TWI818286B - 包括表現腫瘤壞死因子可誘導基因６的間葉幹細胞之組成物及藥物組成物 - Google Patents
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Abstract
本揭露是有關於表現腫瘤壞死因子可誘導基因6(TSG-6)
蛋白的間葉幹細胞在軟骨再生及/或骨關節炎治療中的用途。本揭露提供一種用於軟骨再生及/或表現膠原II蛋白的組成物及用於治療骨關節炎的藥物組成物，所述組成物包含表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞作為活性成分。在本揭露中提供的用於軟骨再生的組成物及/或用於治療骨關節炎的藥物組成物可能夠增加軟骨細胞的膠原表現並降低炎症，並且恢復軟骨結構。
Description
本揭露是有關於一種用於治療關節炎的組成物或使用其的治療方法，且更具體而言，是有關於一種用於治療骨關節炎的藥物組成物及/或使用其的治療方法，所述藥物組成物包含表現腫瘤壞死因子可誘導基因6(tumor necrosis factor-inducible gene 6，TSG-6)的間葉幹細胞(mesenchymal stem cell，MSC)。
相關申請案的交叉參考
本揭露主張基於2020年7月17日提出申請的韓國專利申請案第10-2020-0089148號的優先權的權益，所述韓國專利申請案的全部揭露內容併入本案供參考。
骨關節炎亦被稱為退行性關節炎，且其為當用以保護骨末端的骨骼的軟骨磨損時發生的一種關節疾病。其為最常見的關節炎類型，尤其是在早上表現出例如關節痛、腫脹及僵硬等症狀。
軟骨是位於將身體的兩塊骨頭彼此連接起來的關節面上的纖維結締組織，且由軟骨細胞及成軟骨細胞構成。軟骨的核心組分是膠原，具體而言是膠原II(2型膠原，II型膠原)。
目前，骨關節炎的治療側重於在減輕疼痛的同時保持關節柔性，並且通常使用藥物及鍛煉以及物理治療等，並且當關節嚴重受損時，有限地執行例如人工關節置換等手術。
TSG-6是由LINK及CUBE兩個域(domain)構成的蛋白，且已知由例如TNF等炎症刺激誘導，並且主要產生於例如成纖維細胞及結締組織細胞等細胞中。
已知TSG-6具有抗炎作用，但當注射至關節腔中時，已知其在短時間內分散在關節腔外。根據2016年的一份報告，關節內注射TSG-6的半衰期小於0.5小時(金姆(Kim)D-K等人，2016，影響因子(PLoS ONE)11(1))，且因此，儘管TSG-6具有抗炎作用，但存在注射期間難以預期持續的治療效果此限制。
本揭露的一個實施例提供一種用於軟骨再生的(藥物)組成物，所述(藥物)組成物包含表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞作為活性成分。
另一實施例提供一種再生軟骨的方法，所述方法包括向需要軟骨再生的受試者施用藥學有效量的表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞。
其他實施例提供表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞在軟骨再生中的用途或表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞在製備用於軟骨再生的藥物組成物中的用途。
如上所述表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞的軟骨再生效果可能是由於膠原II蛋白的表現及/或分泌增加。在一個實施例中，將被應用(施用)用於軟骨再生的藥物組成物、方法及/或用途的受試者可為膠原II蛋白的表現及/或分泌低(例如，低於正常人)的患者及/或需要增加膠原II蛋白的表現及/或分泌的患者。此外，軟骨再生的方法可更包括在施用步驟之前，辨識需要軟骨再生及/或需要增加膠原II蛋白的表現及/或分泌(例如，膠原II蛋白的表現及/或分泌低於正常人)的受試者。
其他實施例提供一種用於預防及/或治療骨關節炎的藥物組成物，所述藥物組成物包含表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞作為活性成分。
其他實施例提供一種預防及/或治療骨關節炎的方法，所述方法包括向需要預防及/或治療骨關節炎的受試者施用藥學有效量的表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞。
其他實施例提供表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞在預防及/或治療骨關節炎中的用途，或表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞在製備用於預防及/或治療骨關節炎的藥物組成物中的用途。
如上所述表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞的預防及/或治療骨關節炎的效果可能是由於軟骨再生及/或膠原II蛋白的表現及/
或分泌增加。在一個實施例中，將被應用(施用)用於預防及/或治療骨關節炎的藥物組成物、方法及/或用途的受試者可為膠原II蛋白的表現及/或分泌低(例如，低於正常人)的患者及/或需要增加膠原II蛋白的表現及/或分泌及/或軟骨再生的患者。此外，預防及/或治療骨關節炎的方法可更包括在施用步驟之前，辨識需要預防及/或治療骨關節炎及/或需要軟骨再生、及/或需要增加膠原II蛋白的表現及/或分泌(例如，膠原II蛋白的表現及/或分泌低於正常人)的受試者。
本揭露的其他實施例提供一種用於表現及/或分泌膠原II蛋白或用於增加膠原II蛋白的表現及/或分泌的組成物，所述組成物包含表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞作為活性成分。
其他實施例提供一種表現及/或分泌膠原II蛋白的方法或增加膠原II蛋白的表現及/或分泌的方法，所述方法包括將藥學有效量的表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞施用至需要增加膠原II蛋白的表現及/或分泌的受試者。
其他實施例提供表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞在膠原II蛋白的表現及/或分泌、或增加膠原II蛋白的表現及/或分泌中的用途，或者表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞在製備用於增加膠原II蛋白的表現及/或分泌的組成物中的用途。
本揭露提供一種用於軟骨再生的組成物及/或一種用於預防或治療骨關節炎的藥物組成物及/或一種用於增加膠原II蛋白的
表現及/或分泌的組成物及/或其使用方法，所述組成物包含表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞作為活性成分。
圖1是在所選擇的兩種TSG-6 MSC及對照組(TSG-6非轉導組)中執行ELISA以量測表現水準的結果的圖。
圖2a是確認軟骨細胞體外膠原表現水準的共培養實驗設計的示意圖。
圖2b是示出確認各組中膠原II及對照組(GADPH)的表現水準的蛋白免疫印跡結果(western blot result)的量化值(膠原II蛋白表現水準/GAPDH表現水準)的圖。
圖3a是藉由番紅O染色確認骨關節炎兔模型中各組恢復軟骨組織的程度的顯微鏡照片(比例尺：160um，-B-中的箭頭：標記克隆)。
圖3b是在骨關節炎兔模型中分別量測各組在股骨及脛骨方向上的軟骨厚度的曲線圖，且結果示出統計學意義。n.s.：不顯著；*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.0001(以下相同)。
圖4a是骨關節炎兔模型的軟骨中根據各組的TGF-b1的IHC染色結果的照片。
圖4b是在骨關節炎兔模型中量測各組的TGF-b1的免疫反應性的圖，且結果示出統計學意義。
圖5a是骨關節炎兔模型的軟骨中根據各組的TNF-a的IHC染色結果的照片。
圖5b是在骨關節炎兔模型中量測各組的TGF-a的免疫反應性的圖，且結果示出統計學意義。
圖6a是骨關節炎兔模型的軟骨中根據各組的IFN-r的IHC染色結果的照片。
圖6b是在骨關節炎兔模型中量測各組的INF-r的免疫反應性的圖，且結果示出統計學意義。
圖7a是骨關節炎兔模型的軟骨中根據各組的IL-6的IHC染色結果的照片。
圖7b是在骨關節炎兔模型中量測各組的IL-6的免疫反應性的圖，且結果示出統計學意義。
圖8a是在骨關節炎兔模型的滑膜中對各組執行H&E染色的結果的照片。
圖8b是示出在骨關節炎兔模型的滑膜中作為各組的H&E染色結果的滑膜上皮細胞的厚度及炎症細胞的數目及其統計學意義的圖。
圖9a是在骨關節炎兔模型的滑膜中對各組的TGF-b1及TNF-a執行IHC染色的結果的顯微鏡照片。
圖9b是量測骨關節炎兔模型的滑膜中各組的TGF-b1及TNF-a的免疫反應性的結果及其統計學意義的圖。
圖10a是在骨關節炎兔模型的滑膜中對各組的IFN-r及IL-6
執行IHC染色的結果的顯微鏡照片。
圖10b是量測骨關節炎兔模型的滑膜中各組的IFN-r及IL-6的免疫反應性的結果及其統計學意義的圖。
圖11a是示出初始(naïve)MSC及TNF-a處理的MSC及TSG-6表現載體轉導的MSC的TSG-6 mRNA表現水準的圖。
圖11b是示出初始MSC及TNF-a處理的MSC及TSG-6表現載體轉導的MSC的TSG-6蛋白表現水準的圖。
圖11c是示出與初始MSC及TNF-a處理的MSC或TSG-6表現載體轉導的MSC共培養的軟骨細胞的Col II mRNA表現水準的圖。
在本文中，「TSG-6蛋白」是指腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)可誘導基因6(TNF-可誘導基因6)蛋白。
在本文中所使用的「間葉幹細胞」(MSC)可指可分化為例如脂肪細胞、軟骨細胞或成軟骨細胞、骨細胞或成骨細胞、肌細胞等各種細胞的多能或多潛能細胞(pluripotent or multipotent cell)。在維持多能性或多潛能性的範圍中，間葉幹細胞的來源不受限制。舉例而言，間葉幹細胞可選自來源於血液、真皮、臍帶血、臍帶、脂肪組織、胎盤、成年肌肉、角膜基質、乳牙的牙髓及/或非骨髓組織(例如，骨膜)或骨髓組織(較佳地為非骨髓組織)的多潛能細胞，但並非僅限於此。在本文中，間葉幹細胞可與「MSC」互換使用。
間葉幹細胞可為來源於哺乳動物的間葉幹細胞，並且所述哺乳動物可包括人、狗、貓、馬、小鼠、大鼠等，但並非僅限於此。所述間葉幹細胞可來源於骨關節炎患者或分離自骨關節炎患者以外的供體。
本揭露提供的用於軟骨再生的組成物及/或用於預防或治療骨關節炎的藥物組成物及/或用於增加膠原II蛋白的表現及/或分泌的組成物及/或其使用方法包括或使用(施用)表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞。
表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞可為包含編碼TSG-6蛋白的基因的間葉幹細胞、包含編碼TSG-6蛋白的基因的重組載體或所述兩者。本揭露中提供的表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞具有藉由包含編碼TSG-6蛋白的外源基因及/或包含所述外源基因的重組載體(表現載體)來表現TSG-6蛋白的特性，並且可與其中藉由例如TNF-a等刺激因子在TSG-6蛋白的基因水準及/或蛋白水準上表現增加的細胞區分。
在一個實施例中，包含編碼TSG-6蛋白的基因的重組載體可為其中組成型表現啟動子(constitutive expression promoter)及編碼TSG-6蛋白的基因可操作地連接以組成型表現TSG-6蛋白的載體，但並非僅限於此。
TSG-6蛋白可為由氨基酸序列SEQ ID NO：1組成的蛋白，或者經由核酸序列SEQ ID NO：2組成的基因編碼的蛋白。
在表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞(其中轉導了TSG-6基
因的表現載體)中，TSG-6基因(例如mRNA)及/或蛋白的表現水準相較於其中TSG-6蛋白基因的表現載體未被轉導的同種間葉幹細胞(例如，同種初始間葉幹細胞、TNF-a誘導的間葉幹細胞等)可為約2倍或大於2倍、約5倍或大於5倍、約10倍或大於10倍、約20倍或大於20倍、約50倍或大於50倍、約70倍或大於70倍、約100倍或大於100倍、約200倍或大於200倍、或約300倍或大於300倍，但並非僅限於此。
表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞中的TSG-6蛋白表現水準可為約10至約200奈克/100,000個細胞/24小時(ng/105個細胞/24h)(在下文中，單位相同)、約10至約100、約10至約80、約10至約70、約10至約65、約30至約200、約30至約100、約30至約80、約30至約70、約30至約65、約50至約200、約50至約100、約50至約80、約50至約70、或約50至約65奈克/100,000個細胞/24小時，但並非僅限於此。在本文中，術語「約」是包括與隨後的數值相同或相似範圍內的所有數值的表達，並且其可為包括基於所述數值增加或減少約10%、約8%、約5%、約3%、約2%、約1%、約0.5%或約0.1%的範圍的含義，但並非僅限於此(否則，在下文中其可被解釋為相同的含義)。
本發明提供的用於軟骨再生的組成物及/或用於預防或治療骨關節炎的藥物組成物中的TSG-6表現水準可為約10至約50,000奈克/毫升/24小時(以下，單位相同)、約10至約30,000；約10至約10,000；約10至約5,000、約50至約50,000、約50至
約30,000、約50至約10,000、約50至約5,000、約100至約50,000、約100至約30,000、約100至約10,000、約100至約5,000、約100至約5,000、約500至約50,000、約500至約30,000、約500至約10,000、約500至約5,000、約1,000至約50,000、約1,000至約30,000、約1,000至約10,000或約1,000至約5,000奈克/毫升/24小時，但並非僅限於此。
本發明提供的表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞可連續表現TSG-6蛋白，且因此可克服TSG-6在關節腔中的短半衰期，且因此其適用於軟骨的恢復(再生)及/或骨關節炎的預防或治療。此外，本發明提供的表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞藉由抑制例如TNF-a、IL-1b等炎症指數而具有減輕骨關節炎中的炎症及/或症狀的效果，且此外，增加膠原II蛋白的表現水準及/或分泌水準，並再生軟骨及/或重建(恢復)受損的軟骨，藉此允許更基本地治療骨關節炎，特別是退行性骨關節炎。
本揭露提供的用於軟骨再生的組成物及/或方法、及/或用於預防或治療骨關節炎的藥物組成物及/或方法、及/或用於增加膠原II蛋白的表現及/或分泌的組成物及/或方法(或者在下文中共同稱為「在本揭露中提供的組成物及/或方法」)可增加軟骨細胞及/或軟骨組織中膠原II蛋白在基因(mRNA)水準及/或蛋白水準上的表現水準及/或細胞外分泌。在一個實施例中，相較於未施用的對照組及/或TNF-a未處理或TNF-a經處理(啟動)同種異體間葉幹細胞經處理的組，施用本揭露提供的組成物的軟骨細胞及/或軟
骨組織中的膠原II蛋白的表現水準及/或分泌水準可增加(例如，相較於未施用的對照組及/或TNF-a未處理或TNF-a經處理的同種異體細胞經處理的組的膠原II蛋白表現水準(例如，mRNA水準及/或蛋白水準)及/或分泌水準(例如，培養基中的膠原II蛋白濃度)，增加約1.2倍或大於1.2倍、約1.3倍或大於1.3倍、約1.4倍或大於1.4倍、約1.5倍或大於1.5倍、約1.6倍或大於1.6倍、約1.7倍或大於1.7倍、約1.8倍或大於1.8倍、或約1.9倍或大於1.9倍；增加程度的上限不受特別限制，且例如，其可為約20倍、約15倍、約10倍、約5倍或約2倍，但並非僅限於此)。
在本揭露中提供的組成物及/或方法可保持及/或恢復軟骨厚度。在一個實施例中，施用本揭露提供的藥物組成物的軟骨的厚度可增加超過約1倍至約10倍或小於10倍、超過約1倍至約5倍或小於5倍、超過約1倍至約3倍或小於3倍、超過約1倍至約2倍或小於2倍、約1.3倍至約10倍、約1.3倍至約5倍、約1.3倍至約3倍、約1.3倍至約2倍、約1.5倍至約10倍、約1.5倍至約5倍、約1.5倍至約3倍或約1.5倍至約2倍，但並非僅限於此。在一個實施例中，對於施用本揭露的藥物組成物的OA動物模型的軟骨厚度，相較於未施用的OA患者，觀察到軟骨厚度的恢復，並且相較於相同量的未表現TSG-6的MSC施用組，顯示出約1.5倍或大於1.5倍的更高的軟骨厚度。
在本揭露中提供的組成物及/或方法可降低軟骨細胞及/或滑膜細胞內及/或軟骨組織及/或滑膜組織內炎症指數的表現水
準。炎症指數的表現水準的降低可為相較於未施用或未應用在本揭露中提供的組成物及/或方法的未施用對照組的降低。炎症指數(例如，炎症細胞因子)可為例如選自由以下組成的群組中的一或多者、二或更多者、三或更多者或全部：轉化生長因子-β1(TGF-b1；TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-a；TNF-α)、幹擾素-γ(IFN-r；IFN-γ)及白細胞介素-6(IL-6)，但並非僅限於此。在一個實施例中，當施用表現TSG-6蛋白的間葉幹細胞時，滑膜細胞及軟骨細胞中炎症指數的表現水準降低至正常組的水準。
在一個實施例中，相較於患者組中的TGF-b1表現水準，施用或應用本揭露中提供的組成物及/或方法的軟骨區域(軟骨細胞及/或軟骨組織，在下文中相同)中的TGF-b1表現水準可在約55%或小於55%、約50%或小於50%、約45%或小於45%、約40%或小於40%、約35%或小於35%、或約30%或小於30%的水準，但並非僅限於此。TGF-b1的表現水準可隨著TSG-6表現水準的升高而降低。
相較於患者組中的TNF-a表現水準，施用或應用本揭露中提供的組成物及/或方法的軟骨區域中的TNF-a表現水準可在55%或小於55%、50%或小於50%、45%或小於45%、40%或小於40%、或35%或小於35%的水準，但並非僅限於此。TNF-a的表現水準可隨著TSG-6表現水準的升高而降低。
在一個實施例中，相較於患者組中的IFN-r表現水準，施用或應用本揭露中提供的組成物及/或方法的軟骨區域中的IFN-r
表現水準可在約50%或小於50%、約45%或小於45%、約40%或小於40%、或約35%或小於35%的水準，但並非僅限於此。IFN-r的表現水準可隨著TSG-6表現水準的升高而降低。
在一個實施例中，相較於患者組中的IL-6表現水準，施用或應用本揭露中提供的組成物及/或方法的軟骨區域中的IL-6表現水準可在約60%或小於60%、約55%或小於55%、或約50%或小於50%的水準，但並非僅限於此。IL-6的表現水準可隨著TSG-6表現水準的升高而降低。
在一個實施例中，相較於患者組中的TGF-b1表現水準，施用或應用本揭露中提供的組成物及/或方法的滑膜區域(滑膜細胞及/或滑膜組織，在下文中相同)中的TGF-b1表現水準可在約50%或小於50%、約45%或小於45%、約40%或小於40%、約35%或小於35%、或約30%或小於30%的水準，但並非僅限於此。
在一個實施例中，相較於患者組中的TNF-a表現水準，施用或應用本揭露中提供的組成物及/或方法的滑膜區域中的TNF-a表現水準可在約45%或小於45%、約40%或小於40%、約35%或小於35%、約30%或小於30%、或約25%或小於25%的水準，但並非僅限於此。
在一個實施例中，相較於患者組中的IFN-r表現水準，施用或應用本揭露中提供的組成物及/或方法的滑膜區域中的IFN-r表現水準可在約50%或小於50%、約45%或小於45%、約40%或小於40%、或約35%或小於35%的水準，但並非僅限於此。
在一個實施例中，相較於患者組中的IL-6表現水準，施用或應用本揭露中提供的組成物及/或方法的滑膜區域中的IL-6表現水準可在約45%或小於45%、約40%或小於40%、或約35%或小於35%的水準，但並非僅限於此。
在本發明中提供的組成物及/或方法可單獨包括或施用表現藥學有效量的TSG-6的間葉幹細胞，或更包括或施用一或多種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。藥學有效量是指能夠表現出軟骨再生、預防、改善及/或治療骨關節炎症狀、及/或增加膠原II蛋白的表現及/或分泌的效果的量，並且間葉幹細胞的總TSG-6表現水準可為約200奈克/24小時或大於200奈克/24小時、約500奈克/24小時或大於500奈克/24小時、約1,000奈克/24小時或大於1,000奈克/24小時、約10,000奈克/24小時或大於10,000奈克/24小時、約50,000奈克/24小時或大於50,000奈克/24小時、約200至約100,000奈克/24小時、約200至約50,000奈克/24小時、約200至約10,000奈克/24小時、約200至約5,000奈克/24小時、約200至約3000奈克/24小時、約200至約2000奈克/24小時、約500至約100,000奈克/24小時、約500至約50,000奈克/24小時、約500至10,000奈克/24小時、約500至約5,000奈克/24小時、約500至約3,000奈克/24小時、或約500至約2,000奈克/24小時，但並非僅限於此。
在一個實施例中，間葉幹細胞的藥學有效量可為約100,000至約25,000,000個細胞/毫升(細胞/毫升，在下文中單位
相同)、約100,000至約20,000,000、約100,000至約15,000,000、約100,000至約10,000,000、約100,000至約5,000,000、約500,000至約25,000,000、約500,000至約20,000,000、約500,000至約15,000,000、約500,000至約10,000,000、約500,000至約5,000,000、約1,000,000至約25,000,000、約1,000,000至約20,000,000、約1,000,000至約15,000,000、約1,000,000至約10,000,000、或約1,000,000至約5,000,000個細胞/毫升，但並非僅限於此。
「藥學上可接受的」包括生理學上可接受的且當施用於人類時通常不會引起人類產生胃腸疾病、過敏反應(例如頭暈或類似反應)的組成物，對此並無限制。載體、賦形劑及稀釋劑的實例可為選自由以下組成的群組中的一或多者：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、澱粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、矽酸鈣、纖維素甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油，但並非僅限於此。此外，可更包含填料、抗凝劑、潤滑劑、潤濕劑、調味劑及防腐劑等。
本揭露提供的用於預防或治療骨關節炎的藥物組成物可使用此項技術中已知的方法來配製，以提供活性成分的快速、連續或延遲釋放。製劑可呈以下形式：粉劑、顆粒劑、片劑、乳劑、糖漿劑、氣霧劑、軟或硬明膠膠囊、無菌注射溶液或無菌粉末。在一個實施例中，組成物可配製成可注射溶液。
在一個實施例中，本揭露提供的用於預防或治療骨關節炎的藥物組成物可藉由包括口服、皮膚、皮下、靜脈內或肌內途徑在內的各種途徑施用，用於治療骨關節炎，並且例如，其可關節內施用。
本發明的組成物及/或方法的應用(施用)受試者可為哺乳動物，包括靈長類動物(包括人、猴等)、齧齒動物(包括小鼠、大鼠等)或由其衍生的細胞、組織或其培養物。在一個具體實例中，受試者可為需要軟骨再生、及/或預防及/或治療骨關節炎、及/或增加膠原II蛋白表現的哺乳動物，包括靈長類動物(包括人、猴等)、齧齒動物(包括小鼠、大鼠等)或由其衍生的細胞、組織或其培養物。
本揭露還可提供一種製備用於軟骨再生的組成物及/或用於預防或治療骨關節炎的組成物及/或用於增加膠原II蛋白表現的組成物的方法，所述方法包括將TSG-6基因及/或包含TSG-6基因的載體轉導至間葉幹細胞中。
轉導可藉由在間葉幹細胞的轉導目的範圍內自由選擇此項技術中已知的轉導方法來執行。
TSG-6基因及/或包含所述基因的載體如上所述。
在本揭露中提供的用於軟骨再生的組成物及/或用於預防或治療骨關節炎的藥物組成物及/或方法具有優異的軟骨再生能力及/或抗炎效果。
在本揭露中提供的組成物及/或方法可克服由TSG-6蛋白的關節內短半衰期引起的持久性問題。
此外，由於膠原II蛋白表現水準的優異增加效果，在本發明中提供的組成物及/或方法藉由此在軟骨再生及預防及/或治療骨關節炎方面具有基本及有利的效果。
表現水準表現水準表現水準表現水準表現水準初始表現水準初始表現水準初始表現水準在下文中，將藉由實例更詳細地描述本揭露。然而，以下實例僅用於說明本揭露，但本揭露的範圍不受以下實例限制。
除非在本文中另有說明，否則「AC」是關節面內襯軟骨的縮寫，且「OA」是骨關節炎的縮寫。
在對TSG-6 cDNA序列(基因庫(Genbank)登記號NM_007115；SEQ ID NO：3)執行密碼子最佳化後，製備了一種慢病毒載體，其包含藉由向希瑞恩-生物科技(SIRION-Biotech)請求而完成密碼子最佳化的cDNA序列(SEQ ID NO：4)。
作為間葉幹細胞(MSC)，將來源於臍帶血的間葉幹細胞在5%(v/v)CO2、37℃條件下的用於MSC培養的培養基中進行了培養。向所培養的MSC 50,000個細胞或100,000個細胞中加入轉導了TSG-6 cDNA的慢病毒，並在5%(v/v)CO2、37℃條件下
將其再次培養了24小時。藉由ELISA選擇了TSG-6基因的cDNA序列所在的MSC(TSG-6 MSC)。
為確認在實例1中製備的TSG-6 MSC中的TSG-6蛋白分泌水準，藉由執行ELISA而確認了TSG-6蛋白分泌水準。具體而言，作為對照組，使用未感染包含TSG-6 cDNA的慢病毒的MSC，並將各MSC在無血清培養基中於5% CO2、37℃的培養條件下培養了24小時，以量測24小時表現的TSG-6蛋白總量。
在圖1中，示出了在TSG-6 MSC及對照組中量測TSG-6表現水準的結果的圖。作為量測結果，確認了TSG-6轉導的間葉幹細胞每24小時每100,000個細胞分泌約10至100奈克的TSG-6蛋白。
為確認TSG-6 MSC在體外水準對骨關節炎的治療效果，確認了在軟骨-滑膜細胞共培養條件下依據在實例1中製備的TSG-6 MSC的添加的膠原II的表現水準。
在圖2a中，示出了實驗設計的示意圖。具體而言，將軟骨細胞單獨接種於U型底96孔板中，並在5%(v/v)CO2、37℃下的軟骨分化培養基中培養了3週(21天)以形成軟骨聚集體，並將此軟骨聚集體與滑膜細胞在5% CO2、37℃下共培養了2天，且然後藉由加入TNF-α(TNF-a)10奈克/毫升及白介素1-β(IL1b)
10奈克/毫升而誘發炎症。
在共培養(炎症誘發)2天後，加入純化的TSG-6蛋白200奈克/毫升並培養了1天，且然後取出滑膜細胞，並加入與預先加入濃度相同的純化的TSG-6蛋白200奈克/毫升，並再次培養了7天。為使實驗組確認TSG-6 MSC對骨關節炎的治療效果，在共培養3天後取出滑膜細胞，且為以10奈克/毫升/24小時的水準表現TSG-6蛋白或以30奈克/毫升/24小時的水準表現TSG-6蛋白，在不同量的TSG-6 MSC下將其再次共培養了7天。
使用炎症未誘發組(無炎症對照組(No inflammation control，NIC))作為正常組，且使用誘發炎症後未添加TSG-6的組(炎症對照組(Inflammation control，IC))作為陰性對照組。然後，使用蛋白免疫印跡量測了各組的膠原II蛋白的表現水準，且作為對照組，確認了GAPDH蛋白的表現水準。
在下表1中，對各組進行了排列及顯示。
在圖2b中，示出了量化各組的蛋白免疫印跡結果的值(膠原II蛋白表現水準/GAPDH表現水準)。
如圖2b所示，在炎症誘發的軟骨細胞中幾乎不產生膠原II蛋白(第2欄)，但當以純化蛋白或TSG-6 MSC中表現TSG-6蛋白的形式加入時，兩者中膠原II蛋白的表現水準皆增加。此外，在TSG-6蛋白以純化蛋白的形式加入及其以其中轉導TSG-6表現載體的MSC形式加入此兩種情況下，膠原II蛋白的表現水準依據TSG-6蛋白濃度而增加，但具體而言，當TSG-6蛋白以其中轉導TSG-6表現載體的MSC形式(即，TSG-6蛋白在MSC中表現的形式)加入時，相較於加入純化的TSG-6蛋白的情況，膠原II蛋白的表現水準更高，並且當與以30奈克/毫升/24小時的水準表現TSG-6蛋白的TSG-6 MSC共培養時，示出與NIC組相似水準的膠原II蛋白的表現水準。
換言之，確認了膠原II蛋白的表現水準依據TSG-6蛋白濃度而增加，並且由本揭露提供的表現TSG-6蛋白的TSG-6 MSC具有以與純化的TSG-6相似或更優異的水準恢復膠原II蛋白的效果。
藉由對應的結果，可確認由本揭露提供的TSG-6 MSC具有軟骨再生及/或恢復的效果，且由此可見其可有利地用於關節炎的治療。
為確認TSG-6 MSC在體內水準的治療效果，在退行性骨
關節炎兔模型中執行了實驗。
具體而言，使用雌性SPF紐西蘭白兔(康達(Kangda))(約10個月大)作為退行性骨關節炎兔模型，且在施用TSG-6 MSC等期間，體重約為3.9千克。將兔模型共分為6組。各組的簡要說明在下表2中表示。
使用注射器分別向在表2中表示的6個組中的C至F組中注射對應的MSC。在注射後16週內，自每只兔獲取膝關節，並對軟骨組織進行蘇木精-伊紅(H&E)染色、IHC染色或番紅O染色，並進行顯微鏡觀察及各免疫反應性、上皮厚度量測或炎症細胞數目分析。
圖3a中示出了番紅O染色結果的照片，且圖3b中示出了分別量測各組在股骨側及脛骨側的關節面內襯軟骨(AC)的厚度的結果的圖以及統計學意義。
在下表3中分別示出了所量測的AC厚度的平均值。股骨指在股骨側量測的AC厚度，且脛骨指在脛骨側量測的AC厚度。
在所有骨關節炎(OA)組中，相較於正常組，軟骨厚度顯著減小，且在TSG-6 I及TSG-6 II組中，軟骨厚度分別顯著恢復，且具體而言，隨著TSG-6蛋白濃度增加，軟骨厚度的增加趨於增加。此種濃度依賴性在股骨側的軟骨中顯示得更為明顯。特別是在TSG-6 II組中，確認出軟骨結構改善至與正常組無顯著差異(n.s.：不顯著)的程度。另一方面，在初始組中，初始I組與初始II組之間未觀察到顯著差異。
在表2的各組的軟骨組織中，分別對TGF-b1、TNF-a、IFN-r及IL-6執行免疫組織化學染色(IHC染色)，以分別確認各項炎症指數的表現水準。
對於在股骨側及脛骨側量測的各指數的IHC染色結果及免疫反應性，在圖4a至圖4b針對TGF-b1進行了顯示、在圖5a至圖5b中針對TNF-a進行了顯示、在圖6a至圖6b中針對IFN-r進行了顯示、且在圖7a至圖7b中針對IL-6進行了顯示，且各免疫反應性的量測值示於下表4中。在下表4中，省略了各炎症指數表現水準的數值單位(%/平方毫米)。
在OA組中，示出TGF-b1、TNF-a、IFN-r及IL-6的免疫反應性極高，但在所有TSG-6 MSC治療組中，相較於OA組，示出免疫反應性低。具體而言，對於TGF-b1、IFN-r及IL-6，免疫反應性降低至與正常組(n.s.)相似的程度，且因此，確認了由本揭露提供的TSG-6 MSC顯示出優異的抗炎效果。
此外，在本揭露的TSG-6 MSC治療組中，隨著治療劑量增加，炎症指數的免疫反應性的所有數值相較於無論施用劑量如何皆顯示出相似的炎症指數數值的初始組皆降低，且因此確認了抗炎活性優異。
分離表2的各組的滑膜，且執行H&E染色，且結果示出於圖8a至圖8b中。圖8a是示出滑膜上皮厚度的圖及示出其統計學意義的表，並且圖8b是示出每單位面積的炎症細胞的數目的圖及示出其統計學意義的表。在下表5中，分別示出了滑膜中量測的上皮厚度及炎症細胞(IF細胞)的數目。
[表5]
如在圖8b中可確認，TSG-6 II組滑膜上皮厚度降低至與完好組相似的程度，且炎症細胞的數目亦降低至與完好組相似的程度。
在表2的各組的滑膜組織中，分別對TGF-b1、TNF-a、IFN-r及IL-6執行了免疫組織化學染色(IHC染色)，以分別確認各項炎症指數的表現水準。
圖9a中示出了各組TGF-b1及TNF-a的IHC染色結果，且圖9b示出各組TGF-b1及TNF-a的免疫反應性量測結果及統計學意義，且圖10b示出各組IFN-r及IL-6的免疫反應性量測結果及統計學意義的圖。在下表6中，示出了各組炎症指數的表現水準的量測結果。
作為對滑膜細胞進行IHC染色的結果，相較於完好組，在OA組中各項炎症指數大大增加，但在TSG-6 MSC施用組(TSG-6 I及TSG-6 II)中，所有炎症指數皆降低。具體而言，在TSG-6 II組中，TGF-b1、IFN-r及IL-6的免疫反應性降低至與正常組相似的程度，且因此確認出TSG-6 MSC的抗炎活性優異。
將來源於臍帶血的MSC用TNF-a啟動。簡言之，將來源於臍帶血的MSC以1×105個細胞的量置於6孔板中，所述6孔板包括每孔含10%(v/v)FBS的2毫升先進MEM(Advanced MEM)(賽默飛(Thermofisher)，馬塞諸塞州，美國)培養基，並培養了24小時。然後，將培養基更換為包含1%(v/v)FBS及10奈克/毫升TNF-α的Advanced MEM培養基(皮羅特奇(Peptrotech)，紐約，美國)，並培養了24小時。用0.25%(w/v)胰蛋白酶以及1毫莫耳/升(mM)EDTA(Gibco)在37℃下將細胞處理了2分鐘，以進行胰蛋白酶消化。收集的細胞用於以下實例。
藉由RT-qPCR量測了來源於原始臍帶血的MSC(或簡稱為「MSC」，對照組)、在實例1.2中製備的TSG-6表現載體轉導的來源於臍帶血的MSC(或簡稱為「TSG-6轉導的MSC」；測試
組)及在實例5-1中製備的用TNF-α啟動的來源於臍帶血的MSC(或簡稱為「TNF-α處理的MSC」；比較組)24小時的TSG-6表現水準(mRNA水準)。根據製造商說明使用逸思迷你試劑盒(RNeasy Mini Kit)(凱傑(QIAGEN))，自細胞中提取總RNA，並在使用上標TM III第一鏈合成系統(SuperScriptTM Ⅲ First-Strand Synthesis System)(Thermofisher)合成cDNA後，使用快速SYBRTM綠色原料混合(Fast SYBRTM Green Master Mix)(Thermofisher)對QuantStudioTM 6彎曲即時(Flex Real-Time)PCR系統(應用生物系統(Applied Biosystem))執行了RT-qPCR。使用GAPDH作為內源對照基因。所使用的引子列於下表7中。
將所獲得的結果計算為相對Ct值(TSG-6/GAPDH)，且示出於圖11a中。使用2-△△Ct法計算了相對表現水準。如圖11a所示，TNF-α處理的MSC(比較組)的相對TSG-6表現水準(mRNA水準)與對照組MSC相比未示出大的差異(相較於對照組為3.47倍)，而TSG-6轉導的MSC(測試組)的相對TSG-6表現水準(mRNA水準)顯著高於比較組及對照組(相較於對照組約為1248倍，相較於比較組約為360倍)。
根據製造商說明，使用TSG-6 ELISA試劑盒(瑞博奧技術(Raybiotech)，佐治亞州，美國)量測了在來源於原始臍帶血的MSC(或簡稱為「MSC」；對照組)、在實例1.2中製備的TSG-6表現載體轉導的來源於臍帶血的MSC(或簡稱為「TSG-6轉導的MSC」；測試組)及在實例5-1中製備的用TNF-α啟動的來源於臍帶血的MSC(或簡稱為「TNF-α處理的MSC」；比較組)中24小時表現(在培養基中分泌)的TSG-6蛋白水準。
所獲得的結果(奈克/105個細胞/24小時)示出於圖11b中。如圖11b所示，相較於對照組MSC及比較組TNF-α處理的MSC，對照組MSC及比較組TNF-α處理的MSC的TSG-6蛋白分泌水準的水準太低而無法量測，而TSG-6轉導的MSC以顯著高的水準(約70奈克/105個細胞/24小時)分泌TSG-6蛋白。
分別製備了來源於原始臍帶血的MSC(或簡稱為「MSC」；對照組)、TSG-6表現載體轉導的來源於臍帶血的MSC(或簡稱為「TSG-6轉導的MSC」；測試組；參見實例1.2)及用TNF-α啟動的來源於臍帶血的MSC(或簡稱為「TNF-α處理的MSC」；比較組；參見實例5-1)。將如此製備的每一來源於臍帶血的MSC以1×105個細胞的量置於6孔小室(6-well transwell)(康寧(Corning)，馬塞諸塞州，美國)中，所述6孔小室包括每孔含10%(v/v)FBS的2毫升Advanced MEM培養基，並培養了24小
時。然後，將培養基更換為包含1%(v/v)FBS及10奈克/毫升TNF-a的Advanced MEM培養基，並培養了24小時，以誘導出啟動的MSC。
將軟骨細胞(來源於肋軟骨；參見實例3)以1×105個細胞的量置於6孔板中，所述6孔板包括每孔含10%(v/v)FBS的2毫升Advanced MEM培養基，並培養了24小時。然後，將培養基更換為包含1%(v/v)FBS及75奈克/毫升IL-1b(Peptrotech，紐約，美國)的Advanced MEM培養基，並培養了24小時，以誘發炎症。將其與在6孔小室中啟動的MSC共培養了24小時。用0.25%(w/v)胰蛋白酶以及1mM EDTA(Gibco)在37℃下將軟骨細胞處理了2分鐘，以進行胰蛋白酶消化。將收集的細胞用於以下膠原II mRNA水準的比較(RT-qPCR)。
藉由RT-qPCR量測了與來源於原始臍帶血的MSC(MSC；對照組)、TSG-6表現載體轉導的來源於臍帶血的MSC(TSG-6轉導的MSC；測試組)或用TNF-α啟動的來源於臍帶血的MSC(TNF-α處理的MSC；比較組)共培養的軟骨細胞中的膠原II 24小時表現水準(mRNA水準)。根據製造商說明使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)，自細胞中提取總RNA，並在使用上標TM III第一鏈合成系統(Thermofisher)合成cDNA後，使用快速SYBRTM綠色原料混合(Thermofisher)對QuantStudioTM 6彎曲即時PCR系統(應用生物系統)執行了RT-qPCR。使用GAPDH作為內源對照基因。所使用的引子列於表8中。
將所獲得的結果計算為相對Ct值(膠原II/GAPDH)，且示出於圖11c中。使用2-△△Ct法計算了相對表現水準。如圖11c所示，TNF-α處理的MSC(比較組)的相對膠原II表現水準(mRNA水準)與對照組MSC相比未示出大的差異(相較於對照組為1.03倍)，而TSG-6轉導的MSC(測試組)的相對膠原II表現水準(mRNA水準)顯著高於比較組及對照組(相較於對照組約為1.93倍，相較於比較組約為1.87倍)。此結果確認出，相較於原始MSC以及TNF-α啟動的(可誘導)MSC，TSG-6表現載體轉導的MSC在軟骨細胞中具有顯著優異的膠原II表現效果，並且此結果證明TSG-6表現載體轉導的MSC具有優異的軟骨再生效果及/或骨關節炎治療效果。
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Claims (8)
- 一種表現腫瘤壞死因子可誘導基因6(TSG-6)蛋白的間葉幹細胞在製備用於軟骨再生之藥物組成物的用途，其中表現所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的間葉幹細胞是包含選自由編碼所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的基因組成的群組中的一或多者的重組間葉幹細胞、及包含編碼所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的基因的重組載體；且其中所述藥物組成物具有以下特性：所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的表現水準為10奈克/100,000個細胞/24小時至200奈克/100,000個細胞/24小時，所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的表現水準為10奈克/毫升/24小時至50,000奈克/毫升/24小時，或所述表現水準兩者。
- 如請求項1所述的用途，其中相較於未施用的對照組，選自由施用所述藥物組成物的軟骨細胞及軟骨組織組成的群組中的至少一者中的膠原II蛋白的表現水準增加。
- 如請求項1所述的用途，其中相較於未施用的對照組，選自由施用所述藥物組成物的軟骨細胞、軟骨組織、滑膜細胞及滑膜組織組成的群組中的至少一者中的炎症指數的表現水準降低，且所述炎症指數是選自由TGF-b1、TNF-a、IFN-r及IL-6組成的群組中的至少一者。
- 一種表現腫瘤壞死因子可誘導基因6(TSG-6)蛋白的間葉幹細胞在製備用於預防或治療骨關節炎之藥物組成物的用途，其中表現所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的間葉幹細胞是包含選自由編碼所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的基因組成的群組中的一或多者的重組間葉幹細胞、及包含編碼所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的基因的重組載體；且其中所述藥物組成物具有以下特性：所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的表現水準為10奈克/100,000個細胞/24小時至200奈克/100,000個細胞/24小時，所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的表現水準為10奈克/毫升/24小時至50,000奈克/毫升/24小時，或所述表現水準兩者。
- 如請求項4所述的用途，其中所述藥物組成物具有以下效果：相較於未施用的對照組，選自由軟骨細胞及軟骨組織組成的群組中的至少一者中的膠原II蛋白的表現水準增加，相較於未施用的對照組，選自由軟骨細胞、軟骨組織、滑膜細胞及滑膜組織組成的群組中的一或多者中的至少一種炎症指數的表現水準降低，所述至少一種炎症指數選自由TGF-b1、TNF-a、IFN-r及IL-6組成的群組，或所述表現水準兩者。
- 如請求項4或請求項5所述的用途，其中所述藥物組成物是用於關節內施用。
- 如請求項4或請求項5所述的用途，其中所述藥物組成物為注射劑。
- 一種表現腫瘤壞死因子可誘導基因6(TSG-6)蛋白的間葉幹細胞在製備用於增加表現或分泌膠原II蛋白之組成物的用途，其中表現所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的間葉幹細胞是包含選自由編碼所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的基因組成的群組中的一或多者的重組間葉幹細胞、及包含編碼所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的基因的重組載體；且其中所述組成物具有以下特性：所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的表現水準為10奈克/100,000個細胞/24小時至200奈克/100,000個細胞/24小時，所述腫瘤壞死因子可誘導基因6蛋白的表現水準為10奈克/毫升/24小時至50,000奈克/毫升/24小時，或所述表現水準兩者。
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