CN117165533A - 一种用于治疗骨关节炎的外泌体混合液及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及骨关节炎治疗药物的技术领域的一种用于治疗骨关节炎的外泌体混合液及制备方法和应用。所述外泌体混合液中包括内部过表达miR‑144‑3p的外泌体Exo‑miR‑144‑3p和内部过表达miR‑210‑3p的外泌体Exo‑miR‑210‑3p。本申请所提供的外泌体混合液中同时包括外泌体Exo‑miR‑144‑3p和外泌体Exo‑miR‑210‑3p,上述外泌体所分泌的外源基因miR‑144‑3p和外源基因miR‑210‑3p分别通过降低促炎细胞因子活性以及抑制软骨下血管生成,协同抑制关节内滑膜炎症和关节软骨退化,因此本申请的外泌体混合液具有显著改善骨关节炎症状的优点。同时本申请的外泌体混合溶液还经过了特定的磁化处理,使其治疗效果得到进一步改善。
Description
技术领域
本申请涉及骨关节炎治疗药物的技术领域,尤其是涉及一种用于治疗骨关节炎的外泌体混合液及制备方法和应用。
背景技术
能活动的骨连结叫做关节,是骨连结的主要形式,由关节面、关节囊和关节腔三部分构成。关节面是两个以上相邻骨的接触面,一个略凸另一个略凹,表面覆盖着一层光滑的软骨,能缓冲相连骨在运动时的震动和冲击。关节囊是坚韧的结缔组织,把相邻两骨牢固地联系起来,内层为滑膜层,可分泌关节滑液以减少运动时的摩擦。关节腔是关节软骨和关节囊围成的狭窄间隙,正常时只含有少许滑液。
骨关节炎是一种慢性炎症性疾病,最常见于髋关节和膝关节,特征包括滑膜炎症、关节头骨质疏松(骨体积/组织体积减小、骨小梁数量减少/厚度变薄/间隙变大)和OARSI(患者疼痛、体能和功能)评分增高为特征。骨关节炎的常用动物模型为小鼠膝关节的前交叉韧带横断模型(ACLT),手术7-10周后具有典型的骨关节炎特征。
在全国范围内,有症状的髋关节炎和膝关节炎的患病率分别为1%和8%。骨关节炎好发于中老年人,65岁以上人群的患病率超过50%。对乙酰氨基酚、非甾体抗炎药、葡糖胺和软骨素通常用于骨关节炎的口服治疗,而关节内皮质类固醇和透明质酸注射或关节置换手术适用于更严重的骨关节炎患者。临床治疗的重点是减少慢性炎症和减轻疼痛。
促炎细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)通过促进降解关节细胞外基质II型胶原、蛋白多糖和透明质酸的蛋白水解酶活性,在骨关节炎发病中重要作用。IL-1β的过表达导致T细胞活化、M1型巨噬细胞极化、破骨细胞生成以及滑膜细胞和脂肪细胞释放其他促炎细胞因子。IL-1β还可增强基质金属蛋白酶(MMP)的活性,增加软骨降解的速度。软骨损伤容易引起软骨下异常血管(Emcn+)生成,改变了软骨重建的平衡,导致软骨下骨硬化和骨赘形成,改变了软骨下骨的机械应力特征和软骨的营养供应模式,并增加了软骨的脆弱性。因而,降低促炎细胞因子活性和软骨下血管生成可能是减少骨关节炎进展的有用治疗策略。
发明内容
为了解决现有技术中骨关节炎治疗效果不佳的技术问题,本申请提供一种用于治疗骨关节炎的外泌体混合液,该混合液中同时包括外泌体Exo-miR-144-3p和外泌体Exo-miR-210-3p,二者之间能够发挥协同作用,进而能够显著改善骨关节炎症。
为此,本申请第一方面提供了一种用于治疗骨关节炎的外泌体混合液,所述外泌体混合液中包括内部过表达miR-144-3p的外泌体Exo-miR-144-3p和内部过表达miR-210-3p的外泌体Exo-miR-210-3p。
本申请所述外泌体混合液中的外泌体Exo-miR-144-3p和外泌体Exo-miR-210-3p均为基因工程外泌体,其中外泌体Exo-miR-144-3p的内部能够过表达miR-144-3p,外泌体Exo-miR-210-3p的内部能够过表达miR-210-3p。在关节腔内的炎细胞中,miR-144-3p可抑制IL-1βmRNA的翻译,进而减少或阻断关节腔内炎症因子IL-1β的分泌。miR-210-3p被关节软骨下血管内皮细胞(表面标记粘蛋白阳性,即Emcn+)吸收后,可抑制内皮细胞内转化生长因子β受体1mRNA的翻译,来抑制软骨下血管生成,最终抑制软骨下硬化和骨刺形成。本申请所述外泌体混合液中外泌体过表达的miR-144-3p和miR-210-3p能够同时在关节腔内发挥作用,可协同抑制关节内滑膜炎症和关节软骨退化,发挥“1+1>2的作用”,进而可有效用于治疗骨关节炎疾病。
在一些实施方式中,所述外泌体Exo-miR-144-3p和外泌体Exo-miR-210-3p的粒径分布为50~140nm,D50为58~60nm,D90为75~78nm,D10为55~57nm。
本申请中,D50表示外泌体颗粒累积分布为50%的粒径,也叫中位径或中值粒径;D90表示外泌体颗粒累积分布为90%的粒径;D10表示外泌体颗粒累积分布10%的粒径。
在一些具体实施例中,所述外泌体Exo-miR-144-3p和外泌体Exo-miR-210-3p的D50(中值粒径)为59nm,D90为76nm,D10为56nm。
本申请通过将外泌体的粒径分布控制在上述范围内,使得该外泌体能够更易与靶细胞接触和融合,发挥其作用。
在一些实施方式中,所述外泌体混合液中外泌体Exo-miR-144-3p和外泌体Exo-miR-210-3p总含量为(1.5~10)×1011颗粒/mL。
本申请中,将外泌体混合液中外泌体的数量控制在上述范围内,足够量的外泌体分泌的外源基因(miR-144-3p和miR-210-3p)才能在靶细胞内外充分发挥作用,进而有效用于骨关节炎的治疗。
本申请第二方面提供了一种如本申请第一方面所述的外泌体混合液的制备方法,所述方法包括以下步骤:
S1,制备重组慢病毒,所述重组慢病毒上包括基因miR-144-3p、基因miR-210-3p、抗性基因和筛选标记基因;
S2,将所述重组慢病毒与干细胞接触后进行培养,收集培养上清并进行浓缩,得到所述外泌体混合液。
本申请通过采用上述方法,将基因miR-144-3p和基因miR-210-3p插入慢病毒的基因组后再转染干细胞,随后通过培养该干细胞得到本申请所需的外泌体混合液。通过将两种基因(基因miR-144-3p和基因miR-210-3p)插入慢病毒,这两种基因均能够该体系中高度表达,以同时获得高产量的基因miR-144-3p和基因miR-210-3p。
本申请中,步骤S2中所采用的干细胞为间充质干细胞,例如脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞。间充质干细胞,又称多潜能基质细胞,简称MSCs,是一类能够自我更新并具有多向分化潜能的典型细胞群体,由间充质干细胞分泌的外泌体,不仅具备MSC某些功能特性,还具备低毒性、无致瘤性、渗透性好、无血管堵塞风险等优势。本申请中所采用的间充质干细胞可以为任何来源,例如骨髓、胎盘、脐带、脂肪、粘膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织。间充质干细胞来自动物,通常为哺乳动物,例如,小鼠、大鼠、兔、山羊、羔羊、绵羊、马、猪、牛,优选灵长类动物,最优选为人。
本申请对转染后的干细胞进行培养的方式为本领域的常规方式,例如所述培养在5%左右的CO2培养箱中进行,培养的温度可以为32~38℃。
在一些实施方式中,步骤S1中,所述重组慢病毒的制备方法包括以下步骤:
T1,将基因miR-144-3p、基因miR-210-3p、抗性基因和筛选标记基因连接在慢病毒的基因上,得到未包装的重组慢病毒;
T2,将所述未包装的重组慢病毒与宿主细胞接触后进行培养,使所述未包装的重组慢病毒在宿主细胞内进行包装,获得所述重组慢病毒。
本申请在进行重组慢病毒构建时,除了在慢病毒的基因组上连接上目的基因(基因miR-144-3p和基因miR-210-3p)外,还将抗性基因和筛选标记基因也连接在其上,便于后续对目标干细胞的筛选和培养。
本申请步骤T2中所采用的宿主细胞例如可以为293T细胞,将所述未包装的重组慢病毒与宿主细胞接触后并转染至其内的方式为本领域的常规方式。
在一些实施方式中,所述基因miR-144-3p的序列如SEQ ID NO.1,所述miR-210-3p的基因序列如SEQ ID NO.2,所述慢病毒的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
在一些实施方式中,所述抗性基因为嘌呤霉素抗性基因,且步骤S2中所述培养采用的培养基中添加有嘌呤霉素。
本申请通过采用上述技术方案,可以以抗性基因(嘌呤霉素抗性基因)筛选含有重组慢病毒的干细胞,实现纯化,以进一步扩大培养目标干细胞。
本申请中,嘌呤霉素抗性基因的序列具体如SEQ ID NO.4所示;筛选标记基因可以为绿色荧光蛋白筛选标记基因,其基因序列具体如SEQ ID NO.5所示。
在一些实施方式中,所述方法还包括以下步骤:
S3,对所述外泌体混合液进行磁化处理。
本申请通过对外泌体混合液进行磁化处理,使得磁化处理后的外泌体混合液中外泌体的膜结构通透性、膜结构外的电荷和能量分布等得到显著提升,最终使得Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体能够更完全、充分地释放其中的外源基因至靶细胞外,或者使得Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体能够更好地和靶细胞融合后将外源基因释放至靶细胞内,以发挥其作用,以进一步改善其治疗效果。
在一些实施方式中,所述磁化处理的条件包括:磁化强度为5~8A/m,磁化时间为15~30min,磁化温度为0~10℃。
在一些具体实施例中,所述磁化强度例如可以为5A/m、5.8A/m、6A/m、6.3A/m、6.7A/m、7A/m、7.6A/m或者8A/m等;磁化时间例如可以为15min、16min、16.5min、17min、18min、18.4min、19min、19.6min、20min、20.7min、21min、22min、22.6min、23min、24min、24.3min、25min、26.2min、27min、27.5min、28min、28.5min、29min、29.7min或者30min等;磁化温度例如例如可以为0℃、4℃、8℃或10℃等。
在一些优选的实施方式中,所述磁化处理的条件包括:磁化强度为6~7A/m,磁化时间为20~25min,磁化温度为0~4℃。
本申请对磁化处理过程中,磁化强度、时间和温度需要进行严格控制,否则会对外泌体带来较大的影响,使得功能物质被破坏,反而会带来负面的治疗作用或者无治疗作用。
本申请第三方面提供了一种如本申请第一方面所述的外泌体混合液或者第二方面所述方法制备的外泌体混合液在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用。
本申请所提供的外泌体混合液中的外泌体同时包括Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体,二者之间能够发挥协同效果,进而能够对骨关节炎具有优异的治疗效果,因此能够较好地应用在制备用于治疗骨关节炎的药物中。
本申请的有益技术效果为:本申请通过将基因miR-144-3p和基因miR-210-3p同时插入慢病毒后转染间充质干细胞,随后获得高表达的外泌体Exo-miR-144-3p和Exo-miR-210-3p,上述外泌体内分别含有大量的外源基因miR-144-3p和外源基因miR-210-3p;外源基因miR-144-3p和外源基因miR-210-3p分别通过降低促炎细胞因子活性以及抑制软骨下血管生成,协同抑制关节内滑膜炎症和关节软骨退化,发挥“1+1>2的作用”,进而可有效用于治疗骨关节炎疾病,将本申请的外泌体混合液用于骨关节炎的治疗时,具有显著改善骨关节炎症状的优点。同时本申请的外泌体混合溶液还经过了特定的磁化处理,使其治疗效果得到进一步改善,能够较好地应用在骨关节炎的治疗中,应用前景良好。
附图说明
图1为实施例1中制备的被重组慢病毒感染的人脂肪间充质干细胞和普通人脂肪间充质干细胞中基因miR-144-3p和基因miR-210-3p的表达水平图。
图2为实施例1得到的外泌体混合液中外泌体(Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体)的粒径分布图。
图3为采用实施例1、对比例5和对比例6中制备的外泌体混合液治疗ACLT小鼠后滑膜炎症指标检测结果图。
图4为采用实施例1、对比例5和对比例6中制备的外泌体混合液治疗ACLT小鼠后关节头骨质疏松指标检测结果图。
图5为采用实施例1、对比例5和对比例6中制备的外泌体混合液治疗ACLT小鼠后的OARSI评分结果图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解,下面将结合实施例来进一步详细说明本申请,这些实施例仅起说明性作用,并不局限于本申请的应用范围。本申请实施例中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得,实施例中未注明具体条件者均按照常规条件或制造商建议的条件进行。
制备例1:重组慢病毒的制备
具体制备步骤如下:
步骤I:设计基因miR-144-3p,其基因序列如SEQ ID NO.1所示;设计基因miR-210-3p,其基因序列如SEQ ID NO.2所示;准备慢病毒,其基因序列如SEQ ID NO.3所示;设计嘌呤霉素抗性基因,其基因序列如SEQ ID NO.4;设计绿色荧光蛋白筛选标记基因,其基因序列如SEQ ID NO.5所示。具体地,所设计的SEQ ID NO.1~2和SEQ ID NO.4~5的基因序列如下所示:
基因miR-144-3p:3’-TCATGTAGTAGATATGACAT-5’(SEQ ID NO.1,序列中的T表示RNA序列中的尿嘧啶);基因miR-210-3p:3’-AGTCGGCGACAGTGTGCGTGTC-5’(SEQ ID NO.2,序列中的T表示RNA序列中的尿嘧啶);嘌呤霉素抗性基因:ATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGA(SEQ ID NO.4);绿色荧光蛋白筛选标记基因:ATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAAGGAGATGACCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGCCACAAGTTCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCCTTCAAGGGCAAGCAGGCCATCAACCTGTGCGTGGTGGAGGGCGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATCTTGTCCGCCGCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTACCCCCAGGACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCTGCCCCGCCGGCTACACCTGGGACCGCTCCTTCCTGTTCGAGGACGGCGCCGTGTGCATCTGCAACGCCGACATCACCGTGAGCGTGGAGGAGAACTGCATGTACCACGAGTCCAAGTTCTACGGCGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTGATGAAGAAGATGACCGACAACTGGGAGCCCTCCTGCGAGAAGATCATCCCCGTGCCCAAGCAGGGCATCTTGAAGGGCGACGTGAGCATGTACCTGCTGCTGAAGGACGGTGGCCGCTTGCGCTGCCAGTTCGACACCGTGTACAAGGCCAAGTCCGTGCCCCGCAAGATGCCCGACTGGCACTTCATCCAGCACAAGCTGACCCGCGAGGACCGCAGCGACGCCAAGAACCAGAAGTGGCACCTGACCGAGCACGCCATCGCCTCCGGCTCCGCCTTGCCCTGA(SEQ ID NO.5)。
将基因miR-144-3p、基因miR-210-3p、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒的基因上,得到未包装的重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。
步骤II:将步骤I得到的未包装的重组慢病毒加入培养293T细胞的培养瓶中进行培养,重组慢病毒不断地在293T细胞中包装,随后离心,收集293T细胞培养液的上清液,上清液中含有大量包装好的重组慢病毒,将上清液在-20℃保存备用。
制备例2:重组慢病毒的制备
本制备例和制备例1的不同之处在于,以既往文献证实的对骨关节炎有治疗作用的基因miR-140-5p基因miR-140-5p替换基因miR-144-3p,miR-140-5p的基因序列如SEQ IDNO.6(5’-CAGTGGTTTTACCCTATGGTAG-3’,序列中的T表示RNA序列中的尿嘧啶)所示。其他同制备例1。
具体地,重组慢病毒的制备方法为:
步骤I:设计miR-140-5p基因,其基因序列如SEQ ID NO.6所示;设计miR-210-3p基因,其基因序列如SEQ ID NO.2所示;慢病毒、嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白筛选标记基因均和制备例1相同。
将基因miR-140-5p基因miR-140-5p、基因miR-210-3p、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒的基因上,得到未包装的重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。
步骤II和制备例1相同。
制备例3:重组慢病毒的制备
本制备例和制备例1的不同之处在于,以基因miR-140-5p替换基因miR-210-3p,基因miR-140-5p的序列如SEQ ID NO.6所示。其他同制备例1。
具体地,重组慢病毒的制备方法为:
步骤I:设计基因miR-140-5p,其基因序列如SEQ ID NO.6所示;设计基因miR-144-3p,其基因序列如SEQ ID NO.1所示;慢病毒、嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白筛选标记基因均和制备例1相同。
将基因miR-140-5p、基因miR-144-3p、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒的基因上,得到未包装的重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。
步骤II和制备例1相同。
制备例4:重组慢病毒的制备
本制备例和制备例1的不同之处在于,以既往文献证实的对骨关节炎有治疗作用的基因miR-199a-3p替换基因miR-210-3p,基因miR-199a-3p的序列如SEQ ID NO.7(5’-ACAGTAGTCTGCACATTGGTTA-3’,序列中的T表示RNA序列中的尿嘧啶)所示。其他同制备例1。
具体地,重组慢病毒的制备方法为:
步骤I:设计基因miR-199a-3p,其基因序列如SEQ ID NO.7所示;设计基因miR-144-3p,其基因序列如SEQ ID NO.1所示;慢病毒、嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白筛选标记基因均和制备例1相同。
将基因miR-199a-3p、基因miR-144-3p、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒的基因上,得到未包装的重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。
步骤II和制备例1相同。
制备例5:重组慢病毒的制备
本制备例和制备例1的不同之处在于,以基因miR-199a-3p替换基因miR-144-3p,基因miR-199a-3p的序列如SEQ ID NO.7所示。其他同制备例1。
具体地,重组慢病毒的制备方法为:
步骤I:设计基因miR-199a-3p,其基因序列如SEQ ID NO.7所示;设计基因miR-210-3p,其基因序列如SEQ ID NO.2所示;慢病毒、嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白筛选标记基因均和制备例1相同。
将基因miR-199a-3p、基因miR-210-3p、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒的基因上,得到未包装的重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。
步骤II和制备例1相同。
制备例6:重组慢病毒的制备
本制备例和制备例1的区别在于,不将基因miR-210-3p插入慢病毒中,仅仅将基因miR-144-3p插入慢病毒后制备得到重组慢病毒。
具体地,重组慢病毒的制备方法为:
步骤I:基因miR-144-3p、慢病毒、嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白筛选标记基因均同制备例1。
将基因miR-144-3p、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒的基因上,得到未包装的重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。
步骤II同制备例1。
制备例7:重组慢病毒的制备
本制备例和制备例1的区别在于,不将基因miR-144-3p插入慢病毒中,仅仅将基因miR-210-3p插入慢病毒后制备得到重组慢病毒。
具体地,重组慢病毒的制备方法为:
步骤I:基因miR-210-3p、慢病毒、嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白筛选标记基因均同制备例1。
将基因miR-210-3p、绿色荧光蛋白筛选标记基因和嘌呤霉素抗性基因连接在慢病毒的基因上,得到未包装的重组慢病毒。该重组慢病毒的制备委托南京斑马鱼生物科技有限公司完成。
步骤II同制备例1。
制备例8:人脂肪间充质干细胞的制备
具体制备步骤如下:
(1)获得人脂肪间充质干细胞的细胞团重悬液:
从整形美容机构获取无菌的脂肪组织,先用0.01mol/L无菌PBS缓冲液冲洗脂肪组织,直至其无血色。然后将脂肪组织用无菌眼科剪刀和镊子清理干净后剪成约1mm3大小的块状。随后在块状的脂肪组织中加入适量的0.1wt%Ⅰ型胶原酶溶液消化,并在37℃下振荡消化30min。再用含有10Vol.%胎牛血清的Gibco细胞培养基终止消化,并在1000r/min的转速下离心15min,弃掉离心后的混悬液上清。将未消化完全的脂肪组织块及下层的细胞团以间充质干细胞基础培养基重悬,混匀,即获得细胞团重悬液。
(2)扩大培养:将步骤(1)中获得的细胞团重悬液在37℃、5Vol.%CO2培养箱中培养,贴壁培养3天后获得人脂肪间充质干细胞,并以细胞工厂大量扩增,备用。
实施例1:外泌体混合液的制备
具体制备步骤如下:
步骤一、在T175培养瓶内加入人间充质干细胞无血清基础培养基(AM-V SerumFree Medium;货号SC-2013-G-A,天津灏洋),并转接制备例8制得的人脂肪间充质干细胞,并添加1wt%青链霉素、适量的制备例1制得的重组慢病毒,然后在37℃下培养24h。
步骤二、随后更换T175瓶中的人间充质干细胞无血清基础培养基为人间充质干细胞无血清选择培养基,并添加2μg/mL嘌呤霉素,在37℃下持续筛选培养,直至全部人脂肪间充质干细胞都在荧光显微镜下可见明显的绿色荧光。
步骤三、再继续以人间充质干细胞无血清选择培养基扩增并开始持续收集培养上清液,并以3D Flo Trix viva EXO外泌体收获系统(产自北京华龛公司)将培养上清液浓缩,得到外泌体混合液。
实施例2:外泌体混合液的制备
本实施例和实施例1的区别在于,在步骤三之后还包括步骤四。具体地,步骤四为:对步骤三得到的外泌体混合液进行磁化处理,具体的磁化处理条件是:在磁化强度为6A/m、温度为0℃的条件下磁化20min。其他同实施例1。
实施例3:外泌体混合液的制备
本实施例和实施例1的区别在于,在步骤三之后还包括步骤四。具体地,步骤四为:对步骤三得到的外泌体混合液进行磁化处理,具体的磁化处理条件是:在磁化强度为5A/m、温度为8℃的条件下磁化15min。其他同实施例1。
实施例4:外泌体混合液的制备
本实施例和实施例1的区别在于,在步骤三之后还包括步骤四。具体地,步骤四为:对步骤三得到的外泌体混合液进行磁化处理,具体的磁化处理条件是:在磁化强度为10A/m、温度为0℃的条件下磁化40min。其他同实施例1。
对比例1-6:外泌体混合液的制备
对比例1-6和实施例1的区别在于重组慢病毒的选择不同。
具体如下:
对比例1是以等量的制备例2制得的重组慢病毒替换实施例1中所采用的制备例1制得的重组慢病毒;
对比例2是以等量的制备例3制得的重组慢病毒替换实施例1中所采用的制备例1制得的重组慢病毒;
对比例3是以等量的制备例4制得的重组慢病毒替换实施例1中所采用的制备例1制得的重组慢病毒;
对比例4是以等量的制备例5制得的重组慢病毒替换实施例1中所采用的制备例1制得的重组慢病毒;
对比例5是以等量的制备例6制得的重组慢病毒替换实施例1中所采用的制备例1制得的重组慢病毒;
对比例6是以等量的制备例7制得的重组慢病毒替换实施例1中所采用的制备例1制得的重组慢病毒。
检测例1:
1、Realtime-PCR检测
对实施例1中制得的被重组慢病毒感染的人脂肪间充质干细胞与普通脂肪间充质干细胞进行Realtime-PCR检测,观察上述两种干细胞中基因miR-144-3p和基因miR-210-3p的表达情况,检测结果见图1。从图1的结果可知,实施例1制备的人脂肪间充质干细胞在转染重组慢病毒后,其基因miR-144-3p和基因miR-210-3p在mRNA水平上的表达强度显著提高。其中,基因miR-144-3p在mRNA水平上的表达强度增大了36倍,基因miR-210-3p在mRNA水平上的表达强度增大了45倍。这一结果充分表明了该方法能够同时实现基因miR-144-3p和基因miR-210-3p在mRNA水平上的高效表达。
2、外泌体混合液中外泌体浓度和粒径的检测
以纳米颗粒跟踪分析(NTA)的方法检测实施例1浓缩后获得的外泌体混合液中外泌体的浓度和粒径,具体检测结果见图2。图2的结果表明,实施例1所制备的外泌体混合液中外泌体(Exo-miR-144-3p/210-3p)的含量为3.04×1011颗粒/mL。外泌体Exo-miR-144-3p/210-3p的粒径分布均为53~135nm,中值粒径为59nm,D90为76nm,D10为56nm。对比例1-6中的上述检测结果与该结果类似。
测试例1:实施例1和对比例5-6中制备的外泌体混合液对骨关节炎的治疗效果1、动物实验
选择6月龄的C57BL/6小鼠,双侧膝关节接受ACLT手术。术后使用胰岛素注射器将50μg(50μL)外泌体混合液垂直注射进每侧关节腔,每周一次,连续注射三周。治疗组分别为三组(每组10只),分别为:Exo-miR-144-3p治疗组:施用对比例5制备的外泌体混合液;Exo-miR-210-3p治疗组:施用对比例6制备的外泌体混合液;Exo-miR-144-3p/210-3p治疗组:施用实施例1制备的外泌体混合液。另外将10只6月龄小鼠做正常组,将10只未治疗的ACLT小鼠做对照组(每次注射50μL PBS)。治疗结束1个月后对比治疗组和对照组小鼠的骨关节炎相关病情改善情况,并从关节滑液炎性介质、关节骨质疏松和OARSI评分等角度对比其起效机制,各起效检测指标的检测方式如下:
1.1、关节滑液炎性介质检测
1.1.1、IL-1β
在治疗结束1个月后,抽取各组小鼠膝关节腔滑液,使用ELISA法检测IL-1β蛋白的浓度,结果见图3中的A。从图3中的A可见,Exo-miR-144-3p/210-3p治疗组中小鼠滑液中IL-1β蛋白浓度较低,接近正常鼠;而Exo-miR-144-3p治疗组和Exo-miR-210-3p治疗组中小鼠滑液中IL-1β蛋白浓度的相较于Exo-miR-144-3p/210-3p治疗组均不同程度提高,且对照组小鼠滑液中IL-1β蛋白浓度最高。说明Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体的联合治疗的效果更佳,治疗效果优于Exo-miR-144-3p外泌体的治疗效果,显著优于Exo-miR-210-3p外泌体的治疗效果。
1.1.2、MMP
在治疗结束1个月后处死各组小鼠,取膝关节腔放入多聚甲醛固定,并切片进行MMP免疫组化染色,使用软件定量分析单个高倍镜视野中MMP+的关节软骨细胞数量,各组结果见图3中的B。从图3中的B可见:Exo-miR-144-3p/210-3p治疗组中小鼠的MMP+关节软骨数量较低,接近正常鼠;而Exo-miR-144-3p治疗组和Exo-miR-210-3p治疗组中小鼠的MMP+关节软骨数量相较于Exo-miR-144-3p/210-3p治疗组均不同程度提高,且对照组小鼠的MMP+关节软骨数量最高。说明Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体的联合治疗的效果更佳,治疗效果优于Exo-miR-210-3p外泌体的治疗效果,显著优于Exo-miR-144-3p外泌体的治疗效果。
1.1.3、软骨下血管形成
膝关节腔放入多聚甲醛固定,取关节软骨表面部分切片,进行Emcn免疫组化染色,使用软件定量分析单个高倍镜视野中Emcn+的面积,各组Emcn+面积占视野面积的比例见图3中的C。从图3中的C可见,Exo-miR-144-3p/210-3p治疗组中小鼠的Emcn+面积较小,接近正常鼠;而Exo-miR-144-3p治疗组和Exo-miR-210-3p治疗组中小鼠的Emcn+面积相较于Exo-miR-144-3p/210-3p治疗组均不同程度提高,且对照组小鼠的Emcn+面积最高。说明Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体的联合治疗的效果更佳,治疗效果优于Exo-miR-210-3p外泌体的治疗效果,显著优于Exo-miR-144-3p外泌体的治疗效果。
1.2、关节骨质疏松检测
1.2.1、骨体积/组织体积
在治疗结束1个月后,给各组小鼠膝关节进行显微CT检查,小鼠的骨体积/组织体积的CT重建图像见图4中的A。从图4中的A可见,Exo-miR-144-3p/210-3p治疗组中小鼠的骨体积/组织体积比值较高,接近正常鼠;而Exo-miR-144-3p治疗组和Exo-miR-210-3p治疗组中小鼠的骨体积/组织体积比值相较于Exo-miR-144-3p/210-3p治疗组均不同程度降低,且对照组小鼠的骨体积/组织体积比值最低。说明Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体的联合治疗的效果更佳,治疗效果优于Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体的单独治疗效果。
1.2.2、骨小梁数量、厚度和间隙
在治疗结束1个月后,给各组小鼠膝关节进行显微CT检查,小鼠的骨小梁数量、厚度和间隙的CT重建图像分别见图4中的B、C和D。从图4中的B、C和D可见,Exo-miR-144-3p/210-3p治疗组中小鼠的骨小梁数量和厚度较高、骨小梁间隙较小,骨小梁数量、厚度和间隙均接近正常鼠。从骨小梁数量和厚度上看,Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体的联合治疗的效果优于Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体的单独治疗效果;从骨小梁间隙上看,Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体的联合治疗的效果优于Exo-miR-144-3p外泌体的治疗效果,显著优于Exo-miR-210-3p外泌体的治疗效果。
1.3、OARSI评分在治疗结束1个月后,通过OARSI评分评价各组小鼠膝关节炎严重程度。正常鼠的OARSI评分接近0分。Exo-miR-144-3p/210-3p治疗组小鼠的OARSI评分结果(平均3分)较低、与正常鼠最接近;而Exo-miR-144-3p治疗组和Exo-miR-210-3p治疗组中小鼠的OARSI评分结果(分别平均为7.3分和12份)均不同程度提高,且对照组小鼠的OARSI评分结果(平均17分)最高。说明Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体的联合治疗的效果更佳,治疗效果优于Exo-miR-144-3p外泌体和Exo-miR-210-3p外泌体的单独治疗效果。
总的来说,Exo-miR-144-3p/210-3p治疗骨关节炎的效果显著好于Exo-miR-144-3p和Exo-miR-210-3p单独治疗的效果。
测试例2
基于测试例的研究,本测试例进一步研究了实施例2-4、对比例1-4的外泌体混合液的治疗效果,并将治疗效果与实施例1的外泌体混合体的治疗效果进行比较,具体过程及结果如下:选择6月龄的C57BL/6小鼠,双侧膝关节接受ACLT手术,术后使用胰岛素注射器将50μg(50μL)外泌体混合液垂直注射进每侧关节腔,每周一次,连续注射三周。治疗组共七组(每组10只),分别为:Exo-miR-144-3p/210-3p磁化处理组1:施用实施例2中制备的外泌体混合液;Exo-miR-144-3p/210-3p磁化处理组2:施用实施例3中制备的外泌体混合液;Exo-miR-144-3p/210-3p磁化处理组3:施用实施例4中制备的外泌体混合液;Exo-miR-140-5p/210-3p治疗组:施用对比例1中制备的外泌体混合液;Exo-miR-144-3p/140-5p治疗组:施用对比例2中制备的外泌体混合液;Exo-miR-144-3p/199a-3p治疗组:施用对比例3中制备的外泌体混合液;Exo-miR-199a-3p/210-3p治疗组:施用对比例4中制备的外泌体混合液;另外10只6月龄C57BL/6小鼠做正常鼠,10只未治疗的6月龄ACLT小鼠做对照组。治疗1个月后对比不同组小鼠的骨关节炎病情改善情况。其中关节滑液炎性介质检测的方法同测试例1,检测结果如表1所示;骨质疏松检测和OARSI评分的方法也同测试例1,检测结果如表2所示。
表1:不同方案的小鼠关节滑液炎性介质检测结果
备注:表1的各组数据为平均值。
从表1的数据结果中看出,以Exo-miR-144-3p/210-3p(实施例1-4)治疗小鼠骨关节炎时,能够显著减少ACLT小鼠关节滑液中多种炎性介质。对比实施例1和实施例2-4的检测结果发现,对外泌体混合液中的Exo-miR-144-3p/210-3p做适当的磁化处理后再用于ACLT小鼠治疗,其效果更佳,但是若磁化处理的强度过高,反而会带来负面的治疗作用。原因可能是适当的磁化处理本身对外泌体有一定的作用效果,改善了外泌体的电荷分布、能量分布等,也会对外泌体的膜结构有一定影响,从而影响外泌体膜结构的通透性,使得外泌体内的物质更容易释放,或者更加容易和靶细胞发生膜融合,以更好地将外源基因释放至靶细胞间或者靶细胞内,因此最终带来更好的治疗效果。但是脱磁化处理的强度过高,会对外泌体带来较大的影响,使得功能物质被破坏,反而会带来负面的治疗作用或者无治疗作用。
同时根据对比例1-4的检测结果也能发现,并不是以随意两种微小RNA基因插入得到慢病毒的重组慢病毒转染人脂肪间充质干细胞,以制备得到的外泌体混合液治疗ACLT小鼠后,就会获得较好的治疗效果。miR-140-5p和miR-199a-3p都有促进软骨细胞再生的作用,但是对比例1、对比例4和实施例1的数据结果表明,Exo-miR-140-5p/210-3p或者Exo-miR-199a-3p/210-3p均难以显著降低ACLT小鼠关节腔的多种炎性介质。其原因可能是:基因miR-140-5p和基因miR-210-3p同时插入慢病毒并转染人脂肪间充质干细胞时难以高效表达,因此导致Exo-miR-140-5p/210-3p的表达产物不够,难以发挥较好的作用;也可能是因为基因miR-140-5p和基因miR-210-3p同时用于治疗ACLT小鼠时,这两种基因对小鼠本身基因的调控为无效调控或者负面调控,因此难以实现协同减轻ACLT小鼠膝关节炎症介质的效果。对比例2、对比例3和实施例1的数据结果表明,Exo-miR-140-5p/144-3p或者Exo-miR-144-3p/199a-3p均难以显著降低ACLT小鼠关节腔的多种炎性介质,其原因可能还是和外源基因表达量或者外源基因调控效果有关。
表2:不同方案的小鼠膝部骨质疏松检查结果和OARSI评分结果
备注:表2的各组数据为平均值。
同样地,外源基因的表达量和调控效果的差异,也会使得不同外泌体混合液对ACLT小鼠膝关节的骨质疏松相关指标和OARSI评分有不同的影响结果。表2中实施例1和实施例2-4的检测结果发现,对外泌体混合液中的Exo-miR-144-3p/210-3p做适当的磁化处理后再用于ACLT小鼠治疗,其效果更佳,但是若磁化处理的强度过高,反而会带来负面的治疗作用。对比例1、对比例4和实施例1的数据结果表明,Exo-miR-140-5p/210-3p或者Exo-miR-199a-3p/210-3p都难以显著改善ACLT小鼠膝关节的骨质疏松和OARSI评分。对比例2、对比例3和实施例1的数据结果表明,Exo-miR-140-5p/144-3p与Exo-miR-144-3p/199a-3p同样难以显著改善ACLT小鼠膝关节的骨质疏松和OARSI评分。
应当注意的是,以上所述的实施例仅用于解释本申请,并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述,但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇,而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改,以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例,但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例,相反,本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
Claims (10)
1.一种用于治疗骨关节炎的外泌体混合液,其特征在于,所述外泌体混合液中包括内部过表达miR-144-3p的外泌体Exo-miR-144-3p和内部过表达miR-210-3p的外泌体Exo-miR-210-3p。
2. 根据权利要求1所述的外泌体混合液,其特征在于,所述外泌体Exo-miR-144-3p和外泌体Exo-miR-210-3p的粒径分布为50~140nm,D50为58~60nm,D90为75~78nm,D10为55~57nm。
3.根据权利要求1或2所述的外泌体混合液,其特征在于,所述外泌体混合液中外泌体Exo-miR-144-3p和外泌体Exo-miR-210-3p总含量为(1.5~10)×1011颗粒/mL。
4.一种如权利要求1-3中任意一项所述的外泌体混合液的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
S1,制备重组慢病毒,所述重组慢病毒上包括基因miR-144-3p、基因miR-210-3p、抗性基因和筛选标记基因;
S2,将所述重组慢病毒与干细胞接触后进行培养,收集培养上清并进行浓缩,得到所述外泌体混合液。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤S1中,所述重组慢病毒的制备方法包括以下步骤:
T1,将基因miR-144-3p、基因miR-210-3p、抗性基因和筛选标记基因连接在慢病毒的基因上,得到未包装的重组慢病毒;
T2,将所述未包装的重组慢病毒与宿主细胞接触后进行培养,使所述未包装的重组慢病毒在宿主细胞内进行包装,获得所述重组慢病毒。
6. 根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述基因miR-144-3p的序列如SEQ IDNO.1,所述miR-210-3p的基因序列如SEQ ID NO.2,所述慢病毒的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
7.根据权利要求4-6中任意一项所述的方法,其特征在于,所述抗性基因为嘌呤霉素抗性基因,且步骤S2中所述培养采用的培养基中添加有嘌呤霉素。
8.根据权利要求4-6中任意一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括以下步骤:
S3,对所述外泌体混合液进行磁化处理。
9. 根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述磁化处理的条件包括:磁化强度为5~8A/m,磁化时间为15~30 min,磁化温度为0~10℃。
10.一种如权利要求1-3中所述的外泌体混合液或者权利要求4-9中任意一项所述方法制备的外泌体混合液在制备用于治疗骨关节炎的药物中的应用。
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