CN110290786A - 用于预防或最小化上皮细胞-间充质细胞转换的方法和组合物 - Google Patents

用于预防或最小化上皮细胞-间充质细胞转换的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

描述了抑制或减少上皮细胞‑间充质细胞转换(EMT)的组合物，包括白蛋白组合物。在实施方案中，此类组合物包含白蛋白且i)不含促EMT剂或含低浓度的促EMT剂；ii)促EMT剂和抗EMT剂的含量比例为促EMT剂:抗EMT剂7:3至0:10；或iii)两者。所述促EMT剂为辛酸、辛酸盐或它们的组合。所述抗EMT剂为C9‑C14脂肪酸、C9‑C14脂肪酸的盐、C9‑C14脂肪酸的甘油单酯、C9‑C14脂肪酸的甘油二酯、C9‑C14脂肪酸的甘油三酯或其组合；和此类白蛋白组合物用于基于白蛋白的各种治疗应用，且更具体地，用于治疗应当预防或最小化EMT的疾病或病状。这些白蛋白组合物可有利地与已知的活性成分联合使用。此外，还描述了用于治疗各种治疗适应症的抗EMT剂的组合物，且更具体地，用于治疗应该预防或最小化EMT的疾病或病状。

Description

用于预防或最小化上皮细胞-间充质细胞转换的方法和组 合物
技术领域
本发明涉及预防或最小化上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的方法，以及用于预防或最小化上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的药物制剂的相应用途。更具体地，本发明涉及白蛋白制剂及其在各种医药应用中的用途。白蛋白制剂不含促EMT剂或含低浓度的促EMT剂；或含抗EMT剂，其中促EMT剂:抗EMT剂的比例为7:3至0:10。抗EMT剂是包含9至14个碳的烷基链的脂肪酸或其盐或其甘油单酯或其甘油二酯或其甘油三酯或它们的组合。促EMT试剂是辛酸(C8脂肪酸)或辛酸盐(C8脂肪酸的盐)。
本发明还涉及抗EMT剂在各种医学病状治疗中的方法和用途。
背景技术
白蛋白
人血清白蛋白(HSA)是人血浆中存在的最丰富的蛋白质(浓度为35-50g/L)。HSA在血浆中溶解，并作为蛋白质单体存在(MW＝66,500)。它在肝脏中生成并发挥多种功能，其中大多数涉及小分子的运输。HSA优先结合疏水性羧酸。与HSA结合并由HSA运输的分子包括游离脂肪酸、激素类如甲状腺激素、未结合的胆红素和各种药物。因此，HSA能够通过与药物结合导致随后的分解代谢过程延迟，从而延长它们的半衰期。由于体循环中HSA的相对高浓度，因此它维持循环系统内的胶体渗透(膨胀)压。膨胀压主要起因于大HSA分子不能通过血管壁逃逸。
白蛋白的热处理
因此，HSA被广泛用于治疗低血容量症。低血容量症是指因血浆损失导致血容量显著降低时的状态。有几种原因可引起低血容量症，其包括创伤、烧伤或手术。常规HSA是通过血浆的低温乙醇分级进行制备：Cohn工艺(第二次世界大战期间开发)及其变体。然而，纯化的HSA可能含有病毒病原体，需要在60℃下热处理10小时或热巴氏杀菌的工艺。白蛋白在热处理(例如灭菌)期间容易变性，并且随后形成不溶性(非功能性)聚集体。因此，为了最小化热处理引起的HSA变性，通过在巴氏杀菌之前加入中链脂肪酸、辛酸和N-乙酰色氨酸来制备商业HSA制剂。已经证实辛酸钠保护单体HSA免受热影响，而N-乙酰色氨酸保护免受氧化性应激影响；M.Anraku等人，Biochim.Biophys.ACTA1702(1),9-17(2004)。使用中链和长链脂肪酸进行白蛋白的稳定描述于Shrake等人Biopolymers81(4),235-248(2006)、U.S.专利申请2015/0165000和U.S.专利7,351,800中。特别是由于容易获得且相对于长链脂肪酸具有更大的溶解度，因此辛酸钠构成目前用作商业白蛋白制剂的稳定剂的主要稳定剂。此外，经过数十年的使用，已经确定辛酸钠和N-乙酰色氨酸稳定的HSA可相对安全地用于具有能够代谢辛酸钠和N-乙酰色氨酸的健康肝脏的受试者。
白蛋白制剂的治疗用途
含有白蛋白的制剂通常在治疗上提供给人和动物。例如，含有白蛋白的制剂通常被施用于人，用于以下一种或多种适应症：有或没有休克的低血容量；低白蛋白血症，可能因白蛋白产生不足(因营养不良、烧伤、重大损伤、先天性无白蛋白血症、肝病、感染、恶性肿瘤或内分泌失调)、过度分解代谢(因烧伤、重大损伤、胰腺炎、甲状腺毒症、天疱疮或肾病)、体内白蛋白损失(因出血、肾脏排泄过多、烧伤渗出物、渗出性肠病或剥脱性皮肤病)和/或体内白蛋白的再分布(因重大手术、肝硬化伴腹水或各种炎性病状)引起；在体外心肺循环手术之前或期间；并用于治疗烧伤或肝硬化。
用于治疗用途的许多含有白蛋白(通常浓度为5或25％)的不同制剂为或已经可在市场上获取，包括，例如：
·-25(Centeon/Aventis Behring)含有25％白蛋白的无菌水溶液，该白蛋白是根据Cohn工艺通过低温受控分级从大量成人静脉血浆中得到的。用0.02MN-乙酰色氨酸钠和0.02M羊脂酸钠稳定，并在60℃下巴氏杀菌10小时。
·(Baxter Laboratories)是使用Cohn冷乙醇分级工艺从人静脉血浆制备，用碳酸氢钠和/或氢氧化钠调节至生理pH，并用N-乙酰色氨酸(0.016M)和羊脂酸钠(0.016M)稳定的白蛋白无菌水溶液。5％含有5％(重量/体积)的白蛋白，并用N-乙酰色氨酸(0.004M)和羊脂酸钠(0.004M)稳定。25％含有25％(重量/体积)的白蛋白，并用N-乙酰色氨酸(0.02M)和羊脂酸钠(0.02M)稳定。钠离子含量为145±15mEq/L。此等溶液不含防腐剂，并且不含在新鲜全血或血浆中发现的凝血因子。
·-25(Grifols)是25％(重量/体积)白蛋白在水性稀释剂中的无菌溶液。该制剂是用0.02M羊脂酸钠和0.02M N-乙酰色氨酸稳定，并用碳酸钠缓冲。该产品的铝含量不超过200μg/L。该产品的近似钠离子含量为145mEq/L。
·25％(Grifols)是含有25％(重量/体积)人白蛋白的无菌水溶液，该白蛋白是用由静脉血得到的合并人血浆通过冷醇分级法获得。该产品按每克白蛋白加0.08毫摩尔羊脂酸钠和0.08毫摩尔N-乙酰色氨酸钠进行稳定。每克白蛋白中0.08毫摩尔的羊脂酸钠相当于在25％白蛋白溶液中0.02M羊脂酸钠。25％溶液含钠离子为130至160毫当量/升，pH为6.9±0.5。该产品不含防腐剂。
·(美国红十字会)是使用Cohn冷乙醇分级工艺从人静脉血浆制备，用碳酸氢钠和/或氢氧化钠调节至生理pH，并用羊脂酸钠和N-乙酰色氨酸稳定的5％或25％(重量/体积)白蛋白的无菌水溶液。
·(Albumedix/Novozymes)是按照ICH Q7标准制造的重组人白蛋白(rAlbumin)。的来源是重组的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(面包酵母)发酵，并且其在不使用动物或人衍生材料的情况下制造。是在装有20％(w/v)蛋白质溶液的50ml II类玻璃小瓶中出售。它是用32mM羊脂酸钠、145mM氯化钠和15mg/L聚山梨酯80稳定的。
·Recombumin 20％(Albumedix/Novozymes)是按照ICH Q7标准制造的重组人白蛋白(rAlbumin)。Recombunin的来源是重组的酿酒酵母(面包酵母)发酵，并且其在不使用动物或人衍生材料的情况下制造。Recombumin是在装有20％(w/v)蛋白质溶液的50ml II类玻璃小瓶中出售。它是用16mM羊脂酸钠和145mM氯化钠稳定的。
·Recombumin 10％(Albumedix/Novozymes)是按照ICH Q7标准制造的重组人白蛋白(rAlbumin)。的来源是重组的酿酒酵母(面包酵母)发酵，并且其在不使用动物或人衍生材料的情况下制造。重组蛋白是在装有10％(w/v)蛋白质溶液的50ml II类玻璃小瓶中出售。它是用8mM羊脂酸钠和145mM氯化钠稳定的。
·5％(New Century Pharmaceuticals)是用毕赤酵母(Pichiapastoris)制造的重组人白蛋白(rAlbumin)。衍生自N-末端(Asp)具有单缺失的典型人血清白蛋白序列。它具有人血清白蛋白的所有生物学特性，且对镍和铜的高亲和位点减少。含4mM羊脂酸钠和4mM N-乙酰色氨酸的PBS中的无菌5％溶液。
·(KedrionBiopharma)是含有用合并人血浆通过冷乙醇分级分离制备的25％白蛋白的单剂量静脉施用的无菌水溶液。该产品是通过按每克白蛋白加入0.08mmol羊脂酸钠和0.08mmol N-乙酰色氨酸钠稳定的。每克白蛋白中0.08mmol羊脂酸钠相当于25％白蛋白溶液中0.02M羊脂酸钠。此外，每升材料含有130至160mEq的钠离子和≤200μg的铝。该产品不含防腐剂。
因此，商业人白蛋白制剂通常使用辛酸/羊脂酸(辛酸钠/羊脂酸钠)进行稳定。
白蛋白作为药物的递送媒介物
HSA被认为是用于亲脂性抗癌药物的潜在递送媒介物。例如，AbraxaneTM(纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇)已在美国被批准用于治疗转移性乳腺癌(2005年)、非小细胞肺癌(2012年)和转移性胰腺癌(2013年)。在该案例下，将亲脂性紫杉醇配制成白蛋白结合型纳米颗粒(平均粒径：130nM)，以供用0.9％氯化钠复溶时作为注射用混悬液使用；HSA预先用辛酸钠(羊脂酸钠)和N-乙酰色氨酸(N-乙酰色氨酸钠)处理。在文献中已经记载了HSA作为其他水溶性差的癌症药物递送媒介物的潜在用途。例如，Q.Li等人,Int.J.Nanomedicine6,397-405(2011)报道，负载叶酸结合型HSA-10-羟基喜树碱的纳米颗粒显示缓释行为和药物被癌细胞摄取的有效递送系统。同一期刊的后续出版物证明，负载10-羟基喜树碱的甘草酸结合型白蛋白纳米颗粒是有前景的肝细胞癌靶向疗法的媒介物；Y.Zu等人,Int.J.Nanomedicine 8,1207-1222(2013)。白蛋白纳米颗粒也已作为癌症药物多柔比星的递送媒介物进行研究，例如，S.Abbasi等人(J.Drug Delivery 2012：文章ID 686108，8页)，其报道通过加入聚乙烯亚胺涂层对HSA纳米颗粒进行改性，得到阳离子白蛋白纳米颗粒，其改善了多柔比星对MCF-7乳腺癌细胞的治疗指数。已观察到净正电荷纳米颗粒改善了对癌细胞的渗透(与HSA相比)，从而在更长的持续时间内对癌细胞产生更有效的细胞毒性作用。
持续需要稳定和安全的白蛋白制剂。
本说明书引用了许多文件，所述文件的内容以引用的方式整体并入本文。
发明内容
本发明涉及以下各项：
第1项：用包含白蛋白的组合物治疗疾病或病状同时预防或最小化上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的所述组合物，其中所述组合物不含辛酸和/或辛酸盐或减少量的辛酸和/或辛酸盐，其中所述减少量小于0.08毫摩尔/克白蛋白。
第2项：如第1项所述的方法，其中减少量的辛酸和/或辛酸盐小于0.05毫摩尔/克白蛋白。
第3项：如第1项所述的方法，其中减少量的辛酸和/或辛酸盐小于0.005毫摩尔/克白蛋白。
第4项：如第1项所述的方法，其中减少量的辛酸和/或辛酸盐小于0.0005毫摩尔/克白蛋白。
第5项：如第1项所述的方法，其中所述组合物基本上不含辛酸或辛酸盐。
第6项：如第1项所述的方法，其中所述组合物不含辛酸或辛酸盐。
第7项：如第1项所述的方法，其中所述组合物含有的脂肪酸和/或其盐的量小于或等于0.08毫摩尔/克白蛋白，其中至少30％的所述量的脂肪酸和/或或其盐为C9-C14脂肪酸和/或其盐。
第8项：如第7项所述的方法，其中至少50％的所述脂肪酸和/或其盐为C9-C14脂肪酸和/或其盐。
第9项：如第7项所述的方法，其中至少70％的所述脂肪酸和/或其盐为C9-C14脂肪酸和/或其盐。
第10项：如第7项所述的方法，其中至少90％的所述脂肪酸和/或其盐为C9-C14脂肪酸和/或其盐。
第11项：如第7项所述的方法，其中至少95％的所述脂肪酸和/或其盐为C9-C14脂肪酸和/或其盐。
第12项：如第7项所述的方法，其中100％的所述脂肪酸和/或其盐为C9-C14脂肪酸和/或其盐。
第13项：如第1至12项中任一项所述的方法，其中所述组合物是包含约1％至约40％(w/v)白蛋白的水性白蛋白制剂。
第14项：如第13项所述的方法，其中所述组合物是包含约5％至约25％(w/v)白蛋白的水性白蛋白制剂。
第15项：如第13项所述的方法，其中所述组合物是包含约20％至约25％(w/v)白蛋白的水性白蛋白制剂。
第16项：如第7至12项中任一项所述的方法，其中所述C9-C14脂肪酸和/或其盐为C9-C12脂肪酸和/或其盐。
第17项：如第16项所述的方法，其中所述C9-C12脂肪酸和/或其盐为癸酸或癸酸盐。
第18项：如第7至12项和第16-17项中任一项所述的方法，其中所述盐是钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐或铜盐。
第19项：如第18项所述的方法，其中所述盐是钠盐或钾盐。
第20项：如第18项所述的方法，其中所述盐是钠盐。
第21项：如第1至20项中任一项所述的方法，其中所述白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。
第22项：如第1至21项中任一项所述的方法，其中所述组合物为液体形式，并且还包含一种或更多种药学上可接受的渗透压调节剂。
第23项：如第22项所述的方法，其中所述一种或更多种渗透压调节剂包含钠盐、钾盐或两者。
第24项：如第1至23项中任一项所述的方法，其中所述组合物为液体形式，并且还包含至少一种药学上可接受的抗氧化剂或稳定剂。
第25项：如第24项所述的方法，其中所述至少一种药学上可接受的抗氧化剂或稳定剂为抗氧化剂氨基酸或其衍生物。
第26项：如第24项所述的方法，其中所述至少一种药学上可接受的抗氧化剂或稳定剂是N-酰基甲硫氨酸或N-酰基色氨酸盐。
第27项：如第1至21项中任一项所述的方法，其中所述组合物为纳米颗粒的形式。
第28项：如第1至27项中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含药物活性剂。
第29项：如第27项所述的方法，其中所述组合物还包含药物活性剂；并且其中所述药物活性剂被包封在所述纳米颗粒内。
第30项：如第28项或第29项所述的方法，其中所述药物活性剂是抗癌药。
第31项：如第30项所述的方法，其中所述抗癌药为紫杉烷、喜树碱、伊立替康、吉西他滨、环磷酰胺或多柔比星。
第32项：如第31项所述的方法，其中所述紫杉烷是紫杉醇或多西他赛。
第33项：如第1至30项中任一项所述的方法，其中所述疾病或病状为出血、低血容量性休克、烧伤、急性肝衰竭、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫综合征、肝硬化、新生儿溶血病、体外心肺循环手术、肾病或癌症。
第34项：如第30至32项中任一项所述的方法，其中所述疾病或病状为癌症。
第35项：包含白蛋白的组合物治疗疾病或病状同时预防或最小化上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的用途，其中所述组合物不含辛酸和/或辛酸盐或含减少量的辛酸和/或辛酸盐，其中所述减少量为小于0.08毫摩尔/克白蛋白。
第36项：如第35项所述的用途，其中所述组合物含有一定量的脂肪酸和/或其盐，其中所述量为等于或小于0.08毫摩尔/克白蛋白，其中至少30％的所述量的脂肪酸和/或其盐为C9-C14脂肪酸和/或其盐。
第37项：包含白蛋白的组合物制造用于治疗疾病或病状同时预防或最小化上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的药物的用途，其中所述组合物不含辛酸和/或辛酸盐或含减少量的辛酸和/或辛酸盐，其中所述减少量为小于0.08毫摩尔/克白蛋白。
第38项：如第37项所述的用途，其中所述组合物含有一定量的脂肪酸和/或其盐，其中至少30％的所述量的脂肪酸和/或其盐为C9-C14脂肪酸和/或其盐。
第39项：一种用于治疗疾病或病状同时预防或最小化上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的包含白蛋白的组合物，其中所述组合物不含辛酸和/或辛酸盐或含减少量的辛酸和/或辛酸盐，其中所述减少量为小于0.08毫摩尔/克白蛋白。
第40项：如第39项所述的组合物，其含有的脂肪酸和/或其盐的量为等于或小于0.08毫摩尔/克白蛋白，其中至少30％的所述量的脂肪酸和/或其盐为C9-C14脂肪酸和/或其盐。
第41项：一种组合物，包含白蛋白，和
·小于0.08毫摩尔/克白蛋白的量的辛酸和/或辛酸盐；和/或
·一定量的脂肪酸和/或其盐，其中至少30％的所述量的脂肪酸和/或其盐为C9-C14脂肪酸和/或其盐。
第42项：如第41项所述的组合物，其中所述辛酸和/或辛酸盐的量小于0.05毫摩尔/克白蛋白。
第43项：如第42项所述的组合物，其中所述辛酸和/或辛酸盐的量小于0.005毫摩尔/克白蛋白。
第44项：如第43项所述的组合物，其中所述辛酸和/或辛酸盐的量小于0.0005毫摩尔/克白蛋白。
第45项：如第41至44项中任一项所述的组合物，其中白蛋白的浓度为1％至40％。
第46项：如第45项所述的组合物，其中白蛋白的浓度为5％至25％。
第47项：如第41至46项中任一项所述的组合物，还包含药物活性剂。
第48项：如第47项所述的组合物，其中药物活性剂为抗癌药。
第49项：如第48项所述的组合物，其中所述抗癌药为紫杉烷、喜树碱、伊立替康、吉西他滨、环磷酰胺或多柔比星。
第50项：如第49项所述的组合物，其中所述紫杉烷为紫杉醇或多西他赛。
第51项：如第48至50项中任一项所述的组合物，其中所述组合物基本上不含辛酸和/或辛酸盐。
第52项：如第41至51项中任一项所述的组合物，用于治疗疾病或病状同时预防或最小化上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)。
第53项：如第52项所述的组合物，其中所述疾病或病状为出血、低血容量性休克、烧伤、急性肝衰竭、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫综合征、肝硬化、新生儿溶血病、体外心肺循环手术或肾病。
第54项：如第48至50中任一项所述的组合物，用于治疗疾病或病状同时预防或最小化上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)，其中所述疾病或病状是癌症。
第55项：一种在有需要的受试者中预防、最小化或减少上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含有效量的C9-C14脂肪酸和/或其盐和/或C9-C14脂肪酸的甘油三酯的组合物。
第56项：如第55项所述的方法，其中所述C9-C14脂肪酸和/或其盐和/或C9-C14脂肪酸的甘油三酯为C9-C12脂肪酸和/或其盐和/或C9-C12脂肪酸的甘油三酯。
第57项：如第55项所述的方法，其中所述C9-C14脂肪酸和/或其盐和/或C9-C14脂肪酸的甘油三酯为C10-C12脂肪酸和/或其盐和/或C10-C12脂肪酸的甘油三酯。
第58项：如第55项所述的方法，其中所述C9-C14脂肪酸和/或其盐和/或C9-C14脂肪酸的甘油三酯为癸酸盐。
第59项：如第55项所述的方法，其中所述C9-C14脂肪酸和/或其盐和/或C9-C14脂肪酸的甘油三酯为癸酸钠。
第60项：如第55项所述的方法，其中所述C9-C14脂肪酸和/或其盐和/或C9-C14脂肪酸的甘油三酯为癸酸。
第61项：如第55项所述的方法，其中所述C9-C14脂肪酸和/或其盐和/或C9-C14脂肪酸的甘油三酯为三癸酸甘油酯。
第62项：如第55至58项中任一项所述的方法，其中所述组合物包括脂肪酸的盐，其中所述盐为钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐或铜盐。
第63项：如第62项所述的方法，其中所述盐为钠盐或钾盐。
第64项：如第62项所述的方法，其中所述盐是钠盐。
第65项：如第55至64项中任一项所述的方法，其中所述有效量对于经口或局部施用为每剂量5mg/kg至300mg/kg之间。
第66项：如第65项中任一项所述的方法，其中所述有效量对于经口或局部施用为每剂量10mg/kg至100mg/kg之间。
第67项：如第55至63项中任一项所述的方法，其中所述有效量对于静脉内、腹膜内、直肠、肌内或皮下施用为每剂量0.5mg/kg至100mg/kg之间。
第68项：如第67项中任一项所述的方法，其中所述有效量对于静脉内、腹膜内、直肠、肌内或皮下施用为每剂量0.5mg/kg至4mg/kg之间。
第69项：如第55至64项中任一项所述的方法，其中所述组合物为局部施用。
第70项：如第69项所述的方法，其中所述受试者患有烧伤或疤痕。
第71项：如第55至64项和第67至68项所述的方法，其中所述疾病或病状为出血、低血容量性休克、烧伤、急性肝衰竭、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫综合征、肝硬化、新生儿溶血病、体外心肺循环手术或肾病。
第72项：C9-C14脂肪酸和/或其盐和/或C9-C14脂肪酸的甘油三酯预防、最小化或减少受试者中上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的用途。
第73项：C9-C14脂肪酸和/或其盐和/或C9-C14脂肪酸的甘油三酯制备用于预防、最小化或减少受试者中上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的药物的用途。
第74项：如第72项或第73项所述的用途，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的癸酸和/或癸酸盐。
第75项：如第72项或第73项所述的用途，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的三癸酸甘油酯。
第76项：用白蛋白组合物制备治疗受试者疾病或病状的药物的用途，所述受试者需要接受白蛋白组合物治疗所述疾病或病状，其中所述白蛋白组合物抑制或减少上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)，并且：
-不含促EMT剂或含低浓度的促EMT剂；和/或
-含促EMT剂和抗EMT剂的含量比例为促EMT剂:抗EMT剂7:3至0:10；
其中：
-所述促EMT剂为辛酸、辛酸盐或它们的组合；
-所述抗EMT剂为C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸的盐、C9-C14脂肪酸的甘油单酯、C9-C14脂肪酸的甘油二酯、C9-C14脂肪酸的甘油三酯或它们的组合；且
-促EMT剂的所述低浓度为小于0.08毫摩尔/克白蛋白；
-附带条件为当促EMT剂和抗EMT剂为脂肪酸时，它们是分开的脂肪酸或甘油二酯或甘油三酯的一部分。
第77项：如技术方案76所述的用途，其中促EMT剂的所述低浓度为0.04毫摩尔/克白蛋白或更低。
第78项：如技术方案76所述的用途，其中促EMT剂的所述低浓度为0.007％(w/w)或更低。
第79项：如技术方案76所述的用途，其中促EMT剂:抗EMT剂的所述比例为5:5至0:10。
第80项：如技术方案76至79中任一项所述的用途，其中所述抗EMT剂为C9-C12脂肪酸、C9-C12脂肪酸的盐、C9-C12脂肪酸的甘油单酯、C9-C12脂肪酸的甘油二酯、C9-C12脂肪酸的甘油三酯或它们的组合。
第81项：如技术方案80所述的用途，其中所述抗EMT剂为C10-C12脂肪酸、C10-C12脂肪酸的盐、C10-C12脂肪酸的甘油单酯、C10-C12脂肪酸的甘油二酯、C10-C12脂肪酸的甘油三酯或它们的组合。
第82项：如技术方案81所述的用途，其中所述抗EMT剂为C10脂肪酸、C10脂肪酸的盐或它们的组合。
第83项：如技术方案76至82中任一项所述的用途，其中所述组合物为包含约1％至约40％(w/v)白蛋白的水性白蛋白制剂。
第84页：如技术方案76至83中任一项所述的用途，其中所述盐为钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐、铜盐或它们的组合。
第85项：如技术方案84所述的用途，其中所述盐为钠盐。
第86项：如技术方案76至85中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含药物活性剂。
第87项：如技术方案86所述的用途，其中所述活性剂为抗癌药物，并且所述药物用于治疗癌症。
第88项：如技术方案87所述的用途，其中抗癌药物为紫杉烷。
第89项：如技术方案88所述的用途，其中紫杉烷为紫杉醇或多西他赛。
第90项：如技术方案76至86中任一项所述的用途，其中所述白蛋白的组合物由医师推荐用于治疗所述疾病或病状。
第91项：如技术方案76至90中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗疾病或病状，所述疾病或病状为出血、低血容量、烧伤、急性肝衰竭、肝功能障碍、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫综合征、肝硬化、新生儿溶血病、体外心肺循环手术、肾病、癌症、肝肾综合征、脓毒症、器官灌注或器官再灌注。
第92项：抑制或减少上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的药物制备用组合物的用途，其中所述组合物：
-不含促EMT剂或含低浓度的促EMT剂；和/或
-含促EMT剂和抗EMT剂的含量比例为促EMT剂:抗EMT剂7:3至0:10；
其中：
-所述促EMT剂为辛酸、辛酸盐或它们的组合；
-所述抗EMT剂为C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸的盐、C9-C14脂肪酸的甘油单酯、C9-C14脂肪酸的甘油二酯、C9-C14脂肪酸的甘油三酯或它们的组合；且
-促EMT剂的所述低浓度为小于0.02M；
-附带条件为当促EMT剂和抗EMT剂为脂肪酸时，它们是分开的脂肪酸或甘油二酯或甘油三酯的一部分。
第93项：如技术方案92所述的用途，其中促EMT剂的所述低浓度为0.01M或更低。
第94项：如技术方案92所述的用途，其中促EMT剂的所述低浓度为0.001M或更低。
第95项：如第92项所述的用途，其中促EMT剂:抗EMT剂的所述比例为5:5至0:10。
第96项：如技术方案95所述的用途，其中促EMT剂:抗EMT剂的所述比例为约0:10。
第97项：如技术方案92至96中任一项所述的用途，其中所述抗EMT剂为C9-C12脂肪酸、C9-C12脂肪酸的盐、C9-C12脂肪酸的甘油单酯、C9-C12脂肪酸的甘油二酯、C9-C12脂肪酸的甘油三酯或它们的组合。
第98项：如技术方案97所述的用途，其中所述抗EMT剂为C10-C12脂肪酸、C10-C12脂肪酸的盐、C10-C12脂肪酸的甘油单酯、C10-C12脂肪酸的甘油二酯、C10-C12脂肪酸的甘油三酯或它们的组合。
第99项：如技术方案98所述的用途，其中所述抗EMT剂为C10脂肪酸、C10脂肪酸的盐、C10脂肪酸的甘油单酯、C10脂肪酸的甘油二酯、C10脂肪酸的甘油三酯或它们的组合。
第100页：如技术方案92至99中任一项所述的用途，其中所述盐为钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐、铜盐或它们的组合。
第101项：如技术方案100所述的用途，其中所述盐为钠盐。
第102项：如技术方案92至101中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含药物活性剂。
第103项：如技术方案102所述的用途，其中所述活性剂为抗癌药物，并且所述药物用于治疗癌症。
第104项：如技术方案103所述的用途，其中抗癌药物为紫杉烷。
第105项：如技术方案104所述的用途，其中紫杉烷为紫杉醇或多西他赛。
第106项：如技术方案92至102中任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗疾病或病状，所述疾病或病状为出血、低血容量、烧伤、急性肝衰竭、肝功能障碍、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫综合征、肝硬化、新生儿溶血病、体外心肺循环手术、肾病、癌症、肝肾综合征、脓毒症、器官灌注、器官再灌注、瘢痕形成、牛皮癣或湿疹。
第107项：如技术方案92至102中任一项所述的用途，其中促EMT剂和抗EMT剂的所述总浓度对于经口或局部施用为每剂量5mg/kg至300mg/kg受试者之间。
第108项：如技术方案107所述的用途，其中所述总浓度为每剂量10mg/kg至100mg/kg之间。
第109项：如技术方案92至102中任一项所述的用途，其中所述总浓度对于静脉内、腹膜内、直肠、肌内或皮下施用为每剂量0.5mg/kg至100mg/kg受试者之间。
第110项：如技术方案109所述的用途，其中所述总浓度为每剂量0.5mg/kg至4mg/kg之间。
第111项：如技术方案92至102、107和108中任一项所述的用途，其中所述组合物为局部施用，并且所述药物用于治疗烧伤、预防瘢痕形成或治疗瘢痕、牛皮癣或湿疹。
第112项：一种治疗受试者的疾病或病状的方法，所述受试者需要接受白蛋白组合物来治疗所述疾病或病状，包括施用抑制或减少上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)刺激的白蛋白组合物，并且所述组合物：
-不含促EMT剂或含低浓度的促EMT剂；或者
-含促EMT剂和抗EMT剂的含量比例为促EMT剂:抗EMT剂7:3至0:10；
其中：
-所述促EMT剂为辛酸、辛酸盐或它们的组合；
-所述抗EMT剂为C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸的盐、C9-C14脂肪酸的甘油单酯、C9-C14脂肪酸的甘油二酯、C9-C14脂肪酸的甘油三酯或它们的组合；且
-促EMT剂的所述低浓度为小于0.08毫摩尔/克白蛋白；
-附带条件为当促EMT剂和抗EMT剂为脂肪酸时，它们是分开的脂肪酸或甘油二酯或甘油三酯的一部分。
第113项：一种用于抑制或减少受试者的上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的方法，其包括施用包含以下物质的组合物：
-不含促EMT剂或含低浓度的促EMT剂；和/或
-含促EMT剂和抗EMT剂的含量比例为促EMT剂:抗EMT剂7:3至0:10；
其中：
-所述促EMT剂为辛酸、辛酸盐或它们的组合；
-所述抗EMT剂为C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸的盐、C9-C14脂肪酸的甘油单酯、C9-C14脂肪酸的甘油二酯、C9-C14脂肪酸的甘油三酯或它们的组合；且
-促EMT剂的所述低浓度为小于0.02M；
-附带条件为当促EMT剂和抗EMT剂为脂肪酸时，它们是分开的脂肪酸或甘油二酯或甘油三酯的一部分。
附图说明
在附图中：
图1示出了HPLC色谱图o：40mM羊脂酸钠溶液(上图)、40mM癸酸钠溶液(中图)和如实施例1中所述用癸酸钠替代辛酸钠后5％白蛋白的组合物(下图)。
图2示出了实施例4所述体外检定中所含辛酸钠:癸酸钠的比例为100:0、95:5、70:30、50:50、30:70、5:95或0:100的含白蛋白和不含白蛋白的组合物的EMT标记物(胶原蛋白)的产生。
图3示出了天然HSA前蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1，NCBI参考序列：NP000468.1，UniProtKB：P02768)。
图4示出了在存在和不存在白蛋白的情况下，辛酸钠和癸酸钠对TGF-β诱导的人微血管内皮细胞(HMEC)中胶原1a1 mRNA表达(EMT标记物)的影响。
图5示出了在存在和不存在白蛋白的情况下，辛酸钠和癸酸钠对TGF-β诱导的人肝细胞癌细胞系HepG2中胶原1a1 mRNA表达(EMT标记物)的影响。
图6示出了在存在和不存在白蛋白的情况下，辛酸钠和癸酸钠对TGF-β诱导的人肺上皮细胞A549中胶原1a1 mRNA表达(EMT标记物)的影响。
图7展示了使用丝裂霉素处理的EGF诱导的PC-3细胞进行的划痕检定照片，示出了在存在和不存在白蛋白的情况下，辛酸钠和癸酸钠对细胞迁移的影响。
具体实施方式
本发明涉及白蛋白组合物，其：
·不含脂肪酸或其盐，或
·不含促EMT剂，或
·含低浓度的促EMT剂，和/或
·含促EMT剂:抗EMT剂的比例为7:3至0:10，
其中所述促EMT剂为辛酸、辛酸盐或它们的组合；且其中所述抗EMT剂为具有9、10、11、12、13或14个碳的烷基链的脂肪酸(即C9-C14脂肪酸)、C9-C14脂肪酸的盐、C9-C14脂肪酸的单酸甘油单酯、C9-C14脂肪酸的甘油二酯、C9-C14脂肪酸的甘油三酯或它们的组合。
本发明基于辛酸和辛酸盐是促EMT的发现，即辛酸和辛酸盐刺激上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)。EMT的刺激在医师惯于开具成施用白蛋白制剂的许多医疗病状(例如严重烧伤)下是有害的，，因为EMT刺激导致过度瘢痕形成。在下文中描述了EMT刺激是有害的其他治疗适应症。
发明人还发现其他脂肪酸、其盐和其甘油三酯抗EMT。所述抗EMT剂为C9脂肪酸例如壬酸或天竺葵酸、C9脂肪酸的盐例如壬酸盐、C9脂肪酸的甘油单酯、C9脂肪酸的甘油二酯、C9脂肪酸的甘油三酯例如辛酸的甘油三酯或三壬酸甘油酯、C10脂肪酸如癸酸或羊蜡酸、C10脂肪酸的盐如癸酸盐或羊蜡酸盐、C10脂肪酸的甘油单酯、C10脂肪酸的甘油二酯、C10脂肪酸的甘油三酯例如癸酸甘油三酯或三癸酸甘油酯或三羊蜡酸甘油酯、C11脂肪酸如十一烷酸、C11脂肪酸的盐如十一烷酸盐、C11脂肪酸的甘油单酯、C11脂肪酸的甘油二酯、C11脂肪酸的甘油三酯例如十一烷酸的甘油三酯或三-十一烷酸甘油酯、C12脂肪酸如十二烷酸或月桂酸、C12脂肪酸的盐如十二烷酸盐、C12脂肪酸的甘油单酯、C12脂肪酸的甘油二酯、C12脂肪酸的甘油三酯如十二烷酸的甘油三酯或三月桂酸甘油酯、C13脂肪酸如十三烷酸(tridecanoic acid/tridecylic acid)、C13脂肪酸的盐如十三烷酸盐、C13脂肪酸的甘油单酯、C13脂肪酸的甘油二酯、C13脂肪酸的甘油三酯如十三烷酸甘油三酯或三-十三烷酸甘油酯、C14脂肪酸如十四烷酸、C14脂肪酸的盐如十四烷酸盐、C14脂肪酸的甘油单酯、C14脂肪酸的甘油二酯、C14脂肪酸的甘油三酯如十四烷酸甘油三酯或三-十四烷酸甘油酯或三肉豆蔻酸甘油酯或它们的组合。已经测试了C9、C10、C11、C12、C13和C14脂肪酸的甘油三酯的作用，并且由于甘油三酯在肠道中通过后被分解成一分子甘油和三个脂肪酸，因此可以合理地预期，当调节甘油单酯或甘油二酯的量使其释放出与相应的甘油三酯相同量的脂肪酸时，相应的甘油单酯和甘油二酯将提供相同功效。甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯的抗EMT作用是通过体内释放的C9-C14脂肪酸的活性进行传递。
当抗EMT剂存在于白蛋白制剂中时，其浓度是用促EMT剂:抗EMT剂的比例表示，即7:3至0:10，包括7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9和0:10。在一个实施方案中，促EMT剂:抗EMT剂比例为7:3至0:10的促EMT剂和抗EMT剂的含量是用由两个辛酸和一个C9-C14脂肪酸(即比例为2:1，如实施例4中所例示)或一个辛酸和两个C9-C14脂肪酸(即比例为1:2)组成的甘油三酯或由一个辛酸和一个C9-C14脂肪酸(即比例为5:5)组成的甘油二酯实现。在一个实施方案中，组合物中促EMT剂的含量不是低浓度(促EMT的低浓度于下文定义)，但抗EMT剂的含量使得促EMT剂:抗EMT剂的比例为7:3至0:10，优选2:1，还优选1:1，进一步优选1:2，且还优选1:1至0:1。在另一个实施方案中，组合物中促EMT剂的含量为不存在或者处于低浓度(促EMT剂的低浓度于下文定义)，并且抗EMT剂的含量使得促EMT剂:抗EMT剂的比例为7:3至0:10，优选2:1、6:4、1:1、1:2、3:7、2:8、1:9或0:10。
所述抗EMT剂优选为C9-C14脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C9脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C10脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C11脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C12脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C13脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C14脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C9-12脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C10-12脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C10脂肪酸、其盐或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C10脂肪酸或其盐。所述抗EMT剂优选为C10脂肪酸的盐。所述抗EMT剂优选为C11脂肪酸、其盐或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C11脂肪酸或其盐。所述抗EMT剂优选为C11脂肪酸的盐。所述抗EMT剂优选为C12脂肪酸、其盐或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C12脂肪酸或其盐。所述抗EMT剂优选为C12脂肪酸的盐。所述抗EMT剂优选为C9脂肪酸、其盐或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C9脂肪酸或其盐。所述抗EMT剂优选为C9脂肪酸的盐。所述抗EMT剂优选为C10脂肪酸、其盐或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C13脂肪酸、其盐或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C13脂肪酸或其盐。所述抗EMT剂优选为C13脂肪酸的盐。所述抗EMT剂优选为C14脂肪酸、其盐或其甘油三酯。所述抗EMT剂优选为C14脂肪酸或其盐。所述抗EMT剂优选为C10脂肪酸的盐。
所述组合物优选为基本上不含辛酸或辛酸盐。C9-C14脂肪酸是链长为9个碳至14个碳的脂肪酸。辛酸也可以被称为羊脂酸或C8脂肪酸，其为链长为8个碳的脂肪酸。本发明还涉及本文所述组合物的用途，例如用于治疗受试者的疾病或病状，而没有与受试者中上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的刺激相关的副作用，即避免或预防EMT的刺激或抑制EMT。本发明还涉及在有需要的受试者中治疗疾病或病状而没有不希望的EMT刺激的方法，其包括向受试者施用本文所述的组合物，即同时预防或最小化EMT。此类用途和方法不会产生EMT或使EMT基本上不会增加，和/或在实施方案中可以抑制或减少受试者中的EMT。
已发现在存在和不存在白蛋白的情况下，本文公开的抗EMT剂抑制EMT。因此，本发明还涉及抗EMT剂或组合抗EMT剂治疗各种医学病状的用途。本发明还涉及抗EMT剂或抗EMT剂的组合最小化或减少受试者中上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的用途。还涵盖用于预防、抑制、最小化或减少受试者中上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的组合物，其包含抗EMT剂或抗EMT剂的组合。
本发明的盐优选为药学上可接受的盐。
上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)和内皮细胞-间充质细胞转换(EndoMT)
上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)和逆过程MET(间充质细胞-上皮细胞转换)是胚胎形成过程中许多组织和器官发育的关键过程。最近，内皮细胞-间充质细胞转换(EndoMT)，一种新认识的细胞转分化类型，已成为组织肌成纤维细胞的另一种可能来源。EndoMT是一种复杂的生物学过程，其中内皮细胞失去其特异性标记物并获得间充质表型，且表达间充质细胞产物如α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原。与EMT类似，EndoMT可以通过转化生长因子(TGF-β)进行诱导。出于简化本发明的文本的目的，术语“EMT”在本文中使用并且意图涵盖EMT和EndoEMT过程，它们是细胞转化/分化的相同过程。
上皮细胞(或内皮细胞)和间充质细胞在细胞表型和功能方面彼此不同。上皮细胞和内皮细胞通过紧密连接、间隙连接和粘附连接彼此紧密连接，表现出细胞极性(顶面-底侧极性、细胞骨架的极化)并且通过基底层结合。而间充质细胞不存在该细胞极化，具有纺锤形形态并且最小化彼此之间的相互作用。此外，上皮细胞和内皮细胞表达特征细胞标记物如E-钙粘蛋白和β-连环蛋白，而间充质细胞表达细胞标记物如N-钙粘蛋白、纤连蛋白、波形蛋白和α-SMA(平滑肌肌动蛋白)。另外，与上皮细胞相比，间充质细胞具有增加的迁移能力。因此，EMT的过程使细胞形态和表型产生显著变化。从广义上讲，EMT发生在三个过程中：胚胎形成、细胞增殖迁移和伤口愈合。由于在某些病理状况中如癌症或过度伤口愈合(瘢痕形成)需要抑制EMT，因此已经着手进行研究以发现抑制EMT的潜在药物。由于EMT是经历增殖的细胞的特征，因此它是由蛋白质生长因子如TGF(转化生长因子)、CTGF(结缔组织生长因子)、EGF(表皮生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)和IGF(胰岛素生长因子)诱导的。随后，生长因子的抑制剂提供了作为EMT抑制剂的潜能。例如，小分子(MW＝384)取代的咪唑基苯甲酰胺SB-431542是TGF-β1受体的抑制剂(激活素受体样激酶；Inman等人(2002),Molecular Pharmacol.62(1)65-74)，其减弱了TGF-β的促肿瘤效应，包括TGF-β诱导的EMT。同样，另一种小分子EW-7203阻断哺乳动物上皮细胞中TGF-β1介导的EMT(Park等人(2011),Cancer Sci.102(1):1889-96)。还发现必需激酶(PAK：p21-活化的丝氨酸/苏氨酸激酶)抑制EMT过程(参见例如美国专利申请2009/0286850)。
已经发现C8脂肪酸或其盐增加EMT，而C9-C14脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯和其甘油三酯中的任何一种都降低EMT。因此，为了预防施用白蛋白组合物引起的EMT刺激，其在C8脂肪酸或其盐中的含量被有利地降低或完全避免。或者，已发现用抗EMT剂替代白蛋白组合物中至少30％的C8脂肪酸或其盐的部分，将代偿C8脂肪酸或其盐的不良影响。或者，在白蛋白组合物中加入抗EMT剂使抗EMT剂相当于促EMT剂和抗EMT剂的总含量的至少30％也是本发明所考虑的。
还提供了在有需要的受试者中预防、抑制、最小化或减少上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的方法，所述方法包括向受试者施用白蛋白组合物，所述白蛋白组合物不含促EMT剂或含少量促EMT剂；和/或包含相当于促EMT剂和抗EMT剂的总量的至少30％的量的抗EMT剂。
还提供了包含白蛋白的组合物在有需要的受试者中预防、抑制、最小化或减少上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的用途，其中所述白蛋白组合物不含促EMT剂或含少量促EMT剂；和/或包含相当于促EMT剂和抗EMT剂总量的至少30％的量的抗EMT剂。
还提供了包含白蛋白的组合物制备用于在有需要的受试者中预防、抑制、最小化或减少上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的药物的用途，其中所述白蛋白组合物不含促EMT剂或含少量促EMT剂；和/或包含相当于促EMT剂和抗EMT剂总量的至少30％的量的抗EMT剂。
还提供了用于在有需要的受试者中预防、抑制、最小化或减少上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的包含白蛋白的组合物，其中所述白蛋白组合物不含促EMT剂或含少量促EMT剂；和/或包含相当于促EMT剂和抗EMT剂总量的至少30％的量的抗EMT剂。
旨在将本文所述的用途和方法用于预防、最小化、减少、抑制、减少刺激、最小化刺激、不刺激或避免刺激上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)。本发明还涉及不含促EMT剂和抗EMT剂的白蛋白组合物，因为它不会刺激EMT。在本发明的另一个实施方案中，白蛋白组合物中存在抗EMT剂。在本发明的另一个实施方案中，白蛋白组合物中不存在促EMT剂。在本发明的另一个实施方案中，促EMT剂在白蛋白组合物中以“低浓度”存在，其中所述“低浓度”为低于商业白蛋白组合物中通常使用的浓度(即约0.08毫摩尔辛酸盐/克白蛋白)。优选地，促EMT剂的低浓度为介于0.0007至0.07毫摩尔/克白蛋白之间，或介于0.0007至0.007毫摩尔/克白蛋白之间，或介于0.007至0.07毫摩尔/克白蛋白之间，或介于0.005至0.05毫摩尔/克白蛋白之间，或介于0.0005至0.05毫摩尔/克白蛋白之间，或介于0.002至0.02毫摩尔/克白蛋白之间、介于0.0002至0.02毫摩尔/克白蛋白之间、介于0.04至0.08毫摩尔/克白蛋白之间、介于0.04至0.07毫摩尔/克白蛋白之间、介于0.05至0.07毫摩尔/克白蛋白之间。如本文所述，“低浓度”和“少量”是两个命名相同的表达，因为低量是相对于组合物中白蛋白的量。在另一个实施方案中，白蛋白组合物不含任何促EMT剂。在另一个实施方案中，促EMT剂在白蛋白组合物中以0.008毫摩尔/克白蛋白至0.007％(w/w)的浓度存在。在另一个实施方案中，从本发明中排除了白蛋白组合物用于给受试者解毒的用途，或白蛋白组合物用于解毒治疗的用途，或给有需要的受试者解毒。US 8,877,711中公开了给受试者解毒的白蛋白组合物。在一个实施方案中，受试者需要预防EMT或减少EMT刺激，或预防过度瘢痕形成，或减少过度瘢痕形成的刺激，或预防细胞分化，或减少细胞分化的刺激。
本发明还涉及以下各者的用途：(i)所述白蛋白组合物，其不含促EMT剂或含少量的促EMT剂；和/或包含相当于白蛋白组合物中促EMT剂和抗EMT剂总量的至少30％的量的抗EMT剂，和(ii)所述抗EMT剂的组合物，例如其在以下中的治疗用途，治疗EMT相关疾病或EMT相关病状，或EMT刺激不合乎需要或不适合和/或胶原表达不合乎需要或不适合的疾病或病状，如出血、低血容量、烧伤、急性肝功能衰竭、肝功能障碍、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫综合征、肝硬化、新生儿溶血病、体外心肺循环手术、肾病、癌症、肝肾综合征、脓毒症、器官灌注、器官再灌注、瘢痕形成、牛皮癣和湿疹；以及与水溶性差的药物联合用于治疗EMT刺激不适合或不合乎需要的疾病或病状，例如抗癌药物。本发明还涉及根据本发明的白蛋白组合物制备用于由医师推荐施用白蛋白组合物治疗的疾病或病状的药物的用途。医师推荐施用白蛋白组合物治疗的疾病或病状包括但不限于有或没有休克的低血容量；低白蛋白血症(例如，因营养不良、烧伤、严重损伤、先天性无白蛋白血症、肝脏疾病、肝功能障碍、感染、恶性肿瘤、化疗、内分泌失调等)、过度分解代谢(例如，因烧伤、严重损伤、胰腺炎、甲状腺毒症、天疱疮、肾病等)、体内白蛋白损失(例如，因出血、肾脏排泄过多、烧伤渗出物、渗出性肠病、剥脱性皮肤病等)和/或体内白蛋白再分布(例如，因重大手术、骨科手术、肝硬化伴腹水、腹膜炎、粘连、憩室炎、各种炎性病状等)；在体外心肺循环手术之前或期间，急性肝衰竭或慢性肝病急性失代偿(例如体外肝脏支持)、中毒、感染、手术并发症、感染性休克、严重脓毒症患者的烧伤、肝硬化、白蛋白透析。本发明还涉及根据本发明的白蛋白组合物在药物制剂中的用途，以稳定药物，或使药物溶解度更高，或增加药物的功效或用于其他目的，或用于药物的递送媒介物。在这种情况下，术语“药物”和/或“活性剂”可以互换。本发明还涉及根据本发明的白蛋白组合物在干细胞或胚胎的冷冻保存或在干细胞疗法或体外受精(IVF)中的用途。
在一个实施方案中，本发明组合物中存在的所有C8-14脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯的浓度大于或等于或小于0.08毫摩尔/克白蛋白。在一个实施方案中，C8-14脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯的总量包含至少30％的抗EMT剂。
本发明还涉及包含C8-14脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯的量大于或等于或小于0.08毫摩尔/克白蛋白的白蛋白组合物的用途，其中促EMT剂的量相对于组合物中存在的白蛋白量而言相当于低浓度或不存在，并且其中C8-14脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯的所述量的至少30％或至少40％或至少50％或至少60％为抗EMT剂或它们的组合。所述用途包括用于血清白蛋白的热稳定化。本发明还涵盖巴氏杀菌后对白蛋白组合物进行改性，以便根据要求保护的浓度和/或比例减少或消耗促EMT剂的含量和/或增加抗EMT剂的含量。
在描述本发明的上下文中(尤其在随附权利要求的上下文中)中使用术语“一个/种”和“该/所述”以及类似指称应理解为涵盖单数与复数，除非本文另外指示或明显地与上下文矛盾。
除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将被解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。
本文中值的范围的描述仅旨在用作单独地参考落在该范围内的每个单独值的速记方法，除非本文另有指明，并且将每个单独的值并入本说明书中，如同在本文中单独列举一样。范围内值的所有子集也被并入说明书中，如同它们在本文中被单独列举一样。
除非本文另外指明或以其他方式与上下文明显矛盾，否则可按任何合适的顺序来执行本文所述的所有方法。
除非另有说明，否则本文所提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。
本说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的要素是实践本发明所必需的。
在本文中，术语“约”具有其普通含义。术语“约”用于指示值包括用于确定该值的装置或方法的固有误差变化，或涵盖接近所列举值的值，例如在所列举值(或值的范围)的10％或5％以内。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
在本文所述的研究中，本发明人已证明辛酸和其盐(呈游离形式或与白蛋白络合)刺激上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)，如通过人近端小管上皮细胞上TGF-β诱导的胶原表达(EMT的标记物)增加所评估。相反，用其他饱和脂肪酸(即C9-C14脂肪酸)或其甘油三酯(呈游离形式或与白蛋白络合)治疗后，检测到人近端小管上皮细胞引起的TGF-β诱导的胶原表达降低(即指示EMT抑制)。因此，本文给出的结果提供了证据，即辛酸稳定化HSA的使用可能与不希望的生物学效应相关，特别是在应避免/最小化EMT刺激的某些病理状况中，例如癌症或过度伤口愈合(瘢痕形成)，并且对EMT具有抑制效应的C9-C14脂肪酸稳定化HSA的使用是优选的。
本发明还涉及在有需要的受试者中预防、最小化或减少上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)刺激的方法，所述方法包括向受试者施用一种组合物，所述组合物不含白蛋白且：
-不含促EMT剂或含低浓度的促EMT剂；和/或
-含促EMT剂和抗EMT剂的含量比例为促EMT剂:抗EMT剂7:3至0:10。
促EMT剂为如上所述用于白蛋白组合物，即辛酸、辛酸盐或它们的组合。抗EMT剂为如上所述用于白蛋白组合物，即C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸的盐、C9-C14脂肪酸的甘油单酯、C9-C14脂肪酸的甘油二酯、C9-C14脂肪酸的甘油三酯或它们的组合。促EMT剂的浓度在有利条件下不会太高，优选超过0.02M。在实施方案中，促EMT剂的浓度为0.01M或更低、0.001M或更低、0.0001M或更低。在组合物不含白蛋白、促EMT剂和抗EMT剂的这些实施方案中，当它们为脂肪酸时，它们可以是分开的或不同的化合物，或者它们是甘油二酯或甘油三酯的一部分，同时保持相同比例。表2中列出了该实施方案的实例，其中试验的甘油三酯包含2个辛酸链和1个癸酸链，提供2:1的比例。
本发明还涵盖组合物制备用于抑制或减少受试者中上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的药物的用途，其中所述组合物包含有效量的如上所述的抗EMT剂。在一个实施方案中，抗EMT剂的有效量为经口或局部施用于人时，每剂量介于5mg/kg至300mg/kg受试者之间，或介于5mg/kg至200mg/kg受试者之间，或介于5mg/kg至100mg/kg受试者之间，或介于10mg/kg至100mg/kg受试者之间。在一个实施方案中，抗EMT剂的有效量为经静脉内、腹膜内、直肠、肌内或皮下施用于人时，每剂量介于0.5mg/kg至100mg/kg受试者之间，或介于0.5mg/kg至50mg/kg受试者之间，或介于0.5mg/kg至25mg/kg受试者之间，或介于0.5mg/kg至10mg/kg受试者之间，或介于0.5mg/kg至4mg/kg受试者之间。所述剂量为治疗期间施用一次或以重复方式施用。在一个实施方案中，所述重复方式是每天一次、每两天一次、每三天一次、每周两次或每周一次。所述治疗期优选由医师确定或直至达到所需医学结果。
有效量可一次或以重复方式施用。重复施用是每天2至4次、每天一次、每两天一次、每三天一次、每周两次或每周一次。
在一个实施方案中，抗EMT剂存在于包含药学上可接受的媒介物或载体的药物组合物中。
如本文所用的术语“脂肪酸”是指具有通常为4至28个碳的脂肪链(饱和的或不饱和的)的羧酸。术语“C9-C14脂肪酸”是指具有9、10、11、12、13或14个碳的脂肪链的脂肪酸，或其任何混合物。在一个实施方案中，脂肪链是饱和的。术语“C9-C14脂肪酸的甘油三酯”是指与三个C9-C14脂肪酸进行酯连接的甘油分子，并且可以用下式表示：
其中R’、R”和R”’均独立地选自与甘油骨架酯连接的碳骨架中具有9、10、11、12、13或14个碳的饱和脂肪酸或盐。术语“C9-C14脂肪酸的甘油单酯”是指与一个C9-C14脂肪酸进行酯连接的甘油分子；并且术语“C9-C14脂肪酸的甘油二酯”是指与两个C9-C14脂肪酸进行酯连接的甘油分子。脂肪酸、其盐和脂肪酸的甘油三酯可通过本领域已知的任何方法制备，例如直接酯化、重排、分馏、酯交换等。例如，脂类可从植物油如椰子油的来源中分离或衍生，例如通过重排过程等。链长的长度和分布可根据源油而变化。C9-C14脂肪酸、其盐和C9-C14脂肪酸的甘油三酯的商业来源是本领域技术人员可以获得并且已知的。
在一个实施方案中，白蛋白组合物包含9、10、11、12、13或14个碳的单一脂肪酸或其盐。在另一个实施方案中，白蛋白组合物包含9、10、11、12、13或14个碳的两种或更多种脂肪酸和/或其盐的任何混合物。
在实施方案中，白蛋白组合物中包含的脂肪酸和/或脂肪酸的盐的至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％为C9-C14脂肪酸和/或其盐。在一个实施方案中，白蛋白组合物中包含的脂肪酸和/或脂肪酸的盐的100％是C9-C14脂肪酸和/或其盐。
在实施方案中，白蛋白组合物中包含的脂肪酸和/或脂肪酸的盐的60％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％或更少是C8脂肪酸(“辛酸”或“羊脂酸”)和/或其盐。在一个实施方案中，白蛋白组合物中包含的脂肪酸不含或基本上不含辛酸和/或辛酸盐。
术语“辛酸”或“羊脂酸”在本文中可互换使用，并且是指包含8个碳原子的饱和脂肪酸。它具有以下结构：
术语“辛酸盐”、“辛酸的盐”、“羊脂酸盐”和“羊脂酸的盐”在本文中可互换使用。
表述“促EMT剂的减少量”和“促EMT的低浓度”二者均指的是辛酸和/或辛酸盐的量低于市场上商业白蛋白制剂中目前使用的辛酸和/或辛酸盐的量。商业白蛋白制剂在25％白蛋白制剂中使用0.02M羊脂酸钠，在5％白蛋白制剂中使用约0.004M羊脂酸钠。因此，商业上使用的羊脂酸钠浓度对于25％白蛋白为0.02M，它表示代表0.08毫摩尔/克白蛋白。因此，辛酸和/或辛酸盐的减少量表示小于0.08毫摩尔/克白蛋白，或小于0.05毫摩尔/克白蛋白，或小于0.01毫摩尔/克白蛋白，或0.005毫摩尔/克白蛋白或0.001毫摩尔/克白蛋白，或小于0.0005毫摩尔/克白蛋白，或小于0.0001毫摩尔/克白蛋白。
本文所用的术语“基本上不含辛酸和/或辛酸盐”是指辛酸和/或辛酸盐的浓度不可定量或通过常规技术检测不到。利用发明人已知和使用的技术，定量和检测水平为0.1mM，其相当于0.0005毫摩尔/克白蛋白。因此，“基本上不含辛酸和/或辛酸盐”表示小于0.0005毫摩尔/克白蛋白，或小于0.0001毫摩尔/克白蛋白。
本文所用的术语“不含辛酸和/或辛酸盐”是指不存在辛酸和/或辛酸盐或存在痕量的辛酸和/或辛酸盐。例如，不含辛酸和/或其盐的白蛋白组合物是未向其中加入辛酸和/或其盐的组合物或已向其中加入辛酸和/或其盐并且随后除去和/或消耗的组合物。例如，可以加入一定含量的辛酸和/或其盐，以便在巴氏杀菌过程中稳定白蛋白并在巴氏杀菌后除去。例如，实施例3中使用的Sigma的裸白蛋白被认为不含脂肪酸，尽管产品规格指示它具有0.007％(w/w)或更低的痕量脂肪酸。几种去除脂肪酸(促EMT剂)的方法可用于本发明的目的，例如(i)使用膜如中空纤维、铸膜等进行超滤/渗滤(UF/DF)以与抗EMT剂交换；(ii)利用透析管进行透析以与抗EMT剂交换；(iii)凝胶过滤，例如分子排阻柱或脱盐柱；(iv)在低pH下由活性炭吸附法进行吸附，接着过滤/纯化以除去活性炭；(v)吸附在固相上，例如碳颗粒或各种矿物粉末，包括沸石、二氧化硅等；(vi)色谱法；(vii)经由在37℃下进行疏水柱色谱法如Lipidex 1000(25克，含C15烃基)；(viii)加入乙醇，任选地降低pH，然后加热并过滤以除去不稳定的沉淀蛋白，并且进行UF/DF以置换任何残留的脂肪酸，同时除去乙醇和/或重新调节pH接近中性；(ix)与阴离子和阳离子交换树脂进行离子交换并且也通过透析进行；(x)解折叠白蛋白以消耗促EMT剂，并用抗EMT剂重折叠(即，任选地在还原剂(例如巯基乙醇)存在下使用离液剂(例如尿素或盐酸胍)解折叠，以解开白蛋白并释放结合的促EMT剂，任选地进行稀释或透析/渗滤以除去任何痕量的促EMT剂，在抗EMT剂存在下通过稀释、透析、渗滤等除去离液剂的存在进行重折叠)；或者通过这些方法的组合。
在一个实施方案中，组合物中存在的C8-C14脂肪酸、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯或它们的组合的含量的至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或96％、或97％、或98％、或99％或100％(即促EMT剂和抗EMT剂的总含量的％)为C9-C14脂肪酸、脂肪酸的盐、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯；或优选为C9-C12脂肪酸、脂肪酸的盐、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯，或优选为C10-C12脂肪酸、脂肪酸的盐、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯，或优选为C10脂肪酸、脂肪酸的盐、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯，或优选为癸酸和/或癸酸盐。在实施方案中，组合物中存在的脂肪酸、脂肪酸的盐、其盐、其甘油单酯、其甘油二酯或其甘油三酯不进行放射标记。
术语“癸酸”或“羊蜡酸”在本文中可互换使用，并且是指包含10个碳原子的饱和脂肪酸。它具有以下结构：
术语“癸酸盐”是指癸酸的盐、羊蜡酸的盐或羊蜡酸酯的盐。
有利地，盐是药学上可接受的。C9-C14脂肪酸的药学上可接受的盐的实例包括钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐和铜盐；优选钠盐或钾盐或钠盐和钾盐的组合。在一个实施方案中，所述盐为钠盐。在一个实施方案中，C9-C14脂肪酸的盐为钠盐，例如癸酸钠。
在一个实施方案中，白蛋白组合物中脂肪酸和/或其盐的量是适于在巴氏杀菌过程中稳定白蛋白的量，对于25％白蛋白的浓度而言为约0.02M。白蛋白的较低浓度是用脂肪酸和/或其盐的按比例降低的量稳定的。本文中考虑白蛋白的稳定化可以用辛酸和/或辛酸盐进行，并且在稳定化的要求(即巴氏杀菌过程)后，将辛酸和/或辛酸盐从白蛋白组合物中除去。此类去除被称之为反萃取或消耗。此类去除的结果是不含或基本上不含脂肪酸或其盐的白蛋白组合物，其也被称为裸白蛋白组合物。本发明考虑使用裸白蛋白组合物以预防或最小化EMT。或者，用于稳定白蛋白的脂肪酸或其盐不是纯辛酸和/或其盐，并且含有至少但不限于30％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的C9-C14脂肪酸和/或其盐，或C9-12脂肪酸和/或其盐，或C10-C12脂肪酸和/或其盐，或C10脂肪酸和/或其盐。在脂肪酸和/或其盐的含量的至少30％为C9-C14脂肪酸和/或其盐的这些情况下，在稳定化需求(即巴氏杀菌过程)后除去脂肪酸和/或其盐对于本发明的目的而言不是必需的。
在一个实施方案中，制剂中白蛋白的量为约5％至小于约40％(w/v)。在一个实施方案中，制剂中白蛋白的量为约5％至约25％(w/v)。在一个实施方案中，制剂中白蛋白的量为约20％至约25％(w/v)。在一个实施方案中，制剂中白蛋白的量为约5％(w/v)。在一个实施方案中，制剂中白蛋白的量为约20％(w/v)。在一个实施方案中，制剂中白蛋白的量为约25％(w/v)。术语“白蛋白的组合物”，“白蛋白组合物”和“白蛋白制剂”在本文中可互换使用，并且意指包含白蛋白的组合物。
术语“白蛋白”意指具有与人血清白蛋白(HSA)相同和/或非常相似的三级结构的蛋白质。在一个实施方案中，白蛋白是天然HSA或保留HSA功能/特性的其变体。图3示出了天然HSA前蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1,NCBI参考序列：NP_000468.1,UniProtKB:P02768)。应当注意的是，各个体之间可能发生天然HSA前蛋白的氨基酸序列的天然变异。
对编码的前蛋白进行蛋白水解加工，以产生包含前蛋白的残基25-609(残基1-18定义信号肽，残基19-24定义前肽)的成熟HSA蛋白。
白蛋白的一些主要功能/特性是：i)其调节血浆体积的能力，ii)约19天±5天的长血浆半衰期，iii)配体结合，例如结合内源性分子如亲脂性羧酸化合物包括胆红素脂肪酸、血红素和甲状腺素(也可见Kragh-Hansen等人，2002,Biol.Pharm.Bull.25,695的表1)，iv)结合具有酸性或带负电特征的小有机化合物，例如药物如华法林、地西泮、布洛芬和紫杉醇(也可见Kragh-Hansen等人，2002,同上的表1)。
术语“变体”意指相对于天然HSA在一个或更多个(几个)位置处包含改变即取代、插入和/或缺失的多肽。改变的多肽(变体)可以通过修饰编码天然白蛋白的多核苷酸序列人为干预得到，或者可以是天然存在的。变体白蛋白的氨基酸序列为至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％与SEQID NO：1的残基1-609相同，并且其优选维持天然HSA的至少一种功能/特性。例如，本发明的白蛋白变体包括3-585序列的片段。两个氨基酸序列之间的序列同一性可以使用众所周知的算法例如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice等人.2000,Trends Genet.16:276-277)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。序列同一性还可以使用Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215：403-10中描述的BLAST算法(使用公开的默认设置)来确定。执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心获取。
因此，在一个实施方案中，本发明涵盖白蛋白组合物，其包含与天然成熟白蛋白(即上文残基25-609)具有至少70％同一性的白蛋白。在实施方案中，本发明涵盖与天然成熟白蛋白具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的白蛋白的用途。天然成熟HSA蛋白质的此类变体相对于天然成熟白蛋白可包含氨基酸缺失、取代和/或增加。
本文中定义的制剂中存在的白蛋白可以从任何来源例如从血液、血浆、分级人血清或分离/获得或通过基因工程(重组白蛋白)获得。来自分级人血清的白蛋白可以例如通过血浆的低温乙醇分级分离进行制备(例如，Cohn工艺及其变体)。白蛋白也可以通过色谱法从血浆纯化得到。白蛋白可以通过应用于血浆的一系列亲和离子交换柱获得，并且得到纯化白蛋白。纯化白蛋白通常在60℃下经受热处理10小时或经受热巴氏杀菌进行灭菌。为了最小化因热处理引起的白蛋白变性，使白蛋白与脂肪酸(或其盐)络合。白蛋白也可以使用常规基因工程方法进行重组制备(见例如，Sambrook等人(1989)，分子克隆：实验室手册；以及Sambrook和Russell(2001)，分子克隆：实验室手册(第3版；Cold Spring HarborLaboratory)。例如，包含编码白蛋白多肽的核酸序列的重组表达载体可被引入细胞，例如宿主细胞(细菌或真核细胞)，其可以包括能够从确定的重组表达载体表达蛋白质编码区的活细胞。载体可以通过常规转化或转染技术引入细胞，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、电穿孔、显微注射和病毒介导的转染。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以例如在Sambrook例如(同上)、Sambrook和Russell(同上)以及其他实验室手册中找到。本发明的组合物中存在的白蛋白包括白蛋白融合蛋白和通过共价键与蛋白质结合的白蛋白。例如，融合可以通过使白蛋白经由柔性甘氨酸丝氨酸接头或另一个接头与氨基酸序列(代表蛋白质或其片段)的C-末端或N-末端进行基因融合来得到。例如，结合可以与用马来酰亚胺基团修饰的蛋白质进行，所述基团与白蛋白的硫醇基团反应并共价结合。
维持天然HSA的至少一种功能/特性的HSA变体是本领域众所周知的。本文中可使用的重组血清白蛋白的实例包括先前在美国专利号5,780,594和美国专利号5,948,609中公开的那些血清白蛋白。此外，修饰或截短的人白蛋白，例如美国专利号6,787,636中所公开者也可用于本发明。如其中所述，血清白蛋白可以是在其N-末端具有一个或两个氨基酸截断的白蛋白，或在N-末端处具有足以在N-末端产生空间位阻以降低白蛋白与痕量金属如铜和/或镍的亲和力，从而降低引起痕量金属过敏反应的可能性的任何其他突变的白蛋白(即，低过敏原HSA)。其他形式的HSA也可适用于某些应用，例如WO2011/051489和美国专利号8,822,417、WO2011/124718和WO2012/059486中公开的具有改变的血浆半衰期的白蛋白变体。
在实施方案中，本文所述制剂的pH为约5至约7.5，例如约5.5至约7.5，优选约6.5至7.4。
一种或更多种抗氧化剂或稳定剂也可以被加入制剂中，例如已知显示抗氧化剂或稳定活性的含硫的氨基酸、氨基酸盐或其衍生物，例如半胱氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸或其N-酰基(例如，N-乙酰基)衍生物如N-乙酰基甲硫氨酸(见美国专利号7,351,800)或其他抗氧化剂或稳定剂如N-乙酰基色氨酸(或N-乙酰基色氨酸盐)。因此，在一个实施方案中，本文定义的制剂或组合物包含一种或更多种药学上可接受的抗氧化剂或稳定剂，例如上述抗氧化剂或稳定剂。在另一个实施方案中，一种或更多种药学上可接受的抗氧化剂或稳定剂包含N-乙酰基甲硫氨酸和/或N-乙酰基色氨酸。
在一个实施方案中，制剂中的一种或更多种药学上可接受的抗氧化剂或稳定剂为约0.001M至约0.5M、约0.005至约0.1M、约0.01至约0.1M、约0.01至约0.08M或约0.01至约0.05M，例如，约0.01M、约0.02M、约0.03M、约0.04M或约0.05M，或上述任意两个值之间的范围。
在一个实施方案中，一种或更多种药学上可接受的赋形剂或载体包括例如着色剂、稳定剂、防腐剂、稀释剂、pH调节剂(例如，碱性氨基酸、酸性氨基酸、盐酸、乙酸、苹果酸或氢氧化钠)、渗透压摩尔浓度调节剂(例如，电解质如氯化钠、氯化钾、葡萄糖酸钾、硫酸镁、碳酸氢钠、氯化钙、葡萄糖酸钙或柠檬酸)和/或表面活性剂。在一个实施方案中，一种或更多种药学上可接受的赋形剂或载体包含渗透压摩尔浓度调节剂(例如，电解质)。在一个实施方案中，渗透压调节剂处于约10mM至约500mM的浓度。在另一个实施方案中，渗透压摩尔浓度调节剂处于约50mM至约300mM、约100mM至约200mM、约120mM至约180mM或约125mM至约175mM的浓度。在一个实施方案中，渗透压摩尔浓度调节剂包含钠、钾或两者。在另一个实施方案中，渗透压摩尔浓度调节剂包含钠和钾。在一个实施方案中，钠的量为约130至约160mM。在一个实施方案中，钾的量为约1mM至约5mM，例如约2mM。
本文所述的白蛋白制剂可以通过将i)脂肪酸或其盐或其甘油单酯或其甘油二酯或其甘油三酯或它们的组合和ii)一种或更多种药学上可接受的赋形剂或载体与iii)白蛋白水溶液(例如缓冲液如磷酸盐缓冲液，所述缓冲液可以作为药物制剂、注射用水或生理盐水施用)均匀混合进行制备。溶解后，将混合物溶液加工成适于施用于受试者的制剂，例如用于肠胃外施用，如静脉内液体制剂或注射用溶液。在实施方案中，这些制剂可以皮下或静脉内施用。
在一个实施方案中，本文所述的白蛋白制剂和抗EMT剂的组合物可用于已上市的白蛋白制剂目前适用的治疗适应症，例如有或没有休克的低血容量；低白蛋白血症，可能因白蛋白产生不足(例如，因营养不良、烧伤、重大损伤、先天性无白蛋白血症、肝病、感染、恶性肿瘤、化疗或内分泌失调)、过度-分解代谢(例如，因烧伤、重大损伤、胰腺炎、甲状腺毒症、天疱疮或肾病)、体内白蛋白的损失(例如，因出血、肾脏排泄过多、烧伤渗出物、渗出性肠病或剥脱性皮肤病)和/或体内白蛋白的再分布(例如，因重大手术、整形手术、肝硬化伴腹水、腹膜炎、粘连、憩室炎或各种炎性病状)引起；在体外心肺循环手术之前或期间；并用于治疗烧伤或肝硬化。在一个实施方案中，本文所述的白蛋白制剂或组合物被用于急性肝衰竭或慢性肝病急性失代偿(例如，体外肝脏支持)患者的白蛋白透析。在一个实施方案中，本文所述的白蛋白制剂被用于治疗中毒。在一个实施方案中，本文所述的白蛋白制剂被用于治疗感染、手术并发症、脓毒性休克或严重脓毒症。在一个实施方案中，本文所述的白蛋白制剂被用于药物制剂，以稳定药物或使药物更易溶或增加药物功效或其他目的或用于药物的递送媒介物。在这种情况下，术语“药物”和/或“活性剂”可以互换。在一个实施方案中，本文所述的白蛋白制剂被用于干细胞或胚胎的冷冻保存或用于肝细胞疗法或体外受精(IVF)。
因此，本发明提供了治疗需要用白蛋白治疗的患者的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的本文所述的白蛋白制剂或组合物。本发明提供了本文所述白蛋白制剂治疗需要用白蛋白治疗的患者的用途。本发明提供了本文所述的白蛋白制剂，用于治疗需要用白蛋白治疗的患者。
在一个实施方案中，所述施用或用途在所述受试者中不会刺激或增加EMT。在另一个实施方案中，所述施用或用途在所述受试者中预防或最小化EMT或减少EMT刺激。在一个实施方案中，此类施用或用途不会导致或基本不会导致EMT增加，而在另一个试验方案中抑制或减少所述受试者中的EMT。如本文所用的“不会刺激或增加EMT”、“预防或最小化EMT”或“不会导致或基本不会导致EMT增加”意指本文所述的组合物或制剂的施用或用途与商业上已知的白蛋白制剂相比不会导致或基本不会导致EMT增加。这些表达还意指本文所述的组合物或制剂的施用或用途相对于用辛酸和/或辛酸盐或包含白蛋白和浓度为0.08毫摩尔/克白蛋白的辛酸和/或辛酸盐或不存在抗EMT剂的组合物治疗产生的EMT水平，在所述受试者中导致较低的EMT水平。“抑制或减少EMT”意指本文所述的组合物或制剂的施用或用途不仅不会或基本不会导致EMT增加，而且与治疗前受试者的EMT水平相比，还降低了受试者中的EMT水平。如本文所用的“EMT基本上没有增加”意指施用或用途不会导致EMT显著增加，其在实施方案中是指相对于用本文所述组合物或制剂治疗受试者之前EMT增加小于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。
EMT可用本领域已知的各种方法进行评估，例如通过评估与EMT相关的一种或多种标记物的表达或水平。实例包括测定上皮细胞生物标记物的表达或水平和/或间充质生物标记物的表达或水平。此外，许多试剂、产品和试剂盒为市售，可用于评估EMT。在一个实施方案中，EMT可以通过评估人近端小管上皮细胞上的TGF-β诱导的胶原表达进行测定，因此人近端小管上皮细胞上的TGF-β诱导的胶原蛋白表达的增加指示EMT增加，并且人近端小管上皮细胞上的TGF-β诱导的胶原蛋白表达的减少指示EMT减少。
在一个实施方案中，本文所述的抗EMT剂的白蛋白制剂或组合物被用于治疗疾病或病状，其中它有益于预防或最小化EMT(以预防或最小化过度伤口愈合或瘢痕形成)，例如患有烧伤(例如严重烧伤或转移)的患者、接受器官移植的患者、患有肝肾疾病的患者(例如，预防或减少与此类病状相关的器官病变)或患有癌症的患者(例如增加化疗功效)或患有癌症的患者(例如，预防转移过程中涉及的EMT刺激)。
本文所述的白蛋白制剂通常以约5至12.5g白蛋白的剂量一次施用于成人。本文所述的抗EMT剂的白蛋白制剂或组合物可以按每周一次、每周两次、每三天一次、每两天一次、每天一次或约每天两次至四次、或仅一次施用，此取决于疾病状况。
在一个实施方案中，本文所述的任何组合物中的白蛋白处于1％至40％、2％至40％、5％至40％、5％至30％、5％至25％、20％至25％、约5％、约10％、约15％、约20％或约25％的浓度。
在一个实施方案中，本文所述的抗EMT剂的白蛋白制剂或组合物还包含活性成分。在一个实施方案中，活性成分被与白蛋白结合。在另一个实施方案中，活性成分不与白蛋白结合。
术语“活性剂”可与“活性成分”互换。药物活性剂可选自各种已知类型的药物，包括例如镇痛药、麻醉药、抗炎药、抗寄生虫药(例如，抗蠕虫药)、抗心律失常药、抗哮喘药、抗生素、抗癌药、抗凝药、抗抑郁药、抗糖尿病药、抗癫痫药、抗组胺药、镇咳药、抗高血压药、抗毒蕈碱药、抗分枝杆菌药、抗肿瘤药、抗氧化剂、退热药、免疫抑制剂、免疫刺激剂、抗甲状腺药物、抗病毒药物、抗焦虑镇静剂(催眠药和精神抑制药)、收敛剂、抑菌剂、β-肾上腺素受体阻滞剂、血液制品及替代品、支气管扩张药、缓冲剂、心肌收缩力药、化疗药、造影剂、皮质类固醇、止咳药(祛痰药和粘液溶解剂)、诊断剂、诊断成像剂、利尿剂、多巴胺能药(抗帕金森病药)、自由基清除剂、生长因子、止血药、免疫药、脂质调节剂、肌肉松弛剂、蛋白质、肽类和多肽、副交感神经药、甲状旁腺降钙素和双膦酸盐、前列腺素、放射性药物、激素、性激素(包括类固醇)、定时释放粘合剂、抗过敏药、兴奋剂和减食欲剂、类固醇、拟交感神经药、甲状腺药、疫苗、血管扩张剂和黄嘌呤。
在一个实施方案中，药物活性成分在水中不溶或微溶。可与白蛋白一起掺入组合物中的药物活性成分的实例包括氨鲁米特、硫唑嘌呤、硫酸博来霉素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环孢菌素、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、依托泊苷、氟尿嘧啶、干扰素-α、洛莫司汀、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托坦、盐酸丙卡巴肼、硫鸟嘌呤、硫酸长春碱，硫酸长春新碱、紫杉烷(例如，紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、多西他赛的疏水衍生物如2'-O-己酰基多西他赛和2'-苯甲酰基多西他赛)；大环内酯类如雷帕霉素及其衍生物(例如，坦罗莫司和依维莫司)、埃博霉素B及其衍生物、坦螺旋霉素及其衍生物；喜树碱类，包括但不限于10-羟基喜树碱、SN-38及其衍生物；蒽环类抗生素，包括但不限于阿克拉霉素和吡柔比星；或其他药物活性成分，包括秋水仙碱及其衍生物、硫代秋水仙碱二聚体、胺碘酮、碘塞罗宁、环孢菌素、依西美坦、氟他胺、氟维司群、罗米地辛、司莫司汀、布洛芬、环孢菌素、异丙酚、长春碱等。在一些实施方案中，活性成分为抗癌药物，例如紫杉烷、喜树碱、伊立替康、吉西他滨，环磷酰胺(CytoxanTM)、多柔比星或顺铂，优选紫杉烷，例如紫杉醇或多西他赛。在特定的实施方案中，活性成分是紫杉醇。
在一个实施方案中，白蛋白是纳米颗粒的形式。因此，在另一方面，本发明提供一种纳米颗粒，其包含(i)白蛋白，(ii)抗EMT剂；(iii)所述白蛋白中掺入或包封的药物活性(例如治疗)剂。因此，在另一方面，本发明提供一种纳米颗粒，其包含(i)白蛋白，(ii)不含辛酸和/或辛酸盐或低浓度的辛酸和/或辛酸盐。所述“低浓度”如上所述。包含白蛋白和药物活性剂的纳米颗粒及其制备方法在例如PCT申请号WO2015/018380和WO2016/000653中公开。
如本文所用的术语“纳米颗粒”是指尺寸处于纳米尺度例如在约1nm、约10nm、约100nm或约500nm水平的颗粒。在一个实施方案中，纳米颗粒的尺寸为约1nm至约500nm、约10nm至约200nm，例如约30、50、70、80或100至约120、140、160、180或200nm或上述任意两个值之间的范围。
在一个实施方案中，组合物(例如，纳米颗粒)中白蛋白与药物活性成分的重量比为约0.01:1至约100:1。在另一个实施方案中，组合物(纳米颗粒)中白蛋白与药物活性成分的重量比为约0.02:1至约50:1；约0.05:1到约20:1；约0.1:1到约10:1；或约0.2:1至约5:1，或上述任意两个值之间的范围。
在一个实施方案中，液体形式的药物组合物包含0.1％至约40％(w/v)的白蛋白，例如约0.5％(w/v)、1％(w/v)或2％(w/v)至约5％(w/v)、约10％(w/v)、约15％(w/v)、约20％(w/v)、约30％(w/v)或约35％(w/v)。在一些实施方案中，液体形式的组合物包含约20％至约25％(w/v)的白蛋白，或上述任何两个值之间的范围。
本文所用的术语“约”意指由术语“约”定义的值的平均值+/-10％，优选由术语“约”定义的值的平均值+/-5％。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本文定义的组合物或制剂，并且还包含一种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂。此类药物组合物可以按照药学领域众所周知的方式制备。载体/赋形剂可以适合用于例如静脉内、胃肠外、皮下、肌内、颅内、眶内、眼部、心室内、囊内、脊柱内、鞘内、硬膜外、脑池内、直肠、腹膜内、鼻内或肺部(例如，气溶胶)施用(见Remington:The Science and Practice of Pharmacy，Loyd V Allen,Jr,2012，第22版，Pharmaceutical Press；Handbook of Pharmaceutical Excipients，Rowe等人，2012，第7版，Pharmaceutical Press)。治疗制剂是使用本领域已知的标准方法通过将具有所需纯度的组合物或制剂与一种或更多种任选的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂混合进行制备。
本文所用的“赋形剂”具有其本领域中的正常含义，并且是本身并非活性成分(药物)的任何成分。赋形剂包括例如缓冲剂、稀释剂、润滑剂、稳定剂和其他组分。如本文所使用的“药学上可接受的赋形剂”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性并且对受试者没有毒性的任何赋形剂，即是一种类型的赋形剂和/或以对受试者没有毒性的量使用。赋形剂是本领域中众所周知的，并且本系统不限于这些方面。如技术人员将认识到，单一赋形剂可以一次实现多于两种功能，例如可以用作粘合剂和增稠剂。如技术人员还将认识到，这些术语不必是互斥的。
在一个实施方案中，本文所述的抗EMT剂的白蛋白制剂或组合物是混悬液或溶液，例如混悬液或注射用溶液。白蛋白组合物或制剂可被混悬或溶解在任何合适的液体或稀释剂中，例如药学上可接受的或生理学上可接受的液体，其可以是或可以不是或包含赋形剂、载体或稳定剂。它包括任何和所有溶剂和分散介质。液体或稀释剂的实例包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸。含水液体或稀释剂为优选的，例如水(例如，注射用水)、盐水如生理盐水0.9％NaCl(w/v)或pH缓冲水溶液。
胃肠外施用的制剂可例如含赋形剂、无菌水、盐水或聚亚烷基二醇如聚乙二醇。生物相容、生物可降解的交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。本文所述的抗EMT剂的白蛋白制剂或组合物的其他潜在有用的胃肠外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、植入式注射系统和脂质体。吸入制剂可含赋形剂(例如，乳糖)或可为含例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或可为油性溶液，用于以鼻用滴剂形式或作为凝胶施用。
本文所述的抗EMT剂的白蛋白制剂或组合物可以是干燥制剂(例如冻干组合物)或被混悬在生物相容的介质中。在药物组合物为冻干粉末形式的实施方案中，它包含一种或更多种冻干赋形剂，例如稳定剂和增积剂、甘露醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、葡聚糖、缓冲剂、水等或它们的混合物。合适的生物相容介质包括但不限于水、缓冲水性介质、盐水、缓冲盐水、任选缓冲的氨基酸溶液、任选的蛋白质缓冲溶液、任选缓冲的糖溶液、任选缓冲的维生素溶液、任选的缓冲溶液的合成聚合物、含脂质乳液等。在一些实施方案中，组合物是无菌冻干粉末形式。在一些实施方案中，组合物是用无菌或水或缓冲液复溶的。例如，组合物(例如药物组合物)可以在氯化钠溶液如0.9％氯化钠缓冲液中复溶。
在另一个实施方案中，本文所述的抗EMT剂的白蛋白制剂或组合物被用于局部施用。局部制剂的形式可为任何形式，例如乳膏、乳液、油、泡沫、凝胶、洗剂、软膏、糊剂、喷雾剂或混悬液。局部制剂/组合物任选地包含一种或更多种局部可接受的助剂，包括例如载体、赋形剂、乳化剂、表面活性剂、防腐剂、油、增稠剂、聚合物、凝胶形成剂、稠度调节剂、抗氧化剂、消泡剂、抗静电剂、树脂、溶剂、促溶剂、中和剂、稳定剂、灭菌剂、抛射剂、水溶性或可分散的含硅聚合物、保湿剂、润肤剂或它们的任何混合物。可掺入局部制剂的常规胶凝剂包括以下一种或更多种，但不限于羟乙基纤维素、卡波姆、聚乙烯均聚物、聚乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯/丙烯酸共聚物、壬二酸、芦荟、卵磷脂、热可逆多糖和十六烷基羟乙基纤维素。
如果需要，待施用的药物组合物也可含有少量无毒辅料，例如润湿剂和乳化剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯等。如果需要，也可以加入着色剂。
在另一个方面，本发明提供了使用本文所述的抗EMT剂的白蛋白制剂或组合物的方法。本文所述的抗EMT剂的白蛋白制剂或组合物可用于治疗对活性成分有反应的任何疾病或病症。
例如，本文所述的抗EMT剂的白蛋白制剂或组合物可包含一种或更多种抗癌药，并且可用于治疗癌症，例如肝癌、前列腺癌和肺癌。可以治疗的其他疾病或病症包括乳腺癌、多发性骨髓瘤、移植排斥、结肠癌或淋巴瘤。在一个实施方案中，所述癌症不是胰腺癌。
在一个特定方面，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文提供的药物组合物或纳米颗粒，其中所述药物活性成分是抗肿瘤剂或化疗剂。
在具体的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，包括但不限于人、犬、小鼠和大鼠。在具体的实施方案中，所述白蛋白与受试者同源。
任何适合量的药物组合物均可施用于受试者。剂量将取决于包括施用方式在内的许多因素。
关于指定疾病或病状的预防、治疗或严重性下降，组合物的适当剂量将取决于待治疗的疾病或病状的类型、疾病或病状的严重性和病程、所述组合物被施用供预防抑或治疗目的、先前疗法、患者的临床史和对组合物的响应以及主治医师的裁量。所述组合物被一次性或在一系列治疗中适当地施用于患者。优选地，期望体外测定剂量-响应曲线，然后在人体试验之前在有用的动物模型中测定。本发明提供了化合物和包含所述化合物的组合物的剂量。对于历经若干天或更长时间的重复施用，取决于病状，治疗持续直到出现所需疾病症状遏制。然而，其他剂量方案可能是可用的。通过常规技术和检定可易于监测该疗法的进程。
实施例
以下举例说明本发明的实施方案。
实施例1：通过耗尽/置换辛酸钠制备白蛋白和癸酸钠的组合物
使用0.12M NaCl，30mM羊脂酸盐(辛酸钠)溶液中浓度为200g/L的人血清白蛋白(HSA)作为起始物料(Sigma，目录号C5038-1KG)。将该样品在0.12M NaCl中1:20稀释，得到浓度为约10g/L的白蛋白溶液。然后将该样品用0.12M NaCl渗滤(即缓冲液交换)8次，并再浓缩至白蛋白约50g/L。然后，用包含30mM癸酸钠和0.12M NaCl的溶液进行第二个渗滤步骤3个渗滤体积，并用30mM癸酸钠稀释样品至最终白蛋白浓度200g/L。
人血清白蛋白组合物中癸酸钠的定量测定按照实施例2中描述的方法进行。
实施例2：白蛋白溶液中癸酸钠与辛酸钠的检测
白蛋白溶液中辛酸钠测定的定量方法基于出版物Dengler T.等人，Infusionstherapie 15:273-274(6/1988)。反相的内标是癸酸钠。对于癸酸钠的定量检测，辛酸钠被用作标准品，并且癸酸钠是络合剂。从人血清白蛋白组合物中提取的辛酸和癸酸的214nm相对响应和相对回收率的测定
对用癸酸钠代替辛酸钠得到的白蛋白组合物以及40mM羊脂酸钠(辛酸钠)和40mM癸酸钠的溶液进行HPLC分析，以确认白蛋白组合物中的辛酸钠完全被癸酸钠代替。
样品制备：将250μl试验组合物加入800μl甲醇中并涡旋20秒。将沉淀物以10K RPM离心5分钟，除去上清液并经0.45μmMillexTMHV过滤器过滤。将各等份转移至自动进样器小瓶中。用4.6×250mm Nucleosil-C18(5μm)柱以含0.1％三氟乙酸(TFA)的甲醇/水(4:1)作为流动相、以0.8ml/min的流速进行提取物的反相高效液相色谱分析。进样20μl。通过214nm紫外(UV)吸收进行检测。将每个样品提取物进样三次并取峰面积平均值。HPLC分析是用HewlettModel 1100 HPLC进行，该仪器配有G1315B二极管阵列检测器、G1311A四元泵、G1329A恒温自动采样器、G1316A恒温柱室和安装有10.02软件的HPd530c计算机用Alltech Nucleosil C-18,4.6mm×250mm柱5μm进行等度反相分析。
如图1中所示，发现实施例1中制备的白蛋白组合物中没有可检测量的辛酸钠。这意味着与白蛋白初步络合的辛酸钠被成功去除并用癸酸钠替代。
实施例3：制备包含癸酸钠和裸人血白蛋白的白蛋白组合物
来自Sigma-的人血清白蛋白(HSA-不含脂肪酸)(#A1887)被用于该实验。该人血清白蛋白也称为“裸人血白蛋白”，它仅含有0.007％(w/w)或更少的痕量脂肪酸。将HSA溶解于PBS，以得到6.6％的浓度(6.6g/100ml)，并用0.2μm过滤器过滤。将75μl辛酸钠或癸酸钠10mM与75μl HSA 6.6％混合(未涡旋)，并在室温下培养10分钟。在实施例4的检定中使用该混合物100μL，终体积为1ml(稀释度1:10)。
实施例4：TGF-β诱导的上皮细胞(HK-2细胞)中的EMT调节
进行分析以确定各组合物对TGF-β诱导的胶原蛋白1表达的影响，该表达是永生化的人近端小管上皮细胞(HK-2细胞)上EMT的标记物。用浓度为10ng/ml的TGF-β(EMT诱导剂)处理HK-2细胞。通过定量实时PCR确定EMT标记物胶原蛋白1mRNA的表达。
通过实施例1或实施例3的方法制备的白蛋白组合物是按2.5或5.0×10-4M的癸酸钠或辛酸钠配制。平行检验相同浓度的单独癸酸钠和辛酸钠(即不含白蛋白)以及指定浓度的壬酸、十一烷酸和月桂酸钠。
表1显示癸酸钠单独或与白蛋白一起配制均可降低(或抑制)TGF-β诱导的HK-2细胞中胶原的表达。单独使用的壬酸、十一烷酸和月桂酸钠也抑制TGF-β诱导的HK-2细胞中胶原的表达。相反，在单独或与白蛋白一起配制的辛酸钠处理的TGF-β诱导的细胞中，增加(或刺激)了胶原的表达。因此，按照HK-2细胞中TGF-β诱导的胶原1的表达所评估，癸酸钠和辛酸钠对EMT具有相反的作用，其中癸酸钠抑制EMT，而辛酸钠刺激EMT，并且存在白蛋白时保留此类作用。壬酸、十一烷酸和月桂酸钠对EMT的作用似乎与癸酸钠的作用相似。组合物中存在和不存在白蛋白对EMT没有影响，证明EMT的抑制或刺激是组合物中存在的脂肪酸或盐的结果。“HSA”是指根据实施例3用裸白蛋白制备的白蛋白组合物。“ALB”是指通过根据实施例1通过耗尽辛酸钠并用癸酸钠替代而制备的白蛋白组合物。
表1：单独或与白蛋白组合用C8-C12脂肪酸或其盐处理后HK-2细胞引起的胶原 mRNA表达
还检验了游离C10-C14甘油三酯(具有饱和碳链)对HK-2细胞引起的胶原mRNA表达的影响。结果在表2中报告。
表2：用包含C10-C14甘油三酯的组合物处理后HK-2细胞引起的胶原mRNA表达
通过比较表2中三羊蜡酸甘油酯和C8链占70％、C10链占30％的甘油三酯混合物的结果，可以发现70％的C8链的存在降低了胶原表达的抑制。
在上文所述体外模型中，在含有白蛋白和不含白蛋白的组合物中检验了100:0、95:5、70:30、50:50、30:70、5:95和0:100的辛酸钠:癸酸钠比例。脂肪酸的盐和白蛋白的各种组合物已通过实施例3中所述方法进行制备。胶原1α1mRNA表达在图2中报告。实时PCR是用归一化至人GAPDH内源对照的人TaqMan基因表达检定进行。参考是TGF-β1对照(RQ＝1)。*和**分别表示与参考相比0.05和0.01的p值。检验的辛酸钠和癸酸钠混合物的浓度为500μM。试验次数为3(n＝3)。
首先，图2中显示的结果证实白蛋白对胶原表达没有影响，因此对EMT没有影响。其次，可以发现胶原的表达与癸酸钠与辛酸钠的比例成剂量依赖性。第三，可以发现当癸酸钠以脂肪酸含量的总盐的30％或以上存在时，可以观察到胶原表达显著降低。70:30、50:50、30:70、5:95和0:100的辛酸钠:癸酸钠比例显著降低或抑制胶原表达。这证实70:30的辛酸钠:癸酸钠比例是癸酸钠的抑制作用成功地补偿辛酸钠刺激作用的最小比例。在该研究中，以100:0和95:5的辛酸钠:癸酸钠比例证明了辛酸钠的刺激作用，其中观察到的胶原表达升高至对照(TGF-β1处理的HK-2细胞)的水平以上。
实施例5：TGF-β诱导的人微血管内皮细胞(HMEC)中的EMT调节
本说明书中所用表达EMT的定义中包含的内皮细胞-间充质细胞转换(EndoMT)可以通过转化生长因子(TGF-β)进行诱导。进行EndoMT的分析，且分析方法描述于实施例4中。实时PCR是用归一化至人GAPDH内源对照的人TaqMan基因表达检定进行。参考是TGF-β1对照(RQ＝1)。**和***分别表示与参考相比0.01和0.001的p值。检验的辛酸钠和癸酸钠浓度为500μM。试验次数为3(n＝3)。
图4示出了TGF-β对EndoMT的诱导，并且通过胶原1a1 mRNA表达的增加进行表示。图4还表明，在白蛋白(含HSA)存在或白蛋白(不含HSA)不存在的情况下，癸酸钠与辛酸钠相反，显著降低了由TGF-β诱导的间充质细胞转换。因此，本发明的抗EMT剂成功地抑制或减少内皮细胞中的EMT。
实施例6：TGF-β诱导的人肝细胞癌细胞：HepG2中的EMT调节
按照实施例4中描述的方法，在人肝细胞癌细胞系HepG2中进行EMT分析。这些细胞高度分化，并显示出正常肝细胞的许多基因型特征(Sassa等，1987)。因此，HepG2细胞可被用于筛选EMT，如图5所示，TGF-β也增加EMT标记物胶原1a1 mRNA表达。实时PCR是用归一化至人GAPDH内源对照的人TaqMan基因表达检定进行。参考是TGF-β1对照(RQ＝1)。*、**和****分别表示与参考相比0.05、0.01和0.0001的p值。检验的辛酸钠和癸酸钠浓度为500μM。试验次数为3(n＝3)。
图5表明，在白蛋白(含HSA)存在或白蛋白(不含HSA)不存在的情况下，癸酸钠与辛酸钠相反，显著降低了由TGF-β诱导的间充质细胞转换。因此，本发明的抗EMT剂成功地抑制或减少肝细胞中的EMT。
实施例7：TGF-β诱导的人肺上皮细胞A549中的EMT调节
还通过实施例4中描述的方法，在人肺上皮细胞A549中进行EMT分析。TGF-β还增加人肺上皮细胞A549中EMT的标记物胶原1a1 mRNA的表达。实时PCR是用归一化至人GAPDH内源对照的人TaqMan基因表达检定进行。参考是TGF-β1对照(RQ＝1)。***和****分别表示与参考相比0.001和0.0001的p值。检验的辛酸钠和癸酸钠浓度为500μM。试验次数为3(n＝3)。
图6表明，在存在白蛋白(含HSA)或不存在白蛋白(不含HSA)的情况下，癸酸钠与辛酸钠(未提供显著结果)相反，显著降低了由TGF-β诱导的间充质细胞转换。因此，本发明的抗EMT剂成功地抑制或减少肺细胞中的EMT。
实施例8：TGF-β诱导的人前列腺癌PC-3中的EMT调节
上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)是上皮细胞失去其细胞极性并获得迁移和浸润特性变为间充质干细胞的过程；这些细胞为是多潜能基质细胞，可以分化成各种细胞类型。EMT对多种发育过程必不可少，包括中胚层形成和神经管形成。EMT还被证实出现在伤口愈合、瘢痕形成过程和癌症进展的转移开始中。
本试验举例说明了在“划痕检定”中通过PC-3细胞的浸润/迁移进行癌细胞的EMT分析。该检定基于以下观察：在汇合细胞单层上创建新的人工间隙(所谓的“划痕”)时，新产生的间隙边缘上的细胞将向开口移动以闭合划痕。EGF(上皮生长因子)被用于诱导PC-3细胞迁移/浸润到划痕中。简而言之，将培养物-插入物置于24孔细胞培养皿中。将PC-3细胞接种到培养物-插入物中，并在CO2培养箱中以37℃培养过夜。然后，用无血清培养基将细胞再饥饿24小时。取出插入物，留下可见的500μm无细胞间隙。用50ng/mL的EGF和10μg/mL的丝裂霉素C(Mito+EGF)和促EMT剂、辛酸钠(Mito+EGF+辛酸钠)或抗EMT剂、癸酸钠(Mito+EGF+癸酸钠)处理细胞24小时，含HSA(图7第二行)和不含HSA(图7第一行)。治疗后1小时拍摄照片，作为每组的汇合对照。24小时后，通过结晶紫染色固定细胞，并在处理后风干24小时，拍照。图片报告在图7中。
在图7中可以发现，EGF促进用丝裂霉素处理的PC-3细胞的迁移或浸润。图7表明向细胞培养物中加入癸酸钠(含和不含白蛋白)产生EGF诱导的PC-3细胞迁移或浸润，而辛酸钠不会抑制细胞迁移。当辛酸钠与白蛋白结合时，这种迁移增加。
***
权利要求的范围不应被实施例中阐述的优选实施方案限制，而应给予与说明书作为一个整体一致的最广范的解释。

Claims (36)

1.一种用于治疗受试者的疾病或病状的组合物，所述受试者需要接受白蛋白组合物来治疗所述疾病或病状，其中所述组合物抑制或减少上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)，并且：
-含有白蛋白；
-不含促EMT剂或含低浓度的促EMT剂；和/或
-含促EMT剂和抗EMT剂的含量比例为促EMT剂:抗EMT剂7:3至0:10；
其中：
-所述促EMT剂为辛酸、辛酸盐或它们的组合；
-所述抗EMT剂为C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸的盐、C9-C14脂肪酸的甘油单酯、C9-C14脂肪酸的甘油二酯、C9-C14脂肪酸的甘油三酯或它们的组合；且
-促EMT剂的所述低浓度为小于0.08毫摩尔/克白蛋白；
-附带条件是，当所述促EMT剂和所述抗EMT剂为脂肪酸时，它们是不同的脂肪酸或它们是甘油二酯或甘油三酯的一部分。
2.如权利要求1所述的组合物，其中促EMT剂的所述低浓度为0.04毫摩尔/克白蛋白或更低。
3.如权利要求1所述的组合物，其中促EMT剂的所述低浓度为0.007％(w/w)或更低。
4.如权利要求1所述的组合物，其中促EMT剂:抗EMT剂的所述比例为5:5至0:10。
5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述抗EMT剂为C9-C12脂肪酸、C9-C12脂肪酸的盐、C9-C12脂肪酸的甘油单酯、C9-C12脂肪酸的甘油二酯、C9-C12脂肪酸的甘油三酯或它们的组合。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述抗EMT剂为C10-C12脂肪酸、C10-C12脂肪酸的盐、C10-C12脂肪酸的甘油单酯、C10-C12脂肪酸的甘油二酯、C10-C12脂肪酸的甘油三酯或它们的组合。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述抗EMT剂为C10脂肪酸、C10脂肪酸的盐或它们的组合。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述组合物为包含约1％至约40％(w/v)白蛋白的水性白蛋白制剂。
9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述盐为钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐、铜盐或它们的组合。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述盐为钠盐。
11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含药物活性剂。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述活性剂为抗癌药物，并且所述药物用于治疗癌症。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述抗癌药物为紫杉烷。
14.如权利要求13所述的组合物，其中紫杉烷为紫杉醇或多西他赛。
15.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述白蛋白组合物由医师推荐用于治疗所述疾病或病状。
16.如权利要求1至11和15中任一项所述的组合物，其中所述疾病或病状为出血、低血容量、烧伤、急性肝衰竭、肝功能障碍、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫综合征、肝硬化、新生儿溶血病、体外心肺循环手术、肾病、癌症、肝肾综合征、脓毒症、器官灌注或器官再灌注。
17.一种用于抑制或减少受试者中上皮细胞-间充质细胞转换(EMT)的组合物，其中所述组合物：
-不含促EMT剂或含低浓度的促EMT剂；和/或
-含促EMT剂和抗EMT剂的含量比例为促EMT剂:抗EMT剂7:3至0:10；
其中：
-所述促EMT剂为辛酸、辛酸盐或它们的组合；
-所述抗EMT剂为C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸的盐、C9-C14脂肪酸的甘油单酯、C9-C14脂肪酸的甘油二酯、C9-C14脂肪酸的甘油三酯或它们的组合；且
-促EMT剂的所述低浓度为小于0.02M；
-附带条件是，当所述促EMT剂和所述抗EMT剂为脂肪酸时，它们是不同的脂肪酸或它们是甘油二酯或甘油三酯的一部分。
18.如权利要求17所述的组合物，其中促EMT剂的所述低浓度为0.01M或更低。
19.如权利要求17所述的组合物，其中促EMT剂的所述低浓度为0.001M或更低。
20.如权利要求17所述的组合物，其中促EMT剂:抗EMT剂的所述比例为5:5至0:10。
21.如权利要求20所述的组合物，其中促EMT剂:抗EMT剂的所述比例为约0:10。
22.如权利要求17至21中任一项所述的组合物，其中所述抗EMT剂为C9-C12脂肪酸、C9-C12脂肪酸的盐、C9-C12脂肪酸的甘油单酯、C9-C12脂肪酸的甘油二酯、C9-C12脂肪酸的甘油三酯或它们的组合。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述抗EMT剂为C10-C12脂肪酸、C10-C12脂肪酸的盐、C10-C12脂肪酸的甘油单酯、C10-C12脂肪酸的甘油二酯、C10-C12脂肪酸的甘油三酯或它们的组合。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述抗EMT剂为C10脂肪酸、C10脂肪酸的盐、C10脂肪酸的甘油单酯、C10脂肪酸的甘油二酯、C10脂肪酸的甘油三酯或它们的组合。
25.如权利要求17至24中任一项所述的组合物，其中所述盐为钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐、铜盐或它们的组合。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述盐为钠盐。
27.如权利要求17至26中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含药物活性剂。
28.如权利要求27所述的组合物，其中所述活性剂为抗癌药物，并且所述药物用于治疗癌症。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述抗癌药物为紫杉烷。
30.如权利要求29所述的组合物，其中紫杉烷为紫杉醇或多西他赛。
31.如权利要求17至27中任一项所述的组合物，其用于治疗疾病或病状，所述疾病或病状为出血、低血容量、烧伤、急性肝衰竭、肝功能障碍、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫综合征、肝硬化、新生儿溶血病、体外心肺循环手术、肾病、癌症、肝肾综合征、脓毒症、器官灌注、器官再灌注、瘢痕形成、牛皮癣或湿疹。
32.如权利要求17至27中任一项所述的组合物，其中促EMT剂和抗EMT剂的总浓度对于经口或局部施用为每剂量5mg/kg至300mg/kg所述受试者。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述总浓度为每剂量10mg/kg至100mg/kg之间。
34.如权利要求17至27中任一项所述的组合物，其中所述总浓度对于静脉内、腹膜内、直肠、肌内或皮下施用为每剂量0.5mg/kg至100mg/kg所述受试者之间。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述总浓度为每剂量0.5mg/kg至4mg/kg之间。
36.如权利要求17至27、32和33中任一项所述的组合物，其中所述组合物为局部施用，并且所述药物用于治疗烧伤、预防瘢痕形成或治疗瘢痕、牛皮癣或湿疹。
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