CN108893442A - 一种脂肪干细胞增殖培养基及其增殖培养方法 - Google Patents

一种脂肪干细胞增殖培养基及其增殖培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种脂肪干细胞增殖培养基及其增殖培养方法。该脂肪干细胞增殖培养基包括氨甲环酸、VEGF、FGF和基础培养基；脂肪干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：氨甲环酸：100～10000mg/L；VEGF：10～50mg/L；FGF：5～20ng/mL；基础培养基：补足。本发明将氨甲环酸、VEGF、FGF添加入基础培养基，能缩短原代培养时间，效果好于常规培养基及添加单一因子的培养基；同时可以避免异源性物质的引入，具有更高的临床安全性。

Description

一种脂肪干细胞增殖培养基及其增殖培养方法
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种脂肪干细胞增殖培养基及其增殖培养方法。
背景技术
2001年，Zuk等从吸脂术抽出的脂肪中发现了脂肪干细胞，揭开了干细胞研究的新篇章。近年来的研究证实，干细胞广泛存在于体内各组织，其中脂肪干细胞以其来源广泛、获取简单等优点，一直以来是整形修复科、组织工程和再生医学等相关学科的研究重点。
研究表明脂肪干细胞采用DMEM/F12+10％FBS原代培养48h后细胞有触角伸出，呈纤维细胞样的短梭形，五六天后细胞呈集落样生长，有克隆形成。根据作者观察，脂肪干细胞传代后24h内增殖速度较慢，细胞多独立贴壁生长，48-72h是增殖速度最快的阶段，细胞呈梭形伸展，生长有方向性，3-5d后生长显著加快，与其他学者的研究结果基本一致。脂肪干细胞的倍增时间与细胞活力、种植密度和培养条件等密切相关，平均为30-60h。
现有常规培养技术采用外源血清(如胎牛血清)促进脂肪干细胞增殖，此种技术虽然能达到增殖目的，但是原代培养费时较长，且外源血清其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。
因此，需要寻求一种可替代胎牛血清用于脂肪干细胞的体外快速扩增方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种脂肪干细胞增殖培养基及其增殖培养方法。本发明将氨甲环酸、VEGF、FGF添加入基础培养基，能缩短原代培养时间，效果好于常规培养基及添加单一因子的培养基，同时可以避免异源性物质的引入，具有更高的临床安全性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种脂肪干细胞增殖培养基，包括氨甲环酸、VEGF、FGF和基础培养基；脂肪干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：100～10000mg/L；
VEGF：10～50ng/L；
FGF：5～20ng/mL；
基础培养基：补足。
作为优选，脂肪干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：500～10000mg/L；
VEGF：10～20ng/L；
FGF：10～20ng/mL；
基础培养基：补足。
优选地，脂肪干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：500mg/L；
VEGF：20ng/L；
FGF：10～20ng/mL；
基础培养基：补足。
更优选地，脂肪干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：500mg/L；
VEGF：20ng/L；
FGF：10ng/mL；
基础培养基：补足。
更优选地，脂肪干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：500mg/L；
VEGF：20ng/L；
FGF：20ng/mL；
基础培养基：补足。
作为优选，基础培养基为DMEM/F12培养基。
本发明还提供了一种脂肪干细胞的增殖培养方法，包括：将脂肪干细胞接种于上述脂肪干细胞增殖培养基，进行增殖培养。
作为优选，脂肪干细胞的接种密度为5000～20000cell/mL。
优选地，脂肪干细胞的接种密度为10000cell/mL。
作为优选，增殖培养的条件为37℃、5％CO2。
作为优选，增殖培养的时间为3～4天。
作为优选，增殖培养过程中每三天换液一次。
本发明提供了一种脂肪干细胞增殖培养基及其增殖培养方法。该脂肪干细胞增殖培养基包括氨甲环酸、VEGF、FGF和基础培养基；脂肪干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：氨甲环酸：100～10000mg/L；VEGF：10～50ng/L；FGF：5～20ng/mL；基础培养基：补足。本发明具有的技术效果为：
本发明将氨甲环酸、VEGF、FGF添加入基础培养基，能缩短原代培养时间，效果好于常规培养基及添加单一因子的培养基；
本发明将氨甲环酸、VEGF、FGF的混合物代替胎牛血清，可以避免异源性物质的引入，具有更高的临床安全性。
附图说明
图1示脂肪干细胞的成骨效果；
图2示脂肪干细胞表面标志物的表达情况。
具体实施方式
本发明公开了一种脂肪干细胞增殖培养基及其增殖培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
脂肪干细胞：脂肪来源于间充质，类似于骨髓拥有丰富的基质。脂肪组织中脂肪细胞占50％-70％，除此之外还有脂肪祖细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞、周细胞、内皮细胞、内皮祖细胞、血管平滑肌细胞、基质细胞、免疫细胞和造血干细胞等。人体将多余的能量储存在脂肪中，这个过程包括脂肪细胞体积的增大和数量的增加。此外，在狼疮、皮下脂肪坏死、Paget’s病、进行性骨发育异常等疾病中观察到脂肪组织中异位成骨，上述证据表明脂肪组织中存在具有多向分化能力的干细胞。关于脂肪组织中含有干细胞的原因目前有3种推测，第一种认为脂肪干细胞是通过循环系统迁移至脂肪组织的骨髓间充质干细胞，二者的相似性可以支持这种理论，但是二者的表型有一些差异。第二种认为脂肪干细胞本质上是成纤维细胞，因为二者的形态和生物学特性非常相似。第三种则认为脂肪干细胞是周细胞，因为在体内二者均集中于脂肪组织的血管周围，且周细胞也可以贴壁生长，并具有多向分化的能力。
血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)，又称血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。
成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)有几种异构体，在动脉硬化灶中起作用的主要是bFGF(basic fibroblast growth factor)，bFGF可以由内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞分泌。它的作用是促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，不能使平滑肌细胞游走。能够促进新血管形成，修复损害的内皮细胞.
氨甲环酸，英文名称：Tranexamic Acid，化学名称：对氨甲基环己烷甲酸、反式－4－氨甲基－环己烷甲酸。氨甲环酸可抑制纤溶酶的作用，从而显示出止血、抗变态反应、消炎的效果。主要用于急性或慢性、局限性或全身性纤维蛋白溶解亢进所致的各种出血。
DMEM/F12培养基：F12培养基成分丰富，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基(DME/F12medium)，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。
本发明提供的一种脂肪干细胞增殖培养基及其增殖培养方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1、混合物配比
混合物工作浓度：
(1)氨甲环酸工作浓度为500mg/mL、10000mg/mL；
(2)VEGF工作浓度为10ng/mL、20ng/mL；
(3)FGF工作浓度为10ng/mL、20ng/mL。
配制两种培养基：
实验组：命名为A组，为DMEM/F12+混合物；
对照组：命名为B组，为DMEM/F12+10％FBS。
具体分组如下：
表1培养基中各组分浓度配比
实施例2、原代分离获得脂肪干细胞
将吸脂术收集的脂肪用生理盐水冲洗，每5mL脂肪分装入50mL离心管，以1︰2的比例加入10mL 0.075％的I型胶原酶，放入37℃恒温摇床以80r/min的摇速消化1h，加入与胶原酶等量的生理盐水以终止消化，500g离心10分钟，去上清，得到的下层絮状物接种10cm培养皿培养，培养基为实施例1中各组培养基。接种密度为10000cell/mL，培养条件为：37℃，5％CO2培养箱中培养，每三天换液一次。
实施例3、观察比较原代细胞增殖情况
每天观察实施例2的各组皿内细胞汇合度(％)情况并记录实验结果见表2：
表2脂肪干细胞增殖情况
天数 1d 2d 3d 4d
A1 15％ 25％ 35％ 60％
A2 15％ 30％ 40％ 70％
A3 20％ 40％ 80％ 100％
A4 20％ 40％ 80％ 95％
A5 5％ 10％ 15％ 30％
A6 5％ 10％ 20％ 40％
A7 10％ 20％ 40％ 60％
A8 10％ 15％ 35％ 55％
B 15％ 30％ 50％ 80％
由此表可见，在添加了混合物A3/A4的情况下，原代脂肪干细胞增殖速度明显优于添加FBS的培养基。
实施例4、分化能力比较
取配方A3、B第3代细胞，按2.5×104细胞浓度接种于含有DMEM/F12+20％FBS培养基的24孔板中，至细胞80％融合时，更换为含有1nmol/L地塞米松、10mg/L胰岛素、0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、100μmol/L吲哚美辛的培养液，每周换液2次，3周后用多聚甲醛固定，油红O染色。染色结果见图1。可见清晰被染色脂滴，证明本发明A3组培养得到的脂肪干细胞细胞具有成脂分化能力。
实施例5、免疫表型分析
取配方A3、B组第3代细胞，消化后清洗3次，制成细胞悬液，加入抗体，流式细胞仪检测分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表达情况。试验结果见表3、图2。
表3脂肪干细胞表面标志物的表达情况
上述检测结果表明该细胞是脂肪间充质干细胞。
实施例6、效果对比试验
实验组：A3组；
对照组：命名为C组，为DMEM/F12+单一因子。
表4试验组和对照组中各组分浓度配比
将吸脂术收集的脂肪用生理盐水冲洗，每5mL脂肪分装入50mL离心管，以1︰2的比例加入10mL 0.075％的I型胶原酶，放入37℃恒温摇床以80r/min的摇速消化1h，加入与胶原酶等量的生理盐水以终止消化，500g离心10分钟，去上清，得到的下层絮状物接种10cm培养皿培养，培养基为上述各组培养基。每天观察各组皿内细胞汇合度(％)情况并记录实验结果见表5：
表5脂肪干细胞增殖情况
天数 1d 2d 3d 4d
A3 20％ 40％ 80％ 100％
C1 5％ 10％ 15％ 15％
C2 10％ 15％ 20％ 30％
C3 10％ 15％ 25％ 40％
由上述结果可以看出，加了混合物培养基在相同时间下明显生长速度快于添加单一因子的常规培养基，而最终细胞数量也显著多于添加单一因子的常规培养基。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种脂肪干细胞增殖培养基，其特征在于，包括氨甲环酸、VEGF、FGF和基础培养基；所述脂肪干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：100～10000mg/L；
VEGF：10～50ng/L；
FGF：5～20ng/mL；
基础培养基：补足。
2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞增殖培养基，其特征在于，所述脂肪干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：500～10000mg/L；
VEGF：10～20ng/L；
FGF：10～20ng/mL；
基础培养基：补足。
3.根据权利要求1所述的脂肪干细胞增殖培养基，其特征在于，所述脂肪干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：500mg/L；
VEGF：20ng/L；
FGF：10ng/mL；
基础培养基：补足。
4.根据权利要求1所述的脂肪干细胞增殖培养基，其特征在于，所述脂肪干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：
氨甲环酸：500mg/L；
VEGF：20ng/L；
FGF：20ng/mL；
基础培养基：补足。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的脂肪干细胞增殖培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
6.一种脂肪干细胞的增殖培养方法，其特征在于，包括：将脂肪干细胞接种于权利要求1至5中任一项所述脂肪干细胞增殖培养基，进行增殖培养。
7.根据权利要求6所述的增殖培养方法，其特征在于，所述脂肪干细胞的接种密度为5000～20000cell/mL。
8.根据权利要求6所述的增殖培养方法，其特征在于，所述增殖培养的条件为37℃、5％CO2。
9.根据权利要求6所述的增殖培养方法，其特征在于，所述增殖培养的时间为3～4天。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的增殖培养方法，其特征在于，所述增殖培养过程中每三天换液一次。
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