CN102119936B

CN102119936B - 制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液

Info

Publication number: CN102119936B
Application number: CN2011100544581A
Authority: CN
Inventors: 李荣旗; 郭丽丽; 刘佳新
Original assignee: 李荣旗; 郭丽丽; 刘佳新
Current assignee: Beijing Kerun Vitech Bio & Technology Co., Ltd.
Priority date: 2011-03-07
Filing date: 2011-03-07
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2031-03-07
Also published as: CN102119936A

Abstract

本发明涉及制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液，它包括：将人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；将人羊膜间充质细胞扩增2-3代到所需的数目后，在-196℃至-185℃的液氮下将上述人羊膜间充质细胞冷冻；在需要配制注射液之前，将上述的冷冻人羊膜间充质细胞复苏；将人羊膜间充质细胞扩增3-5代到所需的数目后，将上述人羊膜间充质细胞放入生理盐水中，每毫升生理盐水中含有10⁵个至10⁶个活的人羊膜间充质细胞。

Description

制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液

技术领域

本发明涉及了一种治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液，特别是制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液。

背景技术

干细胞(Stem cell，SC)是一类具有自我更新(self-renewing)和多向分化潜能的细胞，在一定的条件下，可以分化成多种功能的细胞或组织器官，医学界称之为“万用细胞”。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是SC中的一类，它来源于发育早期中胚层，广泛存在于骨髓、骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、骨骼肌、胎肺、胎肝、脐血、脐带等多种组织中，同样具有自我更新，高度增殖和多向分化潜能。目前人羊膜间充质细胞(MSCs)已成为干细胞研究领域的热点，被广泛应用于各系统疾病的治疗研究。中枢神经系统损伤后的神经修复与再生一直是神经科学研究领域的重点和难点。这是因为中枢神经系统缺乏其它系统的器官组织强大的自我修复能力，绝大多数神经元受损后不能再生，再生的细胞也不能建立正常的树突和轴突联系，从而造成不同程度的神经功能障碍，影响中枢神经系统的各种调节功能。近年来，随着医学的快速发展和干细胞研究的不断深入，基因治疗、移植免疫学和发育生物学等学科间相互渗透与促进，干细胞在神经系统损伤中的修复作用越来越备受关注。

由于羊膜是来源于胎儿的产物，暴露于母体免疫系统监视下，其表面人类白细胞抗原(HLA)--A、B、C低表达，不表达HLA-DR，提示羊膜移植不引发免疫排斥。间充质干细胞是低免疫原性细胞，不引发异常淋巴细胞增殖反应，并且能通过抑制T细胞、B细胞和NK细胞功能，影响树突状细胞活性，此外还可以产生各种生长因子、细胞因子、趋化因子和蛋白酶来调节免疫反应和改变组织微环境，刺激内源性干细胞减轻免疫炎症反应。人羊膜间充质细胞低表达MHC-I，不表达MHC-II，可以避免免疫排斥反应，SUSANNE等对同一条件下人羊膜间充质细胞、人羊膜上皮细胞与脂肪组织来源的干细胞的免疫调节活性进行比较，发现羊膜来源的间充质干细胞和上皮干细胞免疫抑制作用的发挥依赖于细胞接触和细胞剂量。

血管内皮细胞是组织工程化血管的核心，是血管外科和心脏外科血管移植物的主要材料。目前研究利用各种间充质细胞进行诱导分化取得了很大进展。Joachim等采用密度梯度法分离人MSCs，加入2％胎牛血清和50μg/L血管内皮生长因子(vascula r endothelialgrowth factor，VEGF)诱导7d，发现诱导前后细胞没有明显的形态学改变，但免疫组织化学提示VIII因子抗体有显著的升高，电镜可以发现Weibel-Palade小体(W-P小体)。同时，细胞表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、VFGF受体KDR/Flt21、血管内皮黏附分子及血管细胞黏附分子。在半固体培养基中还可以形成血管腔样结构。诱导后的细胞呈梭形，传代超过5代后细胞即变宽、变平，故有关内皮细胞的研究应在第1～5代之间进行。Liang等应用VEGF和碱性成纤维生长因子诱导后发现，细胞形成血管腔样结构，周围有呈铺路石样排列的内皮样细胞。兔抗VEGF受体1(Flt21)最早阳性表达，随后CD34、CD31、Flt21、VIII因子抗体也阳性表达并呈逐渐增加的趋势。Gang等则提取脐血MSCs经VEGF、表皮生长因子和皮质醇激素诱导3周，同样诱导出具有内皮细胞表面标记的细胞，并发现有一些细胞因子分泌。

脑血管疾病(cerebral vasculardiseases，CVD)为临床常见病之一。2005年9月出版的《新英格兰杂志》发表了中国医学科学院最新的流行病学调查：脑血管病是40岁以上中国人口总体死亡的第三位原因，是女性死亡的第二位因，是男性死亡的第三位原因；脑血管病患者总体年死亡率为276.9/10万，女性年死亡率为242.3/10万，男性年死亡率为310.5/10万。调查显示脑血管疾病是所有血管性疾病致死的首位原因。按照这个最新统计结果，我国每年死于脑血管病的总人数近300万之多，同时每年还有近200万例新发脑卒中病例。患病后的幸存者有3/4不同程度地丧失劳动能力，给社会和家庭带来极大的精神痛苦和经济负担。在全部脑血管病中缺血性脑血管(isehemiccerebralvaseular disease，ICD)在我国占到70％左右，在欧美国家比例则达85％之高。因此重视和解决ICD的问题对整个社会脑血管病的治疗具有极其重要的意义。近年来，尽管ICD的发病年龄有年轻化的趋势，但是发病群体的主体还是老年人。按照目前国际通用的标准，中国已经成为人口老年型国家。人口普查资料显示：中国60岁及65岁以上老年人口占总人口的比例分别超过了7％与10％，2030-2040年前后60岁以上老年人1∶3将占总人口的20％以上。如何在一个老龄化比重较高的社会里更好地保障人民健康水平，提高ICD患者的生活质量是我国卫生事业面临的巨大课题。治疗ICD目前除了发病急性期6小时内的溶栓治疗，尚没有更为有效的治疗措施，上个世纪末期，国内外学者在干细胞治疗缺血性脑卒中的基础和临床研究方面取得了一定的研究成果，因此为广大的缺血性脑卒中患者带来了希望的曙光。

人羊膜间充质细胞作为一种多潜能细胞，由于间充质干细胞在体内所定居的组织不同，微环境中的细胞因子、生长因子等各种调控物质不同，可促进间充质干细胞向不同的谱系分化。人羊膜间充质细胞可以分化成神经元和血管内皮细胞，在植入缺血性脑损伤部位后，它分化成神经元和血管内皮细胞，可以有效地治疗缺血性脑损伤，减少由于缺血性脑损伤而造成的死亡并且使缺血性脑损伤的患者尽快恢复。

发明内容

本申请的发明目的在提供一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法及其注射液。

为了完成本申请的发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其中：

它包括以下步骤：

(1)将人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；

(2)将人羊膜间充质细胞扩增2-3代到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×10⁶个/毫升-2×10⁶个/毫升；

(3)将上述人羊膜间充质细胞在-196℃至-185℃的液氮下冷冻保存；

(4)在需要配制注射液之前，将上述的冷冻人羊膜间充质细胞复苏；

(5)将人羊膜间充质细胞扩增3-5代到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×10⁷个/毫升-2×10⁷个/毫升；

(6)将上述人羊膜间充质细胞放入生理盐水中，每毫升生理盐水中含有10⁵个至10⁶个活的人羊膜间充质细胞；

本发明的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其中：所述的步骤(3)包括：将在培养瓶底部融合85％以上的人羊膜间充细胞，用D-hank’s过洗2次，然后加入2毫升0.25％胰蛋白酶，待细胞60-70％缩小变圆之后，加2毫升含有蛋白酶抑制剂的终止液，回收细胞悬液，在室温下将其放入离心机中以1500r/min的转速离心5分钟，将上述溶液中的上清液倒掉；然后加入含有10％-20％白蛋白+40％DMSO+50％DMEM/F12的冷冻液，制成细胞悬液，加入冻存管中，在冻存管上做好标记，包括细胞类型、代数、冷冻日期和细胞数，将冻存管放入-85℃的冰箱内放置3至4小时后，再将冻存管直接投入液氮中保存；

本发明的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其中：所述的步骤(4)包括：将装有人羊膜间充质细胞的冻存管从液氮中取出，用镊子夹住冻存管上部在室温25℃中空气浴5秒钟；然后将冻存管投入水浴温度为37℃的水浴锅，轻轻晃动冻存管使得管壁受热均匀，随时观察人羊膜间充质细胞解冻情况，在40-85秒钟后，待冷冻液全部融化后将冻存管取出，将人羊膜间充质细胞悬液吸至10毫升DMEM/F12中，离心洗涤，在室温下将其放入离心机中以1500r/min的转速离心5分钟，将上述溶液中的上清液倒掉，重复上述离心洗涤两次；

本发明的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其中：步骤(2)和步骤(5)包括以下步骤：是分别将步骤(1)和步骤(4)得到人羊膜间充质细胞和无血清培养液放置在培养瓶中，培养瓶在温度为36.5-37.5℃、饱和湿度、体积分数为4.5％的CO₂培养箱中培养，每2-3天更换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合达到85％以上时，去掉培养液，用D-hank’s液清洗两遍后，再加2毫升0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，在消化过程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当60-70％的细胞变化成圆形时，立即加入2毫升含有蛋白酶抑制剂的终止液终止消化，然后吹打培养瓶的壁，将贴壁的细胞吹打下来；将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分钟，共计两次，然后倒掉上清液，并计算细胞的个数；重复上述操作进行传代接种培养，直至达到所需细胞数量；

本发明的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其中：所述步骤(6)是人羊膜间充质细胞放入生理盐水中，在摇动频率为30-60转/分钟的摇床上摇匀；

本发明的一种利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤的注射液，其中：所述的注射液包括：每毫升生理盐水中含有10⁴个至10⁶个活的人羊膜间充质细胞；

本发明的一种利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤的注射液，其中：所述的注射液为静脉注射液，它被配制成100毫升的注射液，即在100毫升生理盐水中含有10⁶个至10⁷个活的人羊膜间充质细胞；

本发明的一种利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤的注射液，其中：所述的注射液为脑室注射液，它被配制成1毫升注射液，即在1毫升生理盐水中含有10⁵个至10⁶个活的人羊膜间充质细胞；

本发明的一种利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤的注射液，其中：所述的静脉注射液在注射时，注射液在摇动频率为30-60转/分钟的摇床上被摇匀。

本发明是利用人羊膜间充质细胞与其它干细胞相比具有下述优势：(1)来源丰富、取材方便、易于分离；(2)扩增能力优于成人骨髓间充质干细胞(bone marrow-MSCs，BM-MSCs)；(3)低免疫原性；(4)无细胞污染；(5)无供体创伤；(6)无伦理学间题；(7)它在不同的环境下，可以分化成不同的组织，有利于缺血性脑损伤患者的康复。近年来科学家尝试利用羊膜组织来源间充质细胞作为再生医学种子细胞，有关人羊膜间充质细胞(hAMCs)生物学研究，已经证实了其具有间充质干细胞的生物学特性，研究表明人羊膜间充质细胞(hAMCs)具有多分化潜能，可以分化成为血管内皮细胞，并表达成血管内皮相关基因，如VEGF-R2和vWF。

附图说明

表1为鼠模型治疗实验组和对照组的比较；

图1为羊膜间充质细胞表达间充质干细胞的特异性蛋白的western blot结果；

图2为人羊膜间充质细胞表达间充质干细胞的特异性蛋白(vimentin、STRO-1)、神经干细胞特异性蛋白表达(nestin、CD133)，神经元分化基因特异性蛋白(Ngn2、mash-1)的表达免疫荧光结果。

图3为人羊膜间充质细胞表达神经元特异性蛋白(b-tubulin、NSE)的免疫荧光结果；

图4为人羊膜间充质细胞分泌神经元因子酶联免疫吸附法的实验结果NT-3的分泌；

图5为人羊膜间充质细胞分泌神经元因子酶联免疫吸附法的实验结果b-NGF的分泌；

图6为人羊膜间充质细胞表达血管内皮的特异性蛋白的免疫荧光染色结果；

图7为人羊膜间充质细胞表达血管内皮的特异性蛋白的免疫荧光染色结果。

具体实施方式

本发明的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，它包括以下步骤：

(1)将人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；

(2)将步骤(1)得到人羊膜间充质细胞和无血清培养液放置在培养瓶中，培养瓶在温度为36.5-37.5℃、饱和湿度、体积分数为4.5％的CO₂培养箱中培养，每2-3天更换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合达到85％以上时，去掉培养液，用D-hank’s液清洗两遍后，再加2毫升0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，在消化过程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当60-70％的细胞变化成圆形时，立即加入2毫升含有蛋白酶抑制剂的终止液(该终止液的厂家为sigma，货号为T9253)终止消化，然后吹打培养瓶的壁，将贴壁的细胞吹打下来；将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分钟，共计两次，然后倒掉上清液，并计算细胞的个数；重复上述操作将人羊膜间充质细胞扩增2-3代到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×10⁶个/毫升-2×10⁶个/毫升；

(3)将在培养瓶底部融合85％以上的人羊膜间充细胞，用D-hank’s过洗2次，然后加入2毫升0.25％胰蛋白酶，待细胞60-70％缩小变圆之后，加2毫升含有蛋白酶抑制剂的终止液(该终止液的厂家为sigma，货号为T9253)，回收细胞悬液，在室温下将其放入离心机中以1500r/min的转速离心5分钟，将上述溶液中的上清液倒掉；然后加入含有10％-20％白蛋白+40％DMSO+50％DMEM/F12的冷冻液，制成细胞悬液，加入冻存管中，在冻存管上做好标记，包括细胞类型、代数、冷冻日期和细胞数，将冻存管放入-85℃的冰箱内放置3至4小时后，再将冻存管直接投入-196℃至-185℃的液氮下冷冻保存；

(4)在需要配制注射液之前，将装有人羊膜间充质细胞的冻存管从液氮中取出，用镊子夹住冻存管上部在室温25℃中空气浴5秒钟；然后将冻存管投入水浴温度为37℃的水浴锅，轻轻晃动冻存管使得管壁受热均匀，随时观察人羊膜间充质细胞解冻情况，在40-85秒钟后，待冷冻液全部融化后将冻存管取出，将人羊膜间充质细胞悬液吸至10毫升DMEM/F12中，离心洗涤，在室温下将其放入离心机中以1500r/min的转速离心5分钟，将上述溶液中的上清液倒掉，重复上述离心洗涤两次；

(5)将步骤(4)得到人羊膜间充质细胞和无血清培养液放置在培养瓶中，培养瓶在温度为36.5-37.5℃、饱和湿度、体积分数为4.5％的CO₂培养箱中培养，每2-3天更换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合达到85％以上时，去掉培养液，用D-hank’s液清洗两遍后，再加2毫升0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，在消化过程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当60-70％的细胞变化成圆形时，立即加入2毫升含有蛋白酶抑制剂的终止液(该终止液的厂家为sigma，货号为T9253)终止消化，然后吹打培养瓶的壁，将贴壁的细胞吹打下来；将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分钟，共计两次，然后倒掉上清液，并计算细胞的个数；重复上述操作，将人羊膜间充质细胞扩增3-5代到所需的数目后，加入DMEM/F12得到含有人羊膜间充质细胞的悬浊液，使人羊膜间充质细胞的个数为1×10⁷个/毫升-2×10⁷个/毫升；

(6)将上述人羊膜间充质细胞放入生理盐水中，在摇动频率为30-60次/分钟的摇床上摇匀，每毫升生理盐水中含有10⁵个至10⁶个活的人羊膜间充质细胞。

一种利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤的注射液，注射液包括：每毫升生理盐水中含有10⁴个至10⁶个活的人羊膜间充质细胞。该注射液为静脉注射液，它被配制成100毫升的注射液，即在100毫升生理盐水中含有10⁶个至10⁷个活的人羊膜间充质细胞；在静脉注射液在注射时，为了防止人羊膜间充质细胞的沉淀，注射液在摇动频率为30-60次/分钟的摇床上被摇匀。该注射液还可以为脑室注射液，它被配制成1毫升注射液，即在1毫升生理盐水中含有10⁵个至10⁶个活的人羊膜间充质细胞。该注射液用于在定位注射在缺血性脑损伤的部位。

从表1中可以看出：本实验随机挑选患有缺血性脑损伤的小白鼠进行治疗实验，治疗时分实验组和对照组，其中实验组注射了本发明的利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤的注射液后，小白鼠的成活率提高，而死亡率降低，说明本发明的利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤的注射液对于治疗缺血性脑损伤具有明显的效果。

	成活数	死亡数	总计
				对照组	14	13	27
实验组	33	10	43
				总计	47	23	70

χ²＝4.6584 P＝0.031

(p小于0.05，差异显著)

表1

从图1中可以看出：图1左侧人羊膜间充质细胞有间充质细胞的特异性蛋白(vimentin)表达，人羊膜间充质细胞表达量大于上皮细胞。图1右侧人羊膜间充质细胞有神经干细胞特异性蛋白(nestin)表达。

从图2中，可以在免疫荧光下看到：人羊膜间充质细胞细胞经过诱导分化后，人羊膜间充质细胞表达间充质细胞的特异性蛋白(vimentin、STRO-1)、表达神经干细胞的特异性蛋白(nestin、CD133)，神经分化过程中出现的特异性蛋白(Ngn2、mash-1)。

从图3中，可以在免疫荧光下看到：人羊膜间充质细胞细胞经过诱导分化后，人羊膜间充质细胞表达神经元特异性蛋白(b-tubulin、NSE)。

在图4中，1表示阴性对照；2表示人羊膜间充质细胞裂解液；3表示人羊膜间充质细胞培养上清液；从图4中可以看出：在人羊膜间充质细胞阴性对照中NT-3因子低表达，人羊膜间充质细胞内NT-3因子表达较高，在细胞的培养上清液中也能检测到NT-3因子，说明人羊膜间充质细胞内部可分泌神经元因子。

在图5中，1表示阴性对照；2表示人羊膜间充质细胞裂解液；3表示人羊膜间充质细胞培养上清液；从图5中可以看出：在人羊膜间充质细胞阴性对照中b-NGF因子低表达，人羊膜间充质细胞内b-NGF因子表达较高，在人羊膜间充质细胞的培养上清液中也能检测到b-NGF因子，说明人羊膜间充质细胞内部可分泌神经元因子。

从图6说明：人羊膜间充质细胞经过诱导分化后，人羊膜间充质细胞表达血管内皮细胞特异性蛋白CD31标记；control为成血管内皮细胞诱导前hAMCs染色；绿色荧光为CD31阳性；蓝色荧光为核染色。

图7为说明：人羊膜间充质细胞经过诱导分化后，人羊膜间充质细胞表达血管内皮细胞特异性蛋白vWF标记；control为成血管内皮细胞诱导前人羊膜间充质细胞染色；绿色荧光为vWF阳性；蓝色荧光为核染色。

以上方法只是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以作任何形式的修改。

Claims

1.一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)将人羊膜组织分离成单个人羊膜间充质细胞；

(6)将上述人羊膜间充质细胞放入生理盐水中，每毫升生理盐水中含有10⁵个至10⁶个活的人羊膜间充质细胞。

2.如权利要求1所述的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其特征在于：所述的步骤(3)包括：将在培养瓶底部融合85％以上的人羊膜间充细胞，用D-hank’s过洗2次，然后加入2毫升0.25％胰蛋白酶，待细胞60-70％缩小变圆之后，加2毫升含有蛋白酶抑制剂的终止液，回收细胞悬液，在室温下将其放入离心机中以1500r/min的转速离心5分钟，将上述溶液中的上清液倒掉；然后加入含有10％-20％白蛋白+40％DMSO+50％DMEM/F12的冷冻液，制成细胞悬液，加入冻存管中，在冻存管上做好标记，包括细胞类型、代数、冷冻日期和细胞数，将冻存管放入-85℃的冰箱内放置3至4小时后，再将冻存管直接投入液氮中保存。

3.如权利要求2所述的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其特征在于：所述的步骤(4)包括：将装有人羊膜间充质细胞的冻存管从液氮中取出，用镊子夹住冻存管上部在室温25℃中空气浴5秒钟；然后将冻存管投入水浴温度为37℃的水浴锅，轻轻晃动冻存管使得管壁受热均匀，随时观察人羊膜间充质细胞解冻情况，在40-85秒钟后，待冷冻液全部融化后将冻存管取出，将人羊膜间充质细胞悬液吸至10毫升DMEM/F12中，离心洗涤，在室温下将其放入离心机中以1500r/min的转速离心5分钟，将上述溶液中的上清液倒掉，重复上述离心洗涤两次。

4.如权利要求3所述的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(5)包括以下步骤：是分别将步骤(1)和步骤(4)得到人羊膜间充质细胞和无血清培养液放置在培养瓶中，培养瓶在温度为36.5-37.5℃、饱和湿度、体积分数为4.5％的CO₂培养箱中培养，每2-3天更换全部培养液，培养5-7天，观察培养瓶中人羊膜间充质细胞融合达到85％以上时，去掉培养液，用D-hank’s液清洗两遍后，再加2毫升0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，在消化过程中，用显微镜下观察细胞的消化情况，当60-70％的细胞变化成圆形时，立即加入2毫升含有蛋白酶抑制剂的终止液终止消化，然后吹打培养瓶的壁，将贴壁的细胞吹打下来；将回收的间充质细胞放入离心机内以1500r/min转速每次离心5分钟，共计两次，然后倒掉上清液，并计算细胞的个数；重复上述操作进行传代接种培养，直至达到所需细胞数量。

5.如权利要求4所述的一种制备利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤注射液的方法，其特征在于：所述步骤(6)是人羊膜间充质细胞放入生理盐水中，在摇动频率为30-60转/分钟的摇床上摇匀。

6.用如权利要求1所述制备方法产生的一种利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤的注射液，其特征在于：所述的注射液包括：每毫升生理盐水中含有10⁴个至10⁶个活的人羊膜间充质细胞。

7.如权利要求6的一种利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤的注射液，其特征在于：所述的注射液为静脉注射液，它被配制成100毫升的注射液，即在100毫升生理盐水中含有10⁶个至10⁷个活的人羊膜间充质细胞。

8.如权利要求6的一种利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤的注射液，其特征在于：所述的注射液为脑室注射液，它被配制成1毫升注射液，即在1毫升生理盐水中含有10⁵个至10⁶个活的人羊膜间充质细胞。

9.如权利要求7的一种利用人羊膜间充质细胞治疗缺血性脑损伤的注射液，其特征在于：所述的静脉注射液在注射时，注射液在摇动频率为30-60转/分钟的摇床上被摇匀。