CN114042032B - 一种实现核酸皮肤递送的药物制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种实现核酸皮肤递送的药物制剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种实现核酸皮肤递送的药物制剂及其制备方法和应用，属于药物制剂技术领域。本发明药物制剂包括药物活性成分和载体材料；载体材料包括碳酸氢胆碱‑香叶酸共聚物和/或碳酸氢胆碱‑苯丙酸共聚物。本发明所用载体材料具有可调性、广泛适用性和卓越的安全性等许多潜在优点，用于局部经皮给药，能够显著增强药物活性成分。本发明提供的载体材料不引起免疫因子水平升高，安全性好，同时能够显著增强mRNA对皮肤的渗透作用；本发明实施例中提供的EGF‑mRNA共聚物制剂能够显著促进小鼠皮肤伤口愈合，同时，AUX‑1‑mRNA共聚物制剂、COL1A2‑mRNA共聚物制剂均显著提高了递送效率，能够有效提高药物治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，尤其涉及一种实现核酸皮肤递送的药物制剂及其制备方法和应用。
背景技术
某些遗传学或免疫性皮肤疾病，目前并没有很好的治愈手段，核酸药物介导的基因治疗可能是有效的解决办法之一。目前，经局部皮肤递送核酸药物的技术尚不成熟，因为核酸的分子量很高，并且容易降解，很难实现稳定、有效的递送。一些报告已经展示了使用球形核酸和自组装框架核酸等技术局部递送小RNA(El-Sagheer A H,Brown T.ClickNucleic Acid Ligation:Applications in Biology andNanotechnology[J].AccountsofChemical Research,2012,45(8):1258；Mokhtarzadeh A,Vahidnezhad H,YoussefianL,Mosafer J,Baradaran B,Uitto J.Applications of Spherical Nucleic AcidNanoparticles as Delivery Systems.Trends Mol Med.2019,25(12):1066-1079.)。微针也被用于局部递送核酸药物；电穿孔法和肽载体法也在探索中(Xt B,Fei J B,Ping WA,etal.Nucleic acid-based drug delivery strategies-ScienceDirect[J].Journal ofControlled Release,2020,323:240-252.)。
表皮生长因子(EGF)是一种人体自有的广泛存在于皮肤细胞内的小分子蛋白，是由53个氨基酸组成的活性多肽，其分子量为6216道尔顿。表皮生长因子(EGF)作为一种有丝分裂源，能够促进细胞分裂分化，促进表皮创伤愈合。EGF可促进钾离子、脱氧葡萄糖、α-氨基异丁酸等小分子物质的运转，增加细胞外基质的合成和分泌，促进RNA，DNA和蛋白质合成，从而为人体表皮细胞的增殖与分化提供能量，有效的刺激表皮细胞的生长，增强细胞新陈代谢能力。临床主要用于治疗皮肤II度以上烧伤、烫伤、溃疡，抗菌、消炎、自然生长皮肤，痊愈快、不留疤痕。
通过局部应用mRNA药物是一种有效且副作用低的治疗选择，具有安全、无创、患者依从性好等优势。但是这一方法的最大挑战是，只有少数满足低分子量(<500dal)及高辛醇-水分配系数的药物才能成功局部给药；包括核酸在内的生物大分子的经皮局部递送仍然具有挑战性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于实现核酸皮肤递送的药物制剂及其制备方法和应用；本发明提供的药物制剂能够稳定、有效地将核酸药物透过皮肤递送至皮下组织。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种实现核酸皮肤递送的药物制剂，包括药物活性成分和载体材料，所述载体材料包括碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和/或碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物。
优选的，所述药物活性成分还包括mRNA。
优选的，所述mRNA和载体材料的质量比为1：500～1：2000。
优选的，当所述载体材料包括碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物时，所述碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物的质量比为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。
优选的，所述mRNA包括EGF-mRNA、COL1A2-mRNA和AUX-1-mRNA中的一种或多种。
优选的，所述碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物的制备方法包括：
将香叶酸乙醇溶液和碳酸氢胆碱水溶液混合进行聚合反应，得到碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物；所述香叶酸和碳酸氢胆碱的质量比1:1～5:1；
所述碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物的制备方法包括：
将苯丙酸乙醇溶液和碳酸氢胆碱水溶液混合进行聚合反应，得到碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物；所述苯丙酸和碳酸氢胆碱的质量比1:1～5:1。
本发明还提供了一种实现核酸皮肤递送的药物制剂的制备方法，包括以下步骤：
将前述技术方案药物制剂中所述载体材料和mRNA混合后利用透析袋透析，得到所述药物制剂。
优选的，所述透析袋的材料的截留分子量为8000～10000D，所述透析的时间为65～80h。
本发明还提供了上述方案得到的药物制剂在制备治疗皮肤病的药物及在制备补充皮肤细胞外基质产品中的应用。
优选的，所述皮肤病包括皮肤损伤、橘皮征或银屑病。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种实现核酸皮肤递送的药物制剂，包括药物活性成分和载体材料，所述载体材料包括碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和/或碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物。本发明所用载体材料是一类通用经皮给药的载体材料，与药物活性成分制得的药物制剂具有较强的皮肤穿透能力，能够显著增强药物活性成分，尤其是核酸，对皮肤的渗透作用；所述的载体材料原料为碳酸氢胆碱和香叶酸，或者碳酸氢胆碱和苯丙酸，或者为碳酸氢胆碱、香叶酸和苯丙酸。本发明所述载体材料的组分以及组分的用量可以在一定范围内进行调整，可调性强，并且使用本发明所述载体材料可以递送编码任意蛋白的mRNA，实现针对不同靶点的治疗，具有广泛适用性，安全系数高。
根据实施例记载，本发明提供的制剂材料不引起免疫因子水平升高，安全性好，同时能够显著增强mRNA对皮肤的渗透作用；外敷本发明实施例中提供的EGF-mRNA共聚物制剂能够显著促进小鼠皮肤伤口愈合，同时，AUX-1-mRNA共聚物制剂、COL1A2-mRNA共聚物制剂均显著提高了递送效率，能够有效提高药物对相应疾病的治疗效果。其中，AUX-1-mRNA共聚物制剂能够有效治疗橘皮征COL1A2-mRNA共聚物制剂能够有效提高补充皮肤细胞外基质的效果。
附图说明
图1为本发明提供的实现核酸皮肤递送的药物制剂的结构示意图；
图2-3为定量PCR实验检测本发明提供的制剂材料CCC(制剂材料CAGE-N+CAPA-N，其中N为1、2、3、4或5)对mRNA的递送效率结果；
图4为实施例4中涂抹luc mRNA-CCC制剂，24h后荧光成像结果；
图5为实施例5中涂抹luc mRNA-CCC制剂，48h后炎症因子TNFa含量检测结果；
图6为实施例6中涂抹EGF mRNA-CCC制剂，10天后观察皮肤损伤修复情况；
图7为实施例7种涂抹COL1A2 mRNA-CCC和AUX-1mRNA-CCC后的递送效率。
具体实施方式
本发明提供了一种实现核酸皮肤递送的药物制剂，包括药物活性成分和载体材料，所述载体材料包括碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和/或碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物。
在本发明中，所述碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和/或碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物与药物活性成分制得的药物制剂具有较强的皮肤穿透能力，能够显著增强药物活性成分对皮肤的渗透作用。
在本发明中，当所述制剂材料包括碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物时，所述碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物的体积比优选为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)，进一步优选为(0.9～1.1)：(0.9～1.1)，更优选为1:1。
本发明对所述碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的或自行制备得到。
在本发明中，当采用自行制备方式提供碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物时，所述香叶酸和碳酸氢胆碱的摩尔比优选为1：1～5：1，进一步优选为1.5：1～2.5：1，更优选为2:1；在本发明的实施例中，可选择1：1～5：1范围内任意比值，具体的为1:1、1.25:1、5:3、2.5:1、3:1、3.25:1、3.5:1、3.75:1、4:1、4.25:1、4.5:1、4.75:1或5:1等。在本发明中，所述碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物的制备方法优选包括：将香叶酸乙醇溶液和碳酸氢胆碱水溶液混合进行聚合反应，得到碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物。在本发明中，所述香叶酸乙醇溶液中香叶酸的质量百分含量优选为65％～75％，更优选为68％～72％，最优选为70％；所述碳酸氢胆碱水溶液中碳酸氢胆碱的质量百分含量优选为75％～85％，更优选为78％～82％，最优选为80％。在本发明具体实施过程中，将所述香叶酸溶解于无水乙醇中制备获得香叶酸乙醇溶液，将碳酸氢胆碱溶解于水中制备获得碳酸氢胆碱水溶液；然后将香叶酸乙醇溶液和碳酸氢胆碱水溶液混合进行聚合反应，得到碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物。在本发明具体实施过程中，根据确定的摩尔比、以及香叶酸乙醇溶液、碳酸氢胆碱水溶液中的香叶酸和碳酸氢胆碱的质量百分比计算混合时的体积比。在本发明中，所述聚合反应的温度优选为20～25℃，进一步优选为22～24℃；所述聚合反应优选在搅拌条件下进行。本发明对所述聚合反应的时间没有特殊限定，优选的在所述混合反应至不再产生二氧化碳气体时结束。本发明通过将香叶酸乙醇溶液和碳酸氢胆碱水溶液聚合反应得到的碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物普适性突出能递送任意编码蛋白的mRNA。
本发明在所述聚合反应后，本发明优选还包括依次进行的静置、去溶剂和烘干步骤。在本发明中，所述静置的温度优选为35～45℃，更优选为38～42℃，最优选为40℃，所述静置的时间优选为20～30h，更优选为22～26h，最优选为24h；所述静置的作用是使反应物充分反应、沉降。本发明在所述静置结束后，优选的进行去溶剂的步骤，所述去溶剂优选的采用旋转蒸发的方法进行，所述旋转蒸发的温度优选为55～65℃，更优选为58～62℃，最优选为60℃，所述旋转蒸发的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。本发明在所述去溶剂步骤结束后，优选的进行干燥；所述干燥的温度优选为55～65℃，更优选为58～63℃，最优选为60℃，所述干燥的时间优选为45～55h，更优选为48h。在本发明中，所述碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物干燥后呈粘稠状。
在本发明中，当采用自行制备方式提供碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物时，所述苯丙酸和碳酸氢胆碱的摩尔比优选为1：1～5：1，进一步优选为1.5：1～2.5：1，更优选为2:1。在本发明的实施例中，可选择1：1～5：1范围内任意比值，具体的1:1、1.25:1、5:3、2.5:1、3:1、3.25:1、3.5:1、3.75:1、4:1、4.25:1、4.5:1、4.75:1或5:1等。在本发明中，所述碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物的制备优选包括：将苯丙酸乙醇溶液和碳酸氢胆碱水溶液混合进行聚合反应，得到碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物。在本发明中，所述苯丙酸乙醇溶液中苯丙酸的质量百分含量优选为65％～75％，更优选为68％～72％，最优选为70％；所述碳酸氢胆碱水溶液中碳酸氢胆碱的质量百分含量优选为75％～85％，更优选为78％～82％，最优选为80％。在本发明具体实施过程中，将所述苯丙酸溶解于无水乙醇中制备获得苯丙酸乙醇溶液，将碳酸氢胆碱溶解于水中制备获得碳酸氢胆碱水溶液；然后将制备获得的苯丙酸乙醇溶液和碳酸氢胆碱水溶液混合进行聚合反应，得到碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物；所述聚合反应的温度优选为20～25℃，所述聚合反应的过程中伴随搅拌，本发明对所述搅拌的方法和转速没有特殊限定；本发明对所述混合反应的时间没有特殊限定，优选的在所述混合反应至不再产生二氧化碳气体时结束。本发明通过将苯丙酸乙醇溶液和碳酸氢胆碱水溶液聚合反应得到的碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物同样普适性突出能递送任意编码蛋白的mRNA。
本发明在所述聚合反应后，优选的还包括依次进行的静置、去溶剂和烘干步骤。在本发明中，所述静置的温度优选为35～45℃，更优选为38～42℃，最优选为40℃，所述静置的时间优选为20～30h，更优选为22～26h，最优选为24h；所述静置的作用是使反应物充分反应、沉降。本发明在所述静置结束后，优选的进行去溶剂的步骤，所述去溶剂优选的采用旋转蒸发的方法进行，所述旋转蒸发的温度优选为55～65℃，更优选为58～62℃，最优选为60℃，所述旋转蒸发的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。本发明在所述去溶剂步骤结束后，优选的进行干燥；所述干燥的温度优选为55～65℃，更优选为58～63℃，最优选为60℃，所述干燥的时间优选为45～55h，更优选为48h。在本发明中，所述碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物干燥后呈粘稠状。
在本发明中，所述药物活性成分优选还包括mRNA。在本发明中，所述mRNA和载体材料的质量比优选为1：500～1：2000，进一步优选为1:800～1:1500，最优选为1:1000～1:1200；在本发明的实施例中，可选择1：500～1：2000范围内任意比值，具体的为1:600，1:700，1:800，1:900，1:1000：1：1200，1:1500，1:1800等。本发明对所述mRNA的具体序列没有特殊限定，任意序列的mRNA均可，优选为EGF(表皮生长因子)-mRNA、COL1A2(胶原蛋白)-mRNA和AUX-1(胶原蛋白酶)mRNA中的一种或多种。在本发明中，所述mRNA优选的为液体形式。本发明对所述mRNA的浓度优选为1ug/ul；具体的mRNA浓度根据mRNA的作用以及药物药效发挥的需求所定。
本发明还提供了前述技术方案含有mRNA的药物制剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述载体材料和mRNA混合后透析，得到所述药物制剂。
在本发明中，当所述制剂材料包括碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物时，本发明优选分别制备碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物，将制备获得的碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物与mRNA混合后透析即得所述药物制剂。
本发明优选将所述制剂材料和mRNA混合后震荡溶解，随后进行透析。在本发明中，所述透析用透析袋的截留分子量优选为8000～10000D，进一步优选为8200～9800D，更优选为8500～9500D。在本发明中，所述透析的时间优选为65～80h，更优选为70～75h，最优选为72h。本发明在所述透析过程中，优选的24h更换一次透析液；所述透析袋外的透析液优选为PBS，所述PBS的溶度优选为80～120mM，更优选为90～110mM，最优选为100mM。在本发明中，所述透析的作用是去除乙醇等小分子杂质。
本发明还提供了上述的药物制剂在制备治疗皮肤病的制剂中的应用。在本发明中，所述皮肤病优选包括但不限于皮肤损伤、橘皮征、需要补充皮肤细胞外基质相应症状和银屑病。本发明优选根据皮肤病的具体类型选择mRNA的类型，当所述皮肤病为皮肤损伤时，所述mRNA优选为EGF-mRNA；当所述皮肤病为橘皮征时，所述mRNA优选为AUX-1-mRNA；当所述皮肤病为需要补充皮肤细胞外基质的相应症状时，所述mRNA优选为COL1A2-mRNA。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1-1
碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物CAGE制备
称取5份9.88g纯香叶酸，分别溶解在5.36mL无水乙醇中制备获得5份70wt％香叶酸乙醇溶液；
依次称取2.02g，4.04g，6.06g，8.08g，10.1g碳酸氢胆碱，分别溶解在8.08mL水中制备获得20wt％，33.3wt％，42.8wt％，50wt％，62.5wt％碳酸氢胆碱溶液；
将1份70wt％香叶酸乙醇溶液和20wt％碳酸氢胆碱溶液在50mL的圆底烧瓶中混匀，得香叶酸和碳酸氢胆碱的摩尔比为5：1的香叶酸和碳酸氢胆碱混合溶液。在20～25℃下，以200rpm的转速搅拌混合物直到不再产生二氧化碳为止，时间为15min，随后40℃静置反应24h。60℃旋转蒸发2h除去溶剂，60℃真空烘干48h，获得碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物，记为CAGE-1，此时CAGE-1呈粘稠状。
按照CAGE-1的制备方式，以1份70wt％香叶酸乙醇溶液、33.3wt％碳酸氢胆碱溶液为原料(所得香叶酸和碳酸氢胆碱混合溶液中香叶酸和碳酸氢胆碱的摩尔比为5：2)，制备得碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物，记为CAGE-2，此时CAGE-2呈粘稠状。
按照CAGE-1的制备方式，以1份70wt％香叶酸乙醇溶液、42.8wt％碳酸氢胆碱溶液为原料(所得香叶酸和碳酸氢胆碱混合溶液中香叶酸和碳酸氢胆碱的摩尔比为5：3)，制备得碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物，记为CAGE-3，此时CAGE-3呈粘稠状。
按照CAGE-1的制备方式，以1份70wt％香叶酸乙醇溶液、50wt％碳酸氢胆碱溶液为原料(所得香叶酸和碳酸氢胆碱混合溶液中香叶酸和碳酸氢胆碱的摩尔比为5：4)，制备得碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物，记为CAGE-4，此时CAGE-4呈粘稠状。
按照CAGE-1的制备方式，以1份70wt％香叶酸乙醇溶液、62.5wt％碳酸氢胆碱溶液为原料(所得香叶酸和碳酸氢胆碱混合溶液中香叶酸和碳酸氢胆碱的摩尔比为1：1)，制备得碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物，记为CAGE-5，此时CAGE-5呈粘稠状。
实施例1-2
碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物CAPA制备
称取5份9.75g苯丙酸，分别溶解在5.29mL无水乙醇中制备获得5份70wt％苯丙酸乙醇溶液；
依次称取2.02g，4.04g，6.06g，8.08g，10.1g碳酸氢胆碱，分别溶解在8.08mL水中制备获得20wt％，33.3wt％，42.8wt％，50wt％，62.5wt％碳酸氢胆碱溶液；
将1份70wt％苯丙酸乙醇溶液和20wt％碳酸氢胆碱溶液在50mL的圆底烧瓶中混匀，得苯丙酸和碳酸氢胆碱的摩尔比为5：1的苯丙酸和碳酸氢胆碱混合溶液。20～25℃下，以200rpm的转速搅拌混合物直到不再产生二氧化碳为止，时间为15min，随后40℃静置反应24h。60℃旋转蒸发2h除去溶剂，60℃真空烘干48h；获得碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物CAPA-1，此时CAPA-1呈粘稠状。
按照CAPA-1的制备方式，以1份70wt％苯丙酸乙醇溶液、33.3wt％碳酸氢胆碱溶液为原料(所得苯丙酸和碳酸氢胆碱混合溶液中苯丙酸和碳酸氢胆碱的摩尔比为5：2)，制备得碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物，记为CAPA-2，此时CAPA-2呈粘稠状。
按照CAPA-1的制备方式，以1份70wt％苯丙酸乙醇溶液、42.8wt％碳酸氢胆碱溶液为原料(所得苯丙酸和碳酸氢胆碱混合溶液中苯丙酸和碳酸氢胆碱的摩尔比为5：3)，制备得碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物，记为CAPA-3，此时CAPA-3呈粘稠状。
按照CAPA-1的制备方式，以1份70wt％苯丙酸乙醇溶液、50wt％碳酸氢胆碱溶液为原料(所得苯丙酸和碳酸氢胆碱混合溶液中苯丙酸和碳酸氢胆碱的摩尔比为5：4)，制备得碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物，记为CAPA-4，此时CAPA-4呈粘稠状。
按照CAPA-1的制备方式，以1份70wt％苯丙酸乙醇溶液、62.5wt％碳酸氢胆碱溶液为原料(所得苯丙酸和碳酸氢胆碱混合溶液中苯丙酸和碳酸氢胆碱的摩尔比为1：1)，制备得碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物，记为CAPA-5，此时CAPA-5呈粘稠状。
实施例1-3
制剂材料CAGE+CAPA的制备
将上述制备获得的CAGE-N和CAPA-N按照体积比1:1的比例混合获得制剂材料CAGE-N+CAPA-N(CCC制剂)，其中N为1、2、3、4或5。
实施例2-1
CAGE+mRNA制备：
向2.5mL CAGE-N中加入2.5mL mRNA溶液(mRNA的浓度为1μg/μl)，轻轻震荡溶解，随后置于透析袋(截留分子量：8000～10000D)中，置于10mM PBS中透析72h，得到实现核酸皮肤递送的药物制剂CAGE-N+mRNA，其中N为1、2、3、4或5。
实施例2-2
CAPA+mRNA制备：
向2.5mL CAPA-N中加入2.5mL mRNA溶液(mRNA的浓度为1μg/μl)，轻轻震荡溶解，随后置于透析袋(截留分子量：8000～10000D)中，置于10mM PBS中透析72h，得到实现核酸皮肤递送的药物制剂CAPA-N+mRNA，其中N为1、2、3、4或5。
实施例2-3
CAGE+CAPA+mRNA制备
将2.5mL CAPA-N和2.5mL CAGE-N混合，加入5mL mRNA溶液(mRNA的浓度为1μg/μl)，轻轻震荡溶解，随后置于透析袋(截留分子量：8000～10000D)中，置于10mM PBS中透析72h，得到实现核酸皮肤递送的药物制剂CAGE-N+CAPA-N+mRNA(mRNA-CCC制剂)，其中N为1、2、3、4或5。
实施例3
制剂材料经皮递送mRNA效率检测
3.1设置7个处理组，处理组1-1为PBS样品；处理组2-1为mRNA样品；处理组3-1为实施例2-3中2.5mL CAPA-1和2.5mL CAGE-1混合，加入5mL mRNA溶液(mRNA的浓度为1μg/μl)得到的CAGE-1+CAPA-1+mRNA样品；处理组4-1为实施例2-3中2.5mL CAPA-2和2.5mL CAGE-2混合，加入5mL mRNA溶液(mRNA的浓度为1μg/μl)得到的CAGE-2+CAPA-2+mRNA样品；处理组5-1为实施例2-3中2.5mL CAPA-3和2.5mL CAGE-3混合，加入5mL mRNA溶液(mRNA的浓度为1μg/μl)得到的CAGE-3+CAPA-3+mRNA样品；处理组6-1为实施例2-3中2.5mL CAPA-4和2.5mLCAGE-4混合，加入5mL mRNA溶液(mRNA的浓度为1μg/μl)得到的CAGE-4+CAPA-4+mRNA样品；处理组7-1为实施例2-3中2.5mL CAPA-5和2.5mL CAGE-5混合，加入5mL mRNA溶液(mRNA的浓度为1μg/μl)得到的CAGE-5+CAPA-5+mRNA样品；
3.2设置7个处理组，处理组1-2为PBS样品；处理组2-2为mRNA样品；处理组3-2为实施例1-1制备得到的CAGE-3样品；处理组4-2为实施例1-2制备得到的CAPA-3样品；处理组5-2为实施例2-1制备得到的CAGE-3+mRNA样品；处理组6-2为实施例2-2制备得到的CAPA-3+mRNA样品；处理组7-2为实施例2-3制备得到的CAGE-3+CAPA-3+mRNA样品，见图3。
其中3.1与3.2中，所有处理组中mRNA具体为GAPDH mRNA。
不同处理组分别按照下述涂抹方式涂抹200μl的样品，进行递送mRNA效率检测。下面以处理组7-2的样品为例对检测流程进行说明，其余组样品按照同样的方式处理：将6-8周龄的balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)在SPF条件下，并且保持12h光亮和12h黑暗循环下的通气笼中饲养。使用脱毛膏脱去背毛，在1cm×1cm范围内涂抹200μl GAPDH mRNA-CCC制剂，24h后取小鼠皮肤组织，放入液氮中速冻，将速冻皮肤组织粉碎成粉末，匀浆于QIAzol裂解剂中(每1g组织粉末加入1ml裂解剂)，制备用于qPCR的组织裂解液。以组织裂解液为RNA模板，按照如下反应体系和实验步骤制备cDNA溶液。
逆转录PCR实验步骤如下：
①反应体系
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶之前先70℃干浴3min，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60min。
③取出后立即95℃干浴3min，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃。
按照如下方式进行定量PCR实验，检测CCC对mRNA的递送效率，β-actin作为内参。
待测样品的实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011copies/ml，反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104copies/ml，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
反应条件为：93℃2min，然后93℃1min，55℃2min，共40个循环。
GADPH上游引物F：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG(SEQ ID No.1)；
GADPH下游引物R：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA(SEQ ID No.2)；
β-actin上游引物：GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA(SEQ ID No.3)；
β-actin下游引物：GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG(SEQ ID No.4)。
3.1部分7个处理组制剂材料经皮递送mRNA效率检测如下表1和图2，3.2部分7个处理组制剂材料经皮递送mRNA效率检测如下表2和图3。
表1不同处理组的皮肤组织中的mRNA相对含量
表2不同处理组的皮肤组织中的mRNA相对含量
由表1～2和图2～3可以看出，本发明提供的制剂材料能有显著增强mRNA经皮递送效率。
实施例4
按照实施例3中3.2部分设置7个处理组，处理组1-3为PBS样品；处理组2-3为mRNA样品；处理组3-3为实施例1-1制备得到的CAGE-3样品；处理组4-3为实施例1-2制备得到的CAPA-3样品；处理组5-3为实施例2-1制备得到的CAGE-3+mRNA样品；处理组6-3为实施例2-2制备得到的CAPA-3+mRNA样品；处理组7-3为实施例2-3制备得到的CAGE-3+CAPA-3+mRNA样品。所有处理组中mRNA具体为LUC mRNA。
不同处理组分别按照下述涂抹方式涂抹200μl的样品，进行递送mRNA效率检测。下面以处理组7-3的样品为例对检测流程进行说明，其余组样品按照同样的方式处理：将6-8周龄的balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)在SPF条件下，并且保持12h光亮和12h黑暗循环下的通气笼中饲养。使用脱毛膏脱去背毛，在1cm×1cm范围内涂抹200μl LUC mRNA-CCC制剂，24h后经小鼠尾静脉注射荧光素酶底物，利用Spectrum InVivo Imaging System进行荧光成像，其荧光成像的原理为编码luciferase的mRNA在小鼠体内表达之后，产物luciferase可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在荧光素氧化的过程中，小鼠会发出生物荧光，荧光强度和luciferase表达强度成正比，然后通过荧光测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光，荧光检测结果如图4所示。(图4中右侧荧光卡标最大值为1.93e7 p/sec/cm2/sr，最小值为1.05e6p/sec/cm2/sr)，其中A为涂抹CAGE-3+mRNA，B为CAPA-3+mRNA，C为CAGE-3+CAPA-3+mRNA，D为mRNA，E为PBS；A中区域1，B中区域2以及C中区域3依次为涂抹CAGE-3+mRNA组、CAPA-3+mRNA组和CAGE-3+CAPA-3+mRNA组荧光检测显色区域，区域1荧光分析结果为：ROI34[12％]＝8.112e5 p/sec/cm2/sr；区域2荧光分析结果为ROI33[12％]＝1.131e6p/sec/cm2/sr；区域3荧光分析结果为ROI 32[12％]＝6.093e6 p/sec/cm2/sr(12％是利用/>Spectrum InVivo Imaging System检测荧光过程中的自动参数设置)；D处理组显色面积较小，难以进行定量分析；E处理组无显色区域。通过对比区域1、2和3荧光强度可以看出，利用本发明LUC mRNA-CCC制剂检测到的荧光强度平均为6.093e6p/sec/cm2/sr，显著高于其他对照组，本发明提供的制剂能够有效地将核酸药物透过皮肤递送至皮下组织，显著增强mRNA经皮递送效率。
实施例5
实施例4中不同处理组分别按照下述涂抹方式涂抹200μl的样品，检测不同处理组皮肤组织中炎症因子TNFa的含量。下面以处理组7-3的样品为例对检测流程进行说明，其余组样品按照同样的方式处理：将6-8周龄的balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)在SPF条件下，并且保持12h光亮和12h黑暗循环下的通气笼中饲养。使用脱毛膏脱去背毛，在1cm×1cm范围内涂抹200μl实施例4中制备的LUC mRNA-CCC制剂，48h后观察皮肤状态，取小鼠皮肤组织，提取蛋白进行酶联免疫吸附实验，采用小鼠TNF alpha ELISA试剂盒(abcam，ab46105)检测炎症因子TNFa含量。结果如图5和表3所示。
表3不同处理组皮肤组织中炎症因子TNFa的含量
由表3可知，本发明提供的制剂材料不引起免疫因子水平升高，具有相对程度的安全性
实施例6
按照实施例3中3.2部分设置3个处理组，处理组1-4为PBS样品；处理组2-4为mRNA样品；处理组3-4为实施例2-3制备得到的CAGE-3+CAPA-3+mRNA样品。所有处理组中mRNA具体为EGF mRNA。
不同处理组分别按照下述涂抹方式涂抹200μl的样品，进行小鼠皮肤伤口愈合检测。下面以处理组3-4的样品为例对检测流程进行说明，其余组样品按照同样的方式处理：将6-8周龄的balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)在SPF条件下，并且保持12h光亮和12h黑暗循环下的通气笼中饲养。使用脱毛膏脱去背毛，使用打孔器在小鼠背部造成对称的两个圆形伤口，同时在1cm×1cm范围内涂抹200μl EGF mRNA-CCC制剂，每12h涂抹一次，第一次涂抹完记为第0天，每天对皮肤状态进行观察，第0天、第3天和10天后的皮肤状态如图6所示，EGF mRNA-CCC处理组伤口愈合度高，愈合效果好，说明本发明提供的EGFmRNA-CCC具有跨皮肤递送的能力，促进了损伤修复。
实施例7
按照实施例3中3.2部分设置5个处理组，处理组1为PBS样品；处理组2为COL1A2mRNA样品，处理3为AUX-1mRNA样品，处理组4为实施例2-3制备得到的CAGE-3+CAPA-3+mRNA样品，其中mRNA为COL1A2 mRNA样品，处理组5为实施例2-3制备得到的CAGE-3+CAPA-3+mRNA样品，其中mRNA为AUX-1mRNA样品。
不同处理组分别按照下述涂抹方式涂抹200μl的样品，进行小鼠皮肤mRNA水平检测检测。将6-8周龄的balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)在SPF条件下，并且保持12h光亮和12h黑暗循环下的通气笼中饲养。使用脱毛膏脱去背毛，在1cm×1cm范围内涂抹200μl COL1A2 mRNA-CCC或者AUX-1mRNA-CCC制剂，24h后取小鼠皮肤组织，放入液氮中速冻，将速冻皮肤组织粉碎成粉末，匀浆于QIAzol裂解剂中(每1g组织粉末加入1ml裂解剂)，制备用于qPCR的组织裂解液。qPCR方法和操作与实施例3相同。实验结果如图7所示，CCC对于皮肤疾病相关性靶点胶原蛋白和胶原蛋白酶mRNA既有有效的递送效果。
表4不同处理组mRNA相对含量
由上述实施例可知，本发明提供的制剂材料是一类通用经皮给药的制剂材料，能够用于不同核酸分子的局部经皮给药，能够显著增强核酸分子对皮肤的渗透作用，能够稳定有效的实现mRNA的递送，安全性好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 武汉瑞佶生物科技有限公司
<120> 一种实现核酸皮肤递送的药物制剂及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtagaccat gtagttgagg tca 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggagattact gccctggctc cta 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gactcatcgt actcctgctt gctg 24
Claims (10)
1.一种实现核酸皮肤递送的药物制剂，包括药物活性成分和载体材料，其特征在于，所述载体材料包括碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物；
所述碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物和碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物的体积比为1：1；
所述碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物中香叶酸和碳酸氢胆碱的摩尔比为5：3；
所述碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物中苯丙酸和碳酸氢胆碱的摩尔比为5：3；
所述药物活性成分为mRNA。
2.根据权利要求1所述的药物制剂，其特征在于，所述mRNA和载体材料的质量比为1：500~1：2000。
3.根据权利要求1所述的药物制剂，其特征在于，所述mRNA包括EGF-mRNA、AUX-1-mRNA和COL1A2-mRNA中的一种或多种。
4.根据权利要求1~3任一项所述的药物制剂，其特征在于，所述碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物的制备方法包括：将香叶酸乙醇溶液和碳酸氢胆碱水溶液混合进行聚合反应，得到碳酸氢胆碱-香叶酸共聚物；
所述碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物的制备方法包括：将苯丙酸乙醇溶液和碳酸氢胆碱水溶液混合进行聚合反应，得到碳酸氢胆碱-苯丙酸共聚物。
5.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于，所述聚合反应的温度为20~25℃。
6.根据权利要求4所述的药物制剂，其特征在于，所述聚合反应后还包括静置、去溶剂和烘干步骤；
所述静置的温度为35~45℃，时间为20~30h；
所述去溶剂采用旋转蒸发的方法进行，所述旋转蒸发的温度为55~65℃，时间为1.5~2.5h；
所述烘干的温度为55~65℃，时间为45~55h。
7.一种实现核酸皮肤递送的药物制剂的制备方法，包括以下步骤：
将权利要求1~6任一项所述药物制剂中所述载体材料和mRNA混合后透析，得到所述药物制剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述透析用透析袋的截留分子量为8000~10000D；所述透析的时间为65~80h。
9.权利要求1~6任一项所述的药物制剂或权利要求7~8任一项所述的制备方法得到的药物制剂在制备治疗皮肤病的制剂及在制备补充皮肤细胞外基质产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述皮肤病包括皮肤损伤、橘皮征或银屑病。
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