CN110935010A - 一种干细胞制剂和生长因子组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种干细胞制剂和生长因子组合物，包括间充质干细胞制剂和自体CGF，间充质干细胞制剂包括浓度为2‑5×107/ml的间充质干细胞、1％‑5％的人血白蛋白、98.5％‑94.5％的勃脉力A和0.5％肝素钠。本发明的间充质干细胞制剂可以产业化制备，需符合药品的要求，统一的生产和质量控制体系，从而利于治疗方案的一致性和疗效评价；通过先常氧培养再低氧培养的方法不仅可保证细胞数量而且增加干性；间充质干细胞制剂联合应用自体CGF能够明显提高间充质干细胞促进软骨新生和修复的作用；能够增强间充质干细胞在炎症状态下的增殖和迁移能力，并且高分泌干细胞促进归巢、组织修复和再生以及免疫调节的细胞因子表达。

Description

一种干细胞制剂和生长因子组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种干细胞制剂和生长因子组合物及其制备方法和在膝关节骨关节炎中的应用。
背景技术
膝关节骨关节炎是指由于膝关节软骨变性、骨质增生而引起的一种慢性骨关节疾患，在临床上主要表现为膝关节疼痛和不同程度的功能障碍，部分有关节肿胀、积液，严重影响患者的生活质量。X线表现关节间隙变窄，关节边缘骨赘形成，软骨下骨硬化和囊性变。
现有治疗膝关节骨关节炎方式主要有物理治疗、药物治疗、手术治疗三种方式。药物治疗是目前骨性关节炎主要的治疗手段，分为：①非甾体类药物；②营养关节的药物；③抗氧化药物；④抗炎药物。经过药物治疗无效，可以考虑进行手术治疗，包括关节清理术、胫骨结节前移术和人工全膝关节置换术。
目前临床上尝试采用多种方法修复关节软骨损伤，如自体或异体软骨移植术、自体软骨细胞或基质诱导的自体软骨细胞移植术，以及基因疗法和干细胞疗法等。然而，关节软骨受损后再生修复能力有限，而应用软骨细胞移植法，不仅受到细胞来源的限制，而且提取细胞的供体部位出现的软骨缺损会形成新的骨关节炎。
目前有大量的临床前研究证实，间充质干细胞(MSCs)可以治疗膝关节骨性关节炎，并且无论是关节局部注射，还是关节腔注射，都取得了良好的效果。MSCs不仅延缓了关节炎的进一步发展，促进新生透明软骨的形成，并且没有毒副作用。关于人体实验，Wakitani等利用骨髓间充质干细胞，在混合胶原凝胶后，植入到膝关节软骨缺损处，经过42周的治疗后，观察到软骨缺损处，有透明质酸软骨样组织生成，其组织学评分和关节镜检查有明显改善。
尽管MSCs治疗关节软骨损伤取得了很大的进展，但是关节内的炎症与自由基环境，影响细胞活性和功能，从而减弱了治疗效果。此外，采用间充质干细胞经过诱导分化得到的软骨细胞来治疗骨性关节炎，也存在以下问题，首先是诱导分化效率较低，培养过程所需时间长，软骨细胞易凋亡；其次，通常使用骨性关节炎来源的细胞、牙髓间充质干细胞、自体骨髓间充质干细胞，其来源受限，取材时存在机体损伤，而且需要较长的制备时间获得一定的细胞数量。更重要的，使用单一的间充质干细胞关节腔内注射，局部的低氧和炎症微环境影响细胞的活性和生物学功能，从而减弱了治疗效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中局部关节腔内细胞存活率低、细胞诱导分化效率低的缺陷，提供一种干细胞制剂和生长因子组合物及其制备方法和应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种干细胞制剂和生长因子组合物，包括间充质干细胞制剂和自体CGF，其中间充质干细胞制剂包括浓度为2-5×107/ml的间充质干细胞和间充质干细胞制剂液，所述间充质干细胞制剂液包括以质量份数计的1％-5％的人血白蛋白、98.5％-94.5％的勃脉力A和0.5％肝素钠组成。
上述干细胞制剂和生长因子组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、将含有间充质干细胞的组织处理后剪碎，接种于培养瓶底部，间隔0.5-1.0cm，将培养瓶置于常氧培养箱中孵育；含有间充质干细胞的组织可以为脂肪、脐带等，优选正常足月产健康新生儿脐带，来源广泛，可大规模生产、产业化制备；含有间充质干细胞的组织可以为自体来源，也可以为异体来源；
S2、24h后添加含有10-20μg/L碱性成纤维细胞生长因子的无血清完全培养基，以后隔天观察细胞，当细胞达到80-90％融合度时，将细胞消化传代；此为P0代细胞；
S3、细胞传代时，应用胰蛋白酶消化，待细胞和残余组织块悬浮后，加入无血清培养基中和；过滤细胞，收集滤液，离心，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1-5×105/ml，接种在培养瓶中培养，将培养瓶置于低氧培养箱中孵育，此为P1代细胞；
S4、待P1代细胞到达80-90％融合度时，应用胰蛋白酶消化，待细胞悬浮后，加入无血清培养基中和；离心，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1-5×105/mL，接种在T75培养瓶中培养；将低氧培养箱中孵育，此为P2代细胞，以此类推，培养至P3-P5代；
S5、将培养好的间充质干细胞的培养瓶，观察细胞融合度达70％-90％，弃去培养基，应用勃脉力A清洗两次后，加入胰蛋白酶消化，待细胞悬浮后，加入无血清培养基中和，收集细胞，离心，弃去上清，用勃脉力A重悬细胞，调整密度为1-5×106/ml，离心，弃去上清，此为第一次细胞清洗，清洗三次后，应用干细胞制剂液重悬，调整细胞密度为2-3×107/ml，分装到2mL无菌冻存管中，封装4℃低温保存，24小时内使用；每管2ml终体积，含有4-6×107个细胞，此为间充质干细胞制剂；
S6、使用肝素钠抗凝负压管，抽取自体静脉血，经变速离心系统离心后得到上层的PPP，中间的液态CGF和最底层为RBC，将注射器针头插入RBC层的最顶端，抽取液态CGF，制得自体CGF。
自体CGF中富含生长因子、纤维蛋白和CD34+干细胞；其中的生长因子包含转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、骨形成蛋白(BMPs)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)以及成纤维生长因子(FGF)等。因此CGF具有促进血管生成和移植物存活，组织修复和免疫调节功能。
进一步的，S6中将自体静脉血经Medifuge 200变速离心系统离心10～15分钟来制备液态CGF。
进一步的，将1/2-2/3体积的间充质干细胞制剂和余量的自体CGF混合均匀，将总体积为4-8ml的组合物5～15分钟内注射到关节腔内。
本发明的关节干细胞制剂和自体生长因子组合物，适用于膝关节骨关节炎、髋关节骨关节炎、脊柱骨关节炎等各种骨关节炎的治疗应用，也适用于膝关节半月板损伤、韧带损伤等各种关节软组织损伤的治疗应用。
优选的，针对I-II期膝关节骨关节炎，干细胞制剂每管2-3ml，含有2-5×107个细胞，使用1管干细胞制剂与2-3ml自体CGF制备组合物，总体积4-5.5ml进行关节腔内注射。针对III-IV期膝关节骨关节炎，干细胞制剂每管2-3ml，含有2-5×107个细胞，使用2管干细胞制剂与2-3ml自体CGF制备组合物，总体积6-7.5ml进行关节腔内注射。
关节腔内是低氧环境，本发明在获取原代间充质干细胞时，先采用常氧培养环境，然后从P1代细胞开始，采用低氧环境培养的方法，逐渐增强间充质干细胞在低氧环境的适应能力，且低氧条件下培养的干细胞具有更强的增殖和克隆形成能力(干性增强)，更有效的成软骨分化能力。因此可获得更多的细胞数量满足临床治疗需求，同时在关节腔内注射后，干性增强的细胞能够更有效地发挥其生物学功能，缩短组织修复的进程。
另一方面骨性关节炎内存在滑膜炎症，关节腔内注射间充质干细胞之后，细胞会受到局部环境中各种细胞因子的影响，出现早期凋亡，从而影响疗效。因此，如何延长干细胞在关节腔内的存活时间，是保证临床治疗疗效的关键。本发明在注射组合物中添加自体静脉血提取的浓缩生长因子(CGF)，CGF含有高浓度的生长因子、纤维蛋白和CD34阳性细胞，能够促进组织细胞再生、修复及免疫调节，使得间充质干细胞得到较好的活性保护。CGF不仅提高了MSCs的增殖率、增强了干细胞促进软骨分化和生成的能力，而且在炎症环境中，提高干细胞的迁移能力，细胞因子分泌量增加，组织修复和免疫调节能力明显增强，从而更好地保证疗效。其优越性在于，在局部低氧和炎症环境中更好地保护干细胞的活性，发挥协同作用，抑制炎症和促进组织修复，实现患者症状的缓解和功能恢复。
克服现有关节炎治疗制剂或方法存在细胞类型单一、局部关节腔内细胞存活率低、治疗时间长、不能充分发挥细胞的生物学性能、细胞诱导分化效率低等不利于关节炎症控制和组织修复的问题。为此，本发明采用间充质干细胞制剂和自体生长因子组合制备，提供一种治疗骨关节炎的方法和组合物，该细胞治疗组合物可以用于关节腔内注射治疗骨关节炎和软骨缺损。
本发明所达到的有益效果是：
一、本发明的间充质干细胞可取自脂肪、脐带组织，取材广泛、数量多、体外增殖能力强，尤其是脐带来源的间充质干细胞易于产业化，是临床干细胞制剂的最佳选择；本发明提前制备成间充质干细胞制剂，需符合药品的要求，统一的生产和质量控制体系，从而利于治疗方案的一致性和疗效评价。
二、本发明在常氧环境中进行P0代细胞培养，从P1代细胞开始，采用低氧环境进行干细胞扩增的方法，一方面增强间充质干细胞增殖能力，获得更多的细胞数量，保证细胞制剂产业化和临床治疗的需求；另一方面提高间充质干细胞的干性，表现为更强的克隆形成能力和成软骨分化能力，在关节腔内的低氧环境，能够更好地发挥生物学功能和疗效。
三、本发明中应用自体静脉血中提取的浓缩生长因子(CGF)作为添加物，自体CGF中包含多种高浓度细胞因子、纤维蛋白和CD34+干细胞，CGF能够明显提高干细胞促进软骨生成相关基因的表达，促进软骨新生和修复；能够增强间充质干细胞在炎症状态下的增殖和迁移能力，并且高分泌干细胞促进归巢、组织修复和再生以及免疫调节的细胞因子表达。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1 脐带间充质干细胞分离图例；
图2 间充质干细胞检测和鉴定；
图3 间充质干细胞的多向分化；
图4 低氧培养对MSCs细胞克隆形成能力的影响；
图5 低氧培养对MSCs细胞增殖能力的影响；
图6 低氧培养对MSCs细胞成软骨分化能力的影响；
图7 CGF中生长因子含量测定；
图8 不同浓度CGF对MSCs软骨生成相关基因表达的影响；
图9 CGF对MSCs在炎症状态下增殖能力的影响；
图10 CGF对MSCs在炎症状态下迁移能力的影响；
图11 CGF对MSCs细胞在炎症状态下因子分泌的影响。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
一种干细胞制剂和生长因子组合物，包括间充质干细胞制剂和自体CGF，其中间充质干细胞制剂包括浓度为2-5×107/ml的脐带间充质干细胞和间充质干细胞制剂液，所述间充质干细胞制剂液包括以质量份数计的1％-5％的人血白蛋白、98.5％-94.5％的勃脉力A和0.5％肝素钠组成。
上述干细胞制剂和生长因子组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、□取正常足月产健康新生儿脐带10-15cm，立即放入DMEM培养基加10-20％双抗的溶液中，8-12h内处理；超净台内取出脐带，75％酒精消毒脐带表面，生理盐水充分洗涤残留的血液。将脐带剪成1-2cm小段，再次漂洗，剖开脐带，提出脐静脉和脐动脉。将剩余脐带组织(华通氏胶)剪成1-2mm3大小，接种于T75培养瓶底部，间隔0.5-1.0cm。将培养瓶置于37℃、21％O2、5％CO2常氧培养箱中孵育；
S2、于第二天添加无血清完全培养基(含有10-20μg/L碱性成纤维细胞生长因子)，以后隔天观察细胞，当细胞达到80-90％融合度时，将细胞消化传代；此为P0代细胞。
S3、细胞传代时，应用0.25％胰蛋白酶消化5-10min，待细胞和残余组织块悬浮后，加入2倍体积的无血清培养基中和。以100μm的滤器过滤细胞，收集滤液，以1500rpm/min离心10min，弃去上清。用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1-5×105/ml，接种在T75培养瓶中培养。将培养瓶置于37℃、5％O2、5％CO2低氧培养箱中孵育。此为P1代细胞。
S4、待P1代细胞到达80-90％融合度时，应用0.25％胰蛋白酶消化5-10min，待细胞悬浮后，加入2倍体积的无血清培养基中和。以1500rpm/min离心10min，弃去上清。用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1-5×105/ml，接种在T75培养瓶中培养；将培养瓶置于37℃、5％O2、5％CO2低氧培养箱中孵育；此为P2代细胞。培养至P3-P5代，以此类推。
如图1所示。其中图1(a)为脐带段，图(b)为剪碎的脐带华通氏胶组织，图1(c)为P0代细胞，图1(d)为融合的P1代细胞；由图1可见，MSC细胞密度低时成扁平单层细胞，细胞密度高时趋于融合，细胞变细长，类似成纤维细胞，呈平行或者漩涡状生长。
选取P3代细胞进行流式细胞仪免疫表型的检测和鉴定。(图2)由图2可见，低氧培养的间充质干细胞高表达CD73，CD90和CD105，不表达造血细胞的标志CD14，CD45和CD34，具有较低的免疫原性(低表达HLA-DR)，符合间充质干细胞的定义。
S5、选取含有P3-P5代间充质干细胞的培养瓶，观察细胞融合度达70％-90％，弃去培养基，应用勃脉力A清洗两次后，每瓶中加入0.25％胰蛋白酶消化5-10min，待细胞悬浮后，加入2倍体积的无血清培养基中和。收集细胞，以1500rpm/min离心10min，弃去上清。用勃脉力A重悬细胞，调整密度为1-5×106/ml，以1000rpm/min离心10min，弃去上清，此为第一次细胞清洗。清洗三次后，应用干细胞制剂液重悬，分装到2ml无菌冻存管中，封装4℃低温保存，24小时内使用。每管2ml终体积，含有4-6×107个细胞，此为关节干细胞制剂。
S6、使用肝素钠抗凝负压管，抽取自体静脉血，经变速离心系统离心后得自体CGF。
使用肝素钠抗凝负压管，抽取自体静脉血9ml，经意大利Silfradent(塞法登特)公司生产的Medifuge 200变速离心系统离心约13分钟，每9ml血液可分离出约2.5mlCGF。经离心制备出的血液制品分为三大部分，上面约2ml为PPP(贫血小板血浆)，中间约2-3ml为液态CGF，最底层为RBC(红细胞)。将2ml注射器针头插入红细胞层最顶端，抽取2-3ml液体，这部分液体富含CD34+细胞和多种浓缩生长因子。提取全血血浆作为对照，应用酶联免疫分析的方法(ELISA试剂盒)检测CGF中细胞因子TGF-β1、PDGF-BB、IGF和EGF的含量。由图7可见，与外周血相比，CGF中含有较高浓度的多种生长因子。
CGF对MSCs细胞表型的影响：选取P3代细胞，分成四组①对照组(单纯无血清培养基)②1/3CGF添加组③1/2CGF添加组，将三组培养瓶置于37℃低氧培养箱(5％O2)中继续培养72小时。应用胰蛋白酶消化MSCs，收集未处理和处理的细胞，用PBS充分洗涤二次。调整细胞浓度为1×106/ml，分别加入鼠抗人单克隆抗体CD73，CD90，CD105和CD34、CD14各10μl，充分混匀，室温下30min，洗涤后应用流式细胞仪进行检测。最终检测结果显示，培养液中添加1/3或1/2CGF不影响MSCs的细胞表面标志表达，仍符合MSCs的鉴定标准。
CGF对MSCs细胞促进软骨生成相关基因的表达影响：选取P3代细胞，以1×105个细胞/孔接种于6孔板，分为三组①对照组(单纯无血清培养基)②1/3CGF添加组③1/2CGF添加组，将三组细胞置于37℃低氧培养箱(5％O2)中培养7天。收集细胞后，提取总RNA，逆转录获得cDNA，定量PCR仪上检测以下基因的相对表达(相对于GAPDH管家基因)：Sox-1、CollagenII和Arrgecan。由图8可见，相对于管家基因GAPDH表达，在培养液中添加1/3或1/2CGF能够明显提高MSCs促进软骨分化和生成相关基因Sox-9、Collagen II和Aggrecan的表达水平。
CGF对MSCs细胞在炎症状态下增殖能力的影响：采用TNF-α(10ng/ml)模拟关节腔内炎症环境。选取P3代细胞，调整MSCs细胞浓度至1-2×104/ml加入96孔板，每孔200μl。根据在完全培养基中添加不同成分，分成四组①对照组(单纯无血清培养基)②TNF-α组(炎症环境)③TNF-α+1/3CGF组(1/3CGF添加)④TNF-α+1/2CGF组(1/2CGF添加)，将细胞置于37℃低氧培养箱(5％O2)中继续培养72小时。培养结束后，每孔加入20μl MTT(5g/L)，37℃放置4h。然后每孔加入150μl DMSO,振荡10min，用酶标仪测定各孔吸光光度值(OD值，490nm)，以OD值代表细胞的相对数量。由图9可见，(1)炎症状态抑制MSCs细胞的增殖，(2)培养液中添加1/3或1/2CGF能够明显提高MSCs在炎症状态下的增殖能力。
CGF对MSCs细胞在炎症状态下迁移能力的影响：采用TNF-α(10ng/ml)模拟关节腔内炎症环境。选取P3代细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，接种于24孔transwell板上，每孔250μl。分成四组①对照组(单纯无血清培养基)②TNF-α组(炎症环境)③TNF-α+1/3CGF组(1/3CGF添加)④TNF-α+1/2CGF组(1/2CGF添加)，将细胞置于37℃低氧培养箱(5％O2)中继续培养24小时。收集迁移到24孔板下层细胞并计数。由图10可见，与对照组相比，培养基中添加1/3或1/2CGF能够更好地提高细胞在炎症状态下的迁移能力。
CGF对MSCs细胞在炎症状态下因子分泌的影响：选取P3代细胞，以1×105个细胞/孔接种于6孔板，分成四组①对照组(单纯无血清培养基)②TNF-α组(炎症环境)③TNF-α+1/3CGF组(1/3CGF添加)④TNF-α+1/2CGF组(1/2CGF添加)，将细胞置于37℃低氧培养箱(5％O2)中培养24小时。收集细胞后，提取总RNA，逆转录获得cDNA，定量PCR仪上检测以下基因的相对表达(相对于GAPDH管家基因)：CXCR4、PDGF和VEGF。由图11可见，由上图定量PCR检测结果显示，和对照组相比，培养基中添加1/3或1/2CGF能够明显提高MSCs分泌归巢、促进组织修复和再生的细胞因子表达。
低氧培养对MSCs细胞克隆形成能力的影响
选取P3代细胞，将50个细胞接种含10ml 37℃预温培养液的10cm培养皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。分别放置在常氧培养箱(21％O2)和低氧培养箱(5％O2)中，继续培养2-3周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，浸洗2次，经4％多聚甲醛固定后，应用吉姆萨染色液染色，用肉眼直接计数克隆，计算克隆形成率。图3中,图3(a)为成骨分化，图3(b)为成软骨分化，图3(c)为成脂肪分化；由图3可见，低氧条件下培养的MSCs具有较强的克隆形成能力。低氧培养的间充质干细胞具有多向分化的潜能，符合对间充质干细胞的定义。
低氧培养对MSCs细胞增殖的影响
选取P3代细胞，调整MSCs细胞浓度至1-2×104/ml加入96孔板，每孔200μl。分成两组，分别在常氧培养箱(21％O2)和低氧培养箱(5％O2)中继续培养24-96小时。培养结束后，每孔加入20μl MTT(5g/L)，37℃放置4h。然后每孔加入150μl DMSO,振荡10min，用酶标仪测定各孔吸光光度值(OD值，490nm)，以OD值代表细胞的相对数量，绘制生长曲线。由图4可见，低氧培养可以明显促进MSCs的增殖，表现为随着时间的延长，其增殖能力成对数上升。
低氧培养对MSCs细胞成软骨分化能力的影响
选取P3代细胞，调整MSCs细胞浓度至0.5-1×105/ml，取5ml细胞悬液置于1.5ml无菌锥形离心管中，1500rpm离心5分钟，形成球形的细胞团块。弃去上清液，将细胞团块浸入250-500μl的软骨生成培养液中，分别在常氧和低氧培养箱中继续培养21天。培养结束后，去除培养液，晾干，经4％多聚甲醛固定后，应用阿尔辛蓝进行软骨染色。由图5可见，在低氧培养条件下，MSCs细胞向软骨分化的能力的增强，表现为更多的表达糖胺聚糖的水平。
间充质干细胞制剂和自体CGF生长因子组合物制备和实施例应用
应用5-10ml注射器，首选抽取2-3ml自体CGF生长因子，然后抽取关节干细胞制剂混悬液2-5ml，在注射器内进行混合，5-10分钟内进行关节腔内注射。
典型病例1治疗方案：女性患者46岁，右侧膝关节骨性关节炎I-II期。采取平卧位，膝关节30度屈曲位置，局部定位消毒后，选择膝关节外侧进行关节腔内注射。应用5ml注射器，注射制剂包含：2-3ml关节干细胞制剂和2-3ml自体CGF因子，总体积4-5.5ml，5-10分钟内完成关节腔内注射。
典型病例2治疗方案：男性患者57岁，左侧膝关节骨性关节炎III-IV期，半月板部分摘除。采取平卧位，膝关节30度屈曲位置，局部定位消毒后，选择膝关节外侧进行关节腔内注射。应用10ml注射器，注射制剂包含：4-5ml关节干细胞制剂和2-3ml自体CGF因子，总体积6-7.5ml，5-10分钟内完成关节腔内注射。
采用KOOS膝关节功能评分系统，在治疗前和治疗后3月、6月和12月分别对两个实施例患者的膝关节功能进行评分。最终显示结果显示，经过关节干细胞制剂和自体生长因子组合物治疗后，6个月后I-II期骨关节炎患者的膝关节功能基本恢复，III-IV期骨关节炎患者的膝关节功能大部分恢复。
实施例1-骨关节炎(I-II期)
治疗前 3个月后 6个月后 12个月后
疼痛 63.89 83.33 97.22 94.44
症状 67.86 85.71 92.86 96.43
日常生活活动能力 70.59 88.24 94.12 97.06
运动及娱乐能力 60 75 95 95
生活质量 68.75 81.25 93.75 93.75
实施例2-骨关节炎(III-IV期)
治疗前 3个月后 6个月后 12个月后
疼痛 47.2 77.78 91.67 88.89
症状 53.57 75 85.71 89.29
日常生活活动能力 52.94 79.41 88.24 91.18
运动及娱乐能力 40 60 75 80
生活质量 37.5 62.5 81.25 87.5
本发明中的关节干细胞制剂4℃低温保存，24小时内使用，与新鲜制备的自体CGF形成的组合物，在5-15分钟内进行关节腔内注射，最大限度地保持细胞和生长因子的生物学活力。根据骨关节炎的不同临床分期，确定两种细胞剂量和不同的CGF添加比例，从而在减少注射总体积的同时保证最大的临床治疗效果。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种干细胞制剂和生长因子组合物，其特征在于，包括间充质干细胞制剂和自体CGF，其中间充质干细胞制剂包括浓度为2-5×107/ml的间充质干细胞和间充质干细胞制剂液，所述间充质干细胞制剂液包括以质量份数计的1％-5％的人血白蛋白、98.5％-94.5％的勃脉力A和0.5％肝素钠组成。
2.权利要求1所述的干细胞制剂和生长因子组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将含有间充质干细胞的组织处理后剪碎，接种于培养瓶底部，间隔0.5-1.0cm，将培养瓶置于常氧培养箱中孵育；
S2、24h后添加含有10-20μg/L碱性成纤维细胞生长因子的无血清完全培养基，以后隔天观察细胞，当细胞达到80-90％融合度时，将细胞消化传代；此为P0代细胞；
S3、细胞传代时，应用胰蛋白酶消化，待细胞和残余组织块悬浮后，加入无血清培养基中和；过滤细胞，收集滤液，离心，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1-5×105/ml，接种在培养瓶中培养，将培养瓶置于低氧培养箱中孵育，此为P1代细胞；
S4、待P1代细胞到达80-90％融合度时，应用胰蛋白酶消化，待细胞悬浮后，加入无血清培养基中和；离心，弃去上清；用无血清完全培养基重悬细胞，调整密度为1-5×105/mL，接种在T75培养瓶中培养；将低氧培养箱中孵育，此为P2代细胞，以此类推，培养至P3-P5代；
S5、将培养好的间充质干细胞的培养瓶，观察细胞融合度达70％-90％，弃去培养基，应用勃脉力A清洗两次后，加入胰蛋白酶消化，待细胞悬浮后，加入无血清培养基中和，收集细胞，离心，弃去上清，用勃脉力A重悬细胞，调整密度为1-5×106/ml，离心，弃去上清，此为第一次细胞清洗，清洗三次后，应用干细胞制剂液重悬，调整细胞密度为2-3×107/ml，分装到2mL无菌冻存管中，封装4℃低温保存，24小时内使用；每管2ml终体积，含有4-6×107个细胞，此为间充质干细胞制剂；
S6、使用肝素钠抗凝负压管，抽取自体静脉血，经变速离心系统离心后得到上层的PPP，中间的液态CGF和最底层为RBC，将注射器针头插入RBC层的最顶端，抽取液态CGF，制得自体CGF。
3.权利要求1所述的干细胞制剂和生长因子组合物的制备方法，其特征在于，S6中将自体静脉血经Medifuge 200变速离心系统离心10～15分钟来制备液态CGF。
4.权利要求1所述的干细胞制剂和生长因子组合物的制备方法，其特征在于，所述的含有间充质干细胞的组织为脂肪或脐带。
5.权利要求1所述的细胞制剂和生长因子组合物在治疗骨关节炎和关节软组织损伤中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的骨关节炎为膝关节骨关节炎、髋关节骨关节炎或脊柱骨关节炎中的任意一种；所述的关节软组织损伤为膝关节半月板损伤或韧带损伤。
7.权利要求6所述的细胞制剂和生长因子组合物的应用，其特征在于，将1/2-2/3体积的间充质干细胞制剂和余量的自体CGF混合均匀，将总体积为4-8ml的组合物5～15分钟内注射到关节腔内。
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