CN113913371A - 一种外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用 - Google Patents

一种外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用。所述制备方法包括以下步骤：(1)采用胰蛋白酶消化液对自体脂肪组织消化后，清洗，得到脂肪细胞；(2)将步骤(1)得到的脂肪细胞置于培养基中培养，得到细胞悬液；(3)将步骤(2)得到的细胞悬液与氨甲环酸混合后培养，收集，得到氨甲环酸修饰的自体间充质脂肪干细胞产生的外泌体。该外泌体制剂的有效成分包括自体间充质脂肪干细胞产生的外泌体及氨甲环酸的修饰，且烧伤创面修复的外泌体制剂，需要能够促进创面愈合、并降低创面的黑色素沉着，减少创面愈合后的痕迹。

Description

一种外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用。
背景技术
皮肤烧伤属于开放性的病理损害，烧伤可致皮肤结构与功能的破坏，烧伤后皮肤的愈合是复杂的生理过程，先后经历出血后的止血、炎症反应、增生、组织改建及瘢痕过程，该过程中需多种组织细胞参与，如上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞等。烧伤创面因存在大量烧伤毒素并暴露于复杂的微生物环境中，适当的炎性细胞参与可降低感染风险，但过度的炎性反应则影响烧伤创面的愈合。
对于大面积烧伤患者，因自体皮肤来源缺乏，自体皮肤移植受限；异体来源的皮肤不仅有限，且存在免疫排斥等问题，亟待新的创面修复技术用于烧伤患者的抢救、皮肤功能恢复、瘢痕的淡化。脂肪来源的间充质干细胞是一种分布广泛、取材方便、具有一定的自我更新和分化潜能的多能干细胞，能够分泌多种促进组织修复、调节组织微环境、消炎、抗纤维化的细胞因子。尽管脂肪间充质干细胞的安全性较高，但完整结构的干细胞仍具备一定的致瘤风险，脂肪间充质干细胞来源的外泌体则兼顾了安全性与有效性。脂肪间充质干细胞来源的外泌体能够将干细胞的核酸、蛋白、脂质及信号分子转运给靶细胞，发挥类似于干细胞在烧伤创面修复中的功能。
CN113018501A公开了一种内皮祖细胞外泌体医用敷料、制备方法及其应用，包括以下步骤：三维培养得到内皮祖细胞、采用内皮祖细胞制备外泌体、通过外泌体得到外泌体医用敷料。该发明所述的内皮祖细胞外泌体医用敷料，以健康的脐带血内皮祖细胞为原料，包含高活力的外泌体，纳米级的磷脂囊泡中包裹着和细胞生长、修复等功能密切相关的数百种蛋白质和microRNA等生物活性分子，通过激活患者机体的内源性组织特异性干细胞、建立组织损伤修复的再生微环境，促进烧伤、烫伤等疾病的伤口组织修复。
CN111671772A公开了一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用，属于皮肤治疗技术领域。该发明从原代鹿茸组织中分离获得间充质干细胞；经体外扩大培养，收集细胞培养液，经分离提取获得鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。经证实，能够通过NLRP3炎症小体信号通路抑制LPS诱导的HaCat细胞的炎症反应，能够加快皮肤损伤小鼠模型的创面修复、减轻炎症反应。本发明可用于制备治疗皮肤损伤修复药物或化妆品。
CN110693912A公开了一种细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用。该发明干细胞外泌体无免疫原性、无致瘤性，提取方法成熟、保存方便，将其贴附压疮皮肤，可降低创面组织中肌成胶原纤维含量、I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白和/或HMGB1和/或TGF-β表达量，进而促进创面愈合。该发明使用外泌体替代因免疫原性、致瘤性原因导致临床使用严格的干细胞，消除干细胞治疗的局限性，且能达到相应治疗效果。
因此，提供一种自体脂肪间充质干细胞的外泌体制备和修饰方法，可用于促进皮肤烧伤患者的创面修复、消炎、淡化瘢痕是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用，特别涉及一种氨甲环酸修饰的自体间充质脂肪干细胞产生的外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种外泌体的制备方法，所述外泌体的制备方法包括以下步骤：
(1)采用胰蛋白酶消化液对自体脂肪组织消化后，清洗，得到脂肪细胞；
(2)将步骤(1)得到的脂肪细胞置于培养基中培养，得到细胞悬液；
(3)将步骤(2)得到的细胞悬液与氨甲环酸混合后培养，收集，得到氨甲环酸修饰的自体间充质脂肪干细胞产生的外泌体。
在本发明中，所述外泌体的制备中，外泌体的来源为自体脂肪间充质干细胞，能够将干细胞的核酸、蛋白、脂质及信号分子转运给靶细胞，发挥类似于干细胞在烧伤创面修复中的功能。
优选地，步骤(1)中，所述胰蛋白酶消化液和自体脂肪组织的体积比为(15-25):(25-50)；
其中，“15-25”例如可以是15、17、19、21、23、25等；
其中，“25-50”例如可以是25、30、35、40、45、50等。
优选地，步骤(1)中，所述胰蛋白酶消化液包括：胰蛋白酶和EDTA溶液。
优选地，所述胰蛋白酶消化液中胰蛋白酶的质量百分含量为0.05-0.2％，例如可以是0.05％、0.1％、0.15％、0.2％等。
优选地，所述EDTA溶液的浓度为0.05-0.15mM，例如可以是0.05mM、0.06mM、0.1mM、0.12mM、0.15mM等。
优选地，所述EDTA溶液的pH为7.5-8.5，例如可以是7.5、7.6、7.8、8.0、8.2、8.5等。
优选地，步骤(1)中，所述自体脂肪组织为自体腹部脂肪组织。
优选地，步骤(1)中，所述消化具体包括以下步骤：将自体脂肪组织与部分胰蛋白酶消化液混合，进行一次消化，收集部分消化细胞悬浮液；再将剩余未消化的自体脂肪组织与剩余胰蛋白酶消化液混合，进行二次消化，合并收集，得到消化细胞悬浮液。
优选地，所述自体脂肪组织、部分胰蛋白酶消化液、剩余胰蛋白酶消化液的体积比为(15-25):(15-30):(10-20)；
其中，“15-25”例如可以是15、17、19、21、23、25等；
其中，“15-30”例如可以是15、20、25、30等；
其中，“10-20”例如可以是10、12、14、16、18、20等。
优选地，所述一次消化的温度为36.5-38℃，例如可以是36.5℃、37℃、37.5℃、38℃等，所述一次消化的时间为8-12min，例如可以是8min、9min、10min、11min、12min等。
优选地，所述二次消化的温度为36.5-38℃，例如可以是36.5℃、37℃、37.5℃、38℃等，所述二次消化的时间为4-10min，例如可以是4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min等。
优选地，所述清洗具体包括以下步骤：将消化细胞悬浮液离心后，弃去上清液，加入PBS缓冲液，震荡清洗，得到脂肪细胞。
优选地，所述离心的转速为800-1500rpm，例如可以是800rpm、900rpm、1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm、1500rpm等，所述离心的时间为2-5min，例如可以是2min、3min、4min、5min等。
优选地，所述震荡清洗的次数为至少两次，例如可以是2次、3次、4次、5次等。
优选地，步骤(2)中，所述培养基为无血清培养基。
优选地，步骤(2)中，所述脂肪细胞的接种量为15-25cm3，例如可以是15cm3、16cm3、17cm3、18cm3、19cm3、20cm3、21cm3、22cm3、23cm3、24cm3、25cm3等。
优选地，步骤(2)中，所述培养的温度为36.5-38℃，例如可以是36.5℃、37℃、37.5℃、38℃等，所述培养的气体为5％的二氧化碳，所述培养的时间为22-28h，例如可以是22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h等。
优选地，步骤(3)中，所述细胞悬液与氨甲环酸的体积与质量比为(20-30)mL:(4-15)mg；
其中，“20-30”例如可以是20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等；“4-15”例如可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等。
优选地，步骤(3)中，所述培养的温度为36.5-38℃，例如可以是36.5℃、37℃、37.5℃、38℃等，所述培养的气体为5％的二氧化碳，所述培养的时间为1-3h，例如可以是1h、1.5h、2h、2.5h、3h等。
优选地，步骤(3)中，所述收集具体包括以下步骤：收获培养后的外泌体，进行一次离心，收集上清液；再进行二次离心，收集上清液；最后进行三次离心，弃去上清液，收集沉淀物。
优选地，所述一次离心、二次离心、三次离心的温度各自独立地为0-8℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等。
优选地，所述一次离心的转速为1000-3000rpm，例如可以是1000rpm、1500rpm、2000rpm、2500rpm、3000rpm等，所述一次离心的时间为10-15min，例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
优选地，所述二次离心的转速为1000-3000rpm，例如可以是1000rpm、1500rpm、2000rpm、2500rpm、3000rpm等，所述二次离心的时间为30-40min，例如可以是30min、32min、34min、36min、38min、40min等。
优选地，所述三次离心的转速为8000-12000rpm，例如可以是8000rpm、9000rpm、10000rpm、11000rpm、12000rpm等，所述三次离心的时间为50-60min，例如可以是50min、52min、54min、56min、58min、60min等。
优选地，所述沉淀物还需采用7-10mLPBS(例如可以是7mL、7.5mL、8mL、8.5mL、9mL、9.5mL、10mL等)缓冲液进行初步悬浮，悬浮后进行总RNA浓度测定。
优选地，根据初步外泌体PBS悬浮液的总RNA浓度，采用PBS缓冲液进一步稀释，将最终外泌体的总RNA浓度稀释至15-30pg/mL，例如总RNA的浓度可以是15pg/mL、18pg/mL、21pg/mL、24pg/mL、27pg/mL、30pg/mL等。
第二方面，本发明提供一种外泌体，所述外泌体由第一方面所述外泌体的制备方法制备得到。
第三方面，本发明提供一种外泌体凝胶剂，所述外泌体凝胶剂包括第二方面所述的外泌体、海藻酸钠、氯化钙和PBS缓冲液。
优选地，所述外泌体凝胶剂中，外泌体总RNA的浓度为15-30pg/mL，海藻酸钠的质量浓度为2.8-3.4％，氯化钙的质量浓度为0.4-0.6％，溶剂为PBS缓冲液。
所述外泌体凝胶剂中，外泌体总RNA的浓度为15-30pg/mL，例如可以是15pg/mL、18pg/mL、21pg/mL、24pg/mL、27pg/mL、30pg/mL等。
所述外泌体凝胶剂中，海藻酸钠的质量浓度为2.8-3.4％，例如可以是2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％等。
所述外泌体凝胶剂中，氯化钙的质量浓度为0.4-0.6％，例如可以是0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％等。
第四方面，本发明提供一种第三方面所述外泌体凝胶剂的制备方法，所述外泌体凝胶剂的制备方法包括以下步骤：将外泌体、海藻酸钠和PBS缓冲液混合后，再与氯化钙混合，得到所述外泌体凝胶剂。
优选地，所述外泌体、海藻酸钠和PBS缓冲液混合的温度为4-25℃(例如可以是4℃、5℃、8℃、10℃、15℃、20℃、25℃等)，使用涡旋震荡器以1500-2000rpm(例如可以是1500rpm、1600rpm、1800rpm、2000rpm等)的速度，震荡3-10s(例如可以是3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s等)。
优选地，所述与氯化钙混合的温度为4-25℃(例如可以是4℃、5℃、8℃、10℃、15℃、20℃、25℃等)，使用涡旋震荡器以1500-2000rpm(例如可以是1500rpm、1600rpm、1800rpm、2000rpm等)的速度，震荡6-15s(例如可以是6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s、13s、14s、15s等)。
第五方面，本发明提供一种如第二方面所述的外泌体、或第三方面如所述的外泌体凝胶剂在制备用于修复烧伤创面的制剂中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述外泌体的有效成分包括自体间充质脂肪干细胞产生的外泌体及氨甲环酸的修饰；
(2)本发明所述外泌体凝胶剂能够促进创面愈合、并降低创面的黑色素沉着，减少创面愈合后的痕迹；
(3)本发明所述外泌体凝胶剂中氨甲环酸浓度应不低于25μg/mL、且RNA总量不低于15pg/mL。
附图说明
图1为氨甲环酸的浓度随时间的变化情况曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例和对比例中各组分来源如下所示：
Figure BDA0003327033480000081
实施例1
本实施例提供一种外泌体凝胶剂，所述外泌体凝胶剂由以下制备方法制备得到：
(1)取20.01mL的自体腹部脂肪组织(样本编号为S01025)用20mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化10min，轻轻震荡消化细胞悬浮液，移至离心管中；再在剩余组织再次用15mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化5min；轻轻震荡消化悬浮液，移至离心管中，合并收集得到的消化细胞悬浮液；
其中，所述胰蛋白酶消化液按质量百分含量计包括：0.1％的胰蛋白酶，溶剂为0.1mM、pH为8.0的EDTA溶液；
将收集的消化细胞悬浮液，以1000rpm离心3min，弃去上清液；加入10mL PBS缓冲液，震荡清洗后，1000rpm离心3min，弃去上清液；重复清洗步骤1次，得到脂肪细胞；
(2)将消化并清洗后的脂肪细胞使用25mL的无血清培养基(培养，培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度，培养时间为24h，得到细胞悬液；
(3)在培养24h的细胞悬液中添加6mg的氨甲环酸继续培养2h，收获外泌体，使用低温离心机，在4℃的温度下将培养液以2000rpm离心12min，取上清液；将上清液继续在4℃温度下以2000rpm离心35min，取上清液；将上清液在4℃下以10000rpm离心55min，弃除上清液，收集沉淀物；
(4)在沉淀物中加入12mL的PBS缓冲液，即可初步获得经氨甲环酸修饰的脂肪间充质来源的外泌体浓悬液；
(5)取1mL浓悬液样本测总RNA，浓度为50pg/mL，取10mL浓悬液样本添加10mL的PBS缓冲液，获得20mL外泌体悬液；
(6)在20mL得到的外泌体的PBS悬浮液中添加620mg的海藻酸钠，溶解并震荡均匀后，添加0.2mL含50mg的氯化钙双蒸水溶液，迅速震荡均匀，即得到20mL的外泌体凝胶制剂。
实施例2
本实施例提供一种外泌体凝胶剂，所述外泌体凝胶剂由以下制备方法制备得到：
(1)取21.43mL的自体腹部脂肪组织(样本编号为S01026)用20mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化10min，轻轻震荡消化细胞悬浮液，移至离心管中；再在剩余组织再次用15mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化5min；轻轻震荡消化悬浮液，移至离心管中，合并收集得到的消化细胞悬浮液；
其中，所述胰蛋白酶消化液按质量百分含量计包括：0.1％的胰蛋白酶，溶剂为0.1mM、pH为8.0的EDTA溶液；
将收集的消化细胞悬浮液，以1000rpm离心3min，弃去上清液；加入10mL PBS缓冲液，震荡清洗后，1000rpm离心3min，弃去上清液；重复清洗步骤1次，得到脂肪细胞；
(2)将消化并清洗后的脂肪细胞使用25mL的无血清培养基(培养，培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度，培养时间为24h，得到细胞悬液；
(3)在培养24h的细胞悬液中添加7mg的氨甲环酸继续培养2h，收获外泌体，使用低温离心机，在4℃的温度下将培养液以2000rpm离心12min，取上清液；将上清液继续在4℃温度下以2000rpm离心35min，取上清液；将上清液在4℃下以10000rpm离心55min，弃除上清液，收集沉淀物；
(4)在沉淀物中加入12mL的PBS缓冲液，即可获得经氨甲环酸修饰的脂肪间充质来源的外泌体浓悬液；
(5)取1mL浓悬液样本测总RNA，浓度为42pg/mL，取10mL浓悬液样本添加10mL的PBS缓冲液，获得20mL外泌体悬液；
(6)在20mL得到的外泌体的PBS悬浮液中添加620mg的海藻酸钠，溶解并震荡均匀后，添加0.2mL含50mg的氯化钙双蒸水溶液，迅速震荡均匀，即得到20mL的外泌体凝胶制剂。
实施例3
本实施例提供一种外泌体凝胶剂，所述外泌体凝胶剂由以下制备方法制备得到：
(1)取16.23mL的自体腹部脂肪组织(样本编号为S01028)用15mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化10min，轻轻震荡消化细胞悬浮液，移至离心管中；再在剩余组织再次用15mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化5min；轻轻震荡消化悬浮液，移至离心管中，合并收集得到的消化细胞悬浮液；
其中，所述胰蛋白酶消化液按质量百分含量计包括：0.1％的胰蛋白酶，溶剂为0.1mM、pH为8.0的EDTA溶液；
将收集的消化细胞悬浮液，以1000rpm离心3min，弃去上清液；加入10mL PBS缓冲液，震荡清洗后，1000rpm离心3min，弃去上清液；重复清洗步骤1次，得到脂肪细胞；
(2)将消化并清洗后的脂肪细胞使用25mL的无血清培养基(培养，培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度，培养时间为24h，得到细胞悬液；
(3)在培养24h的细胞悬液中添加6mg的氨甲环酸继续培养2h，收获外泌体，使用低温离心机，在4℃的温度下将培养液以2000rpm离心15min，取上清液；将上清液继续在4℃温度下以2000rpm离心40min，取上清液；将上清液在4℃下以10000rpm离心60min，弃除上清液，收集沉淀物；
(4)在沉淀物中加入11mL的PBS缓冲液，即可获得经氨甲环酸修饰的脂肪间充质来源的外泌体浓悬液；
(5)取1mL浓悬液样本测总RNA，浓度为24pg/mL，取10mL浓悬液样本添加15mL的PBS缓冲液，获得15mL外泌体悬液；
(6)取15mL得到的外泌体的PBS悬浮液中添加465mg的海藻酸钠，溶解并震荡均匀后，添加0.15mL含50mg的氯化钙双蒸水溶液，迅速震荡均匀，即得到15mL的外泌体凝胶制剂。
实施例4
本实施例提供一种外泌体凝胶剂，所述外泌体凝胶剂由以下制备方法制备得到：
(1)取11.92mL的自体腹部脂肪组织(样本编号为S01029)用15mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化10min，轻轻震荡消化细胞悬浮液，移至离心管中；再在剩余组织再次用10mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化5min；轻轻震荡消化悬浮液，移至离心管中，合并收集得到的消化细胞悬浮液；
其中，所述胰蛋白酶消化液按质量百分含量计包括：0.1％的胰蛋白酶，溶剂为0.1mM、pH为8.0的EDTA溶液；
将收集的消化细胞悬浮液，以1000rpm离心3min，弃去上清液；加入10mL PBS缓冲液，震荡清洗后，1000rpm离心3min，弃去上清液；重复清洗步骤1次，得到脂肪细胞；
(2)将消化并清洗后的脂肪细胞使用25mL的无血清培养基(培养，培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度，培养时间为24h，得到细胞悬液；
(3)在培养24h的细胞悬液中添加4mg的氨甲环酸继续培养2h，收获外泌体，使用低温离心机，在4℃的温度下将培养液以2000rpm离心15min，取上清液；将上清液继续在4℃温度下以2000rpm离心40min，取上清液；将上清液在4℃下以10000rpm离心60min，弃除上清液，收集沉淀物；
(4)在沉淀物中加入9mL的PBS缓冲液，即可获得经氨甲环酸修饰的脂肪间充质来源的外泌体浓悬液；
(5)取1mL浓悬液样本测总RNA，浓度为17pg/mL，取8mL浓悬液样本添加7mL的PBS缓冲液，获得15mL外泌体悬液；
(6)取15mL得到的外泌体的PBS悬浮液中添加465mg的海藻酸钠，溶解并震荡均匀后，添加0.15mL含50mg的氯化钙双蒸水溶液，迅速震荡均匀，即得到15mL的外泌体凝胶制剂。
结果：因脂肪组织取样量不足，最终制剂的总RNA含量仅为9pg/mL，不符合制备要求。
实施例5
本实施例提供一种外泌体凝胶剂，所述外泌体凝胶剂由以下制备方法制备得到：
(1)取13.46mL的自体腹部脂肪组织(样本编号为S01030)用15mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化10min，轻轻震荡消化细胞悬浮液，移至离心管中；再在剩余组织再次用10mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化5min；轻轻震荡消化悬浮液，移至离心管中，合并收集得到的消化细胞悬浮液；
其中，所述胰蛋白酶消化液按质量百分含量计包括：0.1％的胰蛋白酶，溶剂为0.1mM、pH为8.0的EDTA溶液；
将收集的消化细胞悬浮液，以1000rpm离心3min，弃去上清液；加入10mL PBS缓冲液，震荡清洗后，1000rpm离心3min，弃去上清液；重复清洗步骤1次，得到脂肪细胞；
(2)将消化并清洗后的脂肪细胞使用25mL的无血清培养基(培养，培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度，培养时间为24h，得到细胞悬液；
(3)在培养24h的细胞悬液中添加5mg的氨甲环酸继续培养2h，收获外泌体，使用低温离心机，在4℃的温度下将培养液以2000rpm离心15min，取上清液；将上清液继续在4℃温度下以2000rpm离心40min，取上清液；将上清液在4℃下以10000rpm离心60min，弃除上清液，收集沉淀物；
(4)在沉淀物中加入10mL的PBS缓冲液，即可获得经氨甲环酸修饰的脂肪间充质来源的外泌体浓悬液；
(5)取1mL浓悬液样本测总RNA，浓度为15pg/mL，取9mL浓悬液样本添加6mL的PBS缓冲液，获得15mL外泌体悬液；
(6)取15mL得到的外泌体的PBS悬浮液中添加465mg的海藻酸钠，溶解并震荡均匀后，添加0.15mL含50mg的氯化钙双蒸水溶液，迅速震荡均匀，即得到15mL的外泌体凝胶制剂。
结果：因脂肪组织取样量不足，最终制剂的总RNA含量仅为9pg/mL，不符合制备要求。
实施例6
本实施例提供一种外泌体凝胶剂，所述外泌体凝胶剂由以下制备方法制备得到：
(1)取17.00mL的自体腹部脂肪组织(样本编号为S01033)用20mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化10min，轻轻震荡消化细胞悬浮液，移至离心管中；再在剩余组织再次用15mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化5min；轻轻震荡消化悬浮液，移至离心管中，合并收集得到的消化细胞悬浮液；
其中，所述胰蛋白酶消化液按质量百分含量计包括：0.1％的胰蛋白酶，溶剂为0.1mM、pH为8.0的EDTA溶液；
将收集的消化细胞悬浮液，以1000rpm离心3min，弃去上清液；加入10mL PBS缓冲液，震荡清洗后，1000rpm离心3min，弃去上清液；重复清洗步骤1次，得到脂肪细胞；
(2)将消化并清洗后的脂肪细胞使用25mL的无血清培养基(培养，培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度，培养时间为24h，得到细胞悬液；
(3)在培养24h的细胞悬液中添加7mg的氨甲环酸继续培养2h，收获外泌体，使用低温离心机，在4℃的温度下将培养液以2000rpm离心12min，取上清液；将上清液继续在4℃温度下以2000rpm离心35min，取上清液；将上清液在4℃下以10000rpm离心55min，弃除上清液，收集沉淀物；
(4)在沉淀物中加入9mL的PBS缓冲液，即可获得经氨甲环酸修饰的脂肪间充质来源的外泌体浓悬液；
(5)取1mL浓悬液样本测总RNA，浓度为36pg/mL，取8mL浓悬液样本添加7mL的PBS缓冲液，获得15mL外泌体悬液；
(6)取15mL得到的外泌体的PBS悬浮液中添加465mg的海藻酸钠，溶解并震荡均匀后，添加0.15mL含50mg的氯化钙双蒸水溶液，迅速震荡均匀，即得到15mL的外泌体凝胶制剂。
实施例7
本实施例提供一种外泌体凝胶剂，所述外泌体凝胶剂由以下制备方法制备得到：
(1)取19.01mL的自体腹部脂肪组织(样本编号为S01034)用20mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化10min，轻轻震荡消化细胞悬浮液，移至离心管中；再在剩余组织再次用15mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化5min；轻轻震荡消化悬浮液，移至离心管中，合并收集得到的消化细胞悬浮液；
其中，所述胰蛋白酶消化液按质量百分含量计包括：0.1％的胰蛋白酶，溶剂为0.1mM、pH为8.0的EDTA溶液；
将收集的消化细胞悬浮液，以1000rpm离心3min，弃去上清液；加入10mL PBS缓冲液，震荡清洗后，1000rpm离心3min，弃去上清液；重复清洗步骤1次，得到脂肪细胞；
(2)将消化并清洗后的脂肪细胞使用25mL的无血清培养基(培养，培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度，培养时间为24h，得到细胞悬液；
(3)在培养24h的细胞悬液中添加7mg的氨甲环酸继续培养2h，收获外泌体，使用低温离心机，在4℃的温度下将培养液以2000rpm离心12min，取上清液；将上清液继续在4℃温度下以2000rpm离心35min，取上清液；将上清液在4℃下以10000rpm离心55min，弃除上清液，收集沉淀物；
(4)在沉淀物中加入12mL的PBS缓冲液，即可获得经氨甲环酸修饰的脂肪间充质来源的外泌体浓悬液；
(5)取1mL浓悬液样本测总RNA，浓度为34pg/mL，取10mL浓悬液样本添加10mL的PBS缓冲液，获得20mL外泌体悬液；
(6)取20mL得到的外泌体的PBS悬浮液中添加620mg的海藻酸钠，溶解并震荡均匀后，添加0.2mL含50mg的氯化钙双蒸水溶液，迅速震荡均匀，即得到20mL的外泌体凝胶制剂。
实施例8
本实施例提供一种外泌体凝胶剂，所述外泌体凝胶剂由以下制备方法制备得到：
(1)取26.20mL的自体腹部脂肪组织(样本编号为S01040)用25mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化10min，轻轻震荡消化细胞悬浮液，移至离心管中；再在剩余组织再次用15mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化5min；轻轻震荡消化悬浮液，移至离心管中，合并收集得到的消化细胞悬浮液；
其中，所述胰蛋白酶消化液按质量百分含量计包括：0.1％的胰蛋白酶，溶剂为0.1mM、pH为8.0的EDTA溶液；
将收集的消化细胞悬浮液，以1000rpm离心3min，弃去上清液；加入10mL PBS缓冲液，震荡清洗后，1000rpm离心3min，弃去上清液；重复清洗步骤1次，得到脂肪细胞；
(2)将消化并清洗后的脂肪细胞使用25mL的无血清培养基(培养，培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度，培养时间为24h，得到细胞悬液；
(3)在培养24h的细胞悬液中添加9mg的氨甲环酸继续培养2h，收获外泌体，使用低温离心机，在4℃的温度下将培养液以2000rpm离心10min，取上清液；将上清液继续在4℃温度下以2000rpm离心35min，取上清液；将上清液在4℃下以10000rpm离心50min，弃除上清液，收集沉淀物；
(4)在沉淀物中加入15mL的PBS缓冲液，即可获得经氨甲环酸修饰的脂肪间充质来源的外泌体浓悬液；
(5)取1mL浓悬液样本测总RNA，浓度为40pg/mL，取10mL浓悬液样本添加10mL的PBS缓冲液，获得20mL外泌体悬液；
(5)取20mL得到的外泌体的PBS悬浮液中添加620mg的海藻酸钠，溶解并震荡均匀后，添加0.2mL含50mg的氯化钙双蒸水溶液，迅速震荡均匀，即得到20mL的外泌体凝胶制剂。
实施例9
本实施例提供一种外泌体凝胶剂，所述外泌体凝胶剂由以下制备方法制备得到：
(1)取18.35mL的自体腹部脂肪组织(样本编号为S01041)用20mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化10min，轻轻震荡消化细胞悬浮液，移至离心管中；再在剩余组织再次用15mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化5min；轻轻震荡消化悬浮液，移至离心管中，合并收集得到的消化细胞悬浮液；
其中，所述胰蛋白酶消化液按质量百分含量计包括：0.1％的胰蛋白酶，溶剂为0.1mM、pH为8.0的EDTA溶液；
将收集的消化细胞悬浮液，以1000rpm离心3min，弃去上清液；加入10mL PBS缓冲液，震荡清洗后，1000rpm离心3min，弃去上清液；重复清洗步骤1次，得到脂肪细胞；
(2)将消化并清洗后的脂肪细胞使用25mL的无血清培养基(培养，培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度，培养时间为24h，得到细胞悬液；
(3)在培养24h的细胞悬液中添加7mg的氨甲环酸继续培养2h，收获外泌体，使用低温离心机，在4℃的温度下将培养液以2000rpm离心15min，取上清液；将上清液继续在4℃温度下以2000rpm离心40min，取上清液；将上清液在4℃下以10000rpm离心55min，弃除上清液，收集沉淀物；
(4)在沉淀物中加入12mL的PBS缓冲液，即可获得经氨甲环酸修饰的脂肪间充质来源的外泌体浓悬液；
(5)取1mL浓悬液样本测总RNA，浓度为35pg/mL，取10mL浓悬液样本添加5mL的PBS缓冲液，获得15mL外泌体悬液；
(6)取15mL得到的外泌体的PBS悬浮液中添加465mg的海藻酸钠，溶解并震荡均匀后，添加0.15mL含50mg的氯化钙双蒸水溶液，迅速震荡均匀，即得到15mL的外泌体凝胶制剂。
实施例10
本实施例提供一种外泌体凝胶剂，所述外泌体凝胶剂由以下制备方法制备得到：
(1)取29.09mL的自体腹部脂肪组织(样本编号为S01048)用25mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化10min，轻轻震荡消化细胞悬浮液，移至离心管中；再在剩余组织再次用20mL的胰蛋白酶消化液消化，在37℃消化5min；轻轻震荡消化悬浮液，移至离心管中，合并收集得到的消化细胞悬浮液；
其中，所述胰蛋白酶消化液按质量百分含量计包括：0.1％的胰蛋白酶，溶剂为0.1mM、pH为8.0的EDTA溶液；
将收集的消化细胞悬浮液，以1000rpm离心3min，弃去上清液；加入10mL PBS缓冲液，震荡清洗后，1000rpm离心3min，弃去上清液；重复清洗步骤1次，得到脂肪细胞；
(2)将消化并清洗后的脂肪细胞使用25mL的无血清培养基(培养，培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度，培养时间为24h，得到细胞悬液；
(3)在培养24h的细胞悬液中添加10mg的氨甲环酸继续培养2h，收获外泌体，使用低温离心机，在4℃的温度下将培养液以2000rpm离心10min，取上清液；将上清液继续在4℃温度下以2000rpm离心35min，取上清液；将上清液在4℃下以10000rpm离心50min，弃除上清液，收集沉淀物；
(4)在沉淀物中加入12mL的PBS缓冲液，即可获得经氨甲环酸修饰的脂肪间充质来源的外泌体；
(5)取1mL浓悬液样本测总RNA，浓度为44pg/mL，取10mL浓悬液样本添加10mL的PBS缓冲液，获得20mL外泌体悬液；
(6)取20mL得到的外泌体的PBS悬浮液中添加620mg的海藻酸钠，溶解并震荡均匀后，添加0.2mL含50mg的氯化钙双蒸水溶液，迅速震荡均匀，即得到20mL的外泌体凝胶制剂。
测试例1
氨甲环酸的含量测试
氨甲环酸的含量采用衍生物超高效液相色谱法(ULPC)检测，具体检测方法如下：
(1)配制衍生试剂配制：邻苯二甲醛30mg溶解于1mL甲醇；另取0.26g亚硫酸钠溶解于1mL双蒸水；混合邻苯二甲醛和亚硫酸钠溶液，加入0.1mol/L pH 10硼砂缓冲液定容至200mL，仅限24h使用；
(2)标准曲线样本：使用氨甲环酸配置浓度分别为0、10、20、30、40、50μg/mL的氨甲环酸PBS溶液；
(3)取1mL的外泌体PBS悬浮液，加入1mL衍生试剂，混匀后反应15min；
其中，所述外泌体PBS悬浮液分别为实施例1-10及对比例1的步骤(4)最终获得的产品；
(4)取1μL的氨甲环酸衍生化样本，使用WatersAcquity ULPC BEH C18色谱柱，检测温度37℃，控制检测电压为500mV，流量为0.55mL/min流动相(乙腈:28mmol/L乙酸铵溶液＝2:8，pH为4.1)等度洗脱，预计色谱出峰时间为2min 05s～2min 15s；具体测试结果如下表1所示：
表1
Figure BDA0003327033480000201
由表1测试数据可知，本发明所述外泌体制剂中氨甲环酸浓度应不低于25μg/mL符合标准。其中，图1为氨甲环酸的浓度随着时间的变化情况，如图1所示，脂肪组织、无血清培养基培养22h，氨甲环酸50mg共培养2h，制备的外泌体PBS悬浮液体积为20mL。研究发现，氨甲环酸共培养90min后，外泌体制剂中氨甲环酸的浓度接近峰值。
测试例2
总RNA含量测试
以总RNA含量评估外泌体的收获质量，RNA的浓度检测采用分光光度法检测，抽提试剂盒为InvitrogenPureLink RNA微量提取试剂盒(货号12183016)，具体检测方法如下：
(1)吸取1mL的外泌体制剂在0～8℃下以15000rpm离心60min，弃上清；
(2)加入100μL的裂解液将外泌体沉淀物重悬，静置5min；
(3)向100μL的裂解物中加入50μL的乙醇充分混匀，混匀后的裂解物-乙醇溶液加入到micro filter CartridgeAssembly并盖好，以13000rpm离心10s，弃去流穿液；
(4)向micro filter Cartridge中加入180μL的Wash Solution1，13000rpm离心10s，弃去流穿液；
(5)向micro filter Cartridge中加入180μL的Wash Solution2/3，13000rpm离心10s，弃去流穿液；
(6)重复步骤5；
(7)将micro filter Cartridge放置干净的收集管中，13000rpm离心60s，弃去残液，并干燥micro filter Cartridge 60s；
(8)将micro filter Cartridge放入干净的洗脱管中，加入10μL的预热的洗脱液，室温孵育60s；
(9)13000rpm离心30s，获得的RNA，再次向micro filter Cartridge加入10μL的预热的洗脱液，室温孵育60s；
(10)RNA总量测定，吸取全部RNA溶液(约20μL)，溶液不经稀释直接测定测定260nm的吸光值(OD)，以每OD约40ng/μL计算RNA含量；
具体测试结果如下表2所示：
表2
Figure BDA0003327033480000221
由表2测试数据可知，本发明所述外泌体制剂中RNA浓度应不低于15pg/mL。由此充分说明，本发明所述外泌体制剂的有效成分包括自体间充质脂肪干细胞产生的外泌体及氨甲环酸的修饰，且烧伤创面修复的外泌体制剂，需要能够促进创面愈合、并降低创面的黑色素沉着，减少创面愈合后的痕迹。
测试例3
小鼠创面愈合率测试
选择8只6周大雌性的SPF级BALB/6J小鼠，用3％的戊巴比妥钠将小鼠麻醉，麻醉剂量为30mg/kg，使用含巯基乙醇的脱毛膏将小鼠背部两侧脱毛，每个脱毛区域＞1cm2，用90℃恒温恒压电热热源烫15s致成深II度烫伤，烫伤直径为0.4cm圆形(面积为0.5cm2)。
使用S01034和S01048样本用于小鼠烫伤愈合测试，小鼠左侧烫伤伤口使用外泌体凝胶制剂样本，右侧烫伤伤口使用PBS凝胶，每次使用量为0.2mL，涂抹于烫伤处，每12小时涂抹1次，观察第0、7、14、21天的伤口愈合面积，伤口愈合率的计算公式：伤口愈合率(％)＝(伤口初始面积-测量时伤口面积)/伤口初始面积×100％。
测试结果如表3所示：
表3
Figure BDA0003327033480000231
Figure BDA0003327033480000241
由表3测试数据可知，全部小鼠第21天愈合率在90％以上，部分小鼠的愈合率可达到100％，这说明本发明所述外泌体的来源为自体脂肪间充质干细胞，能够将干细胞的核酸、蛋白、脂质及信号分子转运给靶细胞，发挥类似于干细胞在烧伤创面修复中的功能，且所述外泌体凝胶剂能够促进创面愈合、并降低创面的黑色素沉着，减少创面愈合后的痕迹。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明所述外泌体的制备方法及由其制备得到的外泌体和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种外泌体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)采用胰蛋白酶消化液对自体脂肪组织消化后，清洗，得到脂肪细胞；
(2)将步骤(1)得到的脂肪细胞置于培养基中培养，得到细胞悬液；
(3)将步骤(2)得到的细胞悬液与氨甲环酸混合后培养，收集，得到氨甲环酸修饰的自体间充质脂肪干细胞产生的外泌体。
2.根据权利要求1所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述胰蛋白酶消化液和自体脂肪组织的体积比为(15-25):(25-50)；
优选地，步骤(1)中，所述胰蛋白酶消化液包括：胰蛋白酶和EDTA溶液；
优选地，所述胰蛋白酶消化液中胰蛋白酶的质量百分含量为0.05-0.2％；
优选地，所述EDTA溶液的浓度为0.05-0.15mM；
优选地，所述EDTA溶液的pH为7.5-8.5；
优选地，步骤(1)中，所述自体脂肪组织为自体腹部脂肪组织。
3.根据权利要求1或2所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消化具体包括以下步骤：将自体脂肪组织与部分胰蛋白酶消化液混合，进行一次消化，收集部分消化细胞悬浮液；再将剩余未消化的自体脂肪组织与剩余胰蛋白酶消化液混合，进行二次消化，合并收集，得到消化细胞悬浮液；
优选地，所述自体脂肪组织、部分胰蛋白酶消化液、剩余胰蛋白酶消化液的体积比为(15-25):(15-30):(10-20)；
优选地，所述一次消化的温度为36.5-38℃，一次消化的时间为8-12min；
优选地，所述二次消化的温度为36.5-38℃，二次消化的时间为4-10min；
优选地，所述清洗具体包括以下步骤：将消化细胞悬浮液离心后，弃去上清液，加入PBS缓冲液，震荡清洗，得到脂肪细胞；
优选地，所述离心的转速为800-1500rpm，离心的时间为2-5min；
优选地，所述震荡清洗的次数为至少两次。
4.根据权利要求1-3中任一项所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养基为无血清培养基；
优选地，步骤(2)中，所述脂肪来源细胞的接种量为15-25cm3；
优选地，步骤(2)中，所述培养的温度为36.5-38℃，培养的气体为5％的二氧化碳，培养的时间为20-28h。
5.根据权利要求1-4中任一项所述外泌体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述细胞悬液与氨甲环酸的体积与质量比为(20-30)mL:(4-15)mg；
优选地，步骤(3)中，所述培养的温度为36.5-38℃，培养的气体为5％的二氧化碳，培养的时间为1-3h；
优选地，步骤(3)中，所述收集具体包括以下步骤：收获培养后的外泌体，进行一次离心，收集上清液；再进行二次离心，收集上清液；最后进行三次离心，弃去上清液，收集沉淀物；
优选地，所述一次离心、二次离心、三次离心的温度各自独立地为0-8℃；
优选地，所述一次离心的转速为1000-3000rpm，一次离心的时间为10-15min；
优选地，所述二次离心的转速为1000-3000rpm，二次离心的时间为30-40min；
优选地，所述三次离心的转速为8000-12000rpm，三次离心的时间为50-60min；
优选地，所述沉淀物还需采用7-10mL的PBS缓冲液进行初步悬浮，悬浮后进行总RNA浓度测定；
优选地，根据初步外泌体PBS悬浮液的总RNA浓度，采用PBS缓冲液进一步稀释，将最终外泌体的总RNA浓度稀释至15-30pg/mL。
6.一种外泌体，其特征在于，所述外泌体由权利要求1-5中任一项所述外泌体的制备方法制备得到。
7.一种外泌体凝胶剂，其特征在于，所述外泌体凝胶剂包括权利要求6所述的外泌体、海藻酸钠、氯化钙和PBS缓冲液。
8.根据权利要求7所述的外泌体凝胶剂，其特征在于，所述外泌体凝胶剂中，总RNA的浓度为15-30pg/mL，海藻酸钠的质量浓度为2.8-3.4％，氯化钙的质量浓度为0.4-0.6％，溶剂为PBS缓冲液。
9.根据权利要求7或8所述的外泌体凝胶剂的制备方法，其特征在于，所述外泌体凝胶剂的制备方法包括以下步骤：将外泌体、海藻酸钠和PBS缓冲液混合后，再与氯化钙混合，得到所述外泌体凝胶剂；
优选地，所述外泌体、海藻酸钠和PBS缓冲液混合的温度为4-25℃，使用涡旋振荡器以1500-2000rpm的速度，震荡3-10s；
优选地，所述与氯化钙混合的温度为4-25℃，使用涡旋振荡器以1500-2000rpm的速度，震荡6-15s。
10.一种根据权利要求6所述的外泌体、或权利要求7所述的外泌体凝胶剂在制备用于修复烧伤创面的制剂中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114939098A (zh) * 2022-05-19 2022-08-26 明德南加(成都)生物技术有限公司 一种负载外泌体的水凝胶及其制备方法和应用
CN115386543A (zh) * 2022-07-19 2022-11-25 长春科技学院 一种鹿茸干细胞外泌体及其制备方法和应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106265741A (zh) * 2016-10-11 2017-01-04 青岛大学 一种促进皮肤伤口愈合的生物制剂
CN108893442A (zh) * 2018-07-25 2018-11-27 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脂肪干细胞增殖培养基及其增殖培养方法
US20190046573A1 (en) * 2015-09-07 2019-02-14 Eduardo ALVARO GALUE Process for obtaining a sprinkling compound of microvascular endothelial skin cells and mesenchymal stem cells and method of application for tissue regeneration
CN110396497A (zh) * 2019-07-31 2019-11-01 北京添易医学研究院 基于自体脂肪干细胞外泌体的制备及美容方法
CN110507668A (zh) * 2019-09-30 2019-11-29 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 用于治疗免疫性疾病的干细胞制剂及其应用
CN112220736A (zh) * 2020-11-20 2021-01-15 成都武侯睐美医疗美容门诊部有限公司 一种美白嫩肤祛皱护肤品及其制备方法
CN112891297A (zh) * 2021-03-25 2021-06-04 武汉美吉高科生物科技有限公司 一种改善皮肤光泽度的蛋白复配液及制备方法
CN113509433A (zh) * 2021-09-01 2021-10-19 杜德(江门)生物科技有限公司 美白组合物及其制剂和美白方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190046573A1 (en) * 2015-09-07 2019-02-14 Eduardo ALVARO GALUE Process for obtaining a sprinkling compound of microvascular endothelial skin cells and mesenchymal stem cells and method of application for tissue regeneration
CN106265741A (zh) * 2016-10-11 2017-01-04 青岛大学 一种促进皮肤伤口愈合的生物制剂
CN108893442A (zh) * 2018-07-25 2018-11-27 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脂肪干细胞增殖培养基及其增殖培养方法
CN110396497A (zh) * 2019-07-31 2019-11-01 北京添易医学研究院 基于自体脂肪干细胞外泌体的制备及美容方法
CN110507668A (zh) * 2019-09-30 2019-11-29 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 用于治疗免疫性疾病的干细胞制剂及其应用
CN112220736A (zh) * 2020-11-20 2021-01-15 成都武侯睐美医疗美容门诊部有限公司 一种美白嫩肤祛皱护肤品及其制备方法
CN112891297A (zh) * 2021-03-25 2021-06-04 武汉美吉高科生物科技有限公司 一种改善皮肤光泽度的蛋白复配液及制备方法
CN113509433A (zh) * 2021-09-01 2021-10-19 杜德(江门)生物科技有限公司 美白组合物及其制剂和美白方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAO YUAN ET AL.: "Tranexamic acid accelerates skin barrier recovery and upregulates occludin in damaged skin", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF DERMATOLOGY》, vol. 53, no. 8, pages 959 - 965, XP071191537, DOI: 10.1111/ijd.12099 *
柯昌能;郭小宝;唐世杰;易先锋;朱镇森;: "真皮多能干细胞对皮肤创面神经修复的影响", 《实用医学杂志》, vol. 25, no. 12, pages 1931 - 1933 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114939098A (zh) * 2022-05-19 2022-08-26 明德南加(成都)生物技术有限公司 一种负载外泌体的水凝胶及其制备方法和应用
CN114939098B (zh) * 2022-05-19 2023-09-26 明德南加(成都)生物技术有限公司 一种负载外泌体的水凝胶及其制备方法和应用
CN115386543A (zh) * 2022-07-19 2022-11-25 长春科技学院 一种鹿茸干细胞外泌体及其制备方法和应用
CN115386543B (zh) * 2022-07-19 2024-02-02 长春科技学院 一种鹿茸干细胞外泌体及其制备方法和应用

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