CN111228311A - 保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法，该方法包括以下步骤：1)人脂肪间充质干细胞原代提取和传代培养；2)人脂肪间充质干细胞扩增预处理；3)人脂肪间充质干细胞特异诱导预处理；4)人脂肪间充质干细胞旁分泌细胞因子和生长因子的收集和浓缩。本发明通过对人脂肪间充质干细胞毛囊再生方向的特异性刺激和预处理，使之分泌大量保护和促进毛发生长的细胞因子及生长因子，即干细胞生发因子，使其可应用于AGA的防脱生发治疗。

Description

保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法及应用。

背景技术

雄激素性脱发(androgenetic alopecia.AGA)，又称为脂溢性脱发，是病理性脱发的主要类型，也是临床上最常见的脱发类型。AGA的主要表现为进行性毛发稀疏与毛囊萎缩，并可伴头皮油腻、瘙痒和皮屑过多。流行病学数据显示，我国男性AGA总发病率约为20％，18～30岁男性患病率约为3％，50岁以上男性患病率超过35％。随着生活节奏的加快与压力的增加，AGA患病率呈现逐年升高，发病年龄逐步年轻化的趋势。因AGA直接影响外形的美观，所以患者群体不仅数量巨大，治疗需求也极其迫切。

毛发生长过程的更新和维持由毛囊干细胞驱动，并随干细胞在激活与静止状态来回切换而呈现周期性循环，包括生长期、退行期和休止期共3个阶段。研究表明AGA患者毛囊生长期/休止期比例较正常下降，毛囊生长期缩短，休止期延长，并伴有毛囊萎缩。由于生长期变短，使毛发变细变短，形成易于脱落的毳毛，甚至由于毛发无法生长到皮肤表面便进入了退行期(介于生长期与休止期之间)而脱落，从而表现为无毛发生长。目前针对AGA的治疗方式众多，如药物治疗，常用药物包括口服药物非那雄胺、外用药物米诺地尔等，但使用效果尚不理想。毛发移植治疗AGA是目前见效较快、疗效持久，较为理想的治疗方法。自体毛发移植手术过程包括供区全层头皮组织的切取、毛胚制备和毛胚移植。但该疗法影响移植毛发效果的因素众多，如患者脱发状况及供区毛发资源、精神紧张度、手术医师审美观、分离毛囊及种植操作人员的手术技巧等。因此需要治疗医师具备较高的素质和临床经验，而且术后往往受发区头发外观不自然，对于本身头发比较稀少的AGA患者，手术更难以实施，对于脱发面积较大的患者更需要多次毛发移植，将给患者带来更大的身体和精神压力。因此基于以上治疗现状和对AGA发病机制研究的深入，开发针对AGA病因治疗的更安全、有效、好操作的治疗方案，成为现在脱发市场的研究热点。

大量研究发现，毛囊的生长受多种细胞因子调控，尤其是血管内皮细胞生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子5(FGF-5)、角质形成细胞生长因子(KGF)、转化生长因子β(TGF-β)、缺氧诱导因子(HIF-1α)和血管生成素(ANG)等。其中，血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子、肝细胞生长因子等可阻止毛囊退行化，维持并促进毛囊生长；成纤维细胞生长因子5、转化生长因子β等会促进毛囊向退行期转化，使毛发变细减少。基于以上发现，毛发组织工程和干细胞疗法成为治疗AGA的新方案。脂肪间充质干细胞(Adipose derived stem cells,ASC)是再生医学领域的理想种子细胞，它易于获取、具有多能性、可分化各种细胞系，并具有强大旁分泌能力。由脂肪间充质干细胞分泌的的各种细胞因子已被报道有刺激毛囊和保护及诱导毛发生长的作用。因此基于开发可行和有效的脂肪间充质干细胞旁分泌因子的制备方法和相关应用，是本发明探索和期望解决的主要问题。

人脂肪间充质干细胞旁分泌因子和毛囊再生方向的专利检索和调研发现，2016年9月，徐佳洁等人申请了有关专利(中国专利申请号CN201610833262.5)，该发明通过培养人脂肪间充质干细胞，收集其分泌的生物活性因子制成细胞营养液，主要目的为促进毛发再生。但发明人在脂肪间充质干细胞培养过程仅采用UVB辐照和成纤维细胞条件培养基等手段对细胞预处理，该方法的缺点一方面是生产过程中UVB辐照操作繁琐，细胞对辐照剂量要求精细，可能增加细胞污染及细胞损伤风险；另一方面以上手段的预处理并未针对性诱导人脂肪间充质干细胞产生促进或者修复毛囊再生的细胞因子和生长因子。2019年杨永利申请了相关专利(中国专利申请号CN201910691974.1)，发明人通过将脂肪干细胞因子和毛囊干细胞因子混合，制备复合细胞因子浓缩液，主要用于改善头皮健康、促进毛发再生。该发明在培养阶段并未对细胞进行任何刺激或预处理，因此细胞的旁分泌能力并未发挥最大，生发效果还有待提高。

因此，针对目前已有技术的缺陷，需要进一步改良和提升现有人脂肪间充质干细胞的细胞因子和生长因子制备体系，开发适合规模性产业化及临床应用的保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子制备工艺。

通过专利检索，目前尚未有可临床应用的，特异性诱导人脂肪间充质干细胞产生促毛发生长的细胞因子和生长因子专利。

发明内容

针对现有技术所存在不足，本发明的目的是提供一种保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法，通过对人脂肪间充质干细胞毛囊再生方向的特异性刺激和预处理，使之分泌大量保护和促进毛发生长的细胞因子及生长因子，即干细胞生发因子，使其可应用于AGA的防脱生发治疗。

本发明的技术解决方案是：本发明为一种保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法，其特殊在之处在于：该方法包括以下步骤：

1)人脂肪间充质干细胞原代提取和传代培养：

1.1)人脂肪间充质干细胞原代提取：将抽取的脂肪颗粒用PBS清洗2～3遍，加入0.1％～0.3％Ⅰ型胶原酶，于37℃摇床中，220r/min，20～35min消化，无菌滤网过滤后，取滤过液体于800～1000r/min离心机中离心5～10min，PBS清洗2遍，于无血清培养基MSC Xeno-Free SFM(Corning Cat.No 88-600-CV)中重悬并接种，孵箱中常规培养；

1.2)人脂肪间充质干细胞传代培养：细胞融合率达到80％时，以1:3比例传代，孵箱常规传代培养；

2)人脂肪间充质干细胞扩增预处理：

2.1)配置扩增培养基：将临床级抗坏血酸溶解至无血清培养基MSC Xeno-FreeSFM，混匀后于4℃冰箱保存；

2.2)人脂肪间充质干细胞扩增预处理：取步骤1.2)所培养的人脂肪间充质干细胞，PBS清洗后，0.25％胰酶-EDTA消化细胞，于扩增培养基中重悬并接种，孵箱中常规培养；

3)人脂肪间充质干细胞特异诱导预处理：

3.1)配置特异诱导培养基：将米诺地尔溶解至无血清培养基MSC Xeno-Free SFM，混匀后于4℃冰箱保存；

3.2)将步骤2.2)的人脂肪间充质干细胞消化后传代接种，待细胞贴壁后更换培养基为特异诱导培养基，于孵箱中常规培养，培养期间不换液；

4)人脂肪间充质干细胞旁分泌细胞因子和生长因子的收集和浓缩：将步骤3.2)所得上清收集，用滤膜进行首次过滤，随后更换截留分子量为1～3KD的滤膜对滤过液进行浓缩，浓缩倍数为15～25倍，最后将浓缩液通过0.22um的滤膜除菌，最后所得即为干细胞生发因子。

为了在短时间内获得更多促进毛发生长的细胞因子及生长因子，本发明在培养细胞时分别进行扩增处理和特异诱导刺激。在扩增培养期，通过适当浓度和时间的抗坏血酸处理，目的是为了增强细胞增殖能力，在同样的培养时间内获得比普通培养更多的细胞数量。在特异诱导刺激期，利用米诺地尔处理细胞，使之分泌能够促进毛囊真皮乳头细胞的增殖及毛发生长的各种细胞因子和生长因子。米诺地尔是目前市面生发药剂的主流产品之一，通过影响头皮的毛囊真皮乳头细胞和上皮细胞直接促进毛发生长，但应用中也存在效果不理想的情况，因此本发明通过用米诺地尔预处理人脂肪间充质干细胞，诱导人脂肪间充质干细胞旁分泌出能影响皮肤毛发干细胞生态位的多种生物活性因子，间接促进毛发生长。

优选的，步骤2.1)中，抗坏血酸浓度为10～200μM。

优选的，步骤2.2)中，人脂肪间充质干细胞接种密度为1～2×104/ml，人脂肪间充质干细胞培养时间为36h。

优选的，步骤3.1)中，米诺地尔的浓度为0.1～20μM。

优选的，步骤3.2)中，人脂肪间充质干细胞消化后以0.5～2×104/ml传代接种，脂肪间充质干细胞在特异诱导培养基中的培养时间为24～96h。

优选的，步骤4)中，首次截留分子量为75～125KD的滤膜。

优选的，步骤4)之后还包括步骤5)人干细胞生发因子冻干：对步骤4)所得的干细胞生发因子进行蛋白浓度测定，并根据测定结果调节赋性剂中甘露醇、精氨酸、海藻糖各成分比例(质量比)，无菌注射用水调整干细胞生发因子浓度为0.1mg/ml，0.22um滤膜过滤后以2ml/支分装冻干，冻干后即可得到浓度为0.2mg/支的干细胞生发因子冻干粉。

优选的，步骤5)中的各成分比例为甘露醇3～8％，精氨酸0.1～1％，海藻糖0.1～0.8％。

优选的，步骤5)中冻干条件为：温度-80℃，真空度30Pa，时间24～48h。

优选的，步骤1.2)之后还包括步骤1.3)人脂肪间充质干细胞成脂诱导：

1.3.1)配置成脂诱导培养基：在DMEM基础培养基中添加体积分数为10％胎牛血清、5mg/L胰岛素、1mmol/L地塞米松、50mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、40mmol/L吲哚美辛，4℃保存。

1.3.2)人脂肪间充质干细胞成脂诱导：取对数生长期P3代细胞，以1×105/ml密度接种细胞，待细胞生长至70％～80％融合后，将培养基更换为成脂诱导培养基，连续培养14-21天；

1.3.3)油红O检测：细胞出现较大脂滴后，PBS清洗2次，4％福尔马林固定5min，取0.5％油红按照3:2比例用水稀释，0.45um滤膜过滤后加入细胞中孵育1h，清洗2遍后观察。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子其主要成分为细胞培养基和人脂肪间充质干细胞旁分泌因子等，在临床应用时为保证安全性，细胞培养基需成分明确且不含异种蛋白、血清等组分。通过专利检索，目前和干细胞旁分泌因子相关的生发专利均是使用普通实验用细胞培养基如DMEM、α-MEM等，该类培养基在培养过程中，为提供细胞生长所需的营养以及避免培养过程中污染的风险，需在培养基中加入血清成分(常用小牛血清、胎牛血清等)和抗生素，而以上成分会带来免疫原性、引入病毒风险和抗生素副作用风险。因此本发明使用无血清培养基MSC Xeno-Free SFM作为人脂肪间充质干细胞培养基础培养基，无血清培养基MSC Xeno-Free SFM化学成分明确，不含血清及其他任何人源以外的成分，亦不含有酚红和抗生素，这样做的益处是提升产品在临床应用的安全性，避免免疫原性、病毒和抗生素的副作用风险。

为了在短时间内提高细胞增殖效率，缩短培养时间，本发明在人脂肪间充质干细胞培养过程中引入扩增培养环节，通过在培养基中添加一定浓度的抗坏血酸，刺激细胞增殖，提高细胞存活率，缩短培养周期，继而间接提升旁分泌因子的得率和产能。抗坏血酸是人体必需的微量元素，在很多生物合成过程中充当辅助因子，可达到与其它活化剂、活化手段相当的刺激作用，并且比添加其他生长因子在生理上更安全和便宜，也比使用紫外线照射刺激细胞生长操作更简易和更低的污染风险。因此本发明中，应用抗坏血酸预处理干细胞的益处主要有：同紫外线照射法相比，操作简易，污染风险大大减少；同添加其他生长因子相比，生产成本更低且扩增效果一致，性价比更高；抗坏血酸临床安全性高，可添加至细胞培养基中作为扩增培养基使用。

人脂肪间充质干细胞被认为是皮肤毛发干细胞生态位的一部分，它能驱动毛发的周期循环。米诺地尔在临床中可通过刺激毛囊真皮乳头细胞和上皮细胞直接促进毛发生长，因此本发明通过利用米诺地尔预处理人脂肪间充质干细胞，诱导其产生促进毛囊真皮乳头细胞和毛发生长的特异生长因子和细胞因子。

附图说明

图1为本发明方法步骤1)中收集的脂肪颗粒，经过消化离心清洗后分层的结果；

图2为本发明方法步骤1)中的细胞在培养7d后的结果示意图；

图3为本发明方法步骤1)中人脂肪间充质干细胞成脂诱导14天后的结果示意图；

图4为本发明方法步骤2)中常规培养基组(空白对照组)、经抗坏血酸的扩增培养组、UVB处理组分别培养24、48和72h后的ASC细胞增殖情况；

图5为四种处理方式对人毛乳头细胞的增殖作用；

图6为使用本发明制备的干细胞生发因子冻干粉6个月的男性雄激素性脱发患者，从左至右分别为使用前、使用3个月及使用6个月后效果；

图7为使用本发明制备的干细胞生发因子冻干粉6个月的男性雄激素性脱发患者，从左至右分别为使用前、使用6个月后效果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明的具体实施例如下：

1)人脂肪间充质干细胞原代提取和传代培养：

1.1)人脂肪间充质干细胞原代提取：将抽取的脂肪颗粒用PBS清洗3遍，加入0.15％Ⅰ型胶原酶，于37℃摇床中，220r/min，30min消化，无菌滤网过滤后，取滤过液体于800r/min离心机中离心5min，PBS清洗2遍，于无血清培养基MSC Xeno-Free SFM(CorningCat.No 88-600-CV)中重悬并接种，孵箱中常规培养；

1.2)充质干细胞传代培养：细胞融合率达到80％时，以1:3比例传代，孵箱常规传代培养。

实验结果：图1为收集的脂肪颗粒，经过消化离心清洗后分层的结果，可见消化后脂肪颗粒分层分布，脂肪颗粒位于最上层分层明显；

图2为细胞在培养7d后，细胞呈漩涡状集落式生长，细胞排列紧密，胞体呈长梭形。

1.3)人脂肪间充质干细胞成脂诱导：

1.3.1)配置成脂诱导培养基：在DMEM基础培养基中添加体积分数为10％胎牛血清、5mg/L胰岛素、1mmol/L地塞米松、50mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、40mmol/L吲哚美辛，4℃保存。

1.3.2)人脂肪间充质干细胞成脂诱导：取对数生长期P3代细胞，以1×105/ml密度接种细胞，待细胞生长至70％～80％融合后，将培养基更换为成脂诱导培养基，连续培养14-21天。

1.3.3)油红O检测：细胞出现较大脂滴后，PBS清洗2次，4％福尔马林固定5min，取0.5％油红按照3:2比例用水稀释，0.45um滤膜过滤后加入细胞中孵育1h，清洗2遍后观察。

实验结果：图3为人脂肪间充质干细胞成脂诱导14天后，镜下可观察到细胞中出现葡萄串珠状，折光性强的脂滴结构，该结构在油红O作用下可被染成红色，镜下可见胞浆中充满红色油滴结构。说明所得细胞具有成脂分化的能力，具有间充质干细胞的分化潜能。

2)人脂肪间充质干细胞扩增预处理：

2.1)配置扩增培养基：将临床级抗坏血酸以200μM的浓度溶解至无血清培养基MSCXeno-Free SFM，混匀后于4℃冰箱保存；

2.2)人脂肪间充质干细胞扩增预处理：取P3-P10代细胞，PBS清洗后，0.25％胰酶-EDTA消化细胞，于扩增培养基中重悬，并以1～2×104/ml接种，孵箱中常规培养36h。

抗坏血酸处理人脂肪间充质干细胞后增殖能力检测：

实验分组：将人脂肪间充质干细胞以5×103/孔的密度接种于48孔板中。细胞分为抗坏血酸处理组、紫外线UVB处理组和空白对照组。按照以上分组方式处理细胞：待细胞贴壁后，抗坏血酸组用含200μM抗坏血酸的扩增培养基处理细胞3天；紫外线UVB组除去培养基后加入适量PBS，每次使用剂量为30mJ/cm2的UVB照射细胞4min，连续处理3天；空白对照组使用基础培养基常规培养3d。使用CCK-8测定试剂盒对细胞检测，根据操作说明用10％CCK-8溶液处理细胞2h，酶标仪于450nm处测量吸光度。

实验结果：图4为常规培养基组(空白对照组)、经抗坏血酸的扩增培养组、UVB处理组分别培养24、48和72h后的ASC细胞增殖情况，可见抗坏血酸可促进人脂肪间充质干细胞的增殖，且抗坏血酸组和UVB组的增殖效果没有明显差异。说明抗坏血酸可替代UVB成为ASC的有效增殖刺激手段，且操作更简易，污染风险更小，能降低大批量生产时的人工成本和污染风险。

3)人脂肪间充质干细胞特异诱导预处理

3.1)配置特异诱导培养基：将米诺地尔以1μM的浓度溶解至无血清培养基MSCXeno-Free SFM，混匀后于4℃冰箱保存。

3.2)将步骤2的人脂肪间充质干细胞消化后以0.5～2×104/ml传代接种，待细胞贴壁后更换培养基为特异诱导培养基，于孵箱中常规培养72h，期间不换液。

培养72h后，收集培养上清液，并于4℃冰箱保存。

诱导后旁分泌因子对人毛乳头细胞的增殖作用检测：

将人毛乳头细胞以1.5×104/ml接种于96孔板中，待细胞贴壁后，按处理方式将其分为：空白对照组，米诺地尔处理组、人脂肪间充质干细胞(ASC)常规培养上清组、人脂肪间充质干细胞(ASC)诱导后培养上清组，分别按照分组方式培养人毛乳头细胞，具体处理方式如下：

细胞培养96h后，除去培养基，加入1ml DMEM后，添加10μl CCK-8溶液至待测细胞并孵育2h，酶标仪于450nm处测量吸光度。

实验结果：图5为四种处理方式对人毛乳头细胞的增殖作用，数据显示，ASC诱导后培养上清组能显著促进人毛乳头细胞的增殖，增殖效果优于米诺地尔处理组及ASC常规培养上清组。说明本发明能够诱导刺激ASC特异性产生促进人毛乳头细胞增殖的旁分泌因子，且该因子对人毛乳头细胞的增殖效果优于单独使用米诺地尔或不经特异诱导ASC所产生的旁分泌因子。

4)人脂肪间充质干细胞旁分泌细胞因子和生长因子收集和浓缩：用截留分子量为50KD的滤膜进行首次过滤，随后更换截留分子量为3KD的滤膜对滤过液进行浓缩，浓缩倍数为20倍，最后将浓缩液通过0.22um的滤膜除菌，最后所得即为干细胞生发因子。

人干细胞生发因子冻干：将获得的干细胞生发因子蛋白浓度测定后，根据测定结果调节赋性剂比例(质量比)，其中：甘露醇6％，精氨酸1％，海藻糖0.5％。无菌注射用水调整干细胞生发因子浓度为0.1mg/ml，0.22um滤膜过滤后以2ml/支分装冻干，其中冻干条件为：温度-80℃，真空度30Pa，时间24～48h。冻干后即可得到浓度为0.2mg/支的干细胞生发因子冻干粉。

人干细胞生发因子的头皮治疗和临床观察：

治疗前处理：选择男性雄激素性脱发患者，在治疗部位敷麻药1小时，生理盐水清洁，75％酒精消毒。

治疗过程：干细胞生发因子冻干粉每支用2ml生理盐水复融后，利用微针配合使用。微针治疗深度为1-2mm，导入量为2ml/次，每次治疗2-3遍，随着治疗次数的增加、可根据志愿者的自身情况随时调节导入深度，治疗后按摩头皮以促进药物吸收。从治疗第1天起，连续使用6个月。

实验结果：图6和图7均为连续使用干细胞生发因子冻干粉6个月的男性雄激素性脱发患者，图6从左至右分别为使用前、使用3个月及使用6个月后效果；图7从左至右分别为使用前、使用6个月后效果。结果显示，患者脱发处的脱发情况有明显改善，毛发密度显著增加，患者使用期间未出现不良反应，因此证明本发明在临床应用中的安全性和有效性。

Claims (10)

1.一种保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

1)人脂肪间充质干细胞原代提取和传代培养：

1.1)人脂肪间充质干细胞原代提取：将抽取的脂肪颗粒用PBS清洗2～3遍，加入0.1％～0.3％Ⅰ型胶原酶，于37℃摇床中，220r/min，20～35min消化，无菌滤网过滤后，取滤过液体于800～1000r/min离心机中离心5～10min，PBS清洗2遍，于无血清培养基MSC Xeno-FreeSFM中重悬并接种，孵箱中常规培养；

1.2)人脂肪间充质干细胞传代培养：细胞融合率达到80％时，以1:3比例传代，孵箱常规传代培养；

2)人脂肪间充质干细胞扩增预处理：

2.1)配置扩增培养基：将临床级抗坏血酸溶解至无血清培养基MSC Xeno-Free SFM，混匀后于4℃冰箱保存；

2.2)人脂肪间充质干细胞扩增预处理：取步骤1.2)所培养的人脂肪间充质干细胞，PBS清洗后，0.25％胰酶-EDTA消化细胞，于扩增培养基中重悬并接种，孵箱中常规培养；

3)人脂肪间充质干细胞特异诱导预处理：

3.1)配置特异诱导培养基：将米诺地尔溶解至无血清培养基MSC Xeno-Free SFM，混匀后于4℃冰箱保存；

3.2)将步骤2.2)的人脂肪间充质干细胞消化后传代接种，待细胞贴壁后更换培养基为特异诱导培养基，于孵箱中常规培养，培养期间不换液；

4)人脂肪间充质干细胞旁分泌细胞因子和生长因子的收集和浓缩：将步骤3.2)所得上清收集，用滤膜进行首次过滤，随后更换截留分子量为1～3KD的滤膜对滤过液进行浓缩，浓缩倍数为15～25倍，最后将浓缩液通过0.22um的滤膜除菌，最后所得即为干细胞生发因子。

2.根据权利要求1所述的保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法，其特征在于：所述步骤2.1)中，抗坏血酸浓度为10～200μM。

3.根据权利要求2所述的保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法，其特征在于：所述步骤2.2)中，人脂肪间充质干细胞接种密度为1～2×104/ml，人脂肪间充质干细胞培养时间为36h。

4.根据权利要求3所述的保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法，其特征在于：所述步骤3.1)中，米诺地尔的浓度为0.1～20μM。

5.根据权利要求4所述的保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法，其特征在于：所述步骤3.2)中，人脂肪间充质干细胞消化后以0.5～2×104/ml传代接种，脂肪间充质干细胞在特异诱导培养基中的培养时间为24～96h。

6.根据权利要求5所述的保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，首次截留分子量为75～125KD的滤膜。

7.根据权利要求1至6任一权利要求所述的保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法，其特征在于：所述步骤4)之后还包括步骤5)人干细胞生发因子冻干：对步骤4)所得的干细胞生发因子进行蛋白浓度测定，并根据测定结果调节赋性剂中甘露醇、精氨酸、海藻糖各成分比例，无菌注射用水调整干细胞生发因子浓度为0.1mg/ml，0.22um滤膜过滤后以2ml/支分装冻干，冻干后即可得到浓度为0.2mg/支的干细胞生发因子冻干粉。

8.根据权利要求7所述的保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中的各成分比例为甘露醇3～8％，精氨酸0.1～1％，海藻糖0.1～0.8％。

9.根据权利要求8所述的保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中冻干条件为：温度-80℃，真空度30Pa，时间24～48h。

10.根据权利要求8所述的保护和诱导毛囊再生的干细胞生发因子的制备方法，其特征在于：所述步骤1.2)之后还包括步骤1.3)人脂肪间充质干细胞成脂诱导：

1.3.1)配置成脂诱导培养基：在DMEM基础培养基中添加体积分数为10％胎牛血清、5mg/L胰岛素、1mmol/L地塞米松、50mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、40mmol/L吲哚美辛，4℃保存。

1.3.2)人脂肪间充质干细胞成脂诱导：取对数生长期P3代细胞，以1×105/ml密度接种细胞，待细胞生长至70％～80％融合后，将培养基更换为成脂诱导培养基，连续培养14-21天；

1.3.3)油红O检测：细胞出现较大脂滴后，PBS清洗2次，4％福尔马林固定5min，取0.5％油红按照3:2比例用水稀释，0.45um滤膜过滤后加入细胞中孵育1h，清洗2遍后观察。

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