KR102348920B1 - Ptx-3, timp1 및 bdnf를 발현하는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 또는 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents
Ptx-3, timp1 및 bdnf를 발현하는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 또는 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 PTX-3, TIMP1 및 BDNF를 발현하는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PTX-3, TIMP1, BDNF 및/또는 HLA-A2를 발현하는 간엽줄기세포는 염증성 사이토카인인 IL-1b, IL-6, IL-8 및 TNF-a의 발현을 감소시키고, 항염증성 사이토카인인 IL-10 및 ARG-1(Arginase-1)의 발현을 증가시켜 염증 반응을 억제할 수 있으며, 골관절염 유발 랫드에 투여하는 경우 골관절염으로 인한 통증을 완화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 본 발명의 PTX-3, TIMP1 및 BDNF를 발현하는 간엽줄기세포는 염증 질환, 통증 및 염증으로 인한 통증의 예방, 완화 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 또는 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 PTX-3, TIMP1 및 BDNF으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 과발현 또는 이의 발현이 증가된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 또는 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
염증은 외부의 병원체, 독성물질 및 손상된 세포를 포함한 유해한 자극에 대한 면역 반응이다. 이러한 염증은 부종, 통증, 조직의 강성, 기능 및 움직임 상실의 징후를 나타낸다. 특히, 관절에 발생하는 염증은 통증과 일상 생활의 활동 장애 및 운동 장애를 유발하여 삶의 질을 저하시킨다. 염증과 관련된 증상을 치료하기 위해 사용되는 약물의 세계 시장 규모는 2020년 기준으로 1,061억 달러 수준이며, 항암제 시장규모에 버금갈 정도로 크다. 이 중 관절염 치료제는 2019년 전세계 수입 매출에서 42.41%를 차지했으며, 2020년에서 2026년까지 향후 몇 년 동안 6.60%의 빠른 성장률이 예상된다.
골관절염의 발생 초기에 외부 자극에 의해 활액막 및 연골 조직 내에서 염증성 사이토카인(IL-6, TNF-a, IL-8 등)이 분비된다. 이렇게 분비된 사이토카인은 관절 조직에 지속적으로 염증을 유도하면서 통증을 일으키고, 연골파괴 분해효소 및 골 파괴인자의 활성화로 인해 관절이 파괴되어 결국 관절 변형이 발생한다(Piotr Wojdasiewicz et al., Mediators Inflamm. 2014: 561459). 이러한 관절염 치료를 위한 약물로 비스테로이드성 소염제(NSAIDs)를 주로 사용하며, 그 중 항 TNF 제제인 휴미라(애브비)는 2018년 단일 약물로 미국에서 가장 많은 매출을 기록하였다. 그러나, 이러한 약물은 일상적 통증 감소에는 도움을 줄 수는 있으나, 위장장애 등의 부작용이 발생되며, 장기적인 효과를 기대하긴 어렵다. 따라서, 관절염 염증의 발생 기전에 영향을 미쳐 근본적인 치료가 가능한 치료제의 개발이 필요하다.
이러한 문제점을 해결하기 위해 줄기세포치료제의 개발 및 연구가 다양하게 진행되고 있다. 간엽줄기세포는 골수, 제대혈, 지방조직 등 다양한 조직에서 분리, 배양이 가능하며 연골조직으로의 분화가 가능하여 관절염의 근본적인 치료제로 활용되고 있다. 간엽줄기세포가 분비하는 단백질은 항사멸, 면역억제, 항염증 등의 다양한 질환의 치료 및 조직 재생에 효과가 있음이 보고된 바 있다(Mancuso et al., Front Bioeng Biotechnol. 2019 Jan 29;7:9., D. S. Jevotovsky et al., Osteoarthritis Cartilage. 2018 Jun;26(6):711-729). 특히, 간엽줄기세포의 항염증 효과는 항염증성 사이토카인의 분비뿐만 아니라, 대식세포의 분극화를 조절하여 염증반응의 근본적인 발생을 억제할 수 있음이 보고된 바 있다(Meng Sun et al., J Immunol Res. 2019 Jun 19;2019:7059680).
간엽줄기세포의 위와 같은 치료 효과는 기증자, 기원조직, 분리방법 및 배양방법 등에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 치료 효과가 있는 세포를 선별할 수 있는 특성을 확보하는 것이 필요한 실정이다.
Piotr Wojdasiewicz et al., Mediators Inflamm., 2014: 561459
Mancuso et al., Front Bioeng Biotechnol., 2019 Jan 29;7:9
D. S. Jevotovsky et al., Osteoarthritis Cartilage. 2018 Jun;26(6):711-729
Meng Sun et al., J Immunol Res. 2019 Jun 19;2019:7059680
이에 본 발명자들은 염증 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있는 간엽줄기세포를 확보하기 위해 연구한 결과, 염증 조건에서 간엽줄기세포의 특정 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 이를 발현하는 간엽줄기세포가 우수한 항염증 효과 및 통증 감소 효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은, PTX-3, TIMP1 및 BDNF으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 발현하는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 또는 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, PTX-3, TIMP1 및 BDNF으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 증가된 발현을 나타내도록 간엽줄기세포를 자극하는 단계를 포함하는 항염증 또는 통증 감소 효능이 개선된 간엽줄기세포를 수득하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 PTX-3, TIMP1 및 BDNF를 발현하는 간엽줄기세포는 염증성 사이토카인인 IL-1b, IL-6, IL-8 및 TNF-a의 발현을 감소시키고, 항염증성 사이토카인인 IL-10 및 ARG-1(Arginase-1)의 발현을 증가시켜 염증 반응을 억제할 수 있으며, 골관절염 유발 랫드에 투여하는 경우 골관절염으로 인한 통증을 완화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 PTX-3, TIMP1 및 BDNF를 발현하는 간엽줄기세포는 염증 질환, 통증 및 염증으로 인한 통증의 예방, 완화 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 SMUP-Cell을 단독 배양한 경우와 비교하여 RAW264.7 세포주에 LPS(Lipopolysaccharide)를 처리하여 염증 반응이 유도된 대식세포 염증 모델과 SMUP-Cell을 공배양한 경우의 PTX-3, TIMP1 및 BDNF의 발현량 증가 비율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 대식세포 염증 모델과 공배양한 2종의 SMUP-Cell의 HLA-A2 발현을 확인한 도면이다.
도 3은 대식세포 염증 모델에 PTX-3, TIMP1 및 BDNF를 발현하는 SMUP-Cell을 공배양한 경우의 IL-6, TNF-a 및 IL-10의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 SW1353 세포주에 IL-1b를 처리하여 염증 반응이 유도된 연골세포 염증 모델과 SMUP-Cell을 공배양한 경우의 PTX-3, TIMP1 및 BDNF의 발현량 증가 비율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 연골세포 염증 모델과 SMUP-Cell 3종을 각각 공배양한 경우의 IL-1b, IL-8 및 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR 또는 SMUP-Cell PTX-3 siR을 대식세포 염증모델과 공배양한 경우의 TNF-a 및 ARG-1(Arginase-1)의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR 또는 SMUP-Cell PTX-3 siR을 대식세포 염증모델과 공배양한 경우의 대식세포의 M1 마커인 CD11b와 M2의 마커인 CD206를 염색한 사진과 염색된 세포의 비율을 나타낸 도면이다.
도 8은 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR 또는 SMUP-Cell PTX-3 siR을 연골세포 염증모델과 공배양한 경우 연골세포의 IL-1b, IL-6, IL-8 및 TNF-a의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR, SMUP-Cell PTX-3 siR 또는 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cells)의 PTX-3 발현량을 나타는 그래프이다.
도 10은 MIA(Monoiodoacetate)를 주입하여 관절염 통증을 유발한 랫드에 HA(Hyaluronic acid)와 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR, SMUP-Cell PTX-3 siR 또는 HUVEC를 함께 주입하여 체중부하의 분산 정도를 측정한 그래프이다.
도 11은 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-vec 또는 SMUP-Cell TIMP1 KO를 연골세포 염증 모델과 공배양한 경우 연골세포의 IL-1b, IL-6, IL-8 및 TNF-a의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 12는 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR, SMUP-Cell BDNF siR을 대식세포 염증 모델과 공배양한 경우 대식세포의 IL-6 및 TNF-a의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 13은 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-vec 및 PTX-3 과발현된 줄기세포(SMUP-Cell-PTX3 OE)의 염증성 사이토카인 변화를 확인한 그래프이다.
도 2는 대식세포 염증 모델과 공배양한 2종의 SMUP-Cell의 HLA-A2 발현을 확인한 도면이다.
도 3은 대식세포 염증 모델에 PTX-3, TIMP1 및 BDNF를 발현하는 SMUP-Cell을 공배양한 경우의 IL-6, TNF-a 및 IL-10의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 SW1353 세포주에 IL-1b를 처리하여 염증 반응이 유도된 연골세포 염증 모델과 SMUP-Cell을 공배양한 경우의 PTX-3, TIMP1 및 BDNF의 발현량 증가 비율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 연골세포 염증 모델과 SMUP-Cell 3종을 각각 공배양한 경우의 IL-1b, IL-8 및 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR 또는 SMUP-Cell PTX-3 siR을 대식세포 염증모델과 공배양한 경우의 TNF-a 및 ARG-1(Arginase-1)의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR 또는 SMUP-Cell PTX-3 siR을 대식세포 염증모델과 공배양한 경우의 대식세포의 M1 마커인 CD11b와 M2의 마커인 CD206를 염색한 사진과 염색된 세포의 비율을 나타낸 도면이다.
도 8은 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR 또는 SMUP-Cell PTX-3 siR을 연골세포 염증모델과 공배양한 경우 연골세포의 IL-1b, IL-6, IL-8 및 TNF-a의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR, SMUP-Cell PTX-3 siR 또는 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cells)의 PTX-3 발현량을 나타는 그래프이다.
도 10은 MIA(Monoiodoacetate)를 주입하여 관절염 통증을 유발한 랫드에 HA(Hyaluronic acid)와 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR, SMUP-Cell PTX-3 siR 또는 HUVEC를 함께 주입하여 체중부하의 분산 정도를 측정한 그래프이다.
도 11은 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-vec 또는 SMUP-Cell TIMP1 KO를 연골세포 염증 모델과 공배양한 경우 연골세포의 IL-1b, IL-6, IL-8 및 TNF-a의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 12는 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR, SMUP-Cell BDNF siR을 대식세포 염증 모델과 공배양한 경우 대식세포의 IL-6 및 TNF-a의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 13은 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-vec 및 PTX-3 과발현된 줄기세포(SMUP-Cell-PTX3 OE)의 염증성 사이토카인 변화를 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은, PTX-3, TIMP1 및 BDNF으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 발현하는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 또는 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은 PTX-3, TIMP1 및 BDNF으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 과발현 또는 이의 발현이 증가된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 PTX-3(Pentraxin 3)은 순환 다량체 구조(cyclic multimeric structure)를 특징으로 하는 펜트라신 수퍼 패밀리의 구성원을 의미한다. 상기 PTX-3은 여러 세포 유형, 특히, 1차 염증 신호에 반응하여 단핵 대식세포, 수지상 세포(DC), 섬유아세포 및 내피세포에 의해 빠르게 생성되고 방출된다. 또한, 상기 PTX-3은 보체 활성화의 고전적인 경로를 활성화하고 대식세포 및 수지상세포에 의한 항원 인식을 촉진시킨다.
상기 TIMP1(Tissue inhibitor matrix metalloproteinase 1)은 여러 조직에서 발현되는 당단백질로서, 기질금속단백질분해효소(MMP)의 작용을 조절하는 내재성 억제제를 의미한다. 구체적으로, 상기 TIMP1은 TIMP 계열의 구성원으로, 세포외 기질의 분해에 관여하는 펩티다제 그룹인 기질금속단백질분해효소의 천연 억제제이다. 상기 TIMP1은 알려진 기질금속단백질분해효소에 대한 억제 역할 외에도 광범위한 세포 유형에서 세포 증식을 촉진시킬 수 있으며, 항-사멸(apoptosis) 기능도 가질 수 있다.
상기 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)는 뇌에 분포되어 있는 뉴로트로핀(neurotrophin)을 의미한다. 상기 BDNF는 신경원(neuron)의 성장을 촉진하고, 신경전달물질의 합성, 대사, 유리 및 신경원의 활성을 조절하는 것으로 알려져 있다.
상기 간엽줄기세포는 PTX-3, TIMP1 또는 BDNF를 발현하는 것일 수 있다. 또한, 상기 간엽줄기세포는 PTX-3 및 TIMP1; PTX-3 및 BDNF; 또는 TIMP1 및 BDNF를 발현하는 것일 수 있다. 나아가, 상기 간엽줄기세포는 PTX-3, TIMP1 및 BDNF를 발현하는 것일 수 있다.
본 발명은 PTX-3, TIMP1 및 BDNF으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 발현하거나 이의 발현이 증가된 간엽줄기세포가 염증 억제 또는 통증 감소 능력이 우수하다는 결과에 기초한다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 염증 조건에서 간엽줄기세포를 배양하기 위해, 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포주에 LPS(Lipopolysaccharide) 1 ㎍/㎖을 처리하여 제작된 대식세포 염증 모델에 2×105 세포수의 SMUP-Cell을 공배양하였다. 그 후, 공배양된 배지에서의 PTX-3, TIMP1 및 BDNF의 발현량 변화를 확인하였다. 나아가, PTX-3, TIMP1, BDNF 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 발현하는 간엽줄기세포가 염증성 사이토카인인 IL-1b, IL-6, IL-8 및 TNF-a의 발현을 감소시키고, 항염증성 사이토카인인 IL-10 및 ARG-1(Arginase-1)의 발현을 증가시켜 염증 반응을 억제시키는 것을 확인하였다(도 1, 도 3, 도 5, 도 6, 도 8, 도 11 및 도 12).
상기 간엽줄기세포는 HLA-A2를 추가적으로 발현하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 PTX-3, TIMP1, BDNF 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 발현하는 간엽줄기세포가 HLA-A2를 추가적으로 발현하는 것을 확인하였다(도 2).
상기 간엽줄기세포는 PTX-3 및 HLA-A2, TIMP1 및 HLA-A2 또는 BDNF 및 HLA-A2를 발현하는 것일 수 있다. 또한, 상기 간엽줄기세포는 PTX-3, TIMP1 및 HLA-A2; PTX-3, BDNF 및 HLA-A2; 또는 TIMP1, BDNF 및 HLA-A2를 발현하는 것일 수 있다. 나아가, 상기 간엽줄기세포는 PTX-3, TIMP1, BDNF 및 HLA-A2를 발현하는 것일 수 있다.
상기 HLA-A2는 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA)의 HLA-A 혈청 그룹에 속하는 혈청형 중 하나로서, 상기 HLA는 인간의 주조직적합성복합체(major histocompatibility complex: MHC) 유전자에 의해 암호화되는 당단백 분자이다. 상기 HLA-A는 모든 유핵세포 및 혈소판의 세포 표면에 발현되며, 세포독성 T세포가 바이러스에 감염된 세포나 종양세포를 인지하여 제거하기 위한 항원 인식 기능을 한다.
상기 간엽줄기세포는 PTX-3, TIMP1 및 BDNF으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 과발현하는 것일 수 있다. 상기 과발현은 유전적 조작을 통해 수행될 수 있으며, 구체적으로, 상기 과발현은 PTX-3, TIMP1, BDNF 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 코딩하는 유전자가 적재된 벡터를 통해 형질전환하여 수행될 수 있다.
상기 간엽줄기세포는 염증 자극을 가함으로써 PTX-3, TIMP1, BDNF 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현량이 증가되는 것일 수 있다.
본 발명에서 염증 자극은 생체내 염증 반응을 모방하는 염증 환경에 노출시키는 것을 의미할 수 있다. 상기 염증 자극은 염증 세포에 의해 분비되는 물질, 예컨대 사이토카인을 통한 자극일 수 있거나, 시험관내 또는 동물 염증 모델에 노출시키는 것일 수 있거나, 염증이 유도된 세포와 공배양하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염증 조건 또는 염증 환경은 염증이 생긴 환부일 수 있다.
상기 간엽줄기세포는 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수 있다:
(1) 간엽줄기세포를 10㎛ 이하의 크기로 분리하는 단계;
(2) 상기 분리된 간엽줄기세포를 칼슘을 함유하는 배양 배지에서 2% 내지 5% 저산소 조건 하에 배양하는 단계; 및
(3) 상기 배양된 간엽줄기세포를 염증 자극을 가하는 단계.
상기 방법에서 10㎛ 이하의 크기로 분리한 간엽줄기세포는 다른 크기의 간엽줄기세포에 비해 증식력이 우수하고 칼슘을 함유하는 배지에서 저산소 조건으로 배양하는 경우에 간엽줄기세포의 증식력 및 분화능이 더욱 향상될 수 있다.
상기 방법에서 칼슘은 1.5 mM 내지 3.8 mM의 농도로 배양 배지에 함유되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 방법에서 칼슘은 1.5 mM 내지 2.0 mM의 농도로 배양배지에 함유되는 것일 수 있다.
상기 배양은 통상적으로 알려진 방식대로 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 간엽줄기세포는 3차원 생물반응장치(bioreactor 또는 spinner)를 이용하여 배양하거나, 일반 부착성 용기 및 3D 캐리어에 세포 부착성 물질을 코팅하는 방법으로 배양할 수 있다. 또한, 상기 간엽줄기세포는 3D 캐리어를 이용하여 배양할 수 있다.
상기 간엽줄기세포는 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 탯줄, 양수 또는 치아로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 간엽줄기세포는 제대혈로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물은 일종의 세포치료제로서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 담체는 약품 제조시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 염증 질환은 염증이 동반되는 질환을 의미한다. 구체적으로, 상기 염증 질환은 골관절염, 류마티스 관절염, 아토피, 천식, 알레르기 비염, 알츠하이머병, 이식편대숙주병(GVHD), 당뇨병성 신증, 크론병, 염증성 장질환, 이식후 거부반응, 기관지폐이형성증(BPD) 또는 만성폐쇄성폐질환(COPD)인 것일 수 있다. 상기 통증은 염증성 통증일 수 있으며, 상기 염증성 통증은 관절염 통증일 수 있다.
상기 약학 조성물이 투여되는 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물을 치료하고자 하는 염증 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 그 예로는 피하, 눈, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내, 뇌 내, 두개 내(intracranial), 척추 내, 뇌실 내, 수강막 내, 비강 내, 정맥 내 투여, 관절 내 투여가 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은 관절 내, 관절 손상 부위, 관절의 내측(medial) 및/또는 외측(lateral)에 투여할 수 있으며, 상기 관절은 무릎, 손가락, 또는 발가락 관절일 수 있다. 상기 "관절 내" 투여는 "관절강 내" 투여를 포함될 수 있다.
상기 투여는 1회 이상, 1회 내지 3회 투여될 수 있고, 구체적으로 3회 투여될 수 있다. 반복 투여하는 경우에는 1일 내지 56일, 7일 내지 49일, 14일 내지 42일 또는 21일 내지 35일 간격으로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 28일 간격으로 투여할 수 있다. 투여량이 많은 경우에는 하루에 수회에 걸쳐 투여될 수 있다.
상기 간엽줄기세포의 투여량은 1×105 세포/개체 내지 5×107 세포/개체일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, PTX-3, TIMP1 및 BDNF으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 증가된 발현을 나타내도록 간엽줄기세포를 자극하는 단계를 포함하는 항염증 또는 통증 감소 효능이 개선된 간엽줄기세포를 수득하는 방법을 제공한다. 상기 간엽줄기세포는 약학 조성물에서 상술한 바와 동일하다.
상기 자극 단계는 간엽줄기세포를 염증 환경에 노출하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 염증 환경에 노출하는 단계는, 염증 세포에 의해 분비되는 물질, 예컨대 사이토카인을 통한 자극일 수 있거나, 염증이 유도된 세포와 공배양하는 하는 것이거나, 생체내 염증 환경을 모방한 시험관내 또는 동물 염증 모델에 노출하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 염증이 유도된 세포는 LPS(Lipopolysaccharide), 유사분열 촉진물질(mitogen) 또는 사이토카인(Cytokine)을 처리하여 염증이 유도된 것일 수 있다.
상기 세포는 체세포, 생식세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 상기 체세포가 근육세포, 간세포, 신경세포, 섬유아세포, 상피세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 혈소판 또는 점막세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 상기 생식세포가 정자, 난자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 간엽줄기세포는 자극 단계 전에 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것일 수 있다:
(1) 간엽줄기세포를 10㎛ 이하의 크기로 분리하는 단계; 및
(2) 상기 분리된 간엽줄기세포를 칼슘을 함유하는 배양 배지에서 2% 내지 5% 저산소 조건 하에 배양하는 단계.
상기 방법에서 칼슘은 1.5 mM 내지 3.8 mM의 농도로 배양 배지에 함유되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 방법에서 칼슘은 1.5 mM 내지 2.0 mM의 농도로 배양배지에 함유되는 것일 수 있다.
상기 단계 (1) 및 (2)은 약학 조성물에서 상술한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증 질환 또는 통증의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 인간을 포함하는 포유류일 수 있으며, 인간이 아닌 동물일 수 있다. 상기 "인간이 아닌 동물"이라는 용어는 모든 척추동물로서, 인간이 아닌 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 포유동물 및 비(非) 포유동물을 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 상기 조성물의 양 및 투여 횟수는 예방 또는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 간엽줄기세포(SMUP-CELL)의 제조
먼저, 간엽줄기세포(SMUP-CELL)를 제조하기 위해, 동종제대혈로부터 피콜-플라크(Ficoll-plaque)를 이용하여 단핵세포를 분리한 후, 5×106 내지 1×106 cells/cm2로 분주하고 37℃ 5% CO2, 3% O2 배양기에서 최대 21일간 배양하였다. 그 후, 10 um 크기 이하의 세포를 분리하여 500 내지 3,000/cm2 농도로 분주하고 5% 내지 30%의 우태아혈청을 포함한 α-MEM 배지(SH30265.02, Hyclone)에 1.5 내지 3.8 mM 농도의 칼슘을 첨가하여 2% 내지 5%의 저산소 조건에서 최대 7일간 배양하였다.
실시예 1. 대식세포 염증 모델에서 간엽줄기세포의 항염증 효과 확인
실시예 1.1. 염증 조건에서 간엽줄기세포의 PTX-3, TIMP1 및 BDNF 발현 증가 확인
1×105 세포수의 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포주에 LPS(Lipopolysaccharide) 1 ㎍/㎖을 처리하여 제작된 대식세포 염증 모델에 2×105 세포수의 SMUP-Cell을 공배양한 후에 분석을 진행하였다. SMUP-Cell을 단독 배양한 경우와 비교 분석하였다. 이때, 기본적인 배양 배지는 RPMI(22400, GIBCO)를 사용하여 배양 진행하였다.
구체적으로, SMUP-Cell을 단독 배양한 배지와 대식세포 염증 모델과 SMUP-Cell를 공배양한 배지에서 PTX-3, TIMP1 및 BDNF 단백질의 발현량을 human PTX-3 ELISA kit(DPTX30B, R&D System), human TIMP1 ELISA kit(DTM100, R&D System), human BDNF ELISA kit(DBD00, R&D System)으로 분석하였다. 이때, SMUP-Cell을 단독 배양한 배지에서 측정된 각 단백질의 발현량을 100으로 놓고 SMUP-Cell을 공배양한 배지에서 측정된 각 단백질의 발현량을 환산하여 비교하였다.
그 결과, 대식세포 염증 모델과 SMUP-Cell을 공배양한 배지에서 PTX-3, TIMP1 및 BDNF 단백질의 발현량이 증가되는 것을 확인하였다(도 1).
실시예 1.2. 염증조건에서 간엽줄기세포의 HLA-A2 발현 확인
상기 실시예 1.1에서 제조한 대식세포 염증 모델에 2×105 세포수의 SMUP-Cell을 동일한 배양 조건(RPMI (22400, GIBCO)에서 공배양한 후, SMUP-Cell의 HLA-A2 발현을 확인하였다.
구체적으로, 공배양된 SMUP-Cell에 트립신을 처리하여 단일세포로 분리한 후, PBS용액으로 2회 세척하였다. 그 후, 세척된 SMUP-Cell에 PE가 표지된 항-HLA-A2 항체와 반응시켰고, 이를 실험군으로 설정하였다. 음성 대조군으로 Isotype control-PE를 반응시켰다. 상기 실험군 및 음성 대조군을 FACS를 이용하여 HLA-A2의 발현을 확인하였다. 이때, 공배양된 SMUP-Cell은 각 다른 기증자 2종을 사용하여 진행하였다.
그 결과, 실험군의 공배양된 SMUP-Cell 1과 SMUP-Cell 2에서 형광 신호가 측정되었다. 이를 통해, 대식세포 염증 모델과 공배양된 SMUP-Cell 1과 SMUP-Cell 2에서 HLA-A2가 발현되는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 1.3. PTX-3, TIMP1, BDNF 및 HLA-A2를 발현하는 간엽줄기세포의 항염증 효과 확인
상기 실시예 1.2의 공배양된 배지를 획득하여 마우스 IL-6, 마우스 TNF-a에 대해 ELISA 분석을 통해 염증성 사이토카인의 발현량을 확인하였다. 구체적으로, Mouse IL-6 ELISA Kit (DY406, R&D System) 및 Mouse TNF-a ELISA kit(DY410, R&D System)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였으며, 공동배양의 배양액 샘플을 1 내지 50 사이로 희석하여 분석하였다. 그 후, VERSA max microplate reader(Molecular Device)를 이용하여 반응액의 OD 값을 측정하였다.
또한, 마우스 IL-10에 대해 ELISA 분석(DY417, R&D Systems)을 통해 항염증성 사이토카인의 발현량을 확인하였다. 이때, 염증이 유도되지 않은 RAW264.7 세포주를 단독 배양한 배지와 대식세포 염증 모델을 배양한 배지도 동일하게 ELISA 분석을 통해 마우스 IL-6, 마우스 TNF-a 및 마우스 IL-10의 발현량을 비교 분석하였다.
그 결과, RAW264.7 세포주를 단독 배양한 배지에 비해 대식세포 염증 모델을 배양한 배지에서 IL-6, TNF-a, IL-10가 모두 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 대식세포 염증 모델과 SMUP-Cell을 공배양한 배지에서는 IL-6 및 TNF-a의 발현량은 감소하고, IL-10의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 2. 연골세포 염증 모델에서 간엽줄기세포의 항염증 효과 확인
실시예 2.1. 염증조건에서 간엽줄기세포의 PTX-3, TIMP1 및 BDNF 발현 증가 확인
1×105 세포수의 인간 연골세포주인 SW1353 세포주(Chon)에 IL-1b 10 ng/㎖을 처리하여 연골세포 염증 모델을 제작하였다. 그 후, 제작된 연골세포 염증 모델에 1×105 세포수의 SMUP-Cell을 공배양한 후에 분석을 진행하였다. 이때, PTX-3, TIMP1 및 BDNF 발현량을 실시예 1.1과 동일한 방법으로 측정하였으며, SMUP-Cell을 단독 배양한 경우와 비교 분석하였다. SMUP-Cell은 각 다른 3명의 기증자로부터 받은 다른 3종을 사용하였고, 3종의 SMUP-Cell 별로 공배양 배양액에서 더 증가된 비율을 그래프화 하였다. 수치 계산은 ‘(Chon + IL-1b + SMUP-Cell)배양액 / SMUP-Cell 단독 배양액 * 100’으로 하였으며, 계산된 수치만 그래프로 표현하였다.
그 결과, 연골세포 단독 혹은 연골세포 염증 모델에서는 PTX-3, TIMP1 그리고 BDNF가 거의 발현되지 않았다. 반면, 연골세포 염증 모델과 SMUP-Cell을 공배양한 경우에서 PTX-3, TIMP1, BDNF의 발현량이 증가되는 확인하였다(도 4).
실시예 2.2. PTX-3, TIMP1 및 BDNF를 발현하는 간엽줄기세포의 항염증 효과 확인
실시예 2.1에서 제조한 연골세포 염증 모델에 1×105 세포수의 SMUP-Cell을 공배양하여 연골세포의 염증을 감소시킬 수 있는지를 확인하였다. 이때, SMUP-Cell은 각 다른 3명의 기증자로부터 받은 다른 3종을 사용하였으며, 1) 연골세포 단독으로 배양한 군(Chon), 2) 연골세포 염증 모델 군(Chon + IL-1b), 및 3) 연골세포 염증 모델과 SMUP-Cell 3종 각각을 공배양한 군으로 나누어 실험을 진행하였다.
상기 1) 내지 3)의 각 군에서 배양된 연골세포에 트립신을 처리하여 단일세포로 분리한 후, mRNA를 분리하여 염증성 사이토카인인 IL-1b, IL-8 및 IL-6의 발현량을 qPCR로 분석한 후 GAPDH를 이용하여 표준화된 수치로 비교 분석하였다. qPCR은 TRIzol reagent(12263026, Invitrogen)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포에 처리하여 mRNA를 추출하였고, Transcriptor-First-Strand-cDNA Synthesis Kit (4897030001, Roche)를 이용하여 cDNA를 합성한 후, 염증성 마커인 IL-1b, IL-8, IL-6 및 GAPDH 프라이머와 함께 혼합하였다. 그 후, 실시간 PCR인 Light Cycler 480 Real-Time PCR System instrument(Roche)를 이용하여 특정 마커에 따른 cDNA 산물을 측정하였다. 이때, 측정된 cDNA 산물의 발현량을 GAPDH 발현량으로 정규화(normalization)하여 각 조건에서 배양된 세포에서 마커의 발현량을 비교 분석하였다. qPCR에 사용한 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.
| 프라이머 | 서열정보 | |
| Human GAPDH | forward | agc cac atc gct cag aca c |
| reverse | gcc caa tac gac caa atc c | |
| Human IL-1b | forward | TAC CTG TCC TGC GTC TTG AA |
| reverse | TCT TTG GGT AAT TTT TGG GAT CT | |
| Human IL-8 | forward | AGA CAG CAG AGC ACA CAA GC |
| reverse | ATG GTT CCT TCC GGT GGT | |
| Human IL-6 | forward | GAT GAG TAC AAA AGT CCT GAT CCA |
| reverse | CTG CAG CCA CTG GTT CTG T | |
그 결과, 1) 연골세포 단독으로 배양한 군에 비해 2) 연골세포 염증 모델 군에서 IL-1b, IL-8 및 IL-6의 발현량이 상당히 증가되는 것을 확인하였다. 반면, 3) 연골세포 염증 모델과 SMUP-Cell 3종을 공배양한 군에서는 IL-1b, IL-8 및 IL-6의 발현량이 감소되는 것을 확인하였다(도 5).
실시예 3. 간엽줄기세포에서 분비되는 PTX-3의 항염증 효과 확인
실시예 3.1. 간엽줄기세포의 PTX-3 유전자 녹다운에 따른 대식세포 염증 모델의 사이토카인 발현량 변화 확인
간엽줄기세포에서 분비되는 PTX-3와 염증의 연관성을 확인하기 위해 간엽줄기세포에 PTX-3 siRNA를 처리하여 PTX-3 발현을 녹다운(Knock down)시킨 세포(SMUP-Cell PTX-3 C-siR)를 이용하였다. 이때, 음성 대조군으로 control siRNA(SMUP-Cell C-siR)를 처리한 간엽줄기세포를 함께 사용하였다. 실시예 1.1의 대식세포 염증 모델 및 실시예 2.1의 연골세포 염증 모델과 SMUP-Cell 또는 SMUP-Cell PTX-3 C-siR를 각각 공배양하여 항염증 효과를 비교 분석하였다.
먼저, 대식세포 염증 모델에서 배양된 배지를 이용하여 염증성 사이토카인인 TNF-a와 항염증성 사이토카인인 ARG-1(Arginase-1)를 ELISA로 측정하였다. 구체적으로, Mouse TNF-α ELISA (DY410, R&D System) 및 Mouse Arginase 1 ELISA (ab269541, abcam)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였으며, 공동배양의 배양액 샘플을 1 내지 50 사이로 희석하여 분석하였다. 그 후, VERSA max microplate reader(Molecular Device)를 이용하여 반응액의 OD 값을 측정하였다.
그 결과, 대식세포 염증 모델만을 배양한 배지에 비해 대식세포 염증 모델과 SMUP-Cell 또는 SMUP-Cell C-siR를 공배양한 배지에서 TNF-α의 발현량이 감소하였고, ARG-1의 발현량이 증가하였다. 반면, 대식세포 염증 모델과 SMUP-Cell PTX-3 siR을 공배양한 배지에서는 TNF-a의 발현량이 증가하고 ARG-1의 발현량이 감소하였다. 이를 통해, PTX-3의 발현이 염증 반응 조절에 관여하는 것을 확인하였다(도 6).
실시예 3.2. 간엽줄기세포의 PTX-3 유전자 녹아웃에 따른 대식세포 염증 모델의 표현형 변화 확인
LPS 처리를 통한 염증 유도와 SMUP-Cell 공배양에 따른 대식세포의 표현형 변화(M1: 염증 활성, M2: 항염증 활성)를 확인하기 위해 염증이 유도된 RAW264.7 세포주를 고정하고 마우스 항체로 세포 염색을 진행하였다.
구체적으로, 고정된 세포에 1차 항체로 Anti-CD11b(Abcam, #ab128797), mouse MMR/CD206(R&D System, #AF2535)을 각각 냉장에서 12시간 내지 16시간 처리하여 반응시킨 후, 발색을 위해 Alexa Fluor 488(초록색)과 Cy3(빨간색)가 결합된 2차 항체를 각각 처리한 후, 상온에서 30분동안 반응시켰다. 그 후, 반응하지 않은 시약을 세척한 후 핵 염색을 위해 Hoechst 33342(파란색, Invitrogen, H3570)을 처리하고 5분간 반응시켰다. 최종 염색된 세포를 LSM 800 confocal microscopy (Zeiss)를 이용하여 촬영하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 핵은 파란색, M1 마커인 CD11b는 초록색, M2 마커인 CD206은 붉은색으로 염색되었다. 염증을 유도하지 않은 RAW264.7 세포주의 경우 M1의 마커인 CD11b와 M2의 마커인 CD206의 염색이 거의 되지 않은 반면, LPS를 처리하여 염증을 유도한 RAW264.7 세포주의 경우 대부분의 세포주에서 CD11b가 염색된 것을 확인하였다. 반면, 염증이 유도된 RAW264.7 세포주에 SMUP-Cell 또는 SMUP-Cell C-siR을 공배양한 경우에는 CD11b의 염색이 현저히 줄어든 것을 확인하였다. 또한, 염증이 유도된 RAW264.7 세포주에서는 CD206의 염색이 거의 되지 않은, 반면 SMUP-Cell 또는 SMUP-Cell C-siR을 공배양한 세포에서는 CD206의 염색이 증가된 것을 확인하였다. 한편, SMUP-Cell PTX-3 siR을 공배양한 경우에는 CD11b의 염색이 증가된 것을 확인하였으며, CD206의 염색이 감소된 것을 확인하였다. 또한, 연골세포 염증 모델에서도 동일한 경향성을 확인하였다.
이를 통해, SMUP-Cell에서 분비되는 PTX-3가 대식세포의 표현형에 영향을 주어 염증 활성 조절에 관여하는 것을 확인하였다.
실시예 3.2. 간엽줄기세포의 PTX-3 유전자 과발현에 따른 대식세포 염증 모델의 사이토카인 발현량 변화 확인
간엽줄기세포에서 분비되는 PTX-3와 염증의 연관성을 확인하기 위해 간엽줄기세포에 CRISPR/CAS9 기술을 이용하여 PTX-3의 과발현(Overexpression, OE)을 유도시킨 세포(SMUP-Cell PTX-3 OE)를 이용하였다. 이때, 음성 대조군으로 벡터(vector)만 도입시킨 SMUP-Cell C-vec를 이용하였다. 실시예 1.1의 대식세포 염증 모델에서 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-vec 및 SMUP-Cell PTX-3 OE를 각각 공배양하여 항염증 효과를 비교 분석하였다.
대식세포 염증 모델에서 배양된 배지를 이용하여 염증성 사이토카인인 IL-6를 ELISA로 측정하였다. 구체적으로, Mouse IL-6 ELISA (DY406, R&D System)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였으며, 공동배양의 배양액 샘플을 1 내지 50 사이로 희석하여 분석하였다. 그 후, VERSA max microplate reader(Molecular Device)를 이용하여 반응액의 OD 값을 측정하였다.
그 결과, 대식세포 염증 모델만을 배양한 배지에 비해 대식세포 염증 모델과 SMUP-Cell 또는 SMUP-Cell C-vec를 공배양한 배지에서 IL-6의 발현량이 유사하게 감소하였다. 반면, 대식세포 염증 모델과 SMUP-Cell PTX-3 OE을 공배양한 배지에서는 IL-6의 발현량이 과발현 전의 SMUP-Cell의 공배양에 비해 현저히 감소하였다. 이를 통해, PTX-3의 발현이 염증 반응 조절에 관여하는 것을 확인하였다(도 13).
실시예 3.4. 간엽줄기세포의 PTX-3 유전자 녹다운에 따른 연골세포 염증 모델의 사이토카인 발현량 변화 확인
실시예 2.1의 연골세포 염증 모델과 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR 또는 SMUP-Cell PTX-3 siR를 공배양한 후, 연골세포의 염증성 사이토카인의 발현량을 qPCR를 통해 확인하였다. 상기 qPCR은 실시예 2.2와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 연골세포 염증 모델만을 배양한 배지에 비해 연골세포 염증 모델과 SMUP-Cell 또는 SMUP-Cell C-siR를 공배양한 배지에서 IL-1b, IL-6, IL-8 및 TNF-a의 발현량이 감소하였다. 반면, 연골세포 염증 모델과 SMUP-Cell 또는 SMUP-Cell C-siR를 공배양한 배지에 비해 연골세포 염증 모델과 SMUP-Cell PTX-3 siR을 공배양한 배지에서는 IL-1b, IL-6, IL-8 및 TNF-a의 발현량이 높은 것을 확인하였다.
이를 통해, 간엽줄기세포에서 PTX-3의 발현이 연골세포의 염증 반응 조절에 관여하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 간엽줄기세포에서 분비되는 PTX-3의 통증 감소 효과 확인
관절염 통증 유발 랫드 모델의 제작을 위해, 150 g 내지 250 g 수컷 랫드를 마취한 후 무릎 관절강 내 주사기를 이용하여 MIA(Monoiodoacetate) 2 ㎎을 주입하였다. 그 후, MIA 주입 4일 후, 2.5×105 cells/ 25 ㎕의 간엽줄기세포를 1% HA(hyaluronic acid)와 함께 관절강 내 주사기를 이용하여 주입하였다. 통증 측정은 체중부하 측정(Incapacitance test)으로 MIA 주입 후 0일, 1일, 4일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 측정하였다. 대조군으로 1% HA만 단독 주입한 군을 추가하였다. 또한, 음성대조군으로 PTX-3 발현의 영향을 확인하기 위해 PTX-3 siRNA 처리한 SMUP-Cell과 PTX-3 발현이 현저히 낮은 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)(CRL-1730, ATCC)을 이용하였다.
이때, 간엽줄기세포의 PTX-3 발현량은 실시예 1.1의 대식세포 염증 모델에 SMUP-Cell, SMUP-Cell C-siR, SMUP-Cell PTX-3 siR, HUVEC을 각각 공배양한 배양액을 human PTX-3 ELISA kit로 측정한 후, SMUP-Cell에서 발현되는 PTX-3 양을 100%로 환산된 비율로 그래프화하여 확인하였다. 그 결과, SMUP-Cell에 비해서 SMUP-Cell PTX-3 siR에서 분비되는 PTX-3의 양이 감소된 것을 확인하였으며, HUVEC의 경우 SMUP-Cell PTX-3 siR보다도 PTX-3 발현량이 현저히 떨어진 것을 확인하였다(도 9).
각 군의 PTX-3 발현량의 차이에 의해 통증 감소 효과에 변화가 있는지 확인하였다. 이때, 정상 랫드의 뒷다리 양쪽에 체중이 동일하게 분산되는 반면(ipsilateral/total weight(%) = 50), MIA 및 MIA에 HA만 투여한 대조군에서 MIA 주입 후부터 시간이 흐를수록 통증이 심해져 수치가 낮아지는 것을 확인함으로써 동물 통증 모델을 제작하였다. 그 후, 관절염 통증 유발 랫드에 PTX-3 발현량이 차이나는 간엽줄기세포를 주입하여 통증완화 효과를 확인하였다.
그 결과, PTX-3 발현량이 높은 SMUP-Cell과 SMUP-Cell C-siR을 주입한 군에서는 주입 후부터 체중 부하의 수치가 증가하여 세포 투여 24일 이내 거의 회복되는 것을 확인하였다. 반면, SMUP-Cell PTX-3 siR을 이식한 군은 세포 투여 이후에도 체중부하가 회복되지 않고 감소되는 것을 확인하였다. 또한, HUVEC을 이식한 군에서는 초기 체중 부하가 회복되는 듯 하였으나, 결국 세포 투여 10일 후부터 그 수치가 감소하면서 통증 감소의 경향성을 보이지 못하였다.
이를 통해, 간엽줄기세포에서 분비하는 PTX-3가 관절염 통증 감소에 관여하는 것을 확인하였다.
실시예 5. 간엽줄기세포에서 분비하는 TIMP1과 항염증 효과 확인
간엽줄기세포에서 분비되는 TIMP1과 염증의 연관성을 확인하기 위해 간엽줄기세포에 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CAS9 시스템을 이용하여 TIMP1 발현을 녹아웃시킨 세포(SMUP-Cell TIMP1 Knock out, KO)를 이용하여 시험을 진행하였다. 이때, 음성 대조군으로 벡터(vector)만 도입시킨 SMUP-Cell C-vec을 이용하였다.
실시예 2의 연골세포 염증 모델과 상기 각 군의 간엽줄기세포를 공배양한 후, 연골세포 염증 모델에 트립신 처리하여 단일세포로 만들고 mRNA를 추출하여 염증성 사이토카인의 유전자 발현 양상을 qPCR로 확인하였다. 상기 qPCR은 실시예 2.2와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, SMUP-Cell 또는 SMUP-Cell c-vec와 공배양한 정상 연골세포에 비해 SMUP-Cell 또는 SMUP-Cell c-vec와 공배양한 연골세포 염증모델의 IL-1b, IL-6, IL-8 및 TNF-α의 발현이 감소한 것을 확인하였다. 반면, SMUP-Cell 또는 SMUP-Cell c-vec와 공배양한 경우에 비해 SMUP-Cell TIMP1 KO를 연골세포 염증 모델과 공배양한 경우에 IL-1b, IL-6, IL-8 및 TNF-α의 발현량이 높은 것을 확인하였다. 이를 통해, 간엽줄기세포에서 TIMP1의 발현이 염증 반응 조절에 관여하는 것을 확인하였다(도 11).
실시예 6. 간엽줄기세포에서 분비하는 BDNF와 항염증 연관성 확인
간엽줄기세포에서 분비되는 BDNF와 염증의 연관성을 확인하기 위해 간엽줄기세포에 BDNF siRNA를 처리하여 BDNF 발현을 녹다운시킨 세포(SMUP-Cell BDNF C-siR)를 이용하여 시험 진행하였다. 이때, 음성 대조군으로 control siRNA(SMUP-Cell C-siR)를 처리한 간엽줄기세포를 함께 사용하였다.
실시예 1의 대식세포의 염증 모델과 각 군의 간엽줄기세포를 공배양한 후, 배양 배지를 이용하여 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-a의 발현량을 human ELISA kit로 측정하였다.
그 결과, 대식세포 염증 모델만을 배양한 배지에 비해 대식세포 염증 모델과 SMUP-Cell 또는 SMUP-Cell C-siR를 공배양한 배지에서 IL-6 및 TNF-a의 발현량이 감소하였다. 반면, 대식세포 염증 모델과 SMUP-Cell PTX-3 siR을 공배양한 배지에서는 대식세포 염증 모델과 SMUP-Cell 또는 SMUP-Cell C-siR를 공배양한 배지에 비해 IL-6 및 TNF-a의 발현량이 높았다. 이를 통해, BDNF의 발현이 염증 반응 조절에 관여하는 것을 확인하였다(도 12).
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Claims (19)
- PTX-3 단백질을 발현하는 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 간엽줄기세포가 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것인, 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
(1) 간엽줄기세포를 10㎛ 이하의 크기로 분리하는 단계;
(2) 상기 분리된 간엽줄기세포를 칼슘을 함유하는 배양 배지에서 2% 내지 5% 저산소 조건 하에 배양하는 단계; 및
(3) 상기 배양된 간엽줄기세포를 염증 자극을 가하는 단계,
상기 염증 자극은 상기 간엽줄기세포를 염증이 유도된 세포와 공배양하는 것을 포함하는 것인, 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 칼슘이 1.5 내지 3.8 mM 농도로 함유되는 것인, 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 간엽줄기세포가 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 탯줄, 양수 또는 치아로부터 유래된 것인, 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 통증은 염증성 통증인 것인, 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제9항에 있어서,
상기 염증성 통증은 관절염 통증인 것인, 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 간엽줄기세포는 염증이 생긴 환부에서 PTX-3 단백질의 발현량이 증가되는, 통증의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - PTX-3 단백질의 증가된 발현을 나타내도록 간엽줄기세포를 자극하는 단계를 포함하는 통증 감소 효능이 개선된 간엽줄기세포를 수득하는 방법으로서,
상기 간엽줄기세포는 체외의 것이고,
상기 자극 단계가 상기 간엽줄기세포를 염증이 유도된 세포와 공배양하는 것을 포함하는 것인, 통증 감소 효능이 개선된 간엽줄기세포를 수득하는 방법. - 삭제
- 삭제
- 제12항에 있어서,
상기 염증이 유도된 세포는 LPS(Lipopolysaccharide), 유사분열 촉진물질(Mitogen), 케모카인(Chemokine) 또는 사이토카인(Cytokine)을 처리하여 염증이 유도된 것인, 통증 감소 효능이 개선된 간엽줄기세포를 수득하는 방법. - 제15항에 있어서,
상기 세포는 체세포, 생식세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 통증 감소 효능이 개선된 간엽줄기세포를 수득하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 체세포가 근육세포, 간세포, 신경세포, 섬유아세포, 상피세포, 지방세포, 골세포, 백혈구, 림프구, 혈소판 또는 점막세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 통증 감소 효능이 개선된 간엽줄기세포를 수득하는 방법. - 제12항에 있어서,
상기 간엽줄기세포가 자극 단계 전에 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인, 통증 감소 효능이 개선된 간엽줄기세포를 수득하는 방법:
(1) 간엽줄기세포를 10㎛ 이하의 크기로 분리하는 단계; 및
(2) 상기 분리된 간엽줄기세포를 칼슘을 함유하는 배양 배지에서 2% 내지 5% 저산소 조건 하에 배양하는 단계. - 제18항에 있어서,
상기 칼슘이 1.5 내지 3.8 mM 농도로 함유되는 것인, 통증 감소 효능이 개선된 간엽줄기세포를 수득하는 방법.
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| Mancuso et al., Front Bioeng Biotechnol., 2019 Jan 29;7:9 |
| Meng Sun et al., J Immunol Res. 2019 Jun 19;2019:7059680 |
| Piotr Wojdasiewicz et al., Mediators Inflamm., 2014: 561459 |
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