CN110050780B - 冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用。本发明提供的组合物，能够显著性的提高脐带间充质干细胞在冻存条件下的活性，而以其制得的干细胞制剂，具有良好的成骨分化、成软骨分化的潜能，从而能够具有良好的修复软骨损伤的作用，从而起到治疗骨关节炎的效果。

Description

冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用。

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种严重危害人类健康的慢性骨关节疾病，其在关节病中数量最多，超过类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等其他关节炎的总和。在病理水平，骨关节炎表现为关节软骨的破坏及骨赘的异常增生，以致临床上出现关节疼痛、活动受限及关节畸形等表现。同时，骨关节炎是导致青壮年劳动力下降的最主要病因，造成重大经济负担。

骨关节炎以严重的、局限性软骨破坏，深达骨质为特点。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质构成，由于软骨内无血管、淋巴管及神经组织，同时软骨细胞增殖能力有限，不能迁移，因此关节软骨损伤后其自我修复能力很弱。随着衰老，关节内的多种细胞如软骨细胞，滑膜细胞，间充质干细胞均发生细胞衰老和功能退化。因此，向关节内移植有生物活性的软骨细胞能够补充凋亡细胞或抵抗细胞衰老，细胞移植可以为骨关节炎的治疗提供一种新的思路。

细胞治疗骨关节炎近年来发展较快，并得到了广泛关注。脐带来源的间充质干细胞治疗骨关节炎既具有其他来源间充质干细胞扩增分化容易，具有抗炎和招募作用等优势，又具有获得量大、无伦理问题、取材过程无痛苦、高增殖特性、多能分化特性、低免疫源性、无致瘤性等特点，是目前临床细胞治疗最常用的种子细胞。但如何提高脐带间充质干细胞的活率，以及如何提高脐带间充质干细胞冻存后的复苏能力，是目前亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用。该冻存液能够维持间充质干细胞在冻存期间活性。

本发明提供的冻存液由如下体积份的液体组成：

一些实施例中，本发明所述的冻存液由如下体积份的液体组成；

本发明中，所述人血白蛋白注射液中人血白蛋白的质量分数为20％；所述葡萄糖注射液中葡萄糖的质量分数为5％；所述羟乙基淀粉注射液中羟乙基淀粉的质量分数为6％。

本发明提供的组合物用于细胞冻存液，能够显著性的提高细胞的存活率。经过冻存6个月后细胞存活率仍可达95％以上。

本发明所述的冻存液在脐带间充质干细胞冻存中的应用。

本发明还提供了一种脐带间充质干细胞冻存方法，其以本发明所述的冻存液重悬脐带间充质干细胞。

本发明中，所述脐带间充质干细胞为人类脐带间充质干细胞。

本发明中，所述重悬至细胞密度为1×10⁶～1×10⁸cells/ml。

一些实施例中，所述重悬至细胞密度为5×10⁷cells/mL。

本发明中，所述冻存的温度为-196℃。

本发明中，所述冻存后，还包括复苏的步骤。所述复苏的条件为37℃-42℃。

本发明所述的冻存液在制备干细胞制剂中的应用。

本发明还提供了一种干细胞制剂，其包括：脐带间充质干细胞和本发明所述的冻存液。

本发明所述的干细胞制剂中，所述脐带间充质干细胞的密度为1×10⁶～1×10⁸cells/ml。

一些实施例中，所述的干细胞制剂中，所述脐带间充质干细胞的密度为5×10⁷cells/mL。

一些实施例中，所述干细胞制剂中包括：5×10⁷cells/mL脐带间充质干细胞和冻存液；所述冻存液由如下体积份的液体组成；

本发明所述的干细胞制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。

研究表明，本发明所述的干细胞制剂在冻存后，仍具有良好的成骨分化、成软骨分化的潜能，因此，其具有治疗骨关节炎、修复软骨损伤的作用。

本发明还提供了一种治疗骨关节炎的方法，其为给予本发明所述的干细胞制剂。

本发明提供的冻存液由DMSO、人血白蛋白注射液、葡萄糖注射液和羟乙基淀粉注射液组成，其能够维持脐带间充质干细胞的活性，且复苏后的细胞仍具有有良好的成骨分化、成软骨分化的潜能，从而能够具有良好的修复软骨损伤的作用，从而起到治疗骨关节炎的效果。

本发明提供的组合物，能够显著性的提高脐带间充质干细胞在冻存条件下的活性，而以其制得的干细胞制剂，具有良好的成骨分化、成软骨分化的潜能，从而能够具有良好的修复软骨损伤的作用，从而起到治疗骨关节炎的效果。

附图说明

图1示复苏培养后的细胞形态；

图2示细胞成骨分化；

图3示细胞成软骨分化。

具体实施方式

本发明提供了冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide；DMSO)，常温下为液态。

所述人血白蛋白注射液中白蛋白的质量分数为20％。即每100mL人血白蛋白注射液中含20g人血白蛋白。

所述葡萄糖注射液中葡萄糖的质量分数为5％。即每100mL葡萄糖注射液中含5g葡萄糖。

所述羟乙基淀粉注射液中羟乙基淀粉的质量分数为6％。即每100mL羟乙基淀粉注射液中含6g羟乙基淀粉，且含有0.9g氯化钠。

所述脐带间充质干细胞的制备包括：

1、将脐带组织置于含1％双抗的DMEM/F12基础培养基中，浸泡运输至实验室，用生理盐水及75％酒精分别清洗，去除残留血液；

2、在将脐带组织剪成2-3cm小段，去掉组织外膜及动静脉，将剩余组织撕成条并剪碎至30-50mm³，根据脐带的长度选择接种培养皿数量，每3-5mL脐带长度接种1个15cm皿，用镊子取相应组织块平铺到培养皿中，待组织块固定于培养皿上，加入10-15ml含5-20ng/ml终浓度EGF的DMEM/F12完全培养基，轻轻摇晃培养皿，使培养基均匀分布于培养皿中，于培养箱培养；

3、换液：当观察到每皿至少有5处迁出成片的细胞后，用移液管吸掉皿内培养基和组织块，并用移液管吸取15-20mL新的DMEM/F12完全培养基加至15cm的培养皿中，十字摇晃培养皿，使培养基均匀分布于培养皿中。转移至5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的二氧化碳培养箱中继续培养；

4、传代：①当细胞汇合度达80％-85％时，将细胞放至洁净工作台中，用移液管吸掉皿内培养基，每皿加入15-20mL生理盐水清洗2次，用移液管向每个培养皿中加入2-3mL0.25％胰蛋白酶溶液，盖上皿盖前后左右摇晃平皿，使胰蛋白酶浸润整个皿底孵育1-2min，在倒置显微镜下观察，80％细胞皱缩、变圆漂浮时迅速移入洁净工作台，用移液管加5-10mlDMEM/F12完全培养基终止消化，轻轻吹打后将细胞悬液转移至离心管中并取样进行计数，离心管配平后置于离心机内，500-800g离心5-10min。

②倒掉离心后上清液，根据细胞计数结果，用DMEM/F12完全培养基溶液调整细胞接种密度为1-5×10⁴cell/mL，充分混匀后用移液管吸取15-20mL的细胞悬液接种至15cm培养皿中。十字摇晃培养皿，使细胞悬液均匀分布于培养皿中。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

1、取P3-P5代hUC-MSCs，当细胞汇合度达到80-85％时，用生理盐水清洗细胞两次，加入2-3ml 0.25％胰蛋白酶消化1-2min，加入5-10ml完全培养基终止消化，获得的细胞悬液进行500-800g离心5-10min，弃上清；

2、生理盐水重悬细胞，并取样计数，500g-800g离心5-10min，弃上清；

3、以表1所示各组冻存液重悬细胞至密度为1×10⁶～1×10⁸cells/ml。

表1各组方案

分别用表1中记载的方案冻存细胞，每组三次重复，并在冻存后1周、1个月、3个月、6个月及1年后复苏细胞检测其活率并进行对比结果如表2；

表2细胞活率

	1周	1个月	3个月	6个月	12个月
						组1	98.16％	98.54％	96.47％	96.88％	93.55％
组2	99.89％	99.15％	97.21％	98.6％	96.22％
						组3	97.15％	97.64％	93.97％	95.11％	91.76％
组4	99.63％	95.77％	95.26％	89.8％	83.97％
						组5	98.34％	94.56％	95.42％	92.45％	88.4％

结果表明，组1～3的细胞活率相对于组4～5更高，经统计学分析存在显著性差异，p<0.05。而其中，组2的细胞活率最高，优于其他各组，p<0.05。

4、细胞冻存一周后复苏组2的细胞进行培养，并拍照记录其细胞形态(图1～2)，增殖速度。

表3组2细胞复苏后增殖速度

以3d计数结果，代入公式DT＝t×[lg2/(lgNt-lgNo)]计算倍增时间，其他组的细胞倍增时间计算方法与组2一致，结果如表4，

表4细胞倍增时间

组别	倍增时间
		组1	35.63h
组2	28.62h
		组3	31.5h
组4	37.17h
		组5	34.37h

结果表明，组2的细胞倍增时间显著性的优于其他各组，经统计学分析，存在显著性差异，p<0.05。

5、分化效果检测，

细胞冻存一周后复苏组2做成骨分化和成软骨分化检测

5.1成骨分化

hUC-MSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成骨诱导培养基(IMDM中加入10％FBS，5μg/ml胰岛素，0.1μM地塞米松，0.2mM维生素C和10mMβ-甘油磷酸盐)。3d换液1次，分化15d。

待矿化结节形成后，进行茜素红染色。生理盐水清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用生理盐水清洗2次，茜素红染液浸染，生理盐水清洗2次，倒置显微镜下观察拍照，可见矿化结节。

对冻存复苏后的细胞进行成骨分化检测，诱导培养基为如上所述，诱导22天后以茜素红染色，各实施例及对比例的成骨分化结果如图2。

结果显示，经诱导后hUC-MSCs染色呈阳性，细胞被染成红色提示hUC-MSCs具有在体外成骨诱导分化的潜能。实施例2与对照组相比染色程度更高，表明分化情况更加良好。

5.2成软骨分化

hUC-MSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成软骨诱导培养基(IMDM中加入10％FBS，10ng/ml转化生长因子，50mg/L(左旋)维生素C，0.1nmol/L地塞米松，50mg/mL ITS，1mmol/L丙酮酸钠，5.35μg/mL亚油酸，1.25ng/mL牛血清白蛋白)。3d换液1次，分化30d。

待细胞形成球状后进行阿利新蓝染色，生理盐水清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用生理盐水清洗2次，麦氏苏木素复染5min，生理盐水清洗2次，倒置显微镜下观察拍照。

对冻存后的细胞进行成软骨分化检测，诱导培养基如上所述，诱导30天后以阿利新蓝染色，各实施例及对比例的成软骨分化结果如图3。

结果显示，经成软骨诱导后的hUC-MSCs染色呈阳性，细胞的胞浆内出现亮蓝色的蛋白聚糖颗粒，说明hUC-MSCs在体外具有向软骨细胞分化的潜能。实施例2与对照组相比染色程度更高，表明分化情况更加良好。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种冻存液，其由如下体积份的液体组成：

DMSO 5份~10份； 人血白蛋白注射液 5份~20份； 葡萄糖注射液 20份~30份； 羟乙基淀粉注射液 40份~70份；

所述人血白蛋白注射液中人血白蛋白的质量分数为20%；

所述葡萄糖注射液中葡萄糖的质量分数为5%；

所述羟乙基淀粉注射液中羟乙基淀粉的质量分数为6%，且含有质量分数为0.9%的氯化钠。

2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，由如下体积份的液体组成；

3.权利要求1~2任一项所述的冻存液在脐带间充质干细胞冻存中的应用。

4.一种脐带间充质干细胞冻存方法，其特征在于，以权利要求1~2任一项所述的冻存液重悬脐带间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的冻存方法，其特征在于，所述重悬至细胞密度为5×10⁷cells/mL。

6.权利要求1~2任一项所述的冻存液在制备干细胞制剂中的应用。

7.一种干细胞制剂，其包括：脐带间充质干细胞和权利要求1~2任一项所述的冻存液。

8.根据权利要求7所述的干细胞制剂，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的密度为5×10⁷cells/mL。

9.权利要求7~8任一项所述的干细胞制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。

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