CN108823156A - 用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法 - Google Patents
用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于修复的临床级含人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法，包括临床级干细胞完全培养基的制备、人脐带间充质干细胞的提取和培养、人脐带间充质干细胞复合因子的制备、人脐带间充质干细胞复合因子的冻干等步骤。所制备的人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉不含异体血清成分，培养基成分确定，并且人脐带间充质干细胞在使用该培养基体系培养时细胞增殖速度快，分泌生物活性物质能力强，极大降低生产成本，适合产业化大规模生产，可应用于临床伤口愈合和修复类的生物医药产品。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法。
背景技术
人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC- MSCs)作为一种广泛存在于新生儿脐带组织内的间充质干细胞，具备自我更新及多向分化的潜能。研究表明，hUC-MSCs的治疗潜力可归因为三种重要机制：1.归巢作用，hUC-MSCs可通过趋化作用迁移至急性损伤部位；2.hUC-MSCs可分化成多种细胞和组织类型，如心肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞、平滑肌细胞以及骨骼肌、心肌、脂肪等；3.分泌生物活性因子，通过该生理过程影响局部或者全身。基于以上机制， hUC-MSCs在临床研究中常被作为组织器官修复和再生的种子细胞。尽管早期的研究人员将hUC-MSCs的治疗效果归因于它们的移植和分化能力，但是近期的研究数据显示，通过静脉注射的hUC-MSCs多数会被肺脏截留；其次hUC-MSCs经全身给药，一周后只有＜1％的hUC-MSCs可保持存活状态，以上数据表明，hUC-MSCs的主要效果可能是由旁分泌机制介导，hUC-MSCs可产生广泛的生物活性因子，这些因子在组织损伤修复过程中发挥重要的生理调控作用。因此hUC-MSCs分泌的生物活性因子在组织修复和再生过程中的功能备受关注。
目前在再生医学领域，一种新型生物调控形式，无细胞的“cell-free”系统应运而生，其主要通过干细胞分泌的各种生物活性因子如可溶性蛋白质、游离核酸、脂类和细胞外囊泡(微粒、外泌体等)进行细胞间的通讯，继而响应身体生理或病理状态的变化过程，发挥积极的调控作用。hUC-MSCs分泌的各种生物活性物质，即人脐带间充质干细胞复合因子，可通过提取、浓缩等工艺得到，最后为了保证其最大的生物活性，通过冻干工艺应用于临床修复和再生领域。
2012年3月，陈海佳等人申请了有关专利(中国专利申请号 CN201210072079.X)，该发明通过培养人脐带来源的间充质干细胞，收集、提取及浓缩其分泌的生物活性因子，制成人脐带间充质干细胞提取物及冻干粉，主要应用于伤口愈合和修复药物等生物医药产品，但其在培养细胞的过程中使用的培养基为市售基础DMEM/F12培养基，常规培养时添加了10％胎牛血清。尽管该制剂的治疗益处明确，但是要进入临床应用还有以下风险：1、市售DMEM/F12培养基成分复杂不明确，含有4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，酚红等不适合人体应用的组分，且培养基的全成分在提取、浓缩环节无法去除，成为人脐带间充质干细胞提取物及冻干粉的一部分；2、胎牛血清可能携带未知病原体、治病性朊病毒蛋白等，且作为异种蛋白，进入人体后具有感染、过敏等风险。
经过检索和调研，尽管目前无细胞的“cell-free”系统已有很多国内专利涉及，但间充质干细胞的培养基系统含有不适合人类使用的化学组分或牛血清，如中国专利申请号CN201710015650.7、CN201410705636.6、CN201410238533.3、CN201210126581.4、CN201210072079.X等专利，潜在风险系数较高，临床应用具有很大局限性。
2015年7月，国家食药监和卫计委共同发布了《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则》，其中对干细胞培养基作出以下要求和规定：应尽可能避免在干细胞培养过程中使用人源或动物源性血清，不得使用同种异体人血清或血浆。如必须使用动物血清，应确保其无特定动物源性病毒污染。严禁使用海绵体状脑病流行区来源的牛血清。若培养基中含有人的血液成份，如白蛋白、转铁蛋白和各种细胞因子等，应明确其来源、批号、质量检定合格报告，并尽量采用国家已批准的可临床应用的产品。
为了避免成分不定以及异种血清的过敏、感染等风险，有学者采用成分确定的市售无血清培养基，加入配套的外源因子组合：生长因子(如bFGF、EGF等)、转铁蛋白、白蛋白、微量元素等成分，以补偿细胞无血清培养过程中的营养需求，但市售培养基价格昂贵，难以实现人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的产品化。
因此，要保证临床应用的安全性，并最大程度保留人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的修复再生功能，需要摆脱现有培养基体系，开发适合规模性产业化及临床应用的，全新的用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备工艺。
发明内容
针对现有技术所存在的问题，本发明的目的是提供一种用于修复的临床级含人脐带间充质干细胞复合因子的制备方法，所制备的人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉不含异体血清成分，培养基成分确定，并且人脐带间充质干细胞在使用该培养基体系培养时细胞增殖速度快，分泌生物活性物质能力强，极大降低生产成本，适合产业化大规模生产，可应用于临床伤口愈合和修复类的生物医药产品。
本发明的另一目的是提供一种用于修复的临床级含人脐带间充质干细胞复合因子冻干粉的制备方法。
本发明提出的用于修复的临床级含人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法，包括临床级干细胞完全培养基的制备、人脐带间充质干细胞的提取和培养、人脐带间充质干细胞复合因子的制备、人脐带间充质干细胞复合因子的冻干等步骤，具体如下：
步骤1、临床级干细胞完全培养基的制备：
(1)临床级干细胞基础培养基的制备(clinically relevant stem cells basalmedium，CRSCBM)：将临床级别的氨基酸溶液、维生素溶液和葡萄糖溶液混合，加入抗坏血酸至混合物中；所述CRSCBM的详细成分如下：
(2)自提血小板裂解物的制备：为了替代异种血清，我们使用血小板裂解物(platelet lysate,PL)，作为血清替代品配置完全培养基。收集经检测符合临床用血标准的机采血小板，混匀后用无菌生理盐水重悬离心，清洗残余杂质，清洗干净后调整血小板浓度，并将其置于-80℃过夜，第二日取出放于37℃水浴锅复融，并如此反复冻融3次，使其充分裂解并释放生长因子，取该冻融裂解物离心，去除细胞碎片等，最终所得上清即为血小板裂解物，最后将血小板裂解物于0.22um滤器除菌并分装，- 80℃储存。
(3)临床级干细胞完全培养基的制备：将自提血小板裂解物添加至CRSCBM 中，同时添加肝素钠，最终获得临床级干细胞完全培养基。
步骤2、脐带间充质干细胞的提取培养：取原代分离的人脐带间充质干细胞在所配置的临床级干细胞完全培养基中进行传代培养，取P3-P10代细胞，细胞培养至80％融合度时，弃去原培养基，用无菌生理盐水清洗3遍，更换为临床级干细胞基础培养基培养24～72h后，收集培养上清液。
步骤3、人脐带间充质干细胞复合因子的制备：将步骤2的培养上清收集后，用无菌生理盐水清洗1～3遍细胞，用含0.25％胰酶-EDTA消化细胞，无菌生理盐水重悬并离心，清洗3遍后调整细胞浓度，超声破碎仪裂解细胞后收集上清，最后将步骤2所得上清同细胞裂解上清以体积比2:1进行混匀、浓缩并除菌。
步骤4：人脐带间充质干细胞复合因子的冻干：人脐带间充质干细胞复合因子进行蛋白浓度测定，根据测定结果以及所需冻干粉净重调节赋性剂比例(赋性剂占总净重的质量比)，无菌生理盐水调整干细胞复合因子浓度为0.1mg/ml，0.22um滤膜过滤除菌，分装后冻干。
优选地，所述步骤1中，CRSCBM培养基中氨基酸溶液、维生素溶液和葡萄糖溶液的体积比为69:1:20。
优选地，所述步骤1中，抗坏血酸的加入浓度为100mg/L。
优选地，所述步骤1中，自提血小板裂解物的制备过程中，血小板经无菌生理盐水重悬后离心清洗，离心条件为室温条件下200g转速，离心10min。
优选地，所述步骤1中，调整的血小板浓度为0.5～2×109/ml。
优选地，所述步骤1中，冻融裂解物的离心条件为4℃下900g转速，离心30 min。
优选地，所述步骤1中，配置临床级干细胞完全培养基时，血小板裂解物以 5～10％浓度添加，使用血小板裂解物时需同时加入10U/ml肝素钠。
所配置的CRSCBM培养基含有的各化学成分均为国家已批准的可临床应用的产品；血小板裂解物制备过程中未添加任何异源成分。
为了使人脐带间充质干细胞产生更多的生物活性因子，本发明在培养细胞时采用“两阶段培养法”，第一阶段为常规培养，利用临床级干细胞完全培养基培养细胞，添加了血小板裂解物作为血清替代品，目的是为了提供细胞增殖所需的各种营养物质，保证细胞的正常生长；第二阶段为饥饿培养，利用CRSCBM培养基培养细胞，目的是为了刺激人脐带间充质干细胞分泌更多生物活性因子。
优选地，所述步骤3中，消化清洗后，调整的人脐带间充质干细胞浓度为0.5- 2×107/ml。
优选地，所述步骤3中，超声破碎仪裂解细胞的条件为，于4℃下，13000～15000 g转速，离心15～30min。
优选地，所述步骤3中，浓缩和除菌的步骤包括：先用截留分子量为50KD的滤膜进行过滤，随后更换截留分子量为3KD的滤膜对滤过液进行浓缩，浓缩倍数为 15～25倍，最后将浓缩液通过0.22um的滤膜进行除菌过滤，最终得到人脐带间充质干细胞复合因子。
本发明制备的人脐带间充质干细胞复合因子含有多种蛋白质和肽类，其生物活性的保持较为严苛，因此为了最大程度保留其生物功能性，我们采用了真空冷冻干燥技术进行处理。本发明的真空冷冻干燥技术条件均针对人脐带间充质干细胞复合因子的主要成分和生物特性而设定。
优选地，所述步骤4中，赋性剂的成分和含量为：甘露醇1％～6％，精氨酸 0.5％～3.5％，甘氨酸0.3％～3％，海藻糖0.5％～5％。
优选地，所述步骤4中，冻干条件为：温度-80℃～-10℃，真空度10～30Pa，时间 24～48h
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
①由于人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的成分主要是细胞培养基、细胞旁分泌因子、细胞内蛋白成分等，因此细胞培养基成分成为其临床应用的主要限制瓶颈，现常用的人脐带间充质干细胞基础培养基为DMEM/F12,DMEM以及α- MEM等，培养基中含有酚红、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)等，不适合进入人体，因此发明人通过对维生素、电解质、氨基酸、糖类等成分进行筛选，选择可支持人脐带间充质干细胞生长的的各种成分，所使用的维生素、电解质、氨基酸和糖类均为临床应用的注射液形式。本发明使用CRSCBM培养基对人脐带间充质干细胞进行饥饿阶段培养时，仍可维持细胞正常状态。
②根据细胞治疗国际协会(International Society for Cellular therapy,ISCT)针对间充质干细胞的鉴定要求，间充质干细胞在培养条件下具有塑料吸附性，因此在常规培养中，为了增加间充质干细胞的贴壁性，使其快速在二维培养条件下伸展增殖，传统的技术主要使用明胶、重组人纤维粘连蛋白或血清等进行培养皿的预包被，随后进行常规培养。本发明将一定浓度的重组人纤维粘连蛋白直接加入培养基中，获得了和预包被同样的效果，同时降低了污染风险，节省人力。
③为了提供人脐带间充质干细胞生长所需的营养物质，亦不引入异源血清成分，本发明用血小板裂解物替换血清或外源因子组合，通过反复冻融和超声裂解的方式使血小板释放内源性因子，随后高速离心则可去除裂解后的细胞残余结构，进一步降低免疫原性。除此之外，血小板是多种细胞生长因子的自然来源，其裂解物含有PDGF、EGF、FGF、TGF-β、VEGF等多种促细胞增殖和分泌功能的活性因子。因此，血小板裂解物应用于人脐带间充质干细胞的培养具有安全性及有效性，能够大规模用于临床级别的人脐带间充质干细胞相关产品的生产。
④本发明采用CRSCBM+PL培养基体系培养细胞，不仅对所培养细胞的状态(图 1)、表型(图2)、分化能力无影响(图4)，且细胞可维持稳定的PDT，并可在短期内收集到更多目的代次细胞，即可在更短时间内产生更多的人脐带间充质干细胞复合因子(图5)。
⑤为了短时间内获得更多的人脐带间充质干细胞复合因子，我们一方面通过培养细胞过程中扩大细胞的增殖数目，另一方面我们筛选适合的细胞代次，在培养人脐带间充质干细胞过程中能产生更多的生物活性物质。本发明通过多次实验发现，P3-P10代细胞通过饥饿培养72h能够获得更高浓度的生物活性蛋白。使用该技术方案生产能够最大程度获得人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉，避免细胞培养代次高，细胞饥饿时间过长或过短，而带来的细胞状态差、分泌能力降低、生产资源浪费和产能下降等情况。
附图说明
附图1为通过人脐带组织块贴壁法对间充质干细胞进行原代提取；其中图A是将脐带组织块置于α-MEM+10％FBS培养基体系中培养12d后的细胞形态照，可见组织块周围有大量细胞爬出，细胞形态为梭形，形态饱满；B是将脐带组织块置于 CRSCBM+5％PL培养基体系中培养12d后的细胞形态照，可见长梭形细胞沿组织块周边爬出，呈漩涡状集落式生长，两种培养基体系在进行原代培养时细胞均能正常生长增殖，说明CRSCBM+5％PL培养基体系在进行人脐带间充质干细胞原代培养时能够提供细胞生长、增殖过程中的营养支持，可替代α-MEM+10％FBS培养基体系。
附图2是人脐带间充质干细胞在CRSCBM+5％PL培养基体系中培养至P3代进行流式细胞表面标记物检测及鉴定，主要进行CD29，CD105，CD90，CD34及CD45等标记物的检测，可以看到在该培养基体系条件下进行培养，CD34、CD45不表达，CD29、 CD90、CD105表达。根据ISCT针对MSC鉴定标准：间充质干细胞表达CD105,CD73和CD90,不表达CD45,CD34,CD14/CD1lb,CD79/CD19,HLA-DR。因此证明该培养基体系所培养的细胞符合ISCT针对间充干细胞的鉴定标准，为人脐带间充质干细胞。
附图3是将在α-MEM+10％FBS培养基体系中培养的P4代细胞进行成脂诱导，诱导 2周后，A图为人脐带间充质干细胞在诱导培养基的作用下形成大量脂滴，B图为脂滴“Oil-Red”染色。
附图4是将在CRSCBM+5％PL培养基体系中培养的P4代细胞进行成脂诱导，诱导 2周后，A图为人脐带间充质干细胞在诱导培养基的作用下形成的呈葡萄串状的大量脂滴，B图为脂滴“Oil-Red”染色。说明经CRSCBM+5％PL培养基体系培养的人脐带间充质干细胞分化能力正常，可达到和常规培养基一致的效果。
附图5检测了在CRSCBM+5％PL以及α-MEM+10％FBS两种培养基体系中培养人脐带间充质干细胞的群体倍增时间(PDT)，可以看到CRSCBM+5％PL组，细胞从 P5～P10代，PDT稳定于2.15-2.77之间，而α-MEM+10％FBS组，细胞从P5～P10代， PDT则从2.89增长到4.24。稳定的PDT对间充质干细胞的扩增至关重要，因此该数据说明使用CRSCBM+PL培养基体系培养细胞可在短期内收集到更多目的代次细胞，即可在更短时间内产生更多的人脐带间充质干细胞复合因子。
附图6是在两种不同基础培养基体系中，对P6代人脐带间充质干细胞进行饥饿培养24-72h后，检测VEGF、HGF、b-FGF以及PDGF等生长因子的分泌水平，可以看到 CRSCBM基础培养基组的因子分泌水平同α-MEM组相比均呈增高趋势。说明CRSCBM 基础培养基可支持人脐带间充质干细胞在无血清的饥饿条件下生长，并可获得更多生长因子。
附图7为使用不同浓度的人脐带间充质干细胞复合因子添加至人成纤维细胞培养基中培养72h后，检测人成纤维细胞的增殖情况，图A为人成纤维细胞培养基的空白对照组，图B为培养基含有400ug/ml人脐带间充质干细胞复合因子的人成纤维细胞，可以看到图B细胞的数量明显多于图A，同时MTT结果显示，人成纤维细胞的增殖情况和人脐带间充质干细胞复合因子呈浓度依赖趋势。说明人脐带间充质干细胞复合因子可起到促进人成纤维细胞增殖的作用。
附图8为取1×103cells/孔人成纤维细胞接种至96孔板，常规培养24h后更换培养基为含0、40ug/ml、200ug/ml以及400ug/ml人脐带间充质干细胞复合因子的 DMEM完全培养基，培养72h后利用CCK-8法检测人成纤维细胞增殖情况。
具体实施方式
(一)临床级干细胞完全培养基的制备
(1)临床级干细胞基础培养基的制备：将临床应用的各氨基酸溶液、维生素溶液和葡萄糖溶液混合，混合的体积比为69:1:20，混匀后加入浓度为100 mg/L抗坏血酸。下表为CRSCBM的详细成分。
表1 CRSCBM的详细成分表
(2)自提血小板裂解物的制备：收集经检测符合临床用血标准的机采血小板，混匀后用无菌生理盐水重悬，于室温条件下200g转速，离心10min，清洗残余杂质，清洗干净后调整血小板浓度为1×109/ml，并将其置于-80℃过夜，第二日取出放于37℃水浴锅复融，并如此操作反复冻融3次，使其充分裂解并释放生长因子，取该冻融裂解物4℃下900g转速，离心30min，去除细胞碎片等，最终所得上清即为血小板裂解物，最后将血小板裂解物于0.22um滤器除菌并分装，-80℃储存。
(3)临床级干细胞完全培养基的制备：将自提血小板裂解物以5％浓度添加至CRSCBM中，同时添加10U/ml肝素钠，混匀后最终获得临床级干细胞完全培养基。
(二)人脐带间充质干细胞的提取培养：
(1)人脐带间充质干细胞的提取：脐带组织取自足月健康新生儿，将脐带组织于75％酒精消毒30s后，小心剥离华通氏胶，并将其剪切成0.5cm3大小的组织块，在室温，250g转速条件下离心5min，在含有5％PL的 CRSCBM培养基中于37℃、5％CO 2的培养箱中常规培养。每隔3d小心更换培养基，约12～14d后去除脐带组织，贴壁细胞常规培养。
(2)贴壁细胞融合度到达80％时使用0.25％胰酶-EDTA消化细胞并传代。
(3)取P3-P10代细胞，细胞培养至80％融合度时，弃去原培养基，用无菌生理盐水清洗3遍，更换为CRSCBM培养基培养24～72h后，收集培养上清液
实验结果：如图1，α-MEM+10％FBS组细胞在培养12d后，可见组织块周围有大量细胞爬出，细胞形态为梭形，形态饱满；CRSCBM+5％PL组细胞培养12d 后，可见长梭形细胞沿组织块周边爬出，呈漩涡状集落式生长。两种培养基体系在进行原代培养时细胞均能正常生长增殖，说明CRSCBM+5％PL培养基体系在进行脐带间充质干细胞原代培养时，能够提供细胞生长、增殖过程中的营养支持，可替代α-MEM+10％FBS培养基体系。
(三)人脐带间充质干细胞的细胞表型鉴定
取CRSCBM/PL培养基体系培养的P3代人脐带间充质干细胞，调整细胞数为1 ×106，分别加入单克隆抗体CD34、CD29、CD90、CD45以及CD105，4℃避光反应 20min，PBS清洗2次后，于4℃条件下1000r/min转速离心5min，弃上清后加入400ul冷PBS吹打混匀,流式细胞仪检测。
实验结果：如图2，该培养基体系下，CD34、CD45不表达，CD29、CD90、 CD105表达。证明该培养基体系所培养的细胞符合ISCT针对间充干细胞的鉴定标准，为人脐带间充质干细胞。
(四)人脐带间充质干细胞的分化鉴定
分别将α-MEM+10％FBS组和CRSCBM+5％PL组的P4代细胞培养液更换为成脂诱导培养基，于37℃、5％CO 2的培养箱中常规培养，每3d更换一次成脂诱导培养基，诱导14d后进行镜下拍照并进行“Oil-Red”染色。
成脂诱导培养基组成：α-MEM为基础培养基、体积比10％的FBS、地塞米松 0.8ug/ml、IBMX 0.5mg/ml、吲哚美辛0.05mg/ml以及胰岛素0.04mg/ml。
实验结果：图3是α-MEM+10％FBS组P4代细胞诱导2周后，可见形成的大量脂滴，并可被“Oil-Red”染色。图4是CRSCBM+5％PL组P4代细胞诱导2周后，可见形成呈葡萄串状的大量脂滴，且脂滴可被“Oil-Red”染色。说明经 CRSCBM+5％PL培养基体系培养的人脐带间充质干细胞分化能力正常，所培养细胞的分化能力可达到和常规培养基一致的效果。
(五)人脐带间充质干细胞倍增时间检测
分别将α-MEM+10％FBS组和CRSCBM+5％PL组的P2代细胞以3×104个细胞数接种至6孔板中，于37℃、5％CO 2的培养箱中常规培养，当细胞达到90％融合度时，以1：2比例传代，传代至P10代次时终止培养。每次传代培养时，使用细胞计数器计数所收获的细胞数量。
以公式X＝t*[lg2/(lg(q2)-lg(q1)]来计算PDT和累积细胞量，其中T为细胞培养时间；q1为细胞起始量；q2为细胞最终数量。
实验结果：如图5可以看到CRSCBM+5％PL组，细胞从P5～P10代，PDT稳定于2.15-2.77之间，而α-MEM+10％FBS组，细胞从P5～P10代，PDT则从2.89增长到4.24。稳定的PDT对间充质干细胞的扩增至关重要，因此该数据说明使用CRSCBM+PL培养基体系培养细胞可在短期内收集到更多目的代次细胞，即可在更短时间内产生更多的人脐带间充质干细胞复合因子。
(六)人脐带间充质干细胞分泌能力检测
分别收集步骤(二)中P6代经过饥饿处理72h的CRSCBM组和α-MEM组细胞上清液，根据试剂盒说明进行VEGF、HGF、b-FGF以及PDGF等生长因子的分泌水平检测。
实验结果：如图6所示，CRSCBM基础培养基组的因子分泌水平同α-MEM组相比均呈增高趋势。说明CRSCBM基础培养基可支持人脐带间充质干细胞在无血清的饥饿条件下生长，并可获得更多生长因子。
(七)人脐带间充质干细胞复合因子的制备
(1)人脐带间充质干细胞的裂解：将步骤二的培养上清收集后，用无菌生理盐水清洗3遍细胞，用含0.25％胰酶-EDTA消化细胞，无菌生理盐水重悬并离心，清洗3遍后调整细胞浓度为1×107/ml，于4℃，15000g转速，离心30min后收集上清，最后将步骤二所得上清同细胞裂解上清以体积比2:1进行混匀。
(2)浓缩及除菌：将上述制备的混合上清液先用截留分子量为50KD的滤膜进行过滤，随后更换截留分子量为3KD的滤膜对滤过液进行浓缩，浓缩倍数为20倍，最后将浓缩液通过0.22um的滤膜进行除菌过滤，最终得到人脐带间充质干细胞复合因子。
(八)人脐带间充质干细胞复合因子的冻干
将获得的人脐带间充质干细胞复合因子进行蛋白浓度测定后，根据测定结果以及所需冻干粉净重调节赋性剂比例(赋性剂占总净重的质量比)，其中：甘露醇 6％，精氨酸1％，甘氨酸0.3％，海藻糖0.5％。无菌生理盐水调整干细胞复合因子浓度为0.1mg/ml，0.22um滤膜过滤除菌，以规格为2ml/支分装冻干，其中冻干条件为：温度-80℃～-10℃，真空度10～30Pa，时间24～48h。冻干后即可得到浓度为 0.2mg/支的人脐带间充质干细胞复合因子冻干粉。
(九)人脐带间充质干细胞复合因子冻干粉理化及微生物检测
随机取冻干后的人脐带间充质干细胞复合因子冻干粉进行外观、复溶性、含水量、PH、蛋白浓度、微生物及内毒素等项目的检测结果见表2。
表2实验结果
(十)人脐带间充质干细胞复合因子对人成纤维细胞增殖的影响
取1×103cells/孔人成纤维细胞接种至96孔板，常规培养24h后更换培养基为含0、40ug/ml、200ug/ml以及400ug/ml人脐带间充质干细胞复合因子的DMEM 完全培养基，培养72h后利用CCK-8法检测人成纤维细胞增殖情况。
实验结果：如图7所示，图A为人成纤维细胞培养基的空白对照组，图B为培养基含有400ug/ml人脐带间充质干细胞复合因子的人成纤维细胞，可以看到图B 细胞的数量明显多于A图，同时MTT结果显示，人成纤维细胞的增殖情况和人脐带间充质干细胞复合因子的含量呈浓度依赖趋势，说明人脐带间充质干细胞复合因子可起到促进人成纤维细胞增殖的作用。
Claims (10)
1.一种用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1)临床级干细胞完全培养基的制备：
(a)临床级干细胞基础培养基的制备(clinically relevant stem cells basalmedium，CRSCBM)：将临床应用的氨基酸溶液、维生素溶液和葡萄糖溶液混合，加入抗坏血酸至混合物中；
(b)自提血小板裂解物的制备：使用血小板裂解物(platelet lysate,PL)，作为血清替代品配置完全培养基，收集经检测符合临床用血标准的机采血小板，混匀后用无菌生理盐水重悬离心，清洗残余杂质，清洗干净后调整血小板浓度，并将其置于‐80℃过夜，第二日取出放于37℃水浴锅复融，并如此反复冻融3次，使其充分裂解并释放生长因子，取该冻融裂解物离心，去除细胞碎片等，最终所得上清即为血小板裂解物，最后将血小板裂解物于0.22um滤器除菌并分装，‐80℃储存；
(c)临床级干细胞完全培养基的制备：将自提血小板裂解物添加至CRSCBM中，同时添加肝素钠，最终获得临床级干细胞完全培养基；
步骤2)脐带间充质干细胞的提取培养：取原代分离的人脐带间充质干细胞在所配置的临床级干细胞完全培养基中进行传代培养，取P3‐P10代细胞，细胞培养至80％融合度时，弃去原培养基，用无菌生理盐水清洗3遍，更换为临床级干细胞基础培养基培养24～72h后，收集培养上清液；
步骤3)人脐带间充质干细胞复合因子的制备：将步骤二的培养上清收集后，用无菌生理盐水清洗1～3遍细胞，用含0.25％胰酶‐EDTA消化细胞，无菌生理盐水重悬并离心，清洗3遍后调整细胞浓度，超声破碎仪裂解细胞后收集上清，最后将步骤2所得上清同细胞裂解上清以体积比2:1进行混匀、浓缩并除菌，最终得到人脐带间充质干细胞复合因子。
2.如权利要求1所述的用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，CRSCBM培养基中氨基酸溶液、维生素溶液和葡萄糖溶液的体积比为69:1:20；抗坏血酸的加入浓度为100mg/L。
3.如权利要求1所述的用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，自提血小板裂解物的制备过程中，血小板经无菌生理盐水重悬后离心清洗，离心条件为室温条件下200g转速，离心10min。
4.如权利要求1所述的用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，调整的血小板浓度为0.5～2×109/ml；冻融裂解物的离心条件为4℃下900g转速，离心30min。
5.如权利要求1所述的用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，配置临床级干细胞完全培养基时，血小板裂解物以5～10％浓度添加，使用自提血小板裂解物时需同时加入10U/ml肝素钠。
6.如权利要求1所述的用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，消化清洗后，调整的人脐带间充质干细胞浓度为0.5‐2×107/ml；超声破碎仪裂解细胞的条件为，于4℃下，13000～15000g转速，离心15～30min。
7.如权利要求1所述的用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子及冻干粉的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，浓缩和除菌的步骤包括：先用截留分子量为50KD的滤膜进行过滤，随后更换截留分子量为3KD的滤膜对滤过液进行浓缩，浓缩倍数为15～25倍，最后将浓缩液通过0.22um的滤膜进行除菌过滤，最终得到人脐带间充质干细胞复合因子。
8.一种用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子冻干粉的制备方法，其特征在于，人脐带间充质干细胞复合因子进行蛋白浓度测定，根据测定结果以及所需冻干粉净重调节赋性剂比例，无菌生理盐水调整干细胞复合因子浓度为0.1mg/ml，0.22um滤膜过滤除菌，分装后冻干。
9.如权利要求8所述的用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子冻干粉的制备方法，其特征在于，赋性剂的成分和含量为：甘露醇1％～6％，精氨酸0.5％～3.5％，甘氨酸0.3％～3％，海藻糖0.5％～5％。
10.如权利要求8所述的用于修复的临床级人脐带间充质干细胞复合因子冻干粉的制备方法，其特征在于，冻干条件为：温度‐80℃～‐10℃，真空度10～30Pa，时间24～48h。
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Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109010369A (zh) * | 2018-09-27 | 2018-12-18 | 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 | 一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法 |
| CN109859803A (zh) * | 2019-02-15 | 2019-06-07 | 和携科技(北京)有限公司 | 一种用于干细胞制剂的生产存储管理系统及方法 |
| CN110269833A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-09-24 | 湖南丰晖生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞制剂及其制备方法和应用 |
| CN110804607A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-02-18 | 深圳市润科生物科技有限公司 | 一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法 |
| CN111228311A (zh) * | 2020-03-02 | 2020-06-05 | 陕西朗泰生物科技有限公司 | 保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法 |
| CN111759865A (zh) * | 2020-07-10 | 2020-10-13 | 浙江中医药大学 | 血小板裂解产物促进脐带干细胞活化并协同干预膝骨性关节炎的方法 |
| CN111920828A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-11-13 | 西安世越再生医学研究中心有限公司 | 基于脐带间充质干细胞用于毛发再生的冻干粉、制备方法、生发营养液及毛发再生方法 |
| CN113583950A (zh) * | 2021-08-06 | 2021-11-02 | 合肥滴碧云生物科技有限公司 | 一种制备干细胞活性因子的方法及其应用 |
| CN113736730A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-12-03 | 天晴干细胞股份有限公司 | 一种培养脐带组织间充质细胞的方法 |
| CN113730439A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-12-03 | 陕西中鸿瑞康健康管理有限公司 | 能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉及其制备方法和应用 |
| CN114075543A (zh) * | 2021-11-17 | 2022-02-22 | 章毅 | 制备干细胞凝胶的方法 |
| CN115125193A (zh) * | 2021-07-09 | 2022-09-30 | 广州赛莱拉生物基因工程有限公司 | 一种动物脐带外泌体及其提取方法和应用 |
| CN115737523A (zh) * | 2022-11-28 | 2023-03-07 | 深圳市合一康生物科技股份有限公司 | 基于细胞复合因子的女性抑菌修复护理液 |
| CN115786258A (zh) * | 2023-02-01 | 2023-03-14 | 昆明时光肌生物技术有限公司 | 一种细胞培养基添加物制备方法 |
| CN117165520A (zh) * | 2023-09-08 | 2023-12-05 | 小草生物科技有限公司 | 间充质干细胞外泌体、凝胶制剂及在表皮创伤和祛斑中的应用 |
| CN117645972A (zh) * | 2023-11-23 | 2024-03-05 | 新疆赛尔托马斯生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞修复因子制备方法 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102250838A (zh) * | 2011-06-04 | 2011-11-23 | 内蒙古医学院 | 临床及实验用无异种蛋白干细胞培养基添加物及用途 |
| CN102686725A (zh) * | 2009-12-23 | 2012-09-19 | 埃普塞斯有限责任两合公司 | 用于cd34-阴性干细胞的扩增培养基 |
| CN103702674A (zh) * | 2011-06-27 | 2014-04-02 | 爱默蕾大学 | 血小板裂解物的组合物、用途和制备 |
| CN104450613A (zh) * | 2014-12-05 | 2015-03-25 | 黄相杰 | 一种利于自体骨髓间充质干细胞在体外培养的细胞培养基 |
| CN105779381A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-07-20 | 王凌仪 | 临床治疗级细胞治疗用人脐带来源（WJ-MSCs）规模化细胞外基质筛选三维附着制备方法 |
| CN106367389A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-02-01 | 东莞自然衡健康科技有限公司 | 一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用 |
| CN106381284A (zh) * | 2016-09-12 | 2017-02-08 | 博雅干细胞科技有限公司 | 制备干细胞活性因子的方法 |
| CN106566802A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-04-19 | 山东景源生物科技有限公司 | 一种脐血间充质干细胞培养试剂盒的制备方法 |
| CN106591230A (zh) * | 2017-02-09 | 2017-04-26 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 人脐带间充质干细胞培养液及其培养方法 |
| WO2017132358A1 (en) * | 2016-01-26 | 2017-08-03 | Kansas State University Research Foundation | Methods for isolation and expansion of umbilical cord mesenchymal stem cells |
| CN107174590A (zh) * | 2017-05-17 | 2017-09-19 | 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 | 用于小型宠物的含高浓度间人充质干细胞提取物的修复喷雾剂及其制备方法 |
| CN108159078A (zh) * | 2018-01-26 | 2018-06-15 | 深圳市新仑生物科技有限公司 | 一种细胞生长因子冻干粉、制备方法及应用 |
-
2018
- 2018-07-04 CN CN201810727332.8A patent/CN108823156A/zh active Pending
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102686725A (zh) * | 2009-12-23 | 2012-09-19 | 埃普塞斯有限责任两合公司 | 用于cd34-阴性干细胞的扩增培养基 |
| CN102250838A (zh) * | 2011-06-04 | 2011-11-23 | 内蒙古医学院 | 临床及实验用无异种蛋白干细胞培养基添加物及用途 |
| CN103702674A (zh) * | 2011-06-27 | 2014-04-02 | 爱默蕾大学 | 血小板裂解物的组合物、用途和制备 |
| CN104450613A (zh) * | 2014-12-05 | 2015-03-25 | 黄相杰 | 一种利于自体骨髓间充质干细胞在体外培养的细胞培养基 |
| WO2017132358A1 (en) * | 2016-01-26 | 2017-08-03 | Kansas State University Research Foundation | Methods for isolation and expansion of umbilical cord mesenchymal stem cells |
| CN105779381A (zh) * | 2016-03-30 | 2016-07-20 | 王凌仪 | 临床治疗级细胞治疗用人脐带来源（WJ-MSCs）规模化细胞外基质筛选三维附着制备方法 |
| CN106566802A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-04-19 | 山东景源生物科技有限公司 | 一种脐血间充质干细胞培养试剂盒的制备方法 |
| CN106381284A (zh) * | 2016-09-12 | 2017-02-08 | 博雅干细胞科技有限公司 | 制备干细胞活性因子的方法 |
| CN106367389A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-02-01 | 东莞自然衡健康科技有限公司 | 一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法及应用 |
| CN106591230A (zh) * | 2017-02-09 | 2017-04-26 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 人脐带间充质干细胞培养液及其培养方法 |
| CN107174590A (zh) * | 2017-05-17 | 2017-09-19 | 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 | 用于小型宠物的含高浓度间人充质干细胞提取物的修复喷雾剂及其制备方法 |
| CN108159078A (zh) * | 2018-01-26 | 2018-06-15 | 深圳市新仑生物科技有限公司 | 一种细胞生长因子冻干粉、制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 吴迪 等: "无动物源性成分培养基体外扩增的间充质干细胞" * |
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109010369A (zh) * | 2018-09-27 | 2018-12-18 | 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 | 一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法 |
| CN109859803A (zh) * | 2019-02-15 | 2019-06-07 | 和携科技(北京)有限公司 | 一种用于干细胞制剂的生产存储管理系统及方法 |
| CN110269833A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-09-24 | 湖南丰晖生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞制剂及其制备方法和应用 |
| CN110804607A (zh) * | 2019-11-18 | 2020-02-18 | 深圳市润科生物科技有限公司 | 一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法 |
| CN110804607B (zh) * | 2019-11-18 | 2021-09-21 | 深圳市润科生物科技有限公司 | 一种高浓度人源间充质干细胞裂解液的制备方法 |
| CN111228311A (zh) * | 2020-03-02 | 2020-06-05 | 陕西朗泰生物科技有限公司 | 保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法 |
| CN111920828A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-11-13 | 西安世越再生医学研究中心有限公司 | 基于脐带间充质干细胞用于毛发再生的冻干粉、制备方法、生发营养液及毛发再生方法 |
| CN111759865A (zh) * | 2020-07-10 | 2020-10-13 | 浙江中医药大学 | 血小板裂解产物促进脐带干细胞活化并协同干预膝骨性关节炎的方法 |
| CN115125193A (zh) * | 2021-07-09 | 2022-09-30 | 广州赛莱拉生物基因工程有限公司 | 一种动物脐带外泌体及其提取方法和应用 |
| CN115125193B (zh) * | 2021-07-09 | 2024-04-26 | 广州赛莱拉生物基因工程有限公司 | 一种动物脐带提取物及其提取方法和应用 |
| CN113583950A (zh) * | 2021-08-06 | 2021-11-02 | 合肥滴碧云生物科技有限公司 | 一种制备干细胞活性因子的方法及其应用 |
| CN113736730A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-12-03 | 天晴干细胞股份有限公司 | 一种培养脐带组织间充质细胞的方法 |
| CN113730439A (zh) * | 2021-09-09 | 2021-12-03 | 陕西中鸿瑞康健康管理有限公司 | 能降低甘油三酯的干细胞因子冻干粉及其制备方法和应用 |
| CN114075543A (zh) * | 2021-11-17 | 2022-02-22 | 章毅 | 制备干细胞凝胶的方法 |
| CN115737523A (zh) * | 2022-11-28 | 2023-03-07 | 深圳市合一康生物科技股份有限公司 | 基于细胞复合因子的女性抑菌修复护理液 |
| CN115786258A (zh) * | 2023-02-01 | 2023-03-14 | 昆明时光肌生物技术有限公司 | 一种细胞培养基添加物制备方法 |
| CN117165520A (zh) * | 2023-09-08 | 2023-12-05 | 小草生物科技有限公司 | 间充质干细胞外泌体、凝胶制剂及在表皮创伤和祛斑中的应用 |
| CN117165520B (zh) * | 2023-09-08 | 2024-04-26 | 天津科融中健生物科技有限责任公司 | 间充质干细胞外泌体、凝胶制剂及在表皮创伤和祛斑中的应用 |
| CN117645972A (zh) * | 2023-11-23 | 2024-03-05 | 新疆赛尔托马斯生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞修复因子制备方法 |
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