KR20220069855A

KR20220069855A - 바이구아나이드를 유효성분으로 포함하는 smile 발현이 저하된 대사이상 난치 류마티스관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20220069855A
Application number: KR1020210160195A
Authority: KR
Inventors: 민준기; 조미라; 박성환; 전주연; 조근형; 나현식; 이승윤
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2020-11-20
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2022-05-27
Also published as: KR102504468B1

Abstract

본 발명은 신규한 화합물을 유효성분으로 포함하는 대사이상이 동반된 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 본 발명은 SMILE의 발현 감소가 대사이상 관절염을 유발하는 것을 확인하였으며, SMILE가 억제되어 유발된 대사이상 관절염은 TNF-알파 억제제에 불응성을 나타내는 것을 확인하였고, TNF-알파 억제제 불응 비만 관절염에서, 바이구아나이드를 처리하면 TNF-알파 억제제로는 개선되지 않았던, IgG2a 및 IL-17의 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 또한 SMILE이 과발현되면 대사이상 관절염이 개선되고, 대사이상 류마티스관절염 환자에서 SMILE의 발현이 감소되어 것을 확인하여, SMILE의 발현을 증가시키는 바이구아나이드가 효과적으로 대사이상 관절염을 개선시킬 수 있는 것을 확인하였다. 또한, 염증성 장질환에 바이구아나이드를 처리하면, SMILE의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

Description

바이구아나이드를 유효성분으로 포함하는 SMILE 발현이 저하된 대사이상 난치 류마티스관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of refractory rheumatoid arthritis or inflammatory bowel disease with reduced SMILE expression containing biguanide as an active ingredient}

본 발명은 바이구아나이드를 유효성분으로 포함하는 SMILE 발현이 저하된 대사이상 난치 류마티스관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

비만에 대한 늘어나는 경각심과 비만의 원인을 이해하고 이에 대응하고자 하는 전 지구적 노력에도 불구하고, 비만은 가속적으로 증가하는 추세이다.(Mitchell et al., Implications for female fertility and obesity. Reproduction. 2005;130:583-97). 2007년 국민건강영양조사 결과에 의하면 최근 5년 동안 국내 비만 인구 비율이 해마다 3%씩 증가하여, 현재 비만자 비율이 전체 인구 중 32.7%(남 33.1%, 여 32.2%)이며, 연령별로는 중장년층이 평균 44%로 청년층(22%)의 두 배나 되고, 비만으로 인한 질환이 늘어나면서 2007년 기준으로 사회경제적 비용은 1조8239억 원에 이르는 것으로 추정되고 있다.

비만 문제가 심각해짐에 따라 비만 자체가 곧 질병이라는 인식이 확산되고 있다. 비만 진행 여부의 판단은 대표적으로 과체중 여부로 판단할 수 있으며, 구체적으로 특정 부위에서의 체지방의 증가(예를 들어, 복부 비만 등)로 판단할 수 있다. 비만으로 분류된 경우 즉, 비만자는 다른 질병에 비해 유병률과 사망률이 높고 정상체중을 가진 사람과 비교하여 당뇨병 질환으로 인한 사망률은 4배, 간병경증 질환으로 인한 사망률은 2배, 뇌혈관질환으로 인한 사망률은 1.6배 및 관상동맥질환으로 인한 사망률은 1.8배 정도 높은 것으로 보고되고 있다.

비만은 지방의 과다 축적으로 특징 지워지는 다양한 원인을 가진 심각한 만성 증후군이다. 비만 치료의 목표는 크게 두 가지로서, 첫 번째는 과량의 지방을 연소시켜 체중을 감소시키는 것이며, 두 번째는 대사성 불균형을 개선시키는 것이다. 복부 비만을 보이는 환자는 흔히 X-증후군(인슐린 저항성, 제 2형 당뇨병, 고혈압 및 지질대사 이상)과 같은 병적인 상태와 관련되어 있으며, 조기 동맥경화, 허혈성 심질환 및 뇌혈관 질환의 강력한 위험인자로 작용한다.

면역질환은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환으로서, 특히 염증성 장애는 전 세계에서 가장 중요한 건강 문제 중 하나이다. 염증은 일반적으로 외부 물질 또는 해로운 자극에 의한 숙주 침입에 대해 신체 조직의 국소화된 보호 반응이다. 염증의 원인은 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성 원인; 화상 또는 방사선 조사와 같은 물리적 원인; 독소, 약물 또는 산업적 제제와 같은 화학약품; 알레르기 및 자가면역 반응과 같은 면역적 반응, 또는 산화성 스트레스와 연관된 상태일 수 있다.

염증은 통증, 적화현상, 부기, 열 및 감염된 영역의 궁극적인 기능 손실을 그 특징으로 한다. 이들 증상은 면역계의 세포사이에서 일어나는 일련의 복잡한 상호작용의 결과이다. 세포의 반응으로 인해 결과적으로 여러 그룹의 염증 매개자의 상호작용 네트워크가 생성된다: 단백질(예를 들면, 사이토카인, 효소(예를 들면 프로테아제, 퍼옥시다제), 주요 염기성 단백질, 점착 분자(ICAM, VCAM), 지질 매개자(예를 들면, 에이코사노이드, 프로스타글란딘, 류코트라이엔, 혈소판 활성화 인자(PAF)), 반응성 산소 종(예를 들면, 하이드로퍼옥사이드, 슈퍼옥사이드 음이온 O2-, 산화질소(NO) 등). 그러나 염증의 이들 매개자중 대부분은 또한 정상적인 세포 활성의 조절자이다. 따라서 염증 반응의 결핍으로 인해 숙주가 제어되지 않으면서 손상(즉, 감염)되고, 따라서 만성 염증으로 인해 부분적으로는 상기 언급된 매개자중 여럿이 과다 생성됨으로써 매개되는 염증성 질환이 야기된다. 또한, 면역질환 중 하나인 자가면역 질환은 면역 체계가 그 자신의 기관을 공격하여 자발적인 반응을 일으키는 것을 특징으로 한다. 이러한 반응들은 T 림프구에 의한 자가항원(auto-antigen)의 인식에 기인하며, 이로 인하여 체액상(자가항원 생성) 및 세포상 (림프구 및 대식세포 세포독성 활성 증가) 면역 반응이 유발된다.

Tumor necrosis factor-α (TNF-α)는 염증성 사이토카인으로 숙주의 방어, 염증, 세포자멸사(apoptosis), 림프구의 자극, 뼈의 대사, T-B 림프구 상호 반응, 림프기관의 발생, 면역세포 기능의 활성화 등에 관여한다. 특히, 류마티스 관절염의 염증 반응에 가장 결정적인 역할을 하며, 비가역적인 관절의 손상과 골, 연골의 파괴에 관련이 있다. TNF-α transgenic mice에서 류마티스 관절염과 유사한 소견이 보이고, TNF-α 수용체를 이용한 TNFR2-Fc 와 mAb치료에 호전을 보인 결과를 근거로 개발되었다. TNF 길항제는 류마티스 관절염 이외에도 연소성 관절염, 강직성척추염, 건선 관절염 등에 사용이 승인되었다. TNF 길항제는 사용 중에 다양한 원인에 의해 지속적으로 투여하지 못하게 된다. 한 연구에 의하면 1년 후에 21-35%의 환자가 중지하게 되었으며, 그 원인으로는 반응 부족, 반응 소실, 부작용 순이었다. TNF 길항제의 안정성에 대한 문제가 시판 후에 평가되었으며, 감염, 악성 종양, demyelinating disorders, 재생불량성 빈혈, 울혈성 심부전과 혈관염 등에 대한 관심이 있었다. 주사 부위 반응이 가장 흔한 부작용이었으며(20-40%), infliximab은 hypersensitivity reaction의 빈도는 적지만 발생하면 보다 심하였고, 세균 및 기회 감염의 빈도가 증가하였다. 또한 치료 시작 수개월 내 에는 잠복결핵의 활성화에 따른 결핵이 발생하므로 치료 시 작 이전에 잠복결핵에 대한 검사와 적절한 처치가 권해지고 있다. TNF 길항제 치료 중에는 항핵항체나 항dsDNA 항체가 나타날 수 있는 것으로 보고되었으며, MTX와 병용투여 시 빈도가 낮았다. TNF 길항제를 이용한 류마티스 관절염 환자의 임상시험에서 악성 종양이나 림프종이 보고되는 등, 이에 대한 불응성은 심각함이 보고되고 있다.

최근 비만과 같은 대사이상으로 인하여, 면역 기능에 이상으로 초래된 "대사이상이 동반된 관절염"이 증가하고 있으며, 대사이상과 관련된 질환 환자가 전체 인구 중에서 차지하는 비율이 높아짐에 따라, 대사이상이 동반된 관절염의 유병률 또한 증가하는 추세이다. 따라서, 본 발명자들은, 상기 대사이상이 동반된 관절염을 치료하고자, 바이구아나이드(Biaguanide)가 대사이상이 동반된 관절염에 효과가 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 SMILE 유전자의 과소발현에 의하여 유발되는 관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

<화학식 1>

본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 대사이상을 동반하는 관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 TNF-알파 억제제에 대한 불응성을 갖는 관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 SMILE 유전자의 과소발현에 의하여 유발되는 관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 대사이상을 동반하는 관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 TNF-알파 억제제에 대한 불응성을 갖는 관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 SMILE의 발현 감소가 대사이상 관절염을 유발하는 것을 확인하였으며, SMILE가 억제되어 유발된 대사이상 관절염은 TNF-알파 억제제에 불응성을 나타내는 것을 확인하였고, TNF-알파 억제제 불응 비만 관절염에서, 바이구아나이드를 처리하면 TNF-알파 억제제로는 개선되지 않았던, IgG2a 및 IL-17의 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 또한 SMILE이 과발현되면 대사이상 관절염이 개선되고, 대사이상 류마티스관절염 환자에서 SMILE의 발현이 감소되어 것을 확인하여, SMILE의 발현을 증가시키는 바이구아나이드가 효과적으로 대사이상 관절염을 개선시킬 수 있는 것을 확인하였다. 또한, 염증성 장질환에 바이구아나이드를 처리하면, SMILE의 발현이 증가하는 것을 확인하여, 대사이상이 동반된 면역질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 대사이상 관절염(Obese CIA)이 유도된 마우스 동물모델에서, SMILE의 발현을 면역조직화학 염색법으로 확인한 도이다(A: 비장세포 면역조직화학 확인, B: SMILE 발현 정량화).
도 2는 본 발명의 대사이상 관절염(Obese CIA)이 유도된 마우스 동물모델이 TNF-알파 억제제의 불응성을 나타내고, 대사이상 관절염에서의 바이구아나이드의 효과를 IgG2a의 발현으로 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 대사이상 관절염(Obese CIA)이 유도된 마우스 동물모델이 TNF-알파 억제제의 불응성을 나타내고, 대사이상 관절염에서의 바이구아나이드의 관절 보호 효과를 H&E 및 사프라닌 O(safranin O)염색으로 확인한 도이다(A: H&E 및 사프라닌 O 염색 광학 현미경 관찰, B: 관절염 스코어 및 조직 손상 정량화).
도 4는 본 발명의 대사이상 관절염(Obese CIA)이 유도된 마우스 동물모델이 TNF-알파 억제제의 불응성을 나타내고, 대사이상 관절염에서의 바이구아나이드의 효과를 면역조직화학 염색을 이용하여 IL-17 발현으로 관찰한 도이다(A: 관절 면역조직화학 염색 확인, B: IL-17 정량화).
도 5는 본 발명의 대사이상 관절염(Obese CIA)이 유도된 마우스 동물모델에서 바이구아나이드를 투여하여 SMILE의 발현이 증가한 것을 면역조직화학 염색법으로 확인한 도이다(A: 비장 면역조직화학 염색 확인, B: SMILE 정량화).
도 6은 본 발명의 SMILE 과발현 마우스에서 콜라겐 항체 유도 관절염(collagen antibody induced arthritis)을 유도하여, SMILE의 과발현이 관절염 개선 및 보호 효과를 나타내는 것을 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 SMILE 과발현 마우스에서 콜라겐 항체 유도 관절염(collagen antibody induced arthritis)을 유도하여, SMILE의 과발현이 관절염 개선 및 보호 효과를 H&E 및 사프라닌 O(safranin O)염색으로 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 SMILE 과발현 마우스에서 콜라겐 항체 유도 관절염(collagen antibody induced arthritis)을 유도하여, SMILE의 과발현에 따른 면역조절 세포 아형의 분포를 유세포분석으로 확인한 도이다.
도 9는 대사이상 류마티스관절염 환자의 말초 혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서의 SMILE(=Crevzf)의 발현을 마이크로어레이(microarray)로 분석하여 정상인, 골관절염 환자와 비교한 도이다.
도 10은 염증성 장질환이 유도된 마우스에서, 바이구아나이드의 SMILE 발현을 면역조직화학염색으로 확인한 도이다(A: 면역조직화학염색 결과, B: SMILE 발현 정량화).

<화학식 1>

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 대사이상을 동반하는 관절염은 SMILE 유전자가 감소된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 대사이상을 동반하는 관절염은 TNF-알파 억제제에 대하여 불응성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 TNF-알파 억제제는 이타너셉트(etanercept, 제품명 엔브렐(Enbrel)인 것일 수 있으며, 바람직하게는 엔브렐 이다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 SMILE 유전자의 발현을 증가시켜 관절염 또는 염증성 장질환을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 관절염은 류마티스 관절염인 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 SMILE 유전자의 발현을 유도하여,

1)Treg 세포의 증가

2)미성숙 B 세포 증가

3)성숙 B세포 감소;

4)플라즈마 B 세포를 감소시키는 것일 수 있다.

Foxp3는 흉선(thymus)으로부터 유래하는 면역조절 T 세포(Regulatory T cell)에 주로 존재하고, CD4+ CD25+ 표지 항원을 가진 세포에 존재하는 전사 조절 인자 (transcriptional factor)로서, 그 기능은 Foxp3를 발현하는 T 세포에 대한 항원 인지시 항원에 대해 저반응성을 가짐과 동시에 흉선으로부터 분화되어 나온 Foxp3를 발현하지 않는 CD4+ CD25- T 세포 중 잠재적으로 자가 면역증을 유발할 수 있는 T 세포들에 대하여 IL-2의 생성과 세포분열 현상을 억제하는 억제자 T 세포 (suppressor T cell)로서의 역할을 가지고 있다. 또한, Foxp3는 Foxp3를 발현하는 조절 T 세포 및 이와 세포-세포간 접촉(cell-cell contact)을 통해 CD25- T 세포에 대하여서는 IL-2 뿐만이 아니라 전사인자인 NFAT의 영향을 받는 IL-4, IFN-감마 등의 전사 조절을 억제하는 기능을 하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 상기와 같은 작용을 하는 Foxp3를 발현하고 있는 T 세포의 경우, 면역반응을 억제 또는 조절하는 작용을 통해 면역질환을 치료하는데 응용되고 있고, 또한, 인간에 존재하는 Foxp3를 발현하는 CD4 T 세포의 자가 항원 특이적인 T 세포(self-antigen specific T cell clone)를 고농도의 IL-2 사이토카인 처리 및 항-CD3, 항-CD28 항체와의 조합처리를 통해서 그 수를 증가시켜 세포 치료방법으로 응용하고자 하는 시도들이 있어왔다. 따라서 Foxp3의 발현 확인은 Treg 세포의 활성 또는 증폭을 측정할 수 있는 지표가 된다.

B 세포는 주로 자가항체의 분비 기능을 가지고 있기 때문에 자가면역 질환과 관련하여 병인세포로 인식되어 왔으나, 최근 마우스에서 면역 반응을 억제하는 B 세포의 발견과 이들 B 세포를 제거하였을 때 자가면역 반응이 악화되는 것이 확인되었으며, 이들 B 세포에는 CD19+CD1d+CD5+ B 세포 또는 가장자리 구역 B 세포(marginal zone B cell) 등이 있는 것으로 보고되고 있다.

본 발명에서 상기 "활성(activation)"이란 생체 내에서 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg), 즉, 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포를 모두 포함하는 Treg 세포가 가지는 모든 기작이 촉진 또는 증진되는 것을 말하며, 생체 내의 면역반응이 정상상태를 유지하도록 면역조절작용, 예컨대 면역억제반응이 촉진 또는 증진되는 것을 말한다.

또한, 상기 "증폭(expansion)"이란 미분화 T 세포가 조절 T 세포로 분화 및 증식되는 것을 말하는 것으로서, '분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말하며, '증식(proliferation)' 은 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 대사이상을 동반하는 관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "불응성"이란, 대상 적응증을 예방, 개선 또는 치료하기 위하여, 일반적으로 처방되는 제제를 투여하여도, 대상 적응증이 호전되지 않는 상태를 뜻하며, 본 발명에서는 자가면역질환의 일종인 류마티스 관절염을 억제하기 위하여 투여되는 TNF-알파 억제제에 대하여 불응성을 나타내는 것을 뜻한다.

또한 본 발명에서 "TNF-알파 억제제"는 면역 억제제로서, 면역질환 질환에 사용되어 지는 제제로서, 상기 면역질환은 류마티스 관절염, 염증성골관절염, 베체트병, 다발성 근육염 또는 피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 미토콘드리아 관련 증후군, 이식거부 질환 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 바람직하게는 류마티스 관절염 또는 염증성 장질환이나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 TNF-알파 억제제에 대한 불응성을 갖는 관절염은 대사이상을 동반하는 관절염인 것일 수 있으며, 상기 대사이상은 망막색소변성증, 선천성대사이상, 소아내분비질환, 영양실조, 통풍, 갈락토스혈증, 포르피린증, 프로피온산혈증, 타이로신혈증, 당뇨, 지방질침착증, 고지방혈증 및 비만으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 비만이나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 TNF-알파 억제제에 대한 불응성을 갖는 관절염은 SMILE 유전자가 감소된 관절염인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 관절염 또는 염증성 장질환은 SMILE 유전자가 환자의 비장조직에서 감소된 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 대사이상 관절염 동물모델에서의 SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein)의 발현 감소 확인

<1-1> 대사이상 관절염 동물모델 제작

본 발명의 대사이상 관절염 동물모델을 제작하기 위하여, 7주생 수컷 DBA1/J 정상 마우스에 관절염을 유발하기 1주일 전부터 high fat diet 60kcal를 자율 급식을 실시하고 실험종료 시점까지 high fat diet는 실시 해준다. 1주일간 high fat diet를 공급한 시점에서 타입 II 콜라겐 100 μg을 CFA(Complete Freud's adjuvant)와 혼합하여 꼬리 표피에 주입(first immunization)하였고, 이로부터 2주뒤 동일한 타입 II 콜라겐을 동량의 IFA(incomplete Freud's adjuvant)와 혼합한 후 꼬리에 주입하여 대사이상 관절염 동물모델(비만 관절염, Obese CIA)을 제작하였다. 대조군으로는 일반 식이를 투여한 정상 대조군(평균 체중: 20g, Wild type)을 이용하였으며, 상기 대사이상 관절염 동물모델에 바이구아나이드를 투여하여, 바이구아나이드 투여군(Biaguanide compound)으로 분류 하였다. 또한 일반적으로, 관절염을 치료하기 위하여 투여되는 TNF-알파 억제제인 이타너셉트(etanercept, 제품명 엔브렐(Enbrel)을 투여하여 양성 대조군(Enbrel)으로 분류 하였다.

<1-2> 면역조직화학 염색법

대사 이상 동물모델에서 SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein)의 발현 변화를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-1에서 정상 마우스 및 대사이상이 유도된 마우스를 10 주후 인도적으로 희생하고, 비장(spleen)을 적출하여 면역 조직화학 염색법으로 확인하였다.

그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 대사이상이 유도된 마우스 모델에서는 SMILE의 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.

<실시예 2> 비만 관절염에서 바이구아나이드 효과 확인

<2-1> IgG2a 발현 확인

상기 실시예 1-1에서 제작된 동물모델의 TNF-알파 억제제에 대한 불응 효과를 확인하고, 바이구아나이드가 TNF-알파 불응 비만 관절염에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 항-콜라겐 효과를 갖는 마우스 IgG2a의 발현을 확인였다. IgG2a는 과발현되면, 콜라겐을 분해하여, 관절염을 유발하는 것으로 알려져 있으며, TNF-알파에 의해 자극되므로, 일반적으로 TNF-알파 억제제를 투여하여, IgG2a를 억제하게 된다.

구체적으로 상기 실시예 1-1에서 제작된 마우스 동물모델의 IgG2a의 발현을 확인하기 위하여, 희생된 마우스의 비장을 ELISA kit을 이용하여, IgG2a를 측정하였다.

그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 대사이상군과 비교하여, 양성대조군인 enbrel이 투여되면, IgG2a의 발현이 유의적인 차이점이 없는 것을 확인하여, SMILE의 발현이 억제되어 유발된 비만 관절염은 TNF-알파 불을성을 나타내는 것을 확인(TNF-알파 억제제 불응 비만 관절염)하였으며, 바이구아나이드를 투여하면, IgG2a의 발현이 감소하여, 바이구아나이드가 TNF-알파 불응성 비만 관절염에서, IgG2a를 효과적으로 억제할 수 있는 것을 확인하였다.

<2-2> H&E 및 사프라닌 O(safranin O) 염색

상기 실시예 1-1에서 제작된 동물모델에서 바이구아나이드가 TNF-알파 불응 비만 관절염에 효과가 있는지 확인하기 위하여, H&E 및 사프라닌 O(safranin O)를 처리하여, 조직학적으로 관찰하였다.

또한 마우스는 희생 전 관절 염증 점수를 평가하기 위하여, 다음과 같은 기준으로 평가하였다.

0점

뒷발 : 홍반이 없으며 육안적으로 정상마우스 발과 차이가 없을 때 외관을 봐도 뼈의 모양이 깨끗하게 정상적으로 확인됨.

앞발 : 홍반이 없고, 정상 마우스 발과 차이가 없음

1점

뒷발 : 발가락 하나가 부었을 때 / 혹은 발바닥에 붓기 없이 확연한 홍반이 있을 경우/혹은 발등이나 발바닥 혹은 발뒤꿈치가 경미하게 부었을 경우.

앞발 : 발가락 하나가 부었을 때 / 혹은 발바닥에 붓기 없이 확연한 홍반이 있을 경우.

2점

뒷발 : (홍반동반) 발가락 두 개가 부었을 때 / 발가락 1~2개가 부었거나 발등이나 발바닥 혹은 발뒤꿈치가 살짝 둥글게 부었을 경우.

앞발 : (홍반동반) 발가락이 두 개가 부었을 때 / 발가락 1~2개가 부었거나 발목이 부었을 경우.

3점

뒷발 : (홍반동반) 발가락이 1~4개가 부었거나 발등이나 발바닥 혹은 발뒤꿈치가 전체적으로 부었을 때 / 종골의 모양이 거의 드러나지 않고 발등 발바닥 발뒤꿈치 발목까지 모두 부어서 염증성 부종으로 살짝 통통해 보임.

앞발 : (홍반동반) 발가락이 1~4개가 부었거나 발목부위에 염증성 조직의 증가로 발목이 두꺼워져 있음.

4점

뒷발 : 홍반이 거의 발전체 / 발가락 3개 이상 부었고 발이 전체적으로 부었고 홍반과 부종이 굉장히 심해지고 전체적으로 통통해짐.

앞발 : 홍반이 거의 발전체 / 발가락이 3개 이상 부었고 발목과 발이 전체적으로 부어서 움직임이 부자연스러워짐.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군인 enbrel을 처리한 군에서는 대사이상군과 비교하여, 관절 염증 점수(Joint Inflammation score), 관절 연골 손상(Joint Cartilage damage), 관절 골 손상(Joint Bone damage) 및 관절 판누스 형성(Joint Pannus formation)에서 유의한 차이는 나타나지 않아, TNF-알파 불응성인 것을 확인하였으며, 바이구아나이드가 처리된 군에서는 관절 염증 점수, 관절 연골 손상, 관절 골 손상 및 관절 판누스 형성이 모두 억제된 것을 확인하였다.

<2-3> IL-17 발현 억제 확인

IL-17은 염증을 유발하는 인터루킨으로서, IL-17 양성 세포의 분화가 촉진되면 발현되어, 염증을 유발하게 된다. 상기 실시예 1-1에서 제작된 동물모델에서, 바이구아나이드가 TNF-알파 불응 비만 관절염에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 관절 조직 내의 IL-17 양성 세포를 억제하는지 확인하고자 마우스 관절부를 조직화학염색으로 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군인 enbrel을 처리한 군에서는 대사이상군과 비교하여 IL-17 양성 세포의 수가 유의적인 차이가 없어 TNF-알파 불응성인 것을 확인하였으며, 바이구아나이드가 처리된 군에서는 IL-17 양성 세포수가 현저히 감소한 것을 확인하였다.

<실시예 3> 바이구아나이드의 SMILE 발현 유도 확인

상기 실시예 1-1에서 제작된 TNF-알파 억제제 불응 비만 관절염 동물모델에서, 바이구아나이드가 SMILE의 발현을 유도하는지 확인하기 위하여, TNF-알파 억제제 불응 비만 관절염 동물모델(Obese CIA)를 두 군으로 분류하고, 실험군에는 바이구아나이드를 50 mg/kg 농도로 투여하고, 대조군은 동량의 생리식염수를 처리하였다. 그 후 마우스를 인도적으로 희생하여, 비장을 적출하고, 적출된 비장을 면역조직화학 염색법으로 SMILE의 발현을 확인하였다.

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이 대조군인 Obese CIA 군과 비교하여, 바이구아나이드를 처리한 군에서 SMILE의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다.

<실시예 4> SMILE 과발현 마우스 및 콜라겐 항체 유도 관절염 보호 효과

<4-1> SMILE 과발현 마우스 제작

SMILE 과발현이 관절염에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, SMILE 과발현 마우스를 제작하였다. 구체적으로 pcDNA3 벡터의 EcoRⅠ 및 XhoⅠ 제한효소 위치에 SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein) 유전자 (서열번호 1)를 클로닝하여 SMILE을 과발현하는 plasmid를 제작하였다. SMILE plasmid를 Fspl로 single cut 하여 microinjection용 DNA purification을 완료 하였다. Microinjection 후 19일 후 산자를 확보하여 pup tailcutting을 통한 genotype 진행 후 SMILE 발현하는 positive SMILE Tg mouse(SMILE Transgenic, SMILE Tg)를 확보하였다. 대조군(C57BL/6)으로는 mock를 이용하였다.

<4-2> SMILE 과발현의 콜라겐 항체 유도 관절염 보호 효과

상기 실시예 4-1에서 제작된 동물모델에, 콜라겐 항체인 IgG2a를 관절부에 주입하여, 콜라겐 항체 유도 관절염을 유도하여 관절염이 유발된 군(CAIA+C57BL/6) 및 SMILE 과발현 군(CAIA+SMILE)에서 10일간 관절염 유도 및 보호 효과를 관찰하였다. 관절염이 유도된 후 마우스의 관절염 점수를 다음과 같은 기준으로 평가하였다.

0점

앞발 : 홍반이 없고, 정상 마우스 발과 차이가 없음

1점

2점

3점

4점

또한, 관절염 발생율(Incidence)은 마우스의 한발이 부었을 경우 25%로 네발이 모두 부었을 경우 100%로 평가하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 마우스에 콜라겐 항체 유도 관절염을 유도한 이후 10일까지, 관절염 점수는 SMILE 과발현 마우스군에서 유의적으로 낮은 것을 확인하였다. 또한 관절염 발생율 또한 SMILE 과발현 마우스군에서 유의적으로 낮은 것을 확인하여, SMILE가 과발현되면, 콜라겐 항체 유도 관절염이 억제되는 것을 확인하였다.

<4-3> H&E 및 사프라닌 O를 SMILE 과발현 효과 확인

상기 실시예 4-1에서 제작된 마우스 동물모델에서 SMILE의 과발현이 콜라겐 항체 유도 관절염을 효과적으로 억제하는지 확인하기 위하여 H&E 및 사프라닌 O 염색법으로 염색하여 조직학적으로 확인하였다.

그 결과 도 7에 나타낸 바와같이, 대조군과 비교하여 SMILE 과발현 마우스에서는 연골이 유지되고, 염증 세포의 침윤 정도가 현저히 감소한 것을 확인하였다.

<4-4> 면역 조절 세포 아형 유세포 분석

상기 실시예 4-1에서 제작된 마우스 동물모델은 실험 종료 후 인도적으로 희생하여, 비장을 적출 하였다. 그 후 적출된 비장을 각각 유세포 분석을 시행하였다. 구체적으로 적출된 비장에 LPS 100ng/ml를 처리하여 면역 세포를 활성화시킨 뒤 CD4 T 세포 및 B220 양성 세포의 마커를 분석하여, SMILE 과발현에 따른 면역 조절 세포 아형을 분석하였다.

그 결과 도 8에 나타낸 바와같이, SMILE 과발현 마우스 동물모델에서 면역조절 세포의 아형으로 T-조절 세포(T-regulator cell, Treg)가 증가하였으며, B-조절 세포(B-regulator cell, Breg)의 기능을 갖는 것으로 알려진 미성숙 B(Immature B) 세포는 증가하였다. 또한, 성숙 B(mature B) 세포 및 항체 생산능을 가지는 플라즈마 B 세포(plasma B)는 감소된 것을 확인하였다.

<실시예 5> 대사이상 류마티스 관절염 환자에서의 발현 분석

상기 실시예 1 내지 4의 결과를 통해, SMILE의 발현이 대사이상 류마티스 관절염 유발시 정상에 비해 감소되어 있는 것을 동물모델로 확인한 사실을 토대로, 실제 임상적으로도 동일한 결과를 보이는지 확인하기 위해, 정상인, 골관절염 환자 및 류마티스 관절염 환자로부터 수득한 말초 혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 대상으로 GEO DATA SET의 마이크로어레이(Microarray) 분석을 통해 SMILE의 발현량을 분석하였다. 수득된 PBMC에서 SMILE(=Crevzf)의 발현을 조사하여, 정상인, 골관절염(osteoarthritis)환자의 발현과 비교하였다.

그 결과 도 9에 나타낸 바와 같이, 정상인, 골관절염 환자와 비교하여, 대사이상 류마티스 관절염 환자에서 통계적으로 유의하게 SMILE의 발현이 감소되어 있는 것을 확인하였다.

<실시예 6> 염증성 장질환에서의 바이구아나이드의 효과 확인

<6-1> 염증성 장질환 동물모델

본 발명의 바이구아나이드의 염증성 장질환에 대한 효과를 확인하기 위하여, 염증성 장질환 동물모델을 제작하였다. 구체적으로, 7주령 수컷 C57BL/6 마우스에 3% dextran sodium sulfate(DDS)를 급수하였다. 급수 5일차에 일반 음용수로 교체하였다. 그 후 바이구아나이드를 50 mg/kg 농도로 1일 1회 8주간 투여하였다. 대조군으로는 생리식염수를 투여한 Vehicle 군으로 이용하였다.

<6-2> 염증성 장질환 동물모델에서의 SMILE 발현 증가 확인

상기 실시예 5-1의 마우스를 실험 종료 후 인도적으로 희생하여, 장 조직을 적출하였다. 적출된 장조직을 절편화하여, 면역조직화학염색으로 SMILE의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 바이구아나이드가 처리된 군에서는 Vehicle군과 비교하여, SMILE의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 SMILE의 발현 감소가 대사이상 관절염을 유발하는 것을 확인하였으며, SMILE가 억제되어 유발된 대사이상 관절염은 TNF-알파 억제제에 불응성을 나타내는 것을 확인하였고, TNF-알파 억제제 불응 비만 관절염에서, 바이구아나이드를 처리하면 TNF-알파 억제제로는 개선되지 않았던, IgG2a 및 IL-17의 발현이 억제되는 것을 확인하였다. 또한 SMILE이 과발현되면 대사이상 관절염이 개선되고, 대사이상 류마티스관절염 환자에서 SMILE의 발현이 감소되어 것을 확인하여, SMILE의 발현을 증가시키는 바이구아나이드가 효과적으로 대사이상 관절염을 개선시킬 수 있는 것을 확인하였다. 또한, 염증성 장질환에 바이구아나이드를 처리하면, SMILE의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolically abnormal rheumatoid arthritis or inflammatory bowel disease with reduced SMILE expression containing biguanide as an active ingredient <130> PN2111-557 <150> KR 10-2020-0156184 <151> 2020-11-20 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5589 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gcgatactct ggctggagcg aagcgcgttt ttgtgggcgg ggtgggcaga gagtaacttc 60 cggccaggcc gctgtctggg tggcgcggcc gagtcctccc ccgggcctcg ccgcttcgcg 120 cttccactgc cttccccccg cctcgtgcgg ggggttgggc ggccgccgga ggccactcgg 180 accttgcccc gcgcctgcgg tcggcccggc gccgtggctc tgcgcgctgg gggcccgggg 240 tcggagtggc tgcggcctac ccgggcccgc cgctcagccc catgaggcac agcctgacca 300 agctgctggc agcctcgggc cgcgacttcc cgagccgccg cgacagccgg gagccgcccg 360 ccacgcgcgc gccgccccgg gagccgagcg gggcagccgc gggggcggag accccgaggc 420 ccggatcgcc tgaccgcgag caacctcacg gggacgggga cgggggcgag ccggaggccc 480 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tacgagctca caaatataat catttttctt aactaaataa atggttcttc 5580 aacattgaa 5589

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 SMILE 유전자의 과소발현에 의하여 유발되는 관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
<화학식 1>
제 1항에 있어서, 상기 SMILE 유전자의 과소발현에 의하여 유발되는 관절염 또는 염증성 장질환은 TNF-알파 억제제에 대하여 불응성을 갖는 것인, 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 TNF-알파 억제제는 이타너셉트(etanercept), 인플릭시맵(Infliximab) 및 아달리무맙(Adalimumab)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 SMILE 유전자의 과소발현에 의하여 유발되는 관절염 또는 염증성 장질환은 대사이상을 동반하는 것인, 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 대사이상은 비만인 것인, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염인 것인, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 SMILE 유전자의 발현을 증가시켜 관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료를 하는 것인, 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 SMILE 유전자의 발현을 유도하여,
1)Treg 세포의 증가
2)미성숙 B 세포 증가
3)성숙 B세포 감소;
4)플라즈마 B 세포를 감소시키는 것인, 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 대사이상을 동반하는 관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
<화학식 1>
제 9항에 있어서, 상기 대사이상을 동반하는 관절염 또는 염증성 장질환은 SMILE 유전자가 감소된 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 대사이상을 동반하는 관절염 또는 염증성 장질환은 TNF-알파 억제제에 대하여 불응성을 갖는 것인, 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 TNF-알파 억제제는 이타너셉트(etanercept), 인플릭시맵(Infliximab) 및 아달리무맙(Adalimumab)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 조성물은 SMILE 유전자의 발현을 증가시켜 관절염 또는 염증성 장질환을 예방 또는 치료하는 것인, 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염인 것인, 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 대사이상은 비만인 것인, 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 조성물은 SMILE 유전자의 발현을 유도하여,
1)Treg 세포의 증가
2)미성숙 B 세포 증가
3)성숙 B세포 감소;
4)플라즈마 B 세포를 감소시키는 것인, 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 TNF-알파 억제제에 대한 불응성을 갖는 관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
<화학식 1>
제17항에 있어서, 상기 TNF-알파 억제제에 대한 불응성을 갖는 관절염은 대사이상을 동반하는 관절염인 것인, 조성물.
제 18항에 있어서, 상기 대사이상은 비만인 것인, 조성물.
제 17항에 있어서, 상기 TNF-알파 억제제는 이타너셉트(etanercept), 인플릭시맵(Infliximab) 및 아달리무맙(Adalimumab)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
제 17항에 있어서, 상기 TNF-알파 억제제에 대한 불응성을 갖는 관절염 또는 염증성 장질환은 SMILE 유전자가 감소된 관절염인 것인, 조성물.
제 17항에 있어서, 상기 조성물은 SMILE 유전자의 발현을 증가시켜 관절염 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료를 하는 것인, 조성물.
제17항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염인 것인, 조성물.
제17항에 있어서, 상기 조성물은 SMILE 유전자의 발현을 유도하여,
1)Treg 세포의 증가
2)미성숙 B 세포 증가
3)성숙 B세포 감소;
4)플라즈마 B 세포를 감소시키는 것인, 조성물.