CN102703380A - 亚全能干细胞、其制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种亚全能干细胞，其来源于剪断的人类脐带或胎盘，细胞标志是CD151⁺OCT4⁺CD184^-，其在培养容器中贴壁生长，能向人体内、中、外胚层组织分化。本发明也公开了该亚全能干细胞的制备方法，及其用于制备治疗细胞损伤或细胞衰老疾病的药物中的用途，以及其用作基因治疗药物的载体细胞的用途。

Description

亚全能干细胞、其制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及干细胞领域，具体地涉及一种其来源于剪断的人类脐带或胎盘的亚全能干细胞。同时，本发明也涉及该亚全能干细胞的制备方法，以及该亚全能干细胞的用途。

背景技术

人体是由万亿个细胞构成的。细胞是人体的基本结构单位和功能单位，由干细胞分化而来，因此干细胞是人体各种组织器官的起源细胞。干细胞具有自我复制和多向分化的特征。在正常生殖生理过程中，干细胞由受精卵分化而来。受精卵最初发育形成原始胚胎干细胞，后者具有形成完整个体的全部潜能。原始胚胎干细胞进一步分化增殖形成囊胚样结构，其内层细胞群的细胞也称胚胎干细胞。囊胚内层的单个胚胎干细胞不能形成一个完整的个体，但具有形成人体各种组织的全能性。囊胚胚胎干细胞继续分化发育，逐步形成胎儿各器官的功能执行细胞，同时以不对称分裂增殖的模式在机体组织特别是造血组织，包括连接胎儿和母体的胎盘脐带血、骨髓、外周血、肝和脾中保留有不同分化潜能的干细胞。在整个胎儿发育到成年这个漫长而复杂的过程中，干细胞逐级丧失其全能性，形成亚全能干细胞（Pluripotent stem cell，PSC）、多能干细胞（Multipotent stem cell）和专能干细胞(Specialized stem cell)，后者按分化功能分别称造血干细胞、血管干细胞、皮肤干细胞，等等。这些处于不同发育阶段的干细胞在人体组织器官的发育生长、损伤修复过程中发挥着决定性的作用，因此干细胞可以用来新陈代谢、修复组织器官，使机体活力旺盛而保持健康状况。

迄今为止，人们对造血干细胞等专能干细胞的了解和临床使用比较深入，对胚胎干细胞的了解也有长足的进展，但对亚全能干细胞，即在发育阶段及分化能力上与胚胎干细胞接近，表达胚胎干细胞的许多特征，又具备多能干细胞的许多生物学特征，移植到体内不产生畸胎瘤，这样一类干细胞了解甚少。

但是，亚全能干细胞属于成体干细胞范畴，避免了类似胚胎干细胞的医学伦理问题，其在临床上具有广阔现实的应用前景。因此，亚全能干细胞已经成为干细胞研究的一个热点。

发明内容

本发明一个目的是提供一种亚全能干细胞，其来源于剪断的人类脐带或胎盘，可以用作基因治疗药物的载体细胞及用于制备治疗细胞损伤或细胞衰老疾病的药物。

本发明的另一个目的是提供一种制备亚全能干细胞的方法。

本发明还有一个目的是提供上述亚全能干细胞的用途。

为达上述目的，本发明提供了一种亚全能干细胞，其特征在于：其来源于剪断的人类脐带或胎盘，表达标志分子CD151和OCT4，不表达CD184，还表达一些其它胚胎干细胞、间充质干细胞、神经干细胞和血管干细胞的其它主要特异性免疫标志，包括Sox-2、巢蛋白、CD90、CD29、CD13、CD166、CD105、CD44、CD73、CD49e、神经节苷脂GD2和HLA-I。不表达CD34、CD31、CD45、CD133、CD106、CD11b、CD271、CD41、CD61、CD42b和HLA-II。其中OCT4是胚胎干细胞的一种特异性标志。CD151属于一个广泛表达的表面分子，在部分干细胞、表皮细胞、内皮细胞、血小板、树束状细胞等细胞表达，在淋巴细胞、单核细胞、粒细胞不表达。CD184是趋化因子受体4（CXCR4），在淋巴细胞、树束状细胞、单核细胞、粒细胞，内皮细胞、表皮细胞和CD34+干细胞上有表达

本发明亚全能干细胞的特征在于：其在培养容器中贴壁生长，能向人体内、中、外胚层组织，包括但不限于血管、神经、肝脏、心肌、骨、软骨和脂肪组织分化，注射至动物体内不产生畸胎瘤。

本发明提供了一种从剪断的人类脐带或胎盘制备亚全能干细胞的方法，该方法包括下列步骤：

a.无菌采集剪断的人类脐带和/或胎盘；

b.进行组织破碎，蛋白酶降解组织，过筛，分离得到原代单个核细胞；

c.将原代单个核细胞接种于装有干细胞培养液I或II的培养容

器中贴壁生长，蛋白酶消化后培养扩增传代四代以上，收集干细胞，分装后液氮低温冻存；

其中干细胞培养液I的制备过程如下：50-70%体积的DMEM/F 12培养液和30-50%体积的MCDB-201培养液混合成基础培养液后，再添加下列终浓度的组分：2-10%体积的血清，10^-8mol/L的地塞米松，10-50mg/mL的ITS，0.1-10mmol/L的谷氨酰胺，1-100ng/mL的人表皮细胞生长因子和1-100ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子；

其中细胞培养液II的制备过程如下：50-70%体积的DMEM/F 12培养液和30-50%体积的MCDB-201培养液混合，再添加下列终浓度的组分：0.1-5%W/V的人血清白蛋白，1-100μg/mL的亚麻酸，1-100μg/mL的亚油酸，0.1-5%体积的非必需氨基酸，10^-8mol/L的地塞米松，10-50mg/mL的ITS，0.1-10mmol/L的谷氨酰胺，1-100ng/mL的人表皮细胞生长因子和1-100ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。

本发明提供了一种从剪断的人类脐带或胎盘制备亚全能干细胞的方法，该方法包括下列步骤：

a.无菌采集剪断的人类脐带和/或胎盘；

b.进行组织破碎，蛋白酶降解组织，过筛，分离得到原代单个核细胞；

c.使用常规的磁式细胞分选法，以CD184阴性、CD151阳性和OCT4阳性选择组合分选，从采集的单个核细胞中分选出目的细胞，分装后液氮低温冻存。

本发明制备亚全能干细胞的方法的特征在于：其中所述的蛋白酶是胶原酶I或胰蛋白酶。

本发明提供了亚全能干细胞在制备用于基因治疗的药物中作为载体细胞的用途。

本发明也提供了亚全能干细胞在制备用于治疗细胞损伤或细胞衰老疾病的药物中的用途。

本发明也提供了亚全能干细胞在制备促进干细胞向成脂细胞、成骨细胞、成软骨、心肌细胞、神经细胞、肝细胞转化及刺激造血的药物中的用途。

本发明也提供了亚全能干细胞在制备用于治疗免疫调节异常疾病的药物中的用途。

本发明也提供了亚全能干细胞在制备用于治疗大脑损伤疾病的药物中的用途。

本发明也提供了亚全能干细胞在制备用于治疗移植物抗宿主病（aGVHD）的药物中的用途。

本发明的有益效果是：

1．按照本发明的制备方法制备的CD151⁺CD184^-OCT4⁺干细胞可以用作基因治疗药物的载体，转染特定基因后直接移植到体内组织，进行相关疾病的基因治疗。

2．按照本发明的制备方法制备的CD151⁺CD184^-OCT4⁺干细胞可以将干细胞从自体或他人的胎盘脐带中分离出来，制备成适宜的干细胞产品供医学实验研究和临床治疗使用。

2.按照本发明的制备方法制备的CD151⁺CD184^-OCT4⁺干细胞，由于其亚全能性，可以通过病变局部或静脉输注治疗多种疾病。

为了更好地理解本发明，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步说明，其中所述的实施例仅仅是示例本发明，并不构成对本发明的限制。

附图说明

图1是流式细胞仪检测的干细胞（第6代）表面免疫标志。

图2是流式细胞仪检测的干细胞胞内标记检测。

图3是本发明亚全能干细胞成脂分化染色图。

图4是本发明亚全能干细胞成骨分化染色图。

图5是本发明亚全能干细胞成软骨分化染色图。

图6是本发明亚全能干细胞向心肌分化的凝胶电泳图。

图7是本发明亚全能干细胞向神经分化的凝胶电泳图。

图8是本发明亚全能干细胞向肝细胞分化的凝胶电泳图。

图9是本发明亚全能干细胞转染Ad-GFP48小时后的荧光照片。

图10是本发明亚全能干细胞对大鼠出血性脑损伤的治疗试验的结果图。

图11是本发明亚全能干细胞支持造血干细胞生长的图表。

图12A是本发明亚全能干细胞对ConA刺激的小鼠脾细胞增殖的影响的曲线图。

图12B是本发明亚全能干细胞对ConA刺激的小鼠脾细胞分泌IFN-γ的影响的曲线图。

图12C是本发明亚全能干细胞对PHA刺激人外周血单个核细胞（PBMC）增殖的影响的曲线图。

图12D是本发明亚全能干细胞对对PHA刺激人外周血单个核细胞（PBMC）分泌IFN-γ的影响的曲线图。

具体实施方式

下面就本发明中所涉及的培养基、术语及技术进行说明：

本发明所用的干细胞培养液：

DMEM/F12培养液：（购自Invitrogen公司）

MCDB-201培养液：（购自Sigma公司）

本发明所用的术语解释：

表达：指阳性率大于等于70%。

不表达：指阳性率小于等于5%。

ITS：(insulin transferrin selenium)ITS，胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠的混合物，Sigma等公司可以购买到。

非必需氨基酸：是人体非必需氨基酸的混合液，Sigma公司有售。

本发明中所用技术包括流式细胞仪技术和磁珠分选，RT-PCR，细胞培养、传代等技术主要参照以下专著或论文：韩忠朝主编的《造血干细胞理论与移植技术》河南科技出版社，2000年出版；Lv LL等.具有支持造血功能和其它潜能的人类脐带间充质干细胞的分离和鉴定（Isolation and characterization of human umbilicalcord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive functionand other potentials）.Haematologica,91(8):1017-26,2006。

除非特别限定，本发明中的术语具有本领域技术人员所理解的普通含义，所使用的技术为本领域常规技术。

配制细胞培养液：

细胞培养液A：

5L的DMEM/F12培养液和5L的MCDB-201培养液混合成基础培养液后，再添加下列终浓度的组分：2%体积的胎牛血清，10^-8mol/L的地塞米松，10mg/mL的ITS，0.1mmol/L的谷氨酰胺，1ng/mL的人表皮细胞生长因子和1ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。

细胞培养液B：

7L的MEM/F 12培养液和3L的MCDB-201培养液混合成基础培养液后，再添加下列终浓度的组分：10%体积的胎牛血清，10^-8mol/L的地塞米松，50mg/mL的ITS，10mmol/L的谷氨酰胺，100ng/mL的人表皮细胞生长因子和100ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。

细胞培养液C：

6L的DMEM/F 12培养液和4L的MCDB-201培养液混合成基础培养液后，再添加下列终浓度的组分：6%体积的胎牛血清，10^-8mol/L的地塞米松，30mg/mL的ITS，5mmol/L的谷氨酰胺，50ng/mL的人表皮细胞生长因子和50ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。

细胞培养液D：

5L的DMEM/F12培养液和5L的MCDB-201培养液混合，再添加下列终浓度的组分：0.1%W/V的人血清白蛋白，1μg/mL的亚麻酸，1μg/mL的亚油酸，0.1%体积的非必需氨基酸，10^-8mol/L的地塞米松，10mg/mL的ITS，0.1mmol/L的谷氨酰胺，1ng/mL的人表皮细胞生长因子和1ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。

细胞培养液E：

7L的DMEM/F12培养液和3L的MCDB-201培养液混合，再添加下列终浓度的组分：5%W/V的人血清白蛋白，100μg/mL的亚麻酸，100μg/mL的亚油酸，5%体积的非必需氨基酸，10^-8mol/L的地塞米松，50mg/mL的ITS，10mmol/L的谷氨酰胺，100ng/mL的人表皮细胞生长因子和100ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。

细胞培养液F：

6L的DMEM/F12培养液和4L的MCDB-201培养液混合，再添加下列终浓度的组分：2.5%W/V的人血清白蛋白，50μg/mL的亚麻酸，50μg/mL的亚油酸，2.5%体积的非必需氨基酸，10^-8mol/L的地塞米松，25mg/mL的ITS，5mmol/L的谷氨酰胺，50ng/mL的人表皮细胞生长因子和50ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。

实施例1

用贴壁传代培养法分离CD151⁺CD184^-Oct4⁺亚全能干细胞

取剪断的人类胎盘，进行CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞制品的制备。具体步骤如下：1）无菌采集剪断的人类胎盘；2）剪切至<0.5厘米的小碎片、将胎盘机械剪切成1-5mm³小组织块，采用0.5mg/mL胶原酶Ⅰ37℃消化1小时，1mg/mL胰酶37℃消化30分钟，期间温和震荡5次，过筛，离心收集细胞悬液，接种于T75cm²培养瓶中，在细胞培养液A中培养5到7天，呈梭状样细胞贴壁生长；3）贴壁生长细胞经胰蛋白酶消化后进一步培养传代纯化、扩增传代6代后收获细胞、浓缩并用细胞保存液制备成细胞混悬液后，部分细胞送作质量检测，其余分装置液氮罐深低温保存，建CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞种子库。

分离的CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞，培养12-72小时内贴壁，培养3－5天后增长速度增快，可见成纤维细胞样克隆形成，此后增生成为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长。胰蛋白酶消化后传代，细胞经2－4天培养即可铺满80％的瓶底表面。经传代扩增4周天共收获约10^9-10。成纤维样细胞集落形成实验结果显示平均约每400个单个核细胞可形成1个CFU-F。

细胞鉴定：采用流式细胞仪（FACS）检测干细胞（第6代）免疫标志。参考图1、图2，检测显示，本方法制备的干细胞表面CD151阳性率高达99%以上，但不表达CD184、CD34、CD45、HLA-II等，细胞质内高表达OCT4和Sox-2。

实施例2

用贴壁传代培养法分离CD151⁺CD184^-Oct4⁺亚全能干细胞

与实施例1相同，所不同的是所用的细胞培养液是细胞培养液B。

所得的结果与实施例1大体相同。

实施例3

用贴壁传代培养法分离CD151⁺CD184^-Oct4⁺亚全能干细胞

与实施例1相同，所不同的是所用的细胞培养液是细胞培养液C。

所得的结果与实施例1大体相同。

实施例4

用贴壁传代培养法分离CD151⁺CD184^-Oct4⁺亚全能干细胞

与实施例1相同，所不同的是所用的细胞培养液是细胞培养液D。

所得的结果与实施例1大体相同。

实施例5

用贴壁传代培养法分离CD151⁺CD184^-Oct4⁺亚全能干细胞

与实施例1相同，所不同的是所用的细胞培养液是细胞培养液E。

所得的结果与实施例1大体相同。

实施例6

用贴壁传代培养法分离CD151⁺CD184^-Oct4⁺亚全能干细胞

与实施例1相同，所不同的是所用的细胞培养液是细胞培养液F。

所得的结果与实施例1大体相同。

实施例7

用磁式细胞分选法分离CD151⁺CD184^-OCT4⁺亚全能干细胞

从脐带中分离提取CD151阳性细胞的制备方法是：无菌采集剪断的脐带；2）剪切组织至<0.5厘米的小碎片、将脐带机械剪切成1-5mm³小组织块，采用5mg/mL胶原酶Ⅰ37°C消化1小时，5mg/mL胰酶替代物（TyrpLE^TM Express）37°C消化30分钟，期间温和震荡6次，加胎牛血清中和胰酶后将组织悬液通过细胞筛，离心收集细胞悬液；然后用本领域技术人员熟知的方法，先使用CD184⁺磁珠进行阴性选择得到CD184^-细胞，然后用CD151⁺磁珠分离得到CD151⁺CD184^-细胞，OCT4^-磁珠分离作为干细胞种子，置液氮罐保存备用。

实施例8

CD151⁺CD184^-OCT4⁺干细胞具有以下生物学特性：

干细胞的主要生物学特征是自我更新和多向分化。本发明研究表明本发明实施例1-7所制备的CD151⁺CD184^-OCT4⁺干细胞具有以下生物学特性：

1.高增殖能力：将实施例1的所制得的干细胞从10⁶干细胞起始，置75cm²无菌塑料培养瓶传代培养，3-4天便长满瓶底，然后以1瓶传扩至3瓶的方式传代，传6至7代后干细胞总数量可达10^9-10。这些干细胞可以传至20代以上，其细胞免疫标志（表1）表达无明显改变，完全满足规模化生产和多人次临床治疗的需要。

表1：培养不同代数后的干细胞免疫标志表达

注：P，passage,传代代数。

2.向三个胚层组织的分化能力：用干细胞分化培养液对CD151⁺CD184^-OCT4⁺干细胞进行进一步诱导能使其向多胚层分化：

1）成脂分化：取实施例1所制得的第六代（P6代）干细胞在传代的同时以2×10⁴/cm²的密度接种于24孔板中，每孔加入细胞培养液A 0.8ml；待细胞达80%融合，换为诱导培养液(IMDM，10%FBS,1μM地塞米松,0.5mM(IBMX),100μM吲哚美辛和10μg/ml胰岛素)，用上述分化培养基每3–4天换液，持续3周。用油红O染色。油红O染色法步骤：细胞PBS清洗两次，每次5分钟;用4%多聚甲醛固定15分钟;PB S漂洗两次，每次5分钟;用60%异丙醇漂洗。加入油红O染色15分钟，结果见图3。

可以看出，本发明的亚全能干细胞可以成脂分化。

2）成骨分化：取实施例1所制得的P6代干细胞在传代的同时以2×10⁴/cm²的密度接种于24孔板中，每孔加入细胞培养液B 0.8ml；待细胞达80%融合，换为诱导培养液(高糖DMEM,10^-8M地塞米松,1.5mg/mlβ-磷酸甘油,50μg/ml抗坏血酸)，以后每3～4天换一次液；21天后，进行von Kossa染色：固定后的细胞用PBS洗涤2遍；加入5%硝酸银水溶液中10分钟，紫外光晒10分钟，蒸馏水洗涤；浸入5%次亚硫酸钠溶液中，蒸馏水洗，结果见图4。

可以看出，本发明的亚全能干细胞可以成骨分化。

3）成软骨分化：将实施例1所制得干细胞制成2.5×10⁵个细胞/ml浓度的细胞离心到15ml离心管，形成高密度微球，用如下培养基培养21天：DMEM-HG，1×ITS,1×亚油酸–牛血清白蛋白,100nM地塞米松,50μg/ml维生素C,和10ng/ml TGF β1.期间，每3-4天换一次液。21天后用石蜡包埋，切片成5μm厚,用本领域技术人员熟知的番红O法染色，结果见图5。

可以看出，本发明的亚全能干细胞可以成软骨分化。

4）向心肌分化：以4×10³/cm²将实施例1制得的P3代亚全能干细胞接种6孔板内，细胞达到80％融合后，用的诱导培养基为：DMEM-HG，10%体积FBS和6μM 5-脱氧杂氮胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine）处理24小时后,换含10%体积的FB S的DMEM-HG培养基培养14天.用RT-PCR心肌特异的标志,α-肌动蛋白,肌间线蛋白,MyoD1,肌球蛋白和肌钙蛋白的表达，结果见图6。心肌特异基因的RT-PCR的引物设计见表2。

可以看出，本发明的亚全能干细胞可以向心肌分化。

5）向神经分化：诱导培养基DMEM/F12,B27,和增加以下条件:(1)20ng/ml EGF,10ng/ml bFGF,和10ng/ml PDGF诱导实施例1制得的干细胞7天;(2)10ng/ml bFGF,10ng/ml PDGF和50ng/ml NGF诱导实施例1制得的干细胞7天.在十四天，提取细胞RNA检测巢蛋白、GFAP、MAP2、NG2的表达，结果见图7。神经特异基因的RT-PCR的引物设计见表2。

可以看出，本发明的亚全能干细胞可以向神经分化。

6）向肝细胞分化：实施例1制得的干细胞在IMDM中补充20ng/mlbFGF和20ng/ml HGF中诱导培养，3天换液一次，重新补充上述因子，在14天可以检测得到肝特异基因，蛋白AFP、白蛋白的表达，结果见图8。肝特异基因的RT-PCR的引物设计见表2。

可以看出，本发明的亚全能干细胞可以向肝细胞分化。

表2诱导后组织特异性基因的RT-P C R的引物

实施例2-7所制得的干细胞也进行了上述高增殖能力，及成脂、成骨、成软骨、向心肌、向肝脏、向肝细胞的分化试验，结果大体相同。

实施例9

CD151⁺CD184^-OCT4⁺干细胞作为基因治疗的载体细胞

本发明利用携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒Ad-GFP转染体外扩增的实施例1所制得的PSC，取3～6代PSC,按1×10⁵/孔的密度接种于24孔板中培养24h后吸出培养液,加入用培养液稀释的Ad-GFP，1×10⁸PFU/ml，加入培养孔，另设孔作为未加入病毒的空白对照，继续培养48小时，用流式观察转染率，并用荧光显微镜照相。结果见图9：转染Ad-GFP 48小时后检测，转染效率97.76%。

实施例2-7所制得的干细胞也进行了上述试验，结果大体相同。

由此可见，本发明的亚全能干细胞可以作为制备用于基因治疗的药物中的载体细胞。

实施例10

CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞对大鼠出血性脑损伤的治疗试验：

按照实施例1所述的制备方法制备得到CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞。参考Rosenberg等的方法［Rosenberg GA,et al.，Stroke,1990,21:801-807］，制作大鼠脑出血模型制作。将大鼠麻醉后固定于立体定向仪上，头顶部去毛消毒后正中纵向切口，于前颅偏右旁开3.0mm，向后1.4mm处在颅骨上钻一小孔，用10μl微量进样器进针5.6mm，缓慢分次注入2μl含0.4U胶原酶Ⅶ的PBS，留针5min后缓慢拔针，缝合切口。实验动物完全苏醒后，观察到提尾悬空时出血对侧前肢屈曲、内收，自主运动时身体向偏瘫侧转圈，说明模型制作成功。

在模型制作成功24小时后进行CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞移植，大鼠麻醉后固定于立体定向仪上，拆线，在原孔内用10μl微量进样器进针5.6mm，缓慢分次注入10μl细胞悬液，留针5min后缓慢拔针，缝合切口。对照组用同样方法注入等量PBS。

免疫组织化学检测：于PSC移植后28天处死2组大鼠。4%多聚甲醛500ml经左心室灌注后，断头取脑，置4%多聚甲醛后固定24小时，冠状位切取以出血区域为中心的包括侧脑室室管膜下区、基底节区和海马的厚度2mm的脑组织标本，观察移植后的损伤区的大小。结果见图10，图10是大鼠脑出血28天后脑切片，箭头所示为损伤区；Normal是正常组，PBS是PBS注射组，PSC是CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞治疗组。该图显示CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞移植组损伤区比P B S组明显小，说明CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞可以明显减少大鼠脑出血后对大脑的损伤。

实施例2-7所制得的干细胞也进行了上述试验，结果大体相同。

实施例11

CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞支持造血：

将实施例1的第6代CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞以2.0×10⁴/孔的浓度种于24孔板，⁶⁰C_O20Gy照射后种脐血CD34+细胞2.0×10⁴，共同培养8周，每周半量换液。将换出的细胞种于甲基纤维素完全培养基，培养两周后计数集落，大于等于50个细胞为一个集落。对照组为单独脐血CD34+细胞培养组和PSC与脐血CD34+细胞共同培养组。

见图11图表所示，集落形成数量检测结果以均数±标准误表示。细胞培养集落计数结果显示：单独脐血CD34+细胞培养组两周后即无集落形成，而CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞和脐血CD34+细胞共同培养组可维持6周尚可有集落形成，表明CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞具有支持长期造血的能力。

实施例2-7所制得的干细胞也进行了上述试验，结果大体相同。

实施例12

CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞调节免疫反应的功能

1.MTT检测实施例1的CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞对T细胞增殖的抑制作用

T细胞在PHA刺激下成聚簇/克隆性增殖，在倒置显微镜下观察，CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞共培养条件下的T细胞聚簇/克隆大小较对照组缩小，数量减少。MTT检测提示在CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞共培养条件下，丝裂原刺激T细胞增殖受到抑制，增殖指数减低，差别有显著意义（p<0.01）。通过比较不同梯度浓度下的T细胞增殖抑制情况可以发现在T细胞与CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞比值为4：1、2：1和1：1时的增殖抑制率由30.36%增加至为41.14%和51.92%，说明CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞对T细胞的增殖抑制作用具有剂量依赖性。

2.CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞抑制ConA刺激后小鼠脾细胞γ-干扰素的表达

材料与方法：

1）取C57小鼠脾脏，按常规制备脾细胞悬液10⁶/ml备用。

2）取足量实施例1制备的CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞，经放射线（铯源）照射后制备以下浓度的悬液(细胞数/ml)：1x10⁶，5x10⁵，1x10⁵，5x10⁴，1x10⁴。按下表分组并在96孔板中加入相应剂量的小鼠脾细胞、CD151⁺CD184^-Oct⁴+干细胞和ConA，每组均设3重复孔。

将96孔板置于细胞培养箱培养。72小时后取出96孔板，吸取培养液上清。以ELISA法测定干扰素-γ浓度。统计学处理分析，结果如图12A到12D所示，所示结果表明CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞有显著的免疫调节作用。

实施例2-7所制得的干细胞也进行了上述试验，结果大体相同。

实施例13

CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞对小鼠移植物抗宿主病（aGVHD）的预防和治疗作用：

使用实施例1所制备的CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞。

1、aGVHD模型的建立：取雄性、8周龄C57BL/6(H-2^b)小鼠和BALB/C（H－2^d）小鼠。BAL B/c小鼠造模前60Co γ射线照射清髓（照射剂量为10.0Gy）。

2、预防组的分组处置：BAL B/c小鼠于照射后5-6h、造模前3h给予CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞静注，然后给予C57BL/6小鼠的骨髓细胞和脾细胞静注造模。

3、治疗组的分组处置：BAL B/c小鼠于照射后8-10h内给予C57BL/6小鼠的骨髓细胞和脾细胞静注造模，然后于造模后第6天分别注射实施例1的CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞治疗，第一次注射干细胞后间隔12天给予第二次MSC注射治疗。

4、对照：空白对照组，照射组，同系干细胞对照组，模型组

骨髓细胞制备：无菌取小鼠股骨、胫腓骨，反复冲洗骨髓，过滤，制成单细胞悬液，离心、洗2－3次，台盼蓝染色进行活细胞计数：活性率在99％以上，调节细胞浓度为1×10⁸/ml,备用。脾细胞制备：无菌取出脾细胞研碎，制成单细胞悬液，离心，洗2－3次，台盼蓝染色进行活细胞计数：活性率在99％以上。调节细胞浓度为2×10⁸/ml,备用。

实验分组情况如下表：

全部小鼠于半屏障系统中实验和饲养，饲养于无菌层流间内的层流架上，垫料、饲料和饮水经过消毒处理。小鼠骨髓移植:尾静脉注射——局部常规消毒，无菌操作条件下按表1分组情况经尾静脉注射移植细胞。动物无菌饲养观察存活率和小鼠GVHD临床症状。观察时间30天津，每天观察并记录各组动物的存活状况，用于动物生存曲线的绘制以评价模型与治疗效果；每周称量并记录两次动物体重，用于aGVHD模型建立成功与否与治疗效果的评价；每天观察并记录试验动物的一般临床表现，根据体重变化、体位、活动性、被毛质地和皮肤完整性这五项指标的变化程度来进行试验动物临床积分评价；试验结束时处死全部试验动物，取脏器（肝脏，肺脏和皮肤），HE染色观察各组织的病理变化。实验结果如下：

1小鼠生存情况：照射组在急性期大部分死亡，10只存活1只，存活率10％；同系骨髓细胞移植组10只存活5只，存活率50％；GVHD组在急性期全部死亡，存活率0％，中位存活时间6天。CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞低剂量预防组小鼠10只存活2只，存活率20%，中位存活时间15天。CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞高剂量预防组小鼠10只存活3只，存活率30%，中位存活时间18天。CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞低剂量组小鼠10只存活3，存活率30％，中位存活时间18天。中剂量组小鼠10只存活5，存活率50％，中位存活时间22天。高剂量组小鼠10只存活6只，存活率60％，中位存活时间23天。经秩和检验，使用干细胞组与GVHD组在存活率和/或差异中位存活时间在统计学上具有显著性差异（p<0.05）。此外，GVHD小鼠经CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞治疗，GVHD症状表现减轻，经U检验，差异具有统计学意义（p<0.05）,说明CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞可减轻小鼠GVHD症状。

结论：本实验成功建立了小鼠aGVHD模型，证实CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞移植可以预防治疗GVHD，降低aGVHD的病变程度，提高移植小鼠的存活率和生存时间,同时证明CD151⁺CD184^-Oct4⁺干细胞在体内具有免疫调节作用，可以用于治疗异基因造血干细胞后的GVHD。

实施例2-7所制得的干细胞也进行了上述试验，结果大体相同。

Claims (12)

1.一种从剪断的人类脐带或胎盘制备亚全能干细胞的方法，该方法包括下列步骤：

a.无菌采集剪断的人类脐带和/或胎盘；

b.进行组织破碎，蛋白酶降解组织，过筛，分离得到原代单个核细胞；

c.使用常规的磁式细胞分选法，以CD184阴性、CD151阴性和OCT4阳性选择组合分选，从采集的单个核细胞中分选出目的细胞，分装后液氮低温冻存，建亚全能干细胞种子库。

2.根据权利要求3所述的制备亚全能干细胞的方法，其中所述的蛋白酶是胶原酶I或胰蛋白酶；根据权利要求1所述的制备亚全能干细胞的方法，其中所述的蛋白酶是胶原酶I或胰蛋白酶。

3.一种使用权利要求1或2所述方法制备的亚全能干细胞，其特征在于：其来源于剪断的人类脐带或胎盘，表达标志分子CD151和Sox-2，不表达CD34。

4.根据权利要求3所述的亚全能干细胞，其特征在于：其还表达标志分子OCT4、巢蛋白、CD90、CD29、CD13、CD166、CD105、CD44、CD73、CD49e、神经节苷脂GD2和 HLA-I；其不表达CD184、CD31、CD45、CD133、CD106、CD11b、CD271、CD41、CD61、CD42b和HLA-II。

5.根据权利要求3或4所述的亚全能干细胞，其特征在于：其在培养容器中贴壁生长，能向人体内、中、外胚层组织分化，注射至动物体内不产生畸胎瘤。

6.根据权利要求5所述的亚全能干细胞，其特征在于：所述胚层组织是血管、神经、肝脏、心肌、骨、软骨和脂肪组织。

7.权利要求3至6中任一权利要求所述的亚全能干细胞在制备用于基因治疗的药物中作为载体细胞的用途。

8.权利要求3至6中任一权利要求所述的亚全能干细胞在制备用于治疗细胞损伤或细胞衰老疾病的药物中的用途。

9.权利要求3至6中任一权利要求所述的亚全能干细胞在制备促进干细胞向成脂细胞、成骨细胞、成软骨、心肌细胞、神经细胞、肝细胞转化及刺激造血的药物中的用途。

10.权利要求3至6中任一权利要求所述的亚全能干细胞在制备用于治疗免疫调节异常疾病的药物中的用途。

11.权利要求3至6中任一权利要求所述的亚全能干细胞在制备用于治疗大脑损伤疾病的药物中的用途。

12.权利要求3至6中任一权利要求所述的亚全能干细胞在制备用于治疗移植物抗宿主病的药物中的用途。

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