行信号检测。

组织形态测定。将sk4^+/+和sk4^-/-小鼠的股骨和tiboiae在梯度乙醇系列中脱水，以甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate)包埋，未脱钙，如先前所述(Baron等，(1982)in Bone Histomorphometry：Techniques and Interpretation，ed.Recker等，(CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL)，pp.13-35)。股骨远端距生长面0.25mm的4μm厚横截面，以Villanueva Mineralized Bone Stain染色，用于静态组织形态测定，而8μm厚的切片不染色，用于分析动态参数。利用Osteomeasure软件(Osteometrics，Atlanta，GA)进行组织形态测定。测定了以下参数：骨占相应组织面的百分数(B.Ar/T.Ar；％)；每mm骨小梁数量(Tb.N/mm)；骨小梁占相应骨表面的百分数(Tb.Ar；％)；骨小梁之间距离/分离度(μm)；每个总的骨表面的破骨细胞数量(Oc/T.Ar)；破骨细胞周长/每个总的骨周长(Oc.Pm./B.Pm)；成骨细胞周长/每个总的骨周长(Ob.Pm/B.Pm)，矿化表面(MS/BS)，矿物质沉积率(MAR)，以及骨形成速度(BFR/BV)。

源自骨髓和脾的小鼠破骨细胞。这些细胞由4-12周龄sk4^+/+和sk4^-/-小鼠产生，如以前所述(Cui等，(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104：14436-14441；Epub 2007 August 28)。分离骨髓和脾细胞，机械分开，以1.33x10⁶个细胞/cm2的密度在MEM中培养，所述MEM中含10％热灭活胎牛血清(HyClone，Logan，UT)、100单位/ml青霉素-链霉素(Gibco Invitrogen，Carlsbad，CA)、1％MEM维生素、1％谷氨酰胺和30ng/ml M-CSF(PeproTech，Inc.Rocky Hill，NJ)。以40ng/ml的浓度加入RANKL(PeproTech，Inc.)。每3天更换培养基。为了评估肌动蛋白环(破骨细胞活性的标志)的形成，在M-CSF(20ng/ml)和RANKL(40ng/ml)存在下于载玻片上培养细胞8天，固定，与phalloidin-Alexa568和Topro-3反应。为了进一步评估吸收活性，在涂有由磷酸钙晶体构成的人工骨的Osteologic载玻片上培养细胞。8天后，裂解细胞，按照供应商的使用说明书用硝酸银将底物染色。载玻片上的吸收面积利用组织形态测定记录。

人破骨细胞。这些细胞利用正常外周血(Allcells，Emeryville，CA)产生。外周血单核细胞采用Ficoll-Paque分离，以3x10⁶个细胞/ml的浓度在MEM中培养，所述MEM中补充10％ FCS、重组人M-CSF(25ng/ml)和重组人RANKL(40ng/ml)。每周更换一次培养基。

蛋白印迹分析。培养7天后，使破骨细胞血清饥饿2小时，并用指示试剂刺激。接着使细胞在添加有蛋白酶抑制剂(Complete Tablets；RocheMolecular Biochemicals)、氟化钠和磷酸酶抑制剂cocktail II的Laemmli样品缓冲液中裂解。将裂解物超声处理，利用SDS-PAGE解析，转移至Immobilon-P膜，利用增强化学发光(Amersham Pharmacia Biotechnology；Sunnyvale，CA)使其接受蛋白印迹。

流式细胞术。细胞用一抗染色，冰上孵育30分钟，用洗涤缓冲液(5％FCS/PBS)洗两次。加入二抗，冰上孵育细胞30分钟。孵育后，细胞用洗涤缓冲液洗两次，重悬在洗涤缓冲液中用于FACS分析，FACS分析利用FACSCalibur(BD Bioscience；Franklin Lakes，NJ)进行。

实时逆转录聚合酶链反应(实时PCR)。根据厂商的使用说明书，利用Trizol(Invitrogen；Carlsbad，CA)提取总RNA。用1μg总RNA和Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶合成第一链cDNA。PCR反应的引物对在表2中提供。

表2 RT-PCR研究的PCR引物

1.位于外显子2和外显子3之间。

2.位于外显子1和外显子2之间。

统计分析。数据表示为平均值±1个标准差(SD)。利用方差分析比较了治疗组。治疗组之间的成对比较p值利用Tukey多重比较程序调整。如果双侧检验p值＜0.05，则表明有统计学显著性。所有计算利用SPSS进行。

结果

体外巨噬细胞融合试验

新近分离的大鼠肺泡巨噬细胞表现为多个不同的细胞(图1A)。在成融条件(即在M-CSF和RANKL存在下)下培养3天后，巨噬细胞融合成多核细胞(图1B)。有利地，该试验几乎不导致供体变异，不显示任何RANKL刺激作用。

大鼠破骨细胞形成期间中电导钙激活钾通道表达上调

与0小时处理的巨噬细胞相比，融合的大鼠肺泡巨噬细胞中SK4通道信号在1小时后无变化，但在24小时后明显增加(图2)，并且保持升高达5天。

人破骨细胞形成期间中电导钙激活钾通道表达上调

这些结果说明，人巨噬细胞/PBMCs可用于上文所述的巨噬细胞融合试验中，还说明SK4通道表达在融合的巨噬细胞/PBMCs中上调。

新近分离的人巨噬细胞/PBMCs表现为多个不同的细胞，并融合成破骨细胞。在成融条件下培养7天后，当利用

U133 Plus 2.0

(图3A)和

Gene Expression System(图3B)测定时，SK4(SK4)通道表达增加，并保持增加至第21天。评估在其他血细胞和血相关细胞中SK4通道的表达，显示出在B细胞和树突细胞中表达明显增加(图3C)。因此，类似于大鼠细胞，人细胞在成融条件下显示出SK4通道表达增加。

中电导钙激活钾通道在小鼠破骨细胞形成和破骨细胞中的作用

结果表明了利用SK4^-/-敲除小鼠和药理学抑制作用，在破骨细胞形成期间SK4通道(SK4)的作用。

来自SK4^-/-小鼠的脾细胞显示出破骨细胞形成的缺乏，这些细胞未能形成与来自SK4^+/-或WT小鼠的细胞相同数量或大小的破骨细胞(图4A-B)。但单独SK4通道缺乏不影响SK4^-/-小鼠中B细胞(B220)、T细胞(CD4和CD8)、巨噬细胞/粒细胞(GR1、CD11b)、巨细胞(F480、CD11b、CD11c)或树突细胞的相对比例(图5)。

同样，来自SK4^-/-小鼠的源自骨髓的巨噬细胞显示出破骨细胞形成的缺乏，其类似于在源自脾细胞的细胞中所观察到的结果(图6A-B)。来自SK4^-/-小鼠的巨噬细胞中SK4通道缺乏通过膜片箝(patch clamp)研究证实，其显示缺损的SK4通道活性(数据未显示)。

有趣的是，SK4^-/-敲除小鼠显示出小梁骨密度增加(数据未显示)。与纯合野生型小鼠相比，雄性和雌性SK4^-/-敲除小鼠均显示出87％的骨质侵蚀保护。此外，与来自WT小鼠的破骨细胞相比，来自SK4^-/-敲除小鼠的破骨细胞未有效吸收磷酸钙底物(数据未显示)。

用两种SK4通道抑制剂(ICA-17043和TRAM-34)证实了SK4通道在破骨细胞形成中的作用。这些抑制剂以剂量依赖性方式，减弱源自WT小鼠(即SK4^+/+)骨髓的巨噬细胞中破骨细胞形成(图7A-B)。图7C显示ICA-17043处理样本的TRAP-染色图像，其中细胞融合在0.36μM受明显抑制。

中电导钙激活钾通道在类风湿性关节炎的小鼠模型中的作用

这些结果证明，小鼠中SK4通道缺乏或药理学抑制阻止了类风湿性关节炎中骨质吸收。

在重复研究中，与WT小鼠相比，SK4缺乏小鼠显示关节炎评分明显降低(图8A-B)，以及抗骨质侵蚀的实质性保护。此外，来自SK4缺乏小鼠的爪的骨损伤明显更少(图9A-B)。而雌性SK4缺乏小鼠炎症、血管翳和软骨损伤也明显更少(图9A)。

另外的研究显示，来自SK4缺乏小鼠的破骨细胞在吸收骨矿物质方面有缺陷(图11A)，这可能是因为SK4^-/-细胞未能形成足够数量的破骨细胞(图11B)。SK4缺乏小鼠中破骨细胞减少因此显示出小梁骨密度增加。雄性和雌性SK4^-/-小鼠比SK4^+/+小鼠具有小梁骨密度更高的股骨远端(图12)。

中电导钙激活钾通道抑制剂减少人外周血单核细胞的融合

这个例子证明，SK4通道抑制剂阻止了人细胞融合，方式类似于上文实施例4小鼠细胞中所示。

ICA-17043和TRAM-34以剂量依赖性方式，在体外抑制人破骨细胞形成(图10A-B)。ICA-17043在0.3μM IC50时抑制细胞融合；而TRAM-34在0.8μM IC50时抑制细胞融合。而且，ICA-17043和TRAM-34不仅以剂量依赖性方式减少破骨细胞数量，也降低破骨细胞表面积。

颅盖LPS/体内骨质吸收试验

这些结果证明，SK4缺乏(SK4^-/-)小鼠显示出应答局部LPS颅盖注射的体内破骨细胞形成减少。

为了确定SK4在引起类风湿性关节炎的炎症中的作用，将脂多糖(LPS)在颅盖上局部皮下注射，以引起局部、迅速、有效的炎症应答，导致吸收骨质的破骨细胞形成。在解剖学上，颅盖被骨缝分开，没有浅表血管和神经，容易定位(见图14)。结果显示在图14和图15A-C中。

SK4缺乏，因而SK4通道缺乏，显著阻止骨质吸收，以应答局部注射LPS(图14)。当SK4^+/+小鼠颅盖骨由破骨细胞造成缺口时，注意到了骨表面增加，但SK4缺乏小鼠的颅盖骨中并没有。LPS注射5天后，SK4缺乏小鼠保持较高的颅盖骨厚度和密度(见图15A-C)。

除非另外限定，本说明书使用的全部技术术语和科学术语均与本发明所属技术领域的普通技术人员一般理解的含义相同。尽管与本说明书中的所述类似或等同的方法和材料均可用于实施或检验本发明，但本说明书中描述了优选的方法和材料。

本说明书中所述的本发明的许多修饰和其他实施方案都会被这些发明所属领域技术人员所理解，并具有上述内容和相关附图中具有的教导益处。因此，应理解本发明并不意欲限制在公开的具体实施方案，修饰和其他实施方案都要包括在附加权利要求和本说明书中公开的实施方案的范围内。尽管本说明书中应用了特定术语，但它们仅以一般和描述性意义使用，并非为了限制。

本说明书提及的所有出版物和专利申请均显示本发明所属技术领域技术人员的水平。所有出版物和专利申请均通过引用并入本说明书，其引用方式如同将每一个出版物或专利申请具体且分别地通过引用并入。

Claims

2.权利要求1的方法，其中细胞融合受到抑制。

3.权利要求1的方法，其中所述细胞为造血细胞。

4.权利要求1的方法，其中所述细胞选自：巨噬细胞、树突细胞和B细胞。

5.权利要求1的方法，其中所述细胞为巨噬细胞。

6.权利要求1的方法，其中所述细胞融合为同型或异型。

7.权利要求1的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

8.权利要求7的方法，其中所述抑制性核酸靶向包含SEQ ID NO：2所示序列的SK4通道的表达。

9.权利要求7的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。

10.权利要求7的方法，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

11.权利要求7的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

12.权利要求7的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

13.权利要求7的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

14.权利要求7的方法，进一步包括测定细胞中SK4通道表达或活性的步骤。

15.权利要求1的方法，其中所述方法为体内方法，其中所述的SK4通道抑制剂的有效量为向已有或者怀疑有异常细胞融合的受试者提供的治疗有效量。

16.权利要求15的方法，进一步包括向受试者联合提供治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。

18.权利要求17的方法，其中破骨细胞形成受到抑制。

19.权利要求17的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

20.权利要求19的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。

21.权利要求19的方法，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

22.权利要求19的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

23.权利要求19的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

24.权利要求19的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

25.权利要求17的方法，其中所述方法为体内方法，其中所述的SK4通道抑制剂的有效量为向已有或者怀疑有异常破骨细胞分化或功能的受试者提供的治疗有效量。

26.权利要求25的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。

27.一种预防或治疗易患或已患骨丢失的受试者中骨丢失的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂以抑制破骨细胞形成的步骤，其中受试者中骨丢失得到预防或减少。

28.权利要求27的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

29.权利要求28的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。

30.权利要求28的方法，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

31.权利要求28的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

32.权利要求28的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

33.权利要求28的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

34.权利要求27的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。

36.权利要求35的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

37.权利要求36的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。

38.权利要求36的方法，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

39.权利要求36的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

40.权利要求36的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

41.权利要求36的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

42.权利要求35的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。

43.一种预防在有植入物或移植物位于其体内部位的受试者中植入物或移植物排斥的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾通道抑制剂以抑制巨细胞在该部位或该部位附近形成的步骤，其中受试者中植入物或移植物的排斥得到预防。

44.权利要求43的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

45.权利要求44的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。

46.权利要求44的方法，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

47.权利要求44的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

48.权利要求44的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

49.权利要求44的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

50.权利要求43的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂或免疫抑制剂。

51.权利要求43的方法，其中所述移植物为细胞、器官或组织移植物。

52.一种预防患癌症受试者中癌症转移的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂以抑制转移性癌细胞形成的步骤，其中所述受试者中癌症转移得到预防。

53.权利要求52的方法，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

54.权利要求53的方法，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。

55.权利要求53的方法，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

56.权利要求53的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

57.权利要求53的方法，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

58.权利要求53的方法，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

59.权利要求52的方法，进一步包括向受试者联合给药治疗有效量的抗炎剂、抗骨丢失剂、免疫抑制剂，或者化疗剂。

使细胞群与候选SK4通道抑制剂接触；和

确定所述候选试剂是否抑制该细胞群内的细胞-细胞融合。

61.权利要求60的方法，其中所述细胞群包括巨噬细胞，所述SK4通道抑制剂抑制巨噬细胞的细胞-细胞融合。

62.权利要求60的方法，其中所述细胞群包括至少两种细胞类型，其中一种为巨噬细胞。

63.组合物，包括：

有效量的中电导钙激活钾(SK4)通道抑制剂；和

64.权利要求63的组合物，其中所述SK4通道抑制剂选自：抑制性核酸、单克隆抗体和小分子抑制剂。

65.权利要求64的组合物，其中所述单克隆抗体识别SK4通道的孔道区或小分子结合区。

66.权利要求64的组合物，其中所述小分子抑制剂选自：1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑；2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺；1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(4-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；1-[(2-氟苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑；以及1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-四唑。

67.权利要求64的组合物，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)-二苯基甲基]-1H-咪唑。

68.权利要求64的组合物，其中所述小分子抑制剂为2，2-双(4-氟苯基)-2-苯基乙酰胺。

69.权利要求64的组合物，其中所述小分子抑制剂为1-[(2-氯苯基)二苯基甲基]-1H-吡唑。

70.权利要求63的组合物，进一步包括药学可接受载体。