TW201825110A - 用於預防或最小化上皮─間葉轉變之方法及組成物 - Google Patents

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Abstract

所描述者係組成物，包括白蛋白組成物，其抑制或最小化上皮-間葉轉變(EMT)。在實施例中，此類組成物包含白蛋白及以下任一者：i)無促EMT劑或低濃度促EMT劑；ii)一定含量促EMT劑及抗EMT劑，促EMT劑：抗EMT劑之比係7：3至0：10；或iii)兩者。該促EMT劑係辛酸、辛酸鹽或其組合。該抗EMT劑係C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸鹽、C9-C14脂肪酸之單甘油酯、C9-C14脂肪酸之二酸甘油酯、C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯或其組合。此類白蛋白組成物之用途，其用於各種基於白蛋白之治療性應用，且更特定言之用於治療應預防或最小化EMT之疾病或病狀。此等白蛋白組成物可有利地與已知活性成分組合使用。同樣，所描述者係C9-C14脂肪酸及/或其鹽，或C9-C14脂肪酸之單甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯，及其用途，其用於各種治療性應用，且更特定言之用於治療應預防或最小化EMT之疾病或病狀。

Description

用於預防或最小化上皮-間葉轉變之方法及組成物
本發明係關於用於預防或最小化上皮-間葉轉變(EMT)之方法，以及用於製備用於預防或最小化上皮-間葉轉變(EMT)之藥物的對應用途。更特定言之，本發明係關於白蛋白製劑，及其在各種醫學應用中之用途。該白蛋白製劑包含無促EMT劑或包含低濃度促EMT劑；或抗EMT劑，其中該促EMT劑對抗EMT劑係70：30至0：100。該抗EMT劑係包含9至14個碳之烷基鏈之脂肪酸、或其鹽、或其單甘油酯、或其二酸甘油酯、或其三酸甘油酯、或其組合。該促EMT劑係辛酸(C8脂肪酸)或辛酸鹽(C8脂肪酸之鹽)。
本發明亦關於抗EMT劑在治療各種醫學病狀中之方法及用途。
白蛋白
人類血清白蛋白(HSA)係人類血漿中存在之最豐富的蛋白質(濃度係35-50g/L)。HSA可溶於血漿中且呈蛋白質單體存在(MW=66,500)。其於肝中產生且執行多個功能，大部分功能涉及小分子之轉運。HSA優先結合疏水性羧酸。結合至HSA並由其轉運之分子包括游離脂肪酸、激素諸如甲狀腺激素、未結合型膽色素及多種藥物。因而，HSA可藉由結合藥物，導致隨後推遲分解代謝過程來延長藥物之半衰期。由於HSA在全身循環中之濃度相對高，其在循環系統內維持膠體滲透(oncotic)壓。膠體滲透壓主要由大HSA分子不能脫逸穿過血管壁引起。
白蛋白之熱處理
因而，HSA廣泛用於治療低血容量症。低血容量症係指在血容量由於血漿損失而顯著降低時產生的狀態。若干原因可導致低血容量症，包括創傷、燒傷或手術。習知HSA係藉由血漿之低溫乙醇分餾(Cohn方法(在第II次世界大戰期間開發)及其變型)製備。然而，經純化HSA可含有病毒病原體，其需要在60℃下達10小時的熱處理過程或熱巴氏殺菌。白蛋白在熱處理(例如滅菌)期間易於變性且隨後形成不可溶(非功能性)聚集體。因此，為了最小化由熱處理所致的HSA之變性，市售之HSA調配物係藉由在巴氏殺菌之前添加中鏈脂肪酸、辛酸及N-乙醯基色胺酸來製備。已顯示，辛酸鈉保護單體HSA不受熱影響，同時N-乙醯基色胺酸保護不受氧化應力；M.Anraku等人，Biochim.Biophys.ACTA 1702(1),9-17(2004)。使用中鏈及長鏈脂肪酸使白蛋白穩定化亦描述於Shrake等人Biopolymers 81(4),235-248(2006)、美國專利申請案2015/0165000及美國專利7,351,800。尤其由於其易於獲得且其相對於長鏈脂肪酸可溶性較大，辛酸鈉構成當前用作市售之白蛋白製劑之穩定劑的主要穩定劑。此外，在使用數十年之後，已確立，辛酸鈉及N-乙醯基色胺酸穩定之HSA用於具有能夠代謝辛酸鈉及N-乙醯基色胺酸之健康肝的受試者係相對安全的。
白蛋白製劑之治療用途
含有白蛋白之製劑經常治療性地向人類及動物提供。例如，含有白蛋白之製劑通常向人類投與以供以下適應症之一或多者：低血容積症，有或無休克；低白蛋白血症，其可由白蛋白之產生不足(由於營養不良、燒傷、嚴重損傷、先天無清蛋白血(analbuminemia)、肝病、感染、惡性腫瘤或內分泌病症)、過量分解代謝(由於燒傷、嚴重損傷、胰腺炎、甲狀腺中毒症、天皰瘡或腎病)、體內白蛋白損失(由於出血、過量腎排泄、燒傷滲出物(burn exudate)、滲出性腸病或脫落性皮膚病)及/或體內白蛋白再分佈(由於大手術、硬化合併腹水或各種發炎性病狀)引起；在心肺繞道手術之前或期間；及用於治療燒傷或硬化。
供治療用途的許多不同的含有白蛋白(通常以5至25%之濃度)之製劑係或已可商購獲得，包括，例如：
‧Albuminar®-25(Centeon/Aventis Behring)含有25%白蛋白之無菌水溶液，該白蛋白係藉由根據Cohn方法之低溫控制之分餾自大量成年人類靜脈血漿獲得。其用0.02M N-乙醯基色胺酸及0.02M羊脂酸鈉(sodium caprylate)穩定且在60℃下經巴氏殺菌達10小時。
‧Buminate®(Baxter Laboratories)係使用Cohn冷乙醇分餾過程由人類靜脈血漿製備之白蛋白之無菌水溶液，其用碳酸氫鈉及/或氫氧化鈉調整至生理pH且用N-乙醯基色胺酸(0.016M)及羊脂酸鈉(0.016M)穩定。Buminate® 5%含有5%(重量/體積)白蛋白且用N-乙醯基色胺酸(0.004M)及羊脂酸鈉(0.004M)穩定。 Buminate® 25%含有25%(重量/體積)白蛋白且用N-乙醯基色胺酸(0.02M)及羊脂酸鈉(0.02M)穩定。鈉離子含量係145±15mEq/L。溶液不含有防腐劑且新鮮全血或血漿中未發現凝血因子。
‧Plasbumin®-25(Bayer Biological)係白蛋白25%(重量/體積)於水性稀釋劑中之無菌溶液。該製劑係用0.02M羊脂酸鈉及0.02M N-乙醯基色胺酸穩定並用碳酸鈉緩衝。該產品之鋁含量不多於200μg/L。該產品之大致鈉離子含量係145mEq/L。
‧Albutein® 25%(Grifols)係含有25%(重量/體積)人類白蛋白之無菌水溶液，該白蛋白係由自靜脈血獲得之彙集人類血漿藉由冷乙醇分餾方法獲得。該產品係用每公克白蛋白0.08毫莫耳羊脂酸鈉及0.08毫莫耳N-乙醯基色胺酸穩定。0.08毫莫耳羊脂酸鈉每公克白蛋白對應於25%白蛋白溶液中之0.02M羊脂酸鈉。 Albutein® 25%溶液含有130-160毫當量鈉離子每公升且具有pH 6.9±0.5。該產品不含有防腐劑。
‧Albumarc®(American Red Cross)係5%或25%(重量/體積)白蛋白之無菌水溶 液，其使用Cohn冷乙醇分餾過程由人類靜脈血漿製備，用碳酸氫鈉及/或氫氧化鈉調整至生理pH且用羊脂酸鈉及N-乙醯基色胺鈉酸穩定。
‧Recombumin Prime®(Albumedix/Novozymes)係經製造達ICH Q7標準之重組人類白蛋白(rAlbumin)。Recombunin®之來源係重組釀酒酵母(焙用酵母)發酵，且其係在不使用動物或人類來源之材料的情況下製造。Recombumin Prime®係於含有20%(w/v)蛋白質溶液之50ml II型玻璃小瓶中銷售。其用32mM羊脂酸鈉、145mM氯化鈉及15mg/L聚山梨醇酯80穩定。
‧Recombumin 20% Alpha®(Albumedix/Novozymes)係經製造達ICH Q7標準之重組人類白蛋白(rAlbumin)。Recombunin之來源係重組釀酒酵母(焙用酵母)發酵，且其係在不使用動物或人類來源之材料的情況下製造。Recombumin Alpha®係於含有20%(w/v)蛋白質溶液之50ml II型玻璃小瓶中銷售。其用16mM羊脂酸鈉及145mM氯化鈉穩定。
‧Recombumin 10% Alpha®(Albumedix/Novozymes)係經製造達ICH Q7標準之重組人類白蛋白(rAlbumin)。Recombunin®之來源係重組釀酒酵母(焙用酵母)發酵，且其係在不使用動物或人類來源之材料的情況下製造Recombumin Alpha®係於含有10%(w/v)蛋白質溶液之50ml II型玻璃小瓶中銷售。其用8mM羊脂酸鈉及145mM氯化鈉穩定。
‧Albagen® 5%(New Century Pharmaceuticals)係用畢赤酵母製造之重組人類白蛋白(rAlbumin)。其來源於原型人類血清白蛋白序列，在N端處具有單一缺失(Asp)。其具有人類血清白蛋白之所有生物性質，對鎳及銅之高親和力位點減弱。於PBS中之無菌5%溶液含有4mM羊脂酸鈉及4mM N-乙醯基色胺酸。
‧Kedbumin®(Kedrion Biopharma)係含有25%白蛋白之用於單劑量靜脈內投與的無菌水溶液，該白蛋白係由彙集人類血漿藉由冷乙醇分餾製備。該產品係藉由添加0.08mmol羊脂酸鈉及0.08mmolN乙醯基色胺酸鈉每公克白蛋白來穩定。 0.08mmol羊脂酸鈉每公克白蛋白對應於25%白蛋白溶液中之0.02M羊脂酸鈉。此外，各公升材料含有130-160mEq鈉離子及200μg白蛋白。該產品不含有防腐劑。
因此，市售之人類白蛋白製劑通常使用辛酸/羊脂酸(或辛酸鈉/羊脂酸鈉)穩定。
呈藥物之遞送媒劑之白蛋白
HSA已被視為親脂性抗癌藥物之潛在遞送媒劑。例如，AbraxaneTM(奈米粒子白蛋白結合之太平洋紫杉醇(paclitaxel))已在美國經批准用於轉移性乳癌(2005)、非小細胞肺癌(2012)及轉移性胰腺癌(2013)。在此情況下，親脂性太平洋紫杉醇係調配成白蛋白結合之奈米粒子(平均大小：130nM)以供在用0.9%氯化鈉復原時用作可注射懸浮液；HSA先前用辛酸鈉(羊脂酸鈉)及N-乙醯基色胺酸(N-乙醯基色胺酸鈉)處理。HSA作為其他水溶性不佳的癌症藥物之遞送媒劑之潛在用途已記載於文獻中。例如，Q.Li等人，Int.J.Nanomedicine 6,397-405(2011)報導葉酸鹽結合之HSA-10-羥基喜樹鹼負載之奈米粒子顯示持續釋放行為及癌細胞吸收藥物的有效遞送系統。相同期刊中之稍後出版物說明，10-羥基喜樹鹼負載之甘草酸結合之白蛋白奈米粒子係肝細胞癌靶向療法之有前景的媒劑；Y.Zu等人，Int.J.Nanomedicine 8,1207-1222(2013)。白蛋白奈米粒子亦已作為癌症藥物多柔比星(doxorubicin)之遞送媒劑例如由S.Abbasi等人(J.Drug Delivery 2012：Article ID 686108,8頁)經研究，其報導，藉由添加聚乙烯亞胺之包衣來修飾HSA奈米粒子得到陽離子白蛋白奈米粒子，其改良多柔比星對MCF-7乳癌細胞之治療指數。已發現，淨正電荷奈米粒子改良至癌細胞中之穿透(相較於HSA)，從而在較長時間段內對癌細胞產生更有效的細胞毒性作用。
對於穩定且安全的白蛋白製劑有持續需要。
本說明書涉及許多文件，其內容係以全文引用方式併入本文。
本發明係關於以下項：
項目1：一種用包含白蛋白之組成物治療疾病或病狀同時預防或最小化上皮-間葉轉變(EMT)的方法，該方法包含向有需要之受試者投與有效量該組成物，其中該組成物不含有辛酸及/或辛酸鹽或含有少量辛酸及/或辛酸鹽，其中該少量係小於0.08毫莫耳每公克白蛋白。
項目2：如項目1之方法，其中辛酸及/或辛酸鹽之該少量係小於0.05毫莫耳每公克白蛋白。
項目3：如項目1之方法，其中辛酸及/或辛酸鹽之該少量係小於0.005毫莫耳每公克白蛋白。
項目4：如項目1之方法，其中辛酸及/或辛酸鹽之該少量係小於0.0005毫莫耳每公克白蛋白。
項目5：如項目1之方法，其中該組成物實質上不含辛酸或辛酸鹽。
項目6：如項目1之方法，其中該組成物不含辛酸或辛酸鹽。
項目7：如項目1之方法，其中該組成物含有小於或等於0.08毫莫耳每公克白蛋白之量脂肪酸及/或其鹽，其中至少30%該量脂肪酸及/或其鹽係C9-C14脂肪酸及/或其鹽。
項目8：如項目7之方法，其中至少50%該脂肪酸及/或其鹽係C9-C14脂肪酸及/或其鹽。
項目9：如項目7之方法，其中至少70%該脂肪酸及/或其鹽係C9-C14脂肪酸及/或其鹽。
項目10：如項目7之方法，其中至少90%該脂肪酸及/或其鹽係C9-C14脂肪酸及/或其鹽。
項目11：如項目7之方法，其中至少95%該脂肪酸及/或其鹽係 C9-C14脂肪酸及/或其鹽。
項目12：如項目7之方法，其中100%該脂肪酸及/或其鹽係C9-C14脂肪酸及/或其鹽。
項目13：如項目1至12中任一項之方法，其中該組成物係包含約1%至約40%(w/v)白蛋白之水性白蛋白製劑。
項目14：如項目13之方法，其中該組成物係包含約5%至約25%(w/v)白蛋白之水性白蛋白製劑。
項目15：如項目13之方法，其中該組成物係包含約20%至約25%(w/v)白蛋白之水性白蛋白製劑。
項目16：如項目7至12中任一項之方法，其中該C9-C14脂肪酸及/或其鹽係C9-C12脂肪酸及/或其鹽。
項目17：如項目16之方法，其中該C9-C12脂肪酸及/或其鹽係癸酸或癸酸鹽。
項目18：如項目7至12及16-17中任一項之方法，其中該鹽係鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽或銅鹽。
項目19：如項目18之方法，其中該鹽係鈉鹽或鉀鹽。
項目20：如項目18之方法，其中該鹽係鈉鹽。
項目21：如項目1至20中任一項之方法，其中該白蛋白係人類血清白蛋白(HSA)。
項目22：如項目1至21中任一項之方法，其中該組成物係以液體形式，且進一步包含一或多種醫藥學上可接受之滲透壓調節劑。
項目23：如項目22之方法，其中該一或多種滲透壓調節劑包含鈉鹽、鉀鹽或兩者。
項目24：如項目1至23中任一項之方法，其中該組成物係以液體形 式，且進一步包含至少一種醫藥學上可接受之抗氧化劑或穩定劑。
項目25：如項目24之方法，其中該至少一種醫藥學上可接受之抗氧化劑或穩定劑係抗氧化劑胺基酸或其衍生物。
項目26：如項目24之方法，其中該至少一種醫藥學上可接受之抗氧化劑或穩定劑係N-醯基甲硫胺酸或N-醯基色胺酸鹽。
項目27：如項目1至21中任一項之方法，其中該組成物係以奈米粒子之形式。
項目28：如項目1至27中任一項之方法，其中該組成物進一步包含醫藥活性劑。
項目29：如項目27之方法，其中該組成物進一步包含醫藥活性劑；且其中該醫藥活性劑封裝在該等奈米粒子內。
項目30：如項目28或29之方法，其中該醫藥活性劑係抗癌藥物。
項目31：如項目30之方法，其中該抗癌藥物係紫杉烷、喜樹鹼、伊立替康、吉西他濱、癌德星或多柔比星。
項目32：如項目31之方法，其中該紫杉烷係太平洋紫杉醇或多西紫杉醇。
項目33：如項目1至30中任一項之方法，其中該疾病或病狀係出血、血容積過少性休克、燒傷、急性肝衰竭、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫症候群、硬化、新生兒溶血病、心肺繞道手術、腎病或癌症。
項目34：如項目30至32中任一項之方法，其中哎疾病或病狀係癌症。
項目35：包含白蛋白之組成物之用途，其用於治療疾病或病狀同時預防或最小化上皮-間葉轉變(EMT)，其中該組成物不含有辛酸及/或辛酸鹽或含有少量辛酸及/或辛酸鹽，其中該少量係小於0.08毫莫耳每公克白蛋白。
項目36：如項目35之用途，其中該組成物含有一定量脂肪酸及/或其鹽，其中該量等於或小於0.08毫莫耳每公克白蛋白，其中至少30%該量脂肪酸及/或其鹽係C9-C14脂肪酸及/或其鹽。
項目37：包含白蛋白之組成物之用途，其用於製造用於治療疾病或病狀同時預防或最小化上皮-間葉轉變(EMT)之藥物，其中該組成物不含有辛酸及/或辛酸鹽或含有少量辛酸及/或辛酸鹽，其中該少量係小於0.08毫莫耳每公克白蛋白。
項目38：如項目37之用途，其中該組成物含有一定量脂肪酸及/或其鹽，其中至少30%該量脂肪酸及/或其鹽係C9-C14脂肪酸及/或其鹽。
項目39：一種包含白蛋白之組成物，其用於治療疾病或病狀同時預防或最小化上皮-間葉轉變(EMT)，其中該組成物不含有辛酸及/或辛酸鹽或含有少量辛酸及/或辛酸鹽，其中該少量係小於0.08毫莫耳每公克白蛋白。
項目40：如項目39之組成物，其含有等於或小於0.08毫莫耳每公克白蛋白之量脂肪酸及/或其鹽，其中至少30%該量脂肪酸及/或其鹽係C9-C14脂肪酸及/或其鹽。
項目40：一種組成物，其包含白蛋白，及小於0.08毫莫耳每公克白蛋白之量辛酸及/或辛酸鹽；或等於或小於0.08毫莫耳每公克白蛋白之量脂肪酸及/或其鹽，且其中至少30%該量脂肪酸及/或其鹽係C9-C14脂肪酸及/或其鹽。
項目42：如項目41之組成物，其中辛酸及/或辛酸鹽之量係小於0.05毫莫耳每公克白蛋白。
項目43：如項目42之組成物，其中辛酸及/或辛酸鹽之量係小於0.005毫莫耳每公克白蛋白。
項目44：如項目43之組成物，其中辛酸及/或辛酸鹽之量係小於 0.0005毫莫耳每公克白蛋白。
項目45：如項目41至44中任一項之組成物，其中該白蛋白之濃度係1%至40%。
項目46：如項目45之組成物，其中該白蛋白之濃度係5%至25%。
項目47：如項目41至46中任一項之組成物，其進一步包含醫藥活性劑。
項目48：如項目47之組成物，其中該醫藥活性劑係抗癌藥物。
項目49：如項目48之組成物，其中該抗癌藥物係紫杉烷、喜樹鹼、伊立替康、吉西他濱、癌德星或多柔比星。
項目50：如項目49之組成物，其中該紫杉烷係太平洋紫杉醇或多西紫杉醇。
項目51：如項目48至50中任一項之方法，其中該組成物實質上不含辛酸及/或辛酸鹽。
項目52：如項目41至51中任一項之組成物，其用於治療或預防疾病或病狀同時預防或最小化上皮-間葉轉變(EMT)。
項目53：如項目52之組成物，其中該疾病或病狀係出血、血容積過少性休克、燒傷、急性肝衰竭、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫症候群、硬化、新生兒溶血病、心肺繞道手術或腎病。
項目54：如項目48至50中任一項之組成物，其用於治療或預防疾病或病狀同時預防或最小化上皮-間葉轉變(EMT)，其中該疾病或病狀係癌症。
項目55：一種預防、最小化或減小有需要之受試者之上皮-間葉轉變(EMT)之方法，該方法包含向該受試者投與包含有效量C9-C14脂肪酸及/或其鹽、及/或C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯之組成物。
項目56：如項目55之方法，其中該C9-C14脂肪酸及/或其鹽、及/ 或C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯係C9-C12脂肪酸及/或其鹽、及/或C9-C12脂肪酸之三酸甘油酯。
項目57：如項目55之方法，其中該C9-C14脂肪酸及/或其鹽、及/或C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯係C10-C12脂肪酸及/或其鹽、及/或C10-C12脂肪酸之三酸甘油酯。
項目58：如項目55之方法，其中該C9-C14脂肪酸及/或其鹽、及/或C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯係癸酸鹽。
項目59：如項目55之方法，其中該C9-C14脂肪酸及/或其鹽、及/或C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯係癸酸鈉。
項目60：如項目55之方法，其中該C9-C14脂肪酸及/或其鹽、及/或C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯係癸酸。
項目61：如項目55之方法，其中該C9-C14脂肪酸及/或其鹽、及/或C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯係三癸酸甘油酯。
項目62：如項目55至58中任一項之方法，其中該組成物包含脂肪酸鹽，其中該鹽係鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽或銅鹽。
項目63：如項目62之方法，其中該鹽係鈉鹽或鉀鹽
項目64：如項目62之方法，其中該鹽係鈉鹽。
項目65：如項目55至64中任一項之方法，其中該有效量係在5mg/kg至300mg/kg之間每劑量以供經口徑或局部投與。
項目66：如項目65之方法，其中該有效量係在10mg/kg至100mg/kg之間每劑量以供經口徑或局部投與。
項目67：如項目55至63中任一項之方法，其中該有效量係在0.5mg/kg至100mg/kg之間每劑量以供靜脈內、腹膜內、經直腸、肌肉內或皮下投 與。
項目68：如項目67之方法，其中該有效量係在0.5mg/kg至4mg/kg之間每劑量以供靜脈內、腹膜內、經直腸、肌肉內或皮下投與。
項目69：如項目55至64中任一項之方法，其中該組成物係局部投與。
項目70：如項目69之方法，其中該受試者罹患燒傷或瘢痕。
項目71：如項目55至64及67-68中任一項之方法，其中該疾病或病狀係出血、血容積過少性休克、燒傷、急性肝衰竭、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫症候群、硬化、新生兒溶血病、心肺繞道手術或腎病。
項目72：C9-C14脂肪酸及/或其鹽、及/或C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯之用途，其用於預防、最小化或減小受試者之上皮-間葉轉變(EMT)。
項目73：C9-C14脂肪酸及/或其鹽、及/或C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯之用途，其用於製備用於預防、最小化或減小受試者之上皮-間葉轉變(EMT)之藥物。
項目74：如項目72或73之用途，其中該方法包含向該受試者投與有效量癸酸及/或癸酸鹽。
項目75：如項目72或73之用途，其中該方法包含向該受試者投與有效量三癸酸甘油酯。
項目76：一種白蛋白組成物之用途，其用於製備用於治療受試者之疾病或病狀之藥物，該受試者需要接受白蛋白之組成物以供治療該疾病或病狀，其中該白蛋白組成物抑制或減小上皮-間葉轉變(EMT)，且含有：-無促EMT劑或低濃度促EMT劑；及/或-一定含量促EMT劑及抗EMT劑，其中促EMT劑：抗EMT劑之比係7：3至0：10；其中： -該促EMT劑係辛酸、辛酸鹽或其組合；-該抗EMT劑係C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸鹽、C9-C14脂肪酸之單甘油酯、C9-C14脂肪酸之二酸甘油酯、C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯或其組合；且-促EMT劑之該低濃度係小於0.08毫莫耳每公克白蛋白；-限制條件為，當該促EMT劑及該抗EMT劑係脂肪酸時，其係單獨的脂肪酸或二酸甘油酯或三酸甘油酯之一部分。
項目77：如申請專利範圍第76項之用途，其中促EMT劑之該低濃度係0.04毫莫耳每公克白蛋白或更少。
項目78：如申請專利範圍第76項之用途，其中促EMT劑之該低濃度係0.007%(w/w)或更少。
項目79：如申請專利範圍第76項之用途，其中促EMT劑：抗EMT劑之比係5：5至0：10。
項目80：如申請專利範圍第76項至第79項中任一項之用途，其中該抗EMT劑係C9-C12脂肪酸、C9-C12脂肪酸鹽、C9-C12脂肪酸之單甘油酯、C9-C12脂肪酸之二酸甘油酯、C9-C12脂肪酸之三酸甘油酯或其組合。
項目81：如申請專利範圍第80項之用途，其中該抗EMT劑係C10-C12脂肪酸、C10-C12脂肪酸鹽、C10-C12脂肪酸之單甘油酯、C10-C12脂肪酸之二酸甘油酯、C10-C12脂肪酸之三酸甘油酯或其組合。
項目82：如申請專利範圍第81項之用途，其中該抗EMT劑係C10脂肪酸、C10脂肪酸鹽或其組合。
項目83：如申請專利範圍第76項至第82項中任一項之用途，其中該組成物係包含約1%至約40%(w/v)白蛋白之水性白蛋白製劑。
項目84：如申請專利範圍第76項至第83項中任一項之用途，其中該鹽係鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、銅鹽或其 組合。
項目85：如申請專利範圍第84項之用途，其中該鹽係鈉鹽。
項目86：如申請專利範圍第76項至第85項中任一項之用途，其中該組成物進一步包含醫藥活性劑。
項目87：如申請專利範圍第86項之用途，其中該活性劑係抗癌藥物，且該藥物係用於治療癌症。
項目88：如申請專利範圍第87項之用途，其中該抗癌藥物係紫杉烷。
項目89：如申請專利範圍第88項之用途，其中該紫杉烷係紫杉醇或多西紫杉醇。
項目90：如申請專利範圍第76項至第86項中任一項之用途，其中該白蛋白組成物係由醫師建議用於治療該疾病或病狀。
項目91：如申請專利範圍第76項至第90項中任一項之用途，其中該藥物係用於治療以下疾病或病狀：出血、低血容積症、燒傷、急性肝衰竭、肝功能障礙、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫症候群、硬化、新生兒溶血病、心肺繞道手術、腎病、癌症、肝腎症候群、敗血症、器官灌注或器官再灌注。
項目92：一種組成物之用途，其用於製備用於抑制或減小受試者之上皮-間葉轉變(EMT)之藥物，其中該組成物包含：-無促EMT劑或低濃度促EMT劑；及/或-一定含量促EMT劑及抗EMT劑，其中促EMT劑：抗EMT劑之比係7：3至0：10；其中：-該促EMT劑係辛酸、辛酸鹽或其組合；-該抗EMT劑係C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸鹽、C9-C14脂肪酸之單甘油酯、C9-C14脂肪酸之二酸甘油酯、C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯或其組合；且-促EMT劑之該低濃度係小於0.02M； -限制條件為，當該促EMT劑及該抗EMT劑係脂肪酸時，其係單獨的脂肪酸或二酸甘油酯或三酸甘油酯之一部分。
項目93：如申請專利範圍第92項之用途，其中促EMT劑之該低濃度係0.01M或更少。
項目94：如申請專利範圍第92項之用途，其中促EMT劑之該低濃度係0.001M或更少。
項目95：如申請專利範圍第92項之用途，其中促EMT劑：抗EMT劑之比係5：5至0：10。
項目96：如申請專利範圍第95項之用途，其中促EMT劑：抗EMT劑之比係約0：10。
項目97：如申請專利範圍第92項至第96項中任一項之用途，其中該抗EMT劑係C9-C12脂肪酸、C9-C12脂肪酸鹽、C9-C12脂肪酸之單甘油酯、C9-C12脂肪酸之二酸甘油酯、C9-C12脂肪酸之三酸甘油酯或其組合。
項目98：如申請專利範圍第97項之用途，其中該抗EMT劑係C10-C12脂肪酸、C10-C12脂肪酸鹽、C10-C12脂肪酸之單甘油酯、C10-C12脂肪酸之二酸甘油酯、C10-C12脂肪酸之三酸甘油酯或其組合。
項目99：如申請專利範圍第98項之用途，其中該抗EMT劑係C10脂肪酸、C10脂肪酸鹽、C10脂肪酸之單甘油酯、C10脂肪酸之二酸甘油酯、C10脂肪酸之三酸甘油酯或其組合。
項目100：如申請專利範圍第92項至第99項中任一項之用途，其中該鹽係鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、銅鹽或其組合。
項目101：如申請專利範圍第100項之用途，其中該鹽係鈉鹽。
項目102：如申請專利範圍第92項至第101項中任一項之用途，其 中該組成物進一步包含醫藥活性劑。
項目103：如申請專利範圍第102項之用途，其中該活性劑係抗癌藥物，且該藥物係用於治療癌症。
項目104：如申請專利範圍第103項之用途，其中該抗癌藥物係紫杉烷。
項目105：如申請專利範圍第104項之用途，其中該紫杉烷係紫杉醇或多西紫杉醇。
項目106：如申請專利範圍第92項至第102項中任一項之用途，其中該藥物係用於治療以下疾病或病狀：出血、低血容積症、燒傷、急性肝衰竭、肝功能障礙、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫症候群、硬化、新生兒溶血病、心肺繞道手術、腎病、癌症、肝腎症候群、敗血症、器官灌注、器官再灌注、瘢痕形成、牛皮癬或濕疹。
項目107：如申請專利範圍第92項至第102項中任一項之用途，其中促EMT劑及抗EMT劑之總濃度係在5mg/kg至300mg/kg受試者每劑量之間以供經口或局部投與。
項目108：如申請專利範圍第107項之用途，其中該總濃度係在10mg/kg至100mg/kg每劑量之間。
項目109：如申請專利範圍第92項至第102項中任一項之用途，其中該總濃度係在0.5mg/kg至100mg/kg該受試者之間每劑量以供靜脈內、腹膜內、經直腸、肌肉內或皮下投與。
項目110：如申請專利範圍第109項之用途，其中該總濃度係在0.5mg/kg至4mg/kg每劑量之間。
項目111：如申請專利範圍第92項至第102項、第107項及第108項中任一項之用途，其中該組成物係局部投與，且該藥物係用於治療燒傷、用 於預防瘢痕形成或用於治療瘢痕、牛皮癬或濕疹。
項目112：一種用於治療受試者之疾病或病狀之方法，該受試者需要接受白蛋白之組成物以供治療該疾病或病狀，該方法包含投與白蛋白之組成物，該組成物抑制或減小上皮-間葉轉變(EMT)且含有：-無促EMT劑或低濃度促EMT劑；或-一定含量促EMT劑及抗EMT劑，其中促EMT劑：抗EMT劑之比係7：3至0：10；其中：-該促EMT劑係辛酸、辛酸鹽或其組合；-該抗EMT劑係C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸鹽、C9-C14脂肪酸之單甘油酯、C9-C14脂肪酸之二酸甘油酯、C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯或其組合；且-促EMT劑之該低濃度係小於0.08毫莫耳每公克白蛋白；-限制條件為，當該促EMT劑及該抗EMT劑係脂肪酸時，其係單獨的脂肪酸或二酸甘油酯或三酸甘油酯之一部分。
項目113：一種用於抑制或減小受試者之上皮-間葉轉變(EMT)之方法，其包含投與包含以下之組成物：-無促EMT劑或低濃度促EMT劑；及/或-一定含量促EMT劑及抗EMT劑，其中促EMT劑：抗EMT劑之比係7：3至0：10；其中：-該促EMT劑係辛酸、辛酸鹽或其組合；-該抗EMT劑係C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸鹽、C9-C14脂肪酸之單甘油酯、C9-C14脂肪酸之二酸甘油酯、C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯或其組合；且-促EMT劑之該低濃度係小於0.02M；-限制條件為，當該促EMT劑及該抗EMT劑係脂肪酸時，其係單獨的脂肪酸或二酸甘油酯或三酸甘油酯之一部分。
在隨附圖式中：圖1顯示以下之HPLC層析圖：40mM羊脂酸鈉溶液(上圖)、40mM癸酸鈉溶液(中圖)及由癸酸鈉替換辛酸鈉之後的5%白蛋白之組成物，如實例1中所述。
圖2顯示實例4中所述之體外分析中在有白蛋白及無白蛋白之情況下EMT標記物(膠原蛋白)之產生，其中組成物包含比率為100：0、95：5、70：30、50：50、30：70、5：95或0：100之癸酸鈉：辛酸鈉。
圖3顯示原生HSA前蛋白之胺基酸序列(SEQ ID NO：1，NCBI參考序列：NP_000468.1,UniProtKB：P02768)。
圖4顯示辛酸鈉及癸酸鈉在存在及不存在白蛋白之情況下對TGF-β誘導之人類微血管內皮細胞(HMEC)中膠原蛋白1a1 mRNA表現(EMT標記物)之作用。
圖5顯示辛酸鈉及癸酸鈉在存在及不存在白蛋白之情況下對TGF-β誘導之人類肝細胞癌細胞株HepG2中膠原蛋白1a1 mRNA表現(EMT標記物)之作用。
圖6顯示辛酸鈉及癸酸鈉在存在及不存在白蛋白之情況下對TGF-β誘導之人類肺上皮細胞A549中膠原蛋白1a1 mRNA表現(EMT標記物)之作用。
圖7呈現使用絲裂黴素處理之EGF誘導之PC-3細胞之刮痕分析之圖片，其顯示辛酸鈉及癸酸鈉在存在及不存在白蛋白之情況下對細胞遷移之作用。
本發明係關於包含以下之白蛋白組成物：‧無脂肪酸或其鹽，或 ‧無促EMT劑，或‧低濃度促EMT劑，及/或‧一定比率促EMT劑：抗EMT劑，該比率係7：3至0：10，其中該促EMT劑係辛酸、辛酸鹽或其組合；且其中該抗EMT劑係具有9、10、11、12、13或14個碳之烷基鏈之脂肪酸(亦即，C9-C14脂肪酸)、C9-C14脂肪酸鹽、C9-C14脂肪酸之單甘油酯、C9-C14脂肪酸之二酸甘油酯、C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯或其組合。
本發明係基於發現辛酸及辛酸鹽係促EMT，亦即辛酸及辛酸鹽刺激上皮-間葉轉變(EMT)。EMT之刺激在醫師指定投與白蛋白製劑的許多醫學病狀中係有害的，諸如重度燒傷，因為EMT刺激促使過度瘢痕形成。EMT之刺激係有害的其他治療適應症揭示於下文。
發明人亦發現其他脂肪酸、其鹽及其三酸甘油酯係抗EMT。該抗EMT劑係C9脂肪酸(諸如壬酸或天竺葵酸)、C9脂肪酸鹽(諸如壬酸鹽)、C9脂肪酸之單甘油酯、C9脂肪酸之二酸甘油酯、C9脂肪酸之三酸甘油酯(諸如辛酸或三壬酸甘油酯)、C10脂肪酸(諸如癸酸或羊蠟酸)、C10脂肪酸鹽(諸如癸酸鹽或羊蠟酸鹽)、C10脂肪酸之單甘油酯、C10脂肪酸之二酸甘油酯、C10脂肪酸之三酸甘油酯(諸如癸酸之三酸甘油酯、或三癸酸甘油酯、或甘油三癸酸甘油酯(glyceryl tricaprin))、C11脂肪酸(諸如十一酸(undecanoic acid或undecylic acid))、C11脂肪酸鹽(諸如十一酸鹽)、C11脂肪酸之單甘油酯、C11脂肪酸之二酸甘油酯、C11脂肪酸之三酸甘油酯(諸如十一酸之三酸甘油酯或三-十一酸甘油酯)、C12脂肪酸(諸如十二酸或月桂酸)、C12脂肪酸鹽(諸如十二酸鹽)、C12脂肪酸之單甘油酯、C12脂肪酸之二酸甘油酯、C12脂肪酸之三酸甘油酯(諸如十二酸之三酸甘油酯或甘油三月桂酸甘油酯(glyceryl trilaurin))、C13脂肪酸(諸如十三酸(tridecanoic acid或tridecylic acid))、C13脂肪酸鹽(諸如十三酸鹽)、C13脂肪酸 之單甘油酯、C13脂肪酸之二酸甘油酯、C13脂肪酸之三酸甘油酯(諸如十三酸之三酸甘油酯或三-十三酸甘油酯(glyceryl tridodecanoate))、C14脂肪酸(諸如十四酸)、C14脂肪酸鹽(諸如十四酸鹽)、C14脂肪酸之單甘油酯、C14脂肪酸之二酸甘油酯、C14脂肪酸之三酸甘油酯(諸如十四酸之三酸甘油酯、或三-十四酸甘油酯、或甘油三肉豆蔻酸甘油酯)或其組合。本發明抗EMT劑亦涵蓋C9、C10、C11、C12、C13及C14脂肪酸之單甘油酯以及C9、C10、C11、C12、C13及C14脂肪酸之二酸甘油酯，以及與一或多種本文所揭示之其他抗EMT劑之組合。C9、C10、C11、C12、C13及C14脂肪酸之三酸甘油酯之效應經測試，且因為三酸甘油酯在通過腸之後分解成一分子甘油及三分子脂肪酸，所以合理地預期一旦調整單甘油酯或二酸甘油酯之量以便釋放與對應的三酸甘油酯相同量的脂肪酸，則對應的單甘油酯及二酸甘油酯將提供相同功效。抗EMT效應係藉由C9-C14脂肪酸傳達。
當抗EMT劑存在於寶蛋白製劑中時，其濃度由促EMT：抗EMT劑之比表示，該比率係7：3至0：10，包括7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9及0：10。在一實施例中，促EMT劑及抗EMT劑(促EMT劑：抗EMT劑之比係7：3至0：10)之含量係由三酸甘油酯(其由兩個辛酸及一個C9-C14脂肪酸(亦即比率為2：1，如實例4中所例示)或一個辛酸及兩個C9-C14脂肪酸(亦即比率為1：2)構成)或二酸甘油酯(其由一個辛酸及一個C9-C14脂肪酸(亦即比率為5：5)構成)體現。在一實施例中，組成物中促EMT劑之含量非係在低濃度(促EMT劑之低濃度定義於下文)下，但是抗EMT劑之含量係使得促EMT劑：抗EMT劑之比係7：3至0：10、較佳2：1、亦較佳1：1、進一步較佳1：2者。在另一實施例中，組成物中促EMT劑之含量係不存在或在低濃度(促EMT劑之低濃度定義於下文)下，且抗EMT劑之含量係使得促EMT劑：抗EMT劑之比係7：3至0：10、較佳2：1、6：4、1：1、1：2、3：7、2：8、1：9或0：10者。
該抗EMT劑較佳係C9-C14脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C9脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C10脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C11脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C12脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C13脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C14脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C9-12脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C10-12脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C10脂肪酸、其鹽或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C10脂肪酸或其鹽。該抗EMT劑較佳係C10脂肪酸或其鹽。該抗EMT劑較佳係C10脂肪酸鹽。該抗EMT劑較佳係C11脂肪酸、其鹽或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C11脂肪酸或其鹽。該抗EMT劑較佳係C11脂肪酸或其鹽。該抗EMT劑較佳係C11脂肪酸鹽。該抗EMT劑較佳係C12脂肪酸、其鹽或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C12脂肪酸或其鹽。該抗EMT劑較佳係C12脂肪酸或其鹽。該抗EMT劑較佳係C12脂肪酸鹽。該抗EMT劑較佳係C9脂肪酸、其鹽或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C9脂肪酸或其鹽。該抗EMT劑較佳係C9脂肪酸或其鹽。該抗EMT劑較佳係C9脂肪酸鹽。該抗EMT劑較佳係C10脂肪酸、其鹽或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C13脂肪酸或其鹽。該抗EMT劑較佳係C13脂肪酸或其鹽。該抗EMT劑較佳係C13脂肪酸鹽。該抗EMT劑較佳係C14脂肪酸、其鹽或其三酸甘油酯。該抗EMT劑較佳係C14脂肪酸或其鹽。該抗EMT劑較佳係C10脂肪酸或其鹽。該抗EMT劑較佳係C10脂肪酸鹽。
該組成物較佳實質上不含辛酸或辛酸鹽。C9-C14脂肪酸係鏈長度為9個碳至14個碳之脂肪酸。辛酸亦可稱為羊脂酸或C8脂肪酸，其係鏈長度為8個碳之脂肪酸。本發明亦關於本文所述之組成物之用途，例如用於治療受試者之疾病或病狀而無與上皮-間葉轉變(EMT)之刺激相關聯之不良影響，亦即避免或預防EMT之刺激或抑制EMT。本發明亦關於一種用於治療有需要之受試者之疾病或病狀而無非所要EMT之刺激方法，其包含向該受試者投與本文所述之組成物，亦即同時預防或最小化EMT。此類用途及方法不導致或實質上不導致EMT之增加，及/或在實施例中可抑制或減少該受試者之EMT。
在存在或不存在白蛋白之情況下，已發現本文所揭示之抗EMT劑抑制EMT。因此，本發明亦關於抗EMT劑或抗EMT劑之組合之用途，其用於治療各種醫學病狀。本發明亦關於抗EMT劑或抗EMT劑之組合之用途，其用於最小化或減小受試者之上皮-間葉轉變(EMT)。亦涵蓋用於預防、最小化或減小受試者之上皮-間葉轉變(EMT)之組成物，其包含抗EMT劑或抗EMT劑之組合。
本發明之鹽較佳係醫藥學上可接受之鹽。
上皮-間葉轉變(EMT)及內皮-間葉轉變(EndoMT)
上皮-間葉轉變(EMT)及相反過程MET(間葉-上皮轉變)係胚胎發生期間許多組織及器官之發育的關鍵過程。最近，內皮至間葉轉變(EndoMT)(一種新識別之細胞轉分化類型)已作為組織纖維母細胞之另一潛在來源出現。EndoMT係一種複雜的生物過程，在該過程中內皮細胞損失其特異性標記物並需要間葉表型且表現間葉細胞產物諸如α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及I型膠原蛋白。類似於EMT，EndoMT可由轉化生長因子(TGF-β)誘導。出於簡化本發明文本之目的，術語「EMT」在本文使用且意欲涵蓋EMT及EndoEMT過程，其係與細胞轉化/分化相同的過程。
上皮(或內皮)及間葉細胞之細胞表型及功能彼此不同。上皮及內皮細 胞藉由緊密接合、間隙接合及黏連接合彼此密切連接，展現細胞極性(頂部-底部(apico-basal)極性、細胞骨架之極化)且由基底層(basal lamina)結合。間葉細胞缺乏此細胞極化，具有梭形形態且彼此相互作用最小。同樣，上皮及內皮細胞表現諸如E-鈣黏蛋白及β-連環蛋白之特徵細胞標記物，同時間葉細胞表現諸如N-鈣黏蛋白、纖網蛋白、波形蛋白及α-SMA(平滑肌肌動蛋白)之細胞標記物。另外，間葉細胞相較於上皮細胞具有增加之遷移能力。因此，EMT之過程導致細胞形態及表型之深刻變化。概括言之，在三個過程期間發生EMT：胚胎發生、細胞增殖遷移及傷口癒合。因為EMT之抑制係某些病理學病狀諸如癌症或過度傷口癒合(瘢痕形成)所需，所以已對EMT之抑制之潛在藥物之發現進行研究。因為EMT係經歷增殖之細胞之特性，所以其由蛋白質生長因子諸如TGF(轉化生長因子)、CTGF(結締組織生長因子)、EGF(表皮生長因子)、HGF(肝細胞生長因子)及IGF(胰島素生長因子)誘導。隨後，生長因子抑制劑提供EMT抑制劑之可能。例如，小分子(MW=384)取代之咪唑基苯甲醯胺SB-431542係TGF-β1受體抑制劑(類活化素受體激酶；Inman等人.(2002),Molecular Pharmacol.62(1)65-74)，其使TGF-β之腫瘤促進效果減弱，包括TGF-β誘導之EMT。類似地，另一小分子EW-7203阻斷乳腺上皮細胞中TGF-β1介導之EMT(Park等人.(2011),Cancer Sci. 102(1)：1889-96)。亦發現必需激酶(PAK：p21活化絲胺酸/蘇胺酸激酶)之抑制會抑制EMT過程(參見例如美國專利申請案2009/0286850)。
已發現，C8脂肪酸或其鹽增加EMT，而C9-C14脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯及其三酸甘油酯之任一者均減小EMT。因此，為了藉由投與白蛋白組成物來預防EMT刺激，其C8脂肪酸或其鹽之含量應有利地降低或完全避免。可替代地，已發現用抗EMT劑替換白蛋白組成物中至少30% C8脂肪酸或其鹽將抵消C8脂肪酸或其鹽之負面影響。可替代地，在白蛋白組成物中添加抗EMT劑，使得抗EMT劑對應於促EMT劑之總含量之至少30%，且抗 EMT劑亦由本發明考慮。
亦提供一種預防、最小化或減小有需要之受試者之上皮-間葉轉變(EMT)的方法，該方法包含向該受試者投與白蛋白組成物，其包含無促EMT劑或少量促EMT劑；及/或包含一定量抗EMT劑，其對應於促EMT劑及抗EMT劑之總量之至少30%。
亦提供一種包含白蛋白之組成物之用途，其用於預防、最小化或減小有需要之受試者之上皮-間葉轉變(EMT)，其中該白蛋白組成物包含無促EMT劑或少量促EMT劑；及/或包含一定量抗EMT劑，其對應於促EMT劑及抗EMT劑之總量之至少30%。
亦提供一種包含白蛋白之組成物之用途，其用於製備用於預防、最小化或減小有需要之受試者之上皮-間葉轉變(EMT)之藥物，其中該白蛋白組成物包含無促EMT劑或少量促EMT劑；及/或包含一定量抗EMT劑，其對應於促EMT劑及抗EMT劑之總量之至少30%。
亦提供一種包含白蛋白之組成物，其用於預防、最小化或減小有需要之受試者之上皮-間葉轉變(EMT)，其中該白蛋白組成物包含無促EMT劑或少量促EMT劑；及/或包含一定量抗EMT劑，其對應於促EMT劑及抗EMT劑之總量之至少30%。
意欲本文所述之用途及方法係用於預防、最小化、減小、抑制上皮-間葉轉變(EMT)、減小其刺激、最小化其刺激、不對其造成刺激或避免其刺激。本發明亦關於一種白蛋白組成物，其缺乏促EMT劑及抗EMT劑，因為其將不刺激EMT。在本發明之一替代實施例中，抗EMT劑存在於白蛋白組成物中。在本發明之一替代實施例中，促EMT劑不存在於白蛋白組成物中。在本發明之一替代實施例中，促EMT劑係以「低濃度」存在於白蛋白組成物中，其中該「低濃度」低於市售白蛋白組成物中一般使用之濃度(亦即約0.08毫莫耳辛酸鹽每公 克白蛋白)。較佳的是，促EMT劑之低濃度係在0.0007與0.07毫莫耳每公克白蛋白之間、或在0.0007與0.007毫莫耳每公克白蛋白之間、或在0.007與0.07毫莫耳每公克白蛋白之間、或在0.005與0.05毫莫耳每公克白蛋白之間、或在0.0005與0.05毫莫耳每公克白蛋白之間、或在0.002與0.02毫莫耳每公克白蛋白之間、在0.0002與0.02毫莫耳每公克白蛋白之間、在0.04與0.08毫莫耳每公克白蛋白之間、在0.04與0.07毫莫耳每公克白蛋白之間、在0.05與0.07毫莫耳每公克白蛋白之間如本文所述，「低濃度」及「少量」係指定相同的兩種表述，因為少量係相對於組成物中白蛋白之量。在一替代實施例中，白蛋白組成物具有任何促EMT劑。在另一實施例中，促EMT劑係以0.008毫莫耳每公克白蛋白至0.007%(w/w)存在於白蛋白之組成物中。在另一實施例中，本發明排除出於使受試者解毒而使用白蛋白組成物，或出於解毒療法之目的而使用白蛋白組成物，或需要解毒之受試者。用於使受試者解毒之白蛋白組成物揭示於US 8,877,711。在一實施例中，受試者需要EMT預防或減小EMT刺激、或預防過度瘢痕形成，或減小過度瘢痕形成之刺激，或預防細胞分化，或減小細胞分化之刺激。
本發明進一步關於該白蛋白組成物之用途，該白蛋白組成物包含無促EMT劑或少量促EMT劑；及/或包含一定量抗EMT劑，其對應於該白蛋白組成物中促EMT劑及抗EMT劑之總量之至少30%，諸如用於其在治療EMT相關疾病或EMT相關病狀、或其中EMT刺激係非所要或合適的疾病或病狀中的治療性用途，諸如諸如出血、低血容積症、燒傷、急性肝衰竭、肝功能障礙、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫症候群、硬化、新生兒溶血病、心肺繞道手術、腎病、癌症、肝腎症候群、敗血症、器官灌注、器官再灌注、瘢痕形成、牛皮癬及濕疹；以及與水溶性不良藥物組合用於治療其中EMT刺激非係合適或所要的疾病或病狀，諸如抗癌藥物。本發明亦關於根據本發明之白蛋白之組成物之 用途，其用於製備用於治療醫師建議投與白蛋白組成物之疾病或病狀之藥物，該疾病或病狀包括但不限於低血容積症，有或無休克；低白蛋白血症(例如，由於營養不良、燒傷、嚴重損傷、先天無清蛋白血、肝病、肝功能障礙、感染、惡性腫瘤、化療、內分泌病症等)、過量分解代謝(例如，由於燒傷、嚴重損傷、胰腺炎、甲狀腺中毒症、天皰瘡、腎病等)、體內白蛋白損失(例如，由於出血、過量腎排泄、燒傷滲出物、滲出性腸病、脫落性皮膚病等)及/或體內白蛋白再分佈(例如，由於大手術、矯形手術、硬化合併腹水、腹膜炎、黏連、憩室炎、各種發炎性病狀等)；在具有急性肝衰竭或慢性肝病之急性代償能減退(例如，體外肝支持)、中毒、感染、手術併發症、敗血性休克、重度敗血症之患者之心肺繞道手術、燒傷、硬化、白蛋白透析之前或期間。本發明亦關於根據本發明之白蛋白之組成物之用途，其用於藥物調配，以便穩定藥物，或使藥物可溶性更大，或增加藥物之功效或出於其他目的，或用於藥物之遞送媒劑。在此上下文中，術語「藥物」及「或活性劑」可互換。本發明亦關於根據本發明之白蛋白之組成物之用途，其用於幹細胞或胚胎之冷凍保存以供幹細胞療法或體外受精(IVF)。
在一實施例中，本文所述之C8-14脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯之總濃度高於或等於0.08毫莫耳每公克白蛋白，只要促EMT劑不存在，或係上文定義之相對於組成物中白蛋白之量的「低濃度」即可。在此實施例中，C8-14脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯之總量佔該抗EMT劑之至少30%。
本發明進一步關於包含一定量C8-14脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯之白蛋白組成物之用途，該量高於或等於或小於0.08毫莫耳每公克白蛋白，其中促EMT劑之該量對用於相對於組成物中存在之白蛋白之量的低濃度或係不存在，且其中至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%該量C8-14脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘 油酯係抗EMT劑或其組合。該等用途包括用於血清白蛋白之熱穩定。本發明亦涵蓋，白蛋白組成物在巴氏殺菌之後經修改，以便根據所主張之濃度及/或比例減少或耗盡促EMT劑之含量及/或增加抗EMT劑之含量。
除非另外在本文指出或明顯與上下文矛盾，否則描述本發明之上下文中(特別是在以下申請專利範圍之上下文中)之術語「一(個/種)」及「該」以及類似指示物視為同時包括單數及複數。
除非另有說明，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應解釋為開放式術語(亦即，意謂「包括但不限於」)。
本文中敘述之數值範圍僅意欲作為逐一地提及屬於該範圍之各單獨之數值之簡寫方法，並且將各端點(除非另外在文中指出)及各單獨之數值及端點併入本說明書，如同其個別地在本文中敘述一樣。範圍內的值之所有子集亦併入說明書，如同其個別地在本文中敘述一樣。
除非另外在文中指出或明顯與上下文矛盾，否則本文中描述之所有方法可以任何適當之順序進行。
除非另外聲明，否則使用之任何及所有實例，或本文中提供之示範性語言(例如，「諸如」)僅係為了更好地說明本發明並且不對本發明之範疇構成限制。
不應該將說明書中之語言理解為指示之任何未提出申請專利範圍之要素對本發明之實踐為必需的。
在本文，術語「約」具有其一般含義。術語「約」用於指示一個值包括用於測定該值之裝置或方法的誤差之固有變化，或涵蓋接近所述值之值，例如在所述值(或所述值範圍)之10%或5%之內。
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。
在本文所述之研究中，本發明者已說明，辛酸及其鹽(以游離形式或與白蛋白複合)刺激上皮-間葉轉變(EMT)，如藉由人類近端小管上皮細胞上TGF-β誘導之膠原蛋白表現(EMT之標記物)增加所評定。相比之下，在用其他飽和脂肪酸(亦即，C9-C14脂肪酸)或其三酸甘油酯(以游離形式及/或與白蛋白複合)之後偵測出人類近端小管上皮細胞之TGF-β誘導之膠原蛋白表現減小(亦即，指示EMT之抑制)。因此，本文呈現之結果提供以下證據，辛酸穩定之HSA之使用可與非所需生物效應相關聯，尤其在某些病理學病狀中，諸如其中應避免/最小化EMT之刺激的癌症或過度傷口癒合(瘢痕形成)，以及使用C9-C14脂肪酸穩定之HSA(其對EMT具有抑制作用)係較佳的。
本發明亦關於一種預防、最小化或減小有需要之受試者之上皮-間葉轉變(EMT)之刺激的方法，該方法包含向該受試者投與不含有白蛋白且包含以下之組成物：-無促EMT劑或低濃度促EMT劑；及/或-一定含量促EMT劑及抗EMT劑，其中促EMT劑：抗EMT劑之比係7：3至0：10。
該促EMT劑係如上文針對白蛋白組成物所述，亦即辛酸、辛酸鹽或其組合。該抗EMT劑係如上文針對白蛋白組成物所述，亦即C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸鹽、C9-C14脂肪酸之單甘油酯、C9-C14脂肪酸之二酸甘油酯、C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯或其組合。有利的是，促EMT劑之濃度不太高且較佳不超過0.02M。在實施例中，促EMT劑之濃度係0.01M或更少、0.001M或更少、0.0001M或更少。在其中組成物不含有白蛋白、促EMT劑及抗EMT劑的此等實施例中，當其係脂肪酸時，其可係單獨的化合物或係二酸甘油酯或三酸甘油酯之一部分，但是保留了相同比率。此實施例之一實例給出於表2中，其中經測試之三酸甘油酯含有2條辛酸鏈及一條癸酸鏈，比率係2：1。
本發明亦涵蓋組成物之用途，其用於製備用於抑制或減小受試者之 上皮-間葉轉變(EMT)之藥物，其中該組成物包含有效量如上文所述之抗EMT劑。在一實施例中，抗EMT劑之有效量包含在5mg/kg至300mg/kg受試者之間、或在5mg/kg至200mg/kg之間、或在5mg/kg至100mg/kg之間、或在10mg/kg至100mg/kg之間每劑量，以供人類之經口或局部投與。在一實施例中，抗EMT劑之有效量包含在0.5mg/kg至100mg/kg之間、或在0.5mg/kg至50mg/kg之間、或在0.5mg/kg至25mg/kg之間、或在0.5mg/kg至10mg/kg之間、或在0.5mg/kg至4mg/kg受試者之間每劑量，以供人類之靜脈內、腹膜內、經直腸、肌肉內或皮下投與。該劑量在治療期期間投與一次或以重複方式投與。在一實施例中，該重複方式係每日、每兩日、每三日、一週兩次或每週。該治療期較佳由醫師限定或直至達成所要醫學結果。
該有效量可投與一次或重複投與。重複投與係一日二至四次、一日一次、每兩日、每三日、一週兩次或一週一次。
在一實施例中，抗EMT劑存在於包含醫藥學上可接受之媒劑或載劑之醫藥組成物中。
如本文所用之術語「脂肪酸」係指具有脂族鏈之羧酸(飽和或不飽和)，通常4至28個碳。術語「C9-C14脂肪酸」係指9、10、11、12、13或14個碳之具有脂族鏈之脂肪酸，或其任何混合物。在一實施例中，脂族鏈係飽和的。術語「C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯」係指酯連接至三個C9-C14脂肪酸之甘油分子且可由下式表示：
其中R'、R"及R'''獨立選自在酯化至甘油骨架之碳骨架中具有9、10、11、12、13或14個碳的飽和脂肪酸或其鹽。術語「C9-C14脂肪酸之單甘油酯」係指酯連接至一個C9-C14脂肪酸之甘油分子；且術語「C9-C14脂肪酸之二酸甘油酯」係指酯連接至兩個C9-C14脂肪酸之甘油分子。脂肪酸、其鹽及脂肪酸之三酸甘油酯可藉由此項技術中任何已知過程製備，諸如直接酯化、重排、分餾、轉酯化或類似過程。例如，脂質可透過重排過程或類似過程分離自或來源自植物油之來源，諸如椰子油。鏈長度之長度及分佈可取決於來源油而不同。C9-C14脂肪酸、其鹽及C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯之市售來源可供使用且係熟練技術人員已知的。
在一實施例中，白蛋白組成物包含單一9、10、11、12、13或14個碳之脂肪酸或其鹽。在另一實施例中，白蛋白組成物包含二或更多種9、10、11、12、13或14個碳之脂肪酸及/或其鹽之任何混合物。
在實施例中，白蛋白組成物中所包含之至少約40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%脂肪酸及/或脂肪酸鹽係C9-C14脂肪酸及/或其鹽。在一實施例中，白蛋白組成物中所包含之100%脂肪酸及/或脂肪酸鹽係C9-C14脂肪酸及/或其鹽。
在實施例中，白蛋白組成物中所包含之60%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%或5%或更少脂肪酸及/或脂肪酸鹽係C8脂肪酸(「辛酸」或「羊脂酸」)及/或其鹽。在一實施例中，白蛋白組成物中所包含之脂肪酸不含或實質上不含辛酸及/或辛酸鹽。
術語「辛酸」或「羊脂酸」可在本文互換使用，且係指包含8個碳原子之飽和脂肪酸。其具有以下結構：
術語「辛酸鹽」、「辛酸之鹽」、「羊脂酸鹽」及「羊脂酸之鹽」在本文可互換使用。
兩種表述「少量促EMT劑」及「低濃度促EMT劑」係指低於市場上市售之白蛋白製劑中當前使用之辛酸及/或辛酸鹽之量的辛酸及/或辛酸鹽之量。市售之白蛋白製劑在製備25%白蛋白時使用0.02M羊脂酸鈉，且在製備5%白蛋白時使用約0.004M羊脂酸鈉。因此，對於25%白蛋白而言，羊脂酸鈉之商業上使用之濃度係0.02M，且其表示0.08毫莫耳每公克白蛋白。因此，少量辛酸及/或辛酸鹽表示小於0.08毫莫耳每公克白蛋白、或小於0.05毫莫耳每公克白蛋白、或小於0.01毫莫耳每公克白蛋白、或0.005毫莫耳每公克白蛋白、或0.001毫莫耳每公克白蛋白、或小於0.0005毫莫耳每公克白蛋白、或小於0.0001毫莫耳每公克白蛋白。
如本文所用之術語「實質上不含辛酸及/或辛酸鹽」係指不可定量的或不可藉由常見技術偵測的辛酸及/或辛酸鹽之濃度。利用發明人已知且使用之技術，定量及偵測之水準係0.1mM，其對應於0.0005毫莫耳每公克白蛋白。因此，「實質上不含辛酸及/或辛酸鹽」表示小於0.0005毫莫耳每公克白蛋白或小於0.0001毫莫耳每公克白蛋白。
如本文所用之術語「不含辛酸及/或辛酸鹽」係指不存在辛酸及/或辛酸鹽或存在痕量辛酸及/或辛酸鹽。例如，不含辛酸及/或其鹽之白蛋白組成物係尚未向其中添加辛酸及/或辛酸鹽之組成物或已向其中添加辛酸及/或其鹽並進一步移除/耗盡的組成物。例如，可在巴氏殺菌期間添加一定含量辛酸及/或其鹽以供白蛋白之穩定，且在巴氏殺菌之後移除。例如，Sigma且實例3中所用之裸白蛋白被視為不具有脂肪酸，儘管產品規格指示其具有0.007%(w/w)或更少的痕量脂肪酸。出於本發明之目的可使用若干種用於脂肪酸(促EMT劑)移除的方法，諸如(i)超過濾/滲濾(UF/DF)以供與抗EMT劑之交換，其使用膜諸如中空纖 維、鑄膜等；(ii)利用透析管的透析，以供與抗EMT劑之交換；(iii)凝膠過濾，諸如粒徑篩析管柱或除鹽管柱；(iv)在低pH下進行活性碳吸附的吸附，接著進行過濾/純化以移除活性碳；(v)吸附至固相上，諸如碳粒子或各種礦物粉末，包括沸石、矽石等；(vi)層析法；(vii)在37℃下經由疏水性管柱層析法諸如Lipidex 1000(25公克，具有C15烴基)；(viii)添加乙醇，視情況降低pH，接著進行加熱及過濾以移除不穩定沉澱蛋白質，且進行UF/DF以除去任何剩餘脂肪酸同時移除乙醇及/或調整pH更接近中性；(ix)利用陰離子及陽離子交換樹脂且亦藉由透析進行離子交換，(x)展開白蛋白以耗盡促EMT劑且用抗EMT劑進行再折疊(亦即視情況在還原劑(例如巰基乙醇)之存在下，使用離液劑(例如尿素或氯化鈲)進行展開以退繞白蛋白並釋放結合之促EMT劑，視情況進行稀釋或透析/滲濾以移除任何痕量促EMT劑，且在抗EMT劑之存在下進行再折疊，藉由稀釋、透析、滲濾等移除存在的離液劑)；或藉由此等方法之組合。
在一實施例中，組成物中存在之至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或96%、或97%、或98%、或99%或100%該含量C8-C14脂肪酸、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯或其組合(亦即促EMT劑及抗EMT劑之總含量之%)係C9-C14脂肪酸、脂肪酸鹽、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯；或較佳C9-C12脂肪酸、脂肪酸鹽、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯；或較佳C10-C12脂肪酸、脂肪酸鹽、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯；或較佳C10脂肪酸、脂肪酸鹽、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯；或較佳癸酸及/或癸酸鹽。在實施例中，組成物中存在之脂肪酸、脂肪酸鹽、其鹽、其單甘油酯、其二酸甘油酯或其三酸甘油酯非係放射性標記。
術語「癸酸」或「羊蠟酸」可在本文互換使用，且係指包含10個碳 原子之飽和脂肪酸。其具有以下結構：
術語「癸酸鹽」係指癸酸之鹽、羊蠟酸之鹽或羊蠟酸鹽。
有利的是，該鹽係醫藥學上可接受的。C9-C14脂肪酸之醫藥學上可接受之鹽之實例包括鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽及銅鹽；較佳係鈉鹽、或鉀鹽、或鈉鹽及鉀鹽之組合。在一實施例中，該鹽係鈉鹽。在一實施例中，C9-C14脂肪酸鹽係鈉鹽，諸如癸酸鈉。
在一實施例中，白蛋白組成物中脂肪酸及/或其鹽之量係合適於在巴氏殺菌過程期間穩定白蛋白的量，對於濃度為25%之白蛋白而言，其係約0.02M。較低濃度白蛋白係用按比例較少量脂肪酸及/或其鹽穩定。本文考慮到，白蛋白之穩定可用辛酸及/或辛酸鹽執行，且在穩定之需要(亦即巴氏殺菌過程)之後，將辛酸及/或辛酸鹽自白蛋白組成物移除。此類移除稱為汽提或耗盡。此一移除之結果係白蛋白組成物不含或實質上不含脂肪酸或其鹽，其亦稱為裸白蛋白組成物。本發明亦考慮使用裸白蛋白組成物以預防或最小化EMT。可替代地，用於穩定白蛋白之脂肪酸或其鹽非係純辛酸及/或其鹽，且至少含有但不限於30%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100% C9-C14脂肪酸及/或其鹽、或C9-12脂肪酸及/或其鹽、或C10-C12脂肪酸及/或其鹽、或C10脂肪酸及/或其鹽。在至少30%該含量脂肪酸及/或其鹽係C9-C14脂肪酸及/或其鹽的此等情況下，對於預防或最小化EMT而言，在穩定之需要(亦即巴氏殺菌過程)之後移除脂肪酸及/或其鹽非係必要的。
在一實施例中，製劑中白蛋白之量係約5%至小於約40%(w/v)。在一實施例中，製劑中白蛋白之量係約5%至約25%(w/v)。在一實施例中，製劑中白蛋白之量係約20%至約25%(w/v)。在一實施例中，製劑中白蛋白之量係約 5%(w/v)。在一實施例中，製劑中白蛋白之量係約20%(w/v)。在一實施例中，製劑中白蛋白之量係約25%(w/v)。術語「白蛋白之組成物」、「白蛋白組成物」及「白蛋白製劑」在本文可互換使用，且意謂包含白蛋白之組成物。
術語「白蛋白」意謂具有與人類血清白蛋白(HSA)相同及/或非常類似三級結構的蛋白質。在一實施例中，白蛋白係原生HSA或其保留HSA之功能/性質的變異體。圖3顯示原生HSA前蛋白之胺基酸序列(SEQ ID NO：1，NCBI參考序列：NP_000468.1,UniProtKB：P02768)。應注意，原生HSA前蛋白之胺基酸序列之天然變異可在個體之間發生。
經編碼之前蛋白原經蛋白水解處理以產生包含前蛋白原之殘基25-609的成熟HSA蛋白(殘基1-18定義信號肽且殘基19-24定義前肽)。
白蛋白之一些主要功能/性質係i)其調節血漿體積之能力，ii)大約19日±5日之長血漿半衰期，iii)配位體結合，例如結合內源分子諸如親脂性羧酸化合物包括膽紅素脂肪酸、氯化血紅素及甲狀腺素(亦參見Kragh-Hansen等人，2002,Biol.Pharm.Bull.25,695之表1)，iv)結合具有酸性或陰電性特徵之小有機化合物，例如藥物諸如殺鼠靈、苯甲二氮焯、伊布洛芬及太平洋紫杉醇(亦參見Kragh-Hansen等人，2002之表1，同上)。
術語「變異體」意謂包含在相對於原生HSA之一或多個(若干)位置處的改變(亦即，取代、插入及/或缺失)的多肽。經改變多肽(變異體)可藉由修改編碼原生白蛋白之多核苷酸序列透過人類介入來獲得，或可天然地發生。變異體白蛋白之胺基酸序列與SEQ ID NO：1之殘基25-609有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性，且維持原生HSA之至少一個功能/性質。兩個胺基酸序列之間的序列一致性可使用熟知演算法確定，例如Needleman-Wunsch演算法(Needleman及Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)，如EMBOSS套裝之Needle 程式中所實行(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人.2000,Trends Genet.16：276-277)。序列一致性亦可使用BLAST演算法確定，其描述於Altschul等人.,1990,J.Mol.Biol. 215：403-10(使用公開預設設置)。用於執行BLAST分析之軟體可透過美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)獲得。
因此，在一實施例中，本發明涵蓋包含與原生成熟白蛋白蛋白質(亦即上文殘基25-609)具有至少70%一致性的白蛋白的白蛋白組成物。在實施例中，本發明涵蓋與原生成熟白蛋白蛋白質具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的白蛋白之使用。原生成熟HSA蛋白質之此類變異體可包含相對於原生成熟白蛋白蛋白質的胺基酸缺失、取代及/或增加。
本文所定義之製劑中存在之白蛋白可分離/獲自任何來源，例如血液、血漿、經分餾人類血清或透過遺傳工程改造(重組白蛋白)。經分餾人類血清之白蛋白可例如藉由血漿之低溫乙醇分餾(例如，Cohn方法及其變型)來製備。白蛋白亦可由血漿藉由層析法純化。白蛋白可透過一系列親和力及離子交換管柱獲得，該等管柱應用於血漿且得到經純化白蛋白。經純化白蛋白通常經受在60℃下的熱處理達10小時或熱巴氏殺菌以供滅菌。為了最小化由熱處理所致的白蛋白之變性，將白蛋白與脂肪酸(或其鹽)複合。白蛋白亦可使用習知遺傳工程改造方法重組製備(參見，例如，Sambrook等人.(1989)in Molecular Cloning：A Laboratory Manual；及Sambrook及Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版；Cold Spring Harbor Laboratory)。例如，包含編碼白蛋白多肽之核酸序列的重組表現載體可引導至細胞例如宿主細胞(細菌或真核細胞)中，其可包括能夠自經定義重組表現載體表現蛋白質編碼區的活細胞。載體可經由習知轉化或轉染技術引導至細胞中，包括磷酸鈣或氯化鈣共同沉澱、DEAE-葡聚糖介導之轉染、脂轉染、電穿孔、微注射及病毒介導之轉染。用於使宿主細胞轉形 或轉染之合適方法可例如見於Sambrook等人.(同上)、Sambrook及Russell(同上)以及其他實驗室手冊。本發明之組成物中存在之白蛋白包括白蛋白融合蛋白及透過共價鍵結合至蛋白質的白蛋白。例如，融合可由一般經由可撓性甘胺酸連接子或另一連接子融合至胺基酸序列(表示蛋白質或其片段)之C末端或N末端的白蛋白產生。例如，結合可在蛋白質經順丁烯二醯亞胺基團修飾從而反應並共價結合至白蛋白之硫醇基團的情況下發生。
維持原生HSA之至少一個功能/性質的HSA變異體係此項技術中熟知的。本文可用的重組血清白蛋白之實例包括先前揭示於美國專利第5,780,594號及美國專利第5,948,609號者。此外，經修飾或經截短人類白蛋白諸如美國專利第6,787,636號中所揭示者亦可用於本發明。如其中所闡述，血清白蛋白可係在其N端處具有一或兩個胺基酸截短，或在N端處具有足以在N端處造成位阻以便減小白蛋白對痕量金屬諸如銅及/或鎳的親和力，從而減小造成對痕量金屬的過敏反應的可能性的任何其他突變的白蛋白(亦即低過敏性HSA)。HSA之其他形式亦可合適於某些應用，諸如揭示於例如WO2011/051489及美國專利第8,822,417號、WO2011/124718及WO2012/059486中的血漿半衰期改變的白蛋白變異體。
在實施例中，本文所述之製劑之pH係約5至約7.5，例如約5.5至約7.5，較佳約6.5至7.4。
亦可將一或多種抗氧化劑或穩定劑添加至製劑中，例如已知展現抗氧化劑或穩定活性的含硫胺基酸、胺基酸鹽、或其衍生物，諸如半胱胺酸、胱胺酸、甲硫胺酸或其N-醯基(例如，N-乙醯基)衍生物諸如N-乙醯基甲硫胺酸(參見美國專利第7,351,800號)，或其他抗氧化劑或穩定劑諸如N-乙醯基色胺酸(或N-乙醯基色胺酸鹽)。因此，在一實施例中，本文所定義之製劑或組成物包含一或多種醫藥學上可接受之抗氧化劑或穩定劑，例如上文所說明之抗氧化劑或穩 定劑。在另一實施例中，該一或多種醫藥學上可接受之抗氧化劑或穩定劑包含N-乙醯基甲硫胺酸及/或N-乙醯基色胺酸。
在一實施例中，該製劑中該一或多種醫藥學上可接受之抗氧化劑或穩定劑係約0.001M至約0.5M、約0.005至約0.1M、約0.01至約0.1M、約0.01至約0.08M或約0.01至約0.05M，例如，約0.01M、約0.02M、約0.03M、約0.04M或約0.05M，或上文任何兩個數值之間的範圍。
在一實施例中，該一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑包括例如著色劑、穩定劑、抗菌劑、稀釋劑、pH調節劑(例如，鹼性胺基酸、酸性胺基酸、鹽酸、乙酸、蘋果酸或氫氧化鈉)、滲透壓調節劑(例如，電解質諸如氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖酸鉀、硫酸鎂、碳酸氫鈉、氯化鈣、葡萄糖酸鈣或檸檬酸)及/或界面活性劑。在一實施例中，該一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑包含滲透壓調節劑(例如，電解質)。在一實施例中，滲透壓調節劑之濃度係約10mM至約500mM。在進一步實施例中，滲透壓調節劑之濃度係約50mM至約300mM、約100mM至約200mM、約120mM至約180mM或約125mM至約175mM。在一實施例中，滲透壓調節劑包含鈉、鉀或兩者。在另一實施例中，滲透壓調節劑包含鈉及鉀。在一實施例中，鈉之量係約130至約160mM。在一實施例中，鉀之量係約1mM至約5mM，例如約2mM。
本文所述之白蛋白製劑可藉由均勻混合以下來製備：i)脂肪酸、或其鹽、或其單甘油酯、或其二酸甘油酯、或其三酸甘油酯或其組合；及ii)一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑與iii)白蛋白水溶液(例如，緩衝劑諸如磷酸鹽緩衝劑，其可作為醫藥製劑、注射用水或生理鹽水進行投與)。在溶解之後，將混合物溶液加工成合適於向受試者投與的調配物，例如用於腸胃外投與，諸如靜脈內流體製劑或可注射溶液。在實施例中，此等製劑可皮下或靜脈內投與。
在一實施例中，本文所述之抗EMT劑之白蛋白製劑或組成物可用於 當前使用銷售之白蛋白製劑的治療適應症，諸如低血容積症，有或無休克；低白蛋白血症，其可由白蛋白之產生不足(例如，由於營養不良、燒傷、嚴重損傷、先天無清蛋白血、肝病、感染、惡性腫瘤、化療或內分泌病症)、過量分解代謝(例如，由於燒傷、嚴重損傷、胰腺炎、甲狀腺中毒症、天皰瘡或腎病)、體內白蛋白損失(例如，由於出血、過量腎排泄、燒傷滲出物、滲出性腸病或脫落性皮膚病)及/或體內白蛋白再分佈(例如，由於大手術、矯形手術、硬化合併腹水、腹膜炎、黏連、憩室炎或各種發炎性病狀)引起；在心肺繞道手術之前或期間；及用於治療燒傷或硬化。在一實施例中，本文所述之白蛋白製劑或組成物係用於具有急性肝衰竭或慢性肝病之急性代償能減退(例如，體外肝支持)之患者的白蛋白分析。在一實施例中，本文所述之白蛋白製劑用於治療中毒。在一實施例中，本文所述之白蛋白製劑用於治療感染、手術併發症、敗血性休克或重度敗血症。在一實施例中，本文所述之白蛋白製劑用於藥物調配，以便穩定藥物，或使藥物可溶性更大，或增加藥物之功效或出於其他目的，或用於藥物之遞送媒劑。在此上下文中，術語「藥物」及「或活性劑」可互換。在一實施例中，本文所述之白蛋白製劑用於幹細胞或胚胎之冷凍保存以供幹細胞療法或體外受精(IVF)。
因此，本發明提供一種用白蛋白治療需要治療之患者的方法，該方法包含向該受試者投與有效量本文所述之白蛋白製劑或組成物。本發明提供本文所述之白蛋白製劑之用途，其用於用白蛋白治療需要治療之患者。本發明提供本文所述之白蛋白製劑，其用於用白蛋白治療需要治療之患者。
在一實施例中，該投與或使用不刺激或增加該受試者之EMT。在另一實施例中，該投與或使用預防或最小化該受試者之EMT或減小EMT刺激。在一實施例中，此類投與或使用不導致或實質上不導致EMT之增加，且在另一實施例中抑制或減少受試者之EMT。如本文所用，「不刺激或增加EMT」、「預 防或最小化EMT」或「不導致或實質上不導致EMT之增加」意謂本文所述之組成物或製劑之投與或使用相較於商業上已知的白蛋白製劑不導致或實質上不導致EMT之增加。此等表述亦意謂，本文所述之組成物或製劑之投與或使用導致受試者之相對於用辛酸及/或辛酸鹽或包含白蛋白及辛酸及/或辛酸鹽之組成物(以0.08毫莫耳每公克白蛋白之濃度)或在不存在抗EMT劑之情況下治療所致的EMT水準的較低EMT水準。「抑制或減小EMT」意謂，投與或使用本文所述之組成物或製劑不僅導致EMT不或實質上不增加，還相較於治療之前受試者之EMT水準減小受試者中EMT之水準。如本文所用之「EMT實質上不增加」意謂該投與或使用不導致EMT顯著增加，其在實施例中係指相對在用本文所述之組成物或製劑治療受試者之前EMT增加小於10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%。
EMT可藉由此項技術中已知的各種方法評定，例如藉由評定與EMT相關聯之一或多種標記物之表現或水準。實例包括確定上皮生物標記物之表現或水準及/或間葉生物標記物之表現或水準。此外，許多試劑、產品及套組可商購獲得以供評定EMT。在一實施例中，EMT可藉由評定人類近端小管上皮細胞上TGF-β誘導之膠原蛋白表現來確定，從而人類近端小管上皮細胞上TGF-β誘導之膠原蛋白表現增加指示EMT增加，且人類近端小管上皮細胞上TGF-β誘導之膠原蛋白表現減少指示EMT減少。
在一實施例中，本文所述之抗EMT劑之白蛋白製劑或組成物用於治療例如罹患燒傷(例如，重度燒傷或轉移)之患者、經歷器官移植之患者、具有肝腎疾病之患者(例如，預防或減少與此類病狀相關聯之器官病變)、或具有癌症之患者(例如增加化療功效)、或具有癌症之患者(例如預防牽涉轉移過程的EMT刺激)之其中預防或最小化EMT(預防或最小化過度傷口癒合或瘢痕形成)係有益的疾病或病狀。
本文所述之白蛋白製劑通常以一次約5至12.5g白蛋白之劑量向成年人投與。取決於疾病病狀，本文所述之抗EMT劑之白蛋白製劑或組成物可投與一週一次、一週兩次、每三日、每兩日、一日一次或一日約二至四份、或僅一次。
在一實施例中，本文所提及之任何組成物中白蛋白之濃度係1%至40%、2%至40%、5%至40%、5%至30%、5%至25%、20%至25%，、約5%、約10%、約15%、約20%或約25%。
在一實施例中，本文所述之抗EMT劑之白蛋白製劑或組成物進一步包含活性成分。在一實施例中，活性成分結合至白蛋白。在另一實施例中，活性成分不結合至白蛋白。
術語「活性劑」可與「活性成分」互換。醫藥活性劑可選自多種已知類別的藥物，包括，例如，鎮痛劑、麻醉劑、消炎劑、抗寄生物劑(例如，驅蠕蟲劑)、抗心律不整劑、平喘劑、抗生素、抗癌劑、抗凝血劑、抗憂鬱劑、抗糖尿劑、抗癲癇藥、抗組織胺、鎮咳藥、降血壓劑、抗蕈毒素劑、抗分枝桿菌藥、抗腫瘤劑、抗氧化劑、退熱劑、免疫抑制劑、免疫刺激劑、抗甲狀腺劑、抗病毒劑、抗焦慮鎮靜劑(安眠藥及精神安定劑)、收斂劑、抑菌劑、β-腎上腺素受體阻斷劑、血液製劑及替代品、支氣管擴張劑、緩衝劑、心臟收縮劑、化療劑、顯影劑(contrast media)、皮質類固醇、咳嗽遏抑劑(祛痰劑及化痰劑)、診斷劑、診斷成像劑、利尿劑、多巴胺能藥(抗帕金森病藥)、自由基清除劑、生長因子、止血藥、免疫藥劑、脂質調節劑、肌肉鬆弛劑、蛋白質、肽及多肽、擬副交感神經劑、副甲狀腺降血鈣素及雙磷酸鹽類、前列腺素、放射性藥物、激素、性激素(包括類固醇)、限時釋放黏合劑、抗過敏劑、興奮劑及減食慾劑、類固醇、擬交感神經藥、甲狀腺劑、疫苗、血管擴張劑及黃嘌呤。
在一實施例中，醫藥活性成分不可溶於水或可略微溶於水。可與白 蛋白一起併入至組成物中的醫藥活性成分之實例包括胺麩精、硫唑嘌呤、硫酸博萊黴素、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、順鉑、環磷醯胺、環孢黴素(cyclosporine)、達卡巴仁(dacarbazine)、放線菌素(dactinomycin)、道諾黴素(daunorubicin)、阿黴素(amycin)、依託泊苷(etoposide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、干擾素-α、洛莫司汀(lomustine)、巰基嘌呤、胺甲喋呤(methoptrexate)、米托坦(mitotane)、鹽酸丙卡巴肼(procarbazine hydrochloride)、硫鳥嘌呤、硫酸長春鹼、硫酸長春新鹼、紫杉烷(例如，太平洋紫杉醇、多西紫杉醇、卡巴他賽(cabazitaxel)、多西紫杉醇之疏水性衍生物諸如2'-O-己醯基多西紫杉醇及2'-苯甲醯基多西紫杉醇)；巨環內酯諸如雷帕黴素(rapamycin)及其衍生物(例如，西羅莫司(temsirolimus)及依維莫司(everolimus))、衣波塞酮(epothilone)B及其衍生物、坦螺旋黴素(tanespimycin)及其衍生物；喜樹鹼，包括但不限於10-羥基喜樹鹼、SN-38及其衍生物；蒽環黴素(anthracycline)抗生素，包括但不限於阿克拉黴素(aclacinomycin)及吡柔比星(pirarubicin)；或其他醫藥活性成分，包括秋水仙素及其衍生物、甲硫秋水仙素(thiocolchicine)二聚物、胺碘酮(amiodardone)、碘塞羅寧(liothyronine)、環孢素(cyclosporine)、依西美坦(exemestane)、氟他胺(flutamide)、氟維司群(fulvestrant)、羅米地辛(romidepsin)、司莫司汀(semustine)、伊布洛芬、環孢黴素、丙泊酚(propofol)、長春鹼及其類似物。在一些實施例中，活性成分係抗癌藥物，例如紫杉烷、喜樹鹼、伊立替康、吉西他濱、環磷醯胺(CytoxanTM)、多柔比星或順鉑，較佳係紫杉烷諸如太平洋紫杉醇或多西紫杉醇。在特定實施例中，活性成分係太平洋紫杉醇。
在一實施例中，白蛋白係以奈米粒子之形式。因此，在另一態樣中，本發明提供一種奈米粒子，其包含(i)白蛋白；(ii)抗EMT劑；及(iii)併入或封裝在該白蛋白內的醫藥活性(例如，治療性)劑。因此，在另一態樣中，本發明提供一種奈米粒子，其包含(i)白蛋白；(ii)無辛酸及/或辛酸鹽、或低濃度辛酸及/或辛 酸鹽。該「低濃度」係經上文描述。包含白蛋白及醫藥活性劑之奈米粒子以及其生成方法揭示於例如PCT公開案第WO2015/018380號及第WO2016/000653號。
如本文所用之術語「奈米粒子」係指大小以奈米級，例如，以約1nm、約10nm、約100nm或約500nm之水準的粒子。在一實施例中，奈米粒子之大小係約1nm至約500nm、約10nm至約200nm，例如約30、50、70、80或100至約120、140、160、180或200nm，或上文任何兩個數值之間的範圍。
在一實施例中，組成物(例如，奈米粒子)中白蛋白與醫藥活性成分之重量比係約0.01：1至約100：1。在進一步實施例中，組成物(奈米粒子)中白蛋白與醫藥活性成分之重量比係約0.02：1至約50：1；約0.05：1至約20：1；約0.1：1至約10：1；或約0.2：1至約5：1，或上文任何兩個數值之間的範圍。
在一實施例中，以液體形式之醫藥組成物包含約0.1%至約40%(w/v)，例如約0.5%(w/v)、1%(w/v)或2%(w/v)至約5%(w/v)、約10%(w/v)、約15%(w/v)、約20%(w/v)、約30%(w/v)或約35%(w/v)白蛋白。在一些實施例中，以液體形式之組成物包含約20%至約25%(w/v)白蛋白，或上文任何兩個數值之間的範圍。
如上文所用之術語「約」意欲意味術語「約」所定義之值之+/- 10%，且較佳係術語「約」所定義之值之+/- 5%。
在一實施例中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含本文所定義之組成物或製劑且進一步包含一或多種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。此類醫藥組成物可以醫藥技術中熟知方式製備。載劑/賦形劑可合適於例如靜脈內、腸胃外、皮下、肌肉內、顱內、眶內、經眼、心室內、囊內、脊柱內、鞘內、硬膜外、腦池內、經直腸、腹膜內、鼻內或經肺(例如，氣溶膠)投與(參見Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Loyd V Allen,Jr,2012，第22版， Pharmaceutical Press；Handbook of Pharmaceutical Excipients,Rowe等人.,2012，第7版，Pharmaceutical Press)。治療調配物係使用此項技術中已知的標準方法，藉由將具有所需純度的組成物或製劑與一或多種醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑混合來製備。
如本文所用之「賦形劑」具有其在此項技術中之普通含義且為非係活性成分(藥物)本身的任何成分。賦形劑包括例如緩衝劑、稀釋劑、潤滑劑、穩定劑及其他組分。如本文所用之「醫藥學上可接受之賦形劑」係指不干擾活性成分之生物活性之有效性且其對受試者無毒的任何賦形劑，亦即賦形劑之類型及/或用量對受試者無毒。賦形劑在此項技術中為熟知的，且本發明之系統不限於該等方面。如熟習此項技術者所認識到，單一賦形劑可同時實現兩種以上功能，例如可同時充當黏結劑及增稠劑。如熟習此項技術者亦將認識到，該等術語不必相互排斥。
在一實施例中，本文所述之抗EMT劑之白蛋白製劑或組成物係懸浮液或溶液，例如注射用懸浮液或溶液。白蛋白組成物或製劑可懸浮或溶解於任何合適之液體或稀釋劑，諸如醫藥學上可接受或生理上可接受之液體，其可或可非係或包含賦形劑、載劑或穩定劑。其包括任何及所有溶劑及分散介質。液體或稀釋劑之實例包括緩衝劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸。水性液體或稀釋劑係較佳的，諸如水(例如，注射用水)、鹽水諸如生理鹽水0.9% NaCl(w/v)或pH緩衝水溶液。
腸胃外投與之調配物可例如含有賦形劑、無菌水、鹽水或聚伸烷基二醇諸如聚乙二醇。生物相容性、生物可降解乳酸交酯聚合物、乳酸交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用於控制化合物之釋放。本文所述之抗EMT劑之白蛋白製劑或組成物之其他潛在實用之腸胃外遞送系統包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物粒子、滲透幫浦、可植入輸注系統及脂質體。吸入用調配物可含 有賦形劑(例如，乳糖)，或可係水性溶液，其含有例如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘膽酸鹽及脫氧膽酸鹽，或可係油性溶液以供以滴鼻劑之形式或呈凝膠投與。
本文所述之抗EMT劑之白蛋白製劑或組成物可係乾式調配物(諸如凍乾組成物)之形式或懸浮於生物相容性介質中。在醫藥組成物係以凍乾粉末之形式的實施例中，其包含一或多種凍乾賦形劑，諸如穩定劑及增積劑、甘露醇、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、葡聚糖、緩衝劑、水等或其混合物。合適之生物相容性介質包括但不限於水、緩衝水性介質、鹽水、緩衝鹽水、胺基酸之視情況緩衝溶液、蛋白質之視情況緩衝溶液、糖之視情況緩衝溶液、維生素之視情況緩衝溶液、合成聚合物之視情況緩衝溶液、含脂質溶液及其類似物。在一些實施例中，該組成物係以無菌凍乾粉末之形式。在一些實施例中，該組成物用無菌水或緩衝劑復原。例如，該組成物(諸如醫藥組成物)可於氯化鈉溶液諸如0.9%氯化鈉緩衝劑中復原。
在另一實施例中，本文所述之抗EMT劑之白蛋白製劑或組成物係用於局部投與。局部製劑之形式可係任何形式諸如乳膏劑、乳劑、油、泡沫、凝膠、洗劑、軟膏劑、糊劑、噴霧或懸浮液。局部製劑/組成物視情況包含一或多種局部可接受之輔助劑，其包括例如載劑、賦形劑、乳化劑、界面活性劑、防腐劑、油、增稠劑、聚合物、凝膠形成劑、稠度調節劑、抗氧化劑、消泡劑、抗靜電劑、樹脂、溶劑、溶解度促進劑、中和劑、穩定劑、滅菌劑、推進劑、水溶性或可分散含聚矽氧聚合物、保濕劑、潤膚劑或其任何混合物。可併入至局部調配物中之習知膠凝劑包括但不限於以下之一或多者：羥乙基纖維素、卡波姆(carbomer)、聚乙烯均聚物、聚乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯/丙烯酸共聚物、壬二酸、蘆薈、卵磷脂、熱可逆多醣及鯨蠟基羥乙基纖維素。
必要時，欲投與之醫藥組成物亦可含有少量無毒輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝劑及其類似物，例如乙酸鈉、去水山梨糖醇單月桂酸酯、 三乙醇胺乙酸鈉、油酸三乙醇胺等。必要時，亦可添加著色劑。
在另一態樣中，本發明提供用於使用本文所述之抗EMT劑之白蛋白製劑或組成物之方法。本文所述之抗EMT劑之白蛋白製劑或組成物可用於治療回應於活性成分的任何疾病或病症。
例如，本文所述之抗EMT劑之白蛋白製劑或組成物可包含一或多種抗癌劑，且可用於治療癌症，諸如肝癌、前列腺癌及肺癌。可治療之額外疾病或病症包括乳癌、多發性骨髓瘤、移植排斥、結腸癌或淋巴瘤。在一實施例中，癌症非係胰腺癌。
在一特定態樣中，本發明提供一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之受試者投與治療有效量本文所提供之醫藥組成物或奈米粒子，其中該醫藥活性成分係抗腫瘤劑或化療劑。
在具體實施例中，該受試者係哺乳動物，包括但不限於人類、犬、小鼠及大鼠。在具體實施例中，白蛋白係與該受試者同基因型。
任何合適量醫藥組成物可向受試者投與。劑量將取決於許多因素，包括投與模式。
為了預防、治療給定疾病或病狀或減小其嚴重性，該組成物之適當劑量將取決於欲投與之疾病或病狀之類型、該疾病或病狀之嚴重性及時程、投與該組成物係供預防目的還是治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對該組成物之反應以及主治醫師之裁量。該組成物合適一次性或歷經一系列治療向患者投與。較佳的是，需要在於人類中測試之前，確定體外劑量-響應曲線，然後實用於動物模型中。本發明提供針對化合物及包含其之組成物的劑量。對於歷經數日或更長時間之重複投與，取決於病狀，治療通常持續直至對疾病症狀發生所需抑制作用為止。然而，其他給藥方案可能實用。此療法之進展易於藉由習知技術及分析加以監測。
實例
本發明之實施例在下文例示。
實例1：藉由耗盡/替換辛酸鈉製備白蛋白及癸酸鹽之組成物
以200g/L之濃度於0.12M NaCl、30mM羊脂酸鹽(辛酸鈉)之溶液中之人類血清白蛋白(HSA)係用作起始材料(Sigma，目錄號C5038-1KG)。將此樣品1：20稀釋於0.12M NaCl中，得到濃度約10g/L的白蛋白溶液。然後將此樣品用0.12M NaCl滲濾(亦即緩衝劑交換)8次並再濃縮至約50g/L白蛋白。然後用包含30mM癸酸鈉及0.12M NaCl之溶液執行第二滲濾步驟達3個滲濾體積，且將樣品用30mM癸酸鈉調至濃度為200g/L之最終白蛋白。
根據實例2中所述之方法執行人類血清白蛋白組成物中癸酸鈉之定量確定。
實例2：白蛋白溶液中癸酸鈉相對於辛酸鈉之偵測
用於確定白蛋白溶液中辛酸鈉之定量方法係基於Dengler T.等人.Infusionstherapie 15：273-274(6/1988)之公開。逆相之內標準係癸酸鈉。對於癸酸鈉之定量偵測，將辛酸鈉用作標準，且癸酸鈉係複合劑。對於確定自人類血清白蛋白組成物萃取之辛酸及癸酸之在214nm下的相對反應及相對回收率
使用癸酸鈉替換辛酸鈉所得之白蛋白組成物及40mM羊脂酸鈉(辛酸鈉)及40mM癸酸鈉之溶液經歷HPLC分析以確認白蛋白組成物中辛酸鈉完全由癸酸鈉替換。
樣品製備：將250μl測試組成物添加至800μl甲醇中並渦旋20秒。將沉澱物在10K RPM下離心5分鐘，且將上清液移除並過濾穿過0.45μm MillexTM HV過濾器。將等分試樣轉移至自動取樣器小瓶中。用4.6x250mm Nucleosil-C18(5μm)管柱進行提取物之相高效液相層析法，其中於甲醇/水(4：1)中之0.1%三氟乙酸(TFA)作為流動相，流速為0.8ml/分鐘。注射20μl。藉由214 nm下之紫外(UV)吸收進行偵測。將各樣品提取物注射三次，且將峰面積取平均。HPLC分析係在具有G1315B二極體陣列偵測器、G1311A四級幫浦、G1329A恆溫自動取樣器、G1316A恆溫管柱腔及具有Chemstation® 10.02軟體之HP Compaq® d530c電腦(WIN XP®)之Hewlett Packard®型號1100 HPLC上進行。用Alltech Nucleosil C-18,4.6mm x 250mm管柱，5μm執行等度逆相分析。
如圖1中所示，發現實例1中製備之白蛋白組成物中未剩餘可偵測量辛酸鈉。此意謂，與白蛋白複合之辛酸鈉經成功移除且用癸酸鈉替換。
實例3：包含癸酸鈉及裸人類白蛋白之白蛋白組成物之製備
Sigma-Aldrich®之人類血清白蛋白(HAS-游離脂肪酸)(#A1887)用於此實驗。此人類血清白蛋白亦稱為「裸人類白蛋白」，其僅含有0.007%(w/w)或更少的痕量脂肪酸。將HSA溶解於PBS中以獲得6.6%(6.6g/100ml)之濃度且使用0.2μm過濾器過濾。將75μl辛酸鈉或癸酸鈉10mM與75μl HSA 6.6%混合(無渦旋)，且在室溫下培育10min。將100μL此混合物以1ml之最終體積(1：10稀釋)用於實例4之分析。
實例4：TGF-β誘導之上皮細胞(HK-2細胞)中之EMT調節
進行分析以確定各種組成物在永生化人類近端小管上皮細胞(HK-2細胞)上對TGF-β誘導之膠原蛋白1表現的作用，膠原蛋白1係EMT之標記物。將HK-2細胞用濃度10ng/ml之TGF-β(EMT之誘導物)處理。EMT標記物膠原蛋白1mRNA之表現係藉由定量即時PCR確定。
將藉由實例1或實例3之方法製備之白蛋白組成物與2.5或5.0 x 10-4M癸酸鈉或辛酸鈉調配。並行測試相同濃度之單獨癸酸鈉及辛酸鈉(亦即無白蛋白)，以及指示濃度之壬酸(nonaic acid)、十一酸及月桂酸鈉。
表1顯示單獨或與白蛋白調配之癸酸鈉降低(或抑制)TGF-β誘導之HK-2細胞中膠原蛋白之表現。單獨使用之壬酸、十一酸及月桂酸鈉亦抑制TGF-β 誘導之HK-2細胞中膠原蛋白之表現。相比之下，用單獨或與白蛋白調配之辛酸鈉處理之TGF-β誘導之細胞中膠原蛋白之表現經增加(或經刺激)。因此，如藉由HK-2細胞中TGF-β誘導之膠原蛋白1之表現所評定，癸酸鈉及辛酸鈉對EMT有相反作用，其中癸酸鈉抑制EMT而辛酸鈉刺激EMT，且此類作用在白蛋白之存在下得以保留。壬酸、十一酸及月桂酸鈉似乎對EMT展現類似於癸酸鈉的作用。組成物中存在或不存在白蛋白均對EMT無作用，證明EMT之抑制或刺激係由於組成物中存在之脂肪酸或鹽。「HSA」係指根據實例3由裸白蛋白製備之白蛋白組成物。「ALB」係指根據實例1藉由耗盡辛酸鈉並用癸酸鈉替換所製備之白蛋白組成物。
亦測試游離C10-C14三酸甘油酯(具有飽和碳鏈)對HK-2細胞之膠原蛋白mRNA表現之作用。結果報導於表2中。
藉由比較表2中三癸酸甘油酯及具有70% C8鏈及30% C10鏈之三酸甘油酯混合物之結果，可注意到，70% C8鏈之存在減小膠原蛋白表現之抑制。
在上文所述之體外模型中，測試具有白蛋白及不具有白蛋白之組成物中100：0、95：5、70：30、50：50、30：70、5：95及0：100之癸酸鈉：辛酸鈉之比。藉由實例3中所述之方法製備脂肪酸鹽及白蛋白之各種組合。膠原蛋白1α1 mRNA表現報導於圖2中。即時PCR係使用人類TaqMan基因表現分析，其正規化至人類GAPDH內源性對照。參考係TGF-ß1對照(RQ=1)。*及**意謂相較於參考分別0.05及0.01之p值。辛酸鈉及癸酸鈉之混合物之測試濃度係500μM。實驗數係3(n=3)。
首先，圖2中所示之結果證實白蛋白對膠原蛋白表現無影響，且因此對EMT無影響。其次，可注意到，膠原蛋白之表現係劑量依賴於癸酸鈉對辛酸鈉之比例。再次，可注意到，當癸酸鈉以脂肪酸鹽總含量之30%或更大存在時，可觀察到膠原蛋白表現顯著減少。比率為100：0、95：5、70：30、50：50、30：70之癸酸鈉：辛酸鈉顯著減少或抑制膠原蛋白表現。此證實，比率為30：70之癸酸鈉：辛酸鈉係癸酸鈉之抑制作用完全抵消辛酸鈉之刺激作用的最小比率。此研究中以比率為5：95及0：100之癸酸鈉：辛酸鈉顯示辛酸鈉之刺激作用，其中觀察之膠原蛋白表現高於對照(TGF-β1處理之HK-2細胞)之水準。
實例5：TGF-β誘導之人類微血管內皮細胞(HMEC)之EMT調節
內皮-間葉轉變(EndoMT)(其包括在如本說明書中所用之表述EMT之定義中)可由轉化生長因子(TGF-β)誘導。進行EndoMT之分析，且分析之方法描述於實例4中。即時PCR係使用人類TaqMan基因表現分析，其正規化至人類GAPDH內源性對照。參考係TGF-ß1對照(RQ=1)。*、**及****意謂相較於參考分別0.05、0.01及0.0001之p值。辛酸鈉及癸酸鈉之測試濃度係500μM。實驗數係3(n=3)。
圖4顯示EndoMT經TGF-β誘導，且藉由膠原蛋白1a1 mRNA表現之增加來表述。圖4亦顯示癸酸鈉(在存在白蛋白(有HSA)或不存在白蛋白(無HSA)之情況下)顯著降低TGF-β所誘導之間葉轉變，與辛酸鈉相反。因此，本發明之抗EMT劑成功抑制或減小內皮細胞之EMT。
實例6：TGF-β誘導之人類肝細胞癌細胞(HepG2)之EMT調節
根據實例4中所述之方法，進行人類肝細胞癌瘤細胞株HepG2之EMT之分析。此等細胞經高度分化且顯示正常幹細胞之許多基因型特徵(Sassa等人1987)。因此，HepG2細胞可用於篩檢EMT，且如圖5中所繪示，TGF-β亦增加膠原蛋白1a1 mRNA(EMT之標記物)表現。即時PCR係使用人類TaqMan基因表現分析，其正規化至人類GAPDH內源性對照。參考係TGF-ß1對照(RQ=1)。*、**及****意謂相較於參考分別0.05、0.01及0.0001之p值。辛酸鈉及癸酸鈉之測試濃度係500μM。實驗數係3(n=3)。
圖5顯示癸酸鈉(在存在白蛋白(有HSA)或不存在白蛋白(無HSA)之情況下)顯著降低TGF-β所誘導之間葉轉變，與辛酸鈉相反。因此，本發明之抗EMT劑成功抑制或減小肝細胞之EMT。
實例7：TGF-β誘導之人類肺上皮細胞A549之EMT調節
亦藉由實例4中所述之方法進行人類肺上皮細胞A549之EMT之分析。TGF-β亦增加人類肺上皮細胞A549之膠原蛋白1a1 mRNA(EMT之標記物) 表現。即時PCR係使用人類TaqMan基因表現分析，其正規化至人類GAPDH內源性對照。參考係TGF-ß1對照(RQ=1)。***及****意謂相較於參考分別0.001及0.0001之p值。辛酸鈉及癸酸鈉之測試濃度係500μM。實驗數係3(n=3)。
圖6顯示癸酸鈉(在存在白蛋白(有HSA)或不存在白蛋白(無HSA)之情況下)顯著降低TGF-β所誘導之間葉轉變，與未提供顯著結果的辛酸鈉相反。因此，本發明之抗EMT劑成功抑制或減小肺細胞之EMT。
實例8：TGF-β誘導之人類前列腺癌PC-3之EMT調節
上皮-間葉轉變(EMT)係上皮細胞損失其細胞極性及細胞/細胞黏連並增加遷移及侵襲性性質以變成間葉幹細胞的過程；此等係可分化成多種細胞型的多能基質細胞。EMT係許多發育過程包括中胚層形成及神經管形成所必需的。EMT已顯示發生於傷口癒合、瘢痕形成過程及癌症進展中轉移之起始。
本實驗透過「刮痕分析(scratch assay)」中PC-3細胞之侵襲/遷移例示癌細胞之EMT分析。此分析係基於以下觀察，即在匯合細胞單層上建立新的人工間隙(所謂的『刮痕』)後，新建立之間隙之邊緣上的細胞將朝向接近刮痕之開口移動。EGF(上皮生長因子)用於誘導PC-3細胞向刮痕中之遷移/侵襲。簡言之，將培養插件放置於24孔細胞培養盤中。將PC-3細胞接種於細胞插件中並在CO2培育箱中在37℃下培育隔夜。然後再將細胞用無血清培養基饑餓24小時。將插件移除，留下可見的500μm無細胞間隙。將細胞在有HSA(圖7中之第二列)及無HSA(圖7中之第一列)之情況下用50ng/mL EGF及10μg/mL絲裂黴素C(Mito+EGF)並用促EMT劑辛酸鈉(Mito+EGF+辛酸鈉)或抗EMT劑癸酸鈉(Mito+EGF+癸酸鈉)處理24h。在治療後1h取得圖片作為各組之匯合對照。24h之後，將細胞用結晶紫染色固定並空氣乾燥，之後在處理後24h取得圖片。圖片報導於圖7中。
在圖7中可注意到，EGF促進用絲裂黴素處理之PC-3細胞之遷移或 侵襲。圖7顯示，將癸酸鈉(有及無白蛋白)添加至細胞培養物產生EGF誘導之PC-3遷移或侵襲之抑制，而辛酸鈉不抑制細胞遷移。此遷移當辛酸鈉與白蛋白組合時增加。
申請專利範圍之範疇不應限於實例中闡述之較佳實施例，而應對申請專利範圍之範疇給予與整篇說明書一致之最廣泛理解。

Claims (36)

  1. 一種白蛋白組成物之用途，其用於製備用於治療受試者之疾病或病狀之藥物，該受試者需要接受白蛋白之組成物以供治療該疾病或病狀，其中該白蛋白組成物抑制或減小上皮-間葉轉變(EMT)，且含有：-無促EMT劑或低濃度促EMT劑；及/或-一定含量促EMT劑及抗EMT劑，其中促EMT劑：抗EMT劑之比係7：3至0：10；其中：-該促EMT劑係辛酸、辛酸鹽或其組合；-該抗EMT劑係C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸鹽、C9-C14脂肪酸之單甘油酯、C9-C14脂肪酸之二酸甘油酯、C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯或其組合；且-促EMT劑之該低濃度係小於0.08毫莫耳每公克白蛋白；-限制條件為，當該促EMT劑及該抗EMT劑係脂肪酸時，其係單獨的脂肪酸或二酸甘油酯或三酸甘油酯之一部分。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中促EMT劑之該低濃度係0.04毫莫耳每公克白蛋白或更少。
  3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中促EMT劑之該低濃度係0.007%(w/w)或更少。
  4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中促EMT劑：抗EMT劑之比係5：5至0：10。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之用途，其中該抗EMT劑係C9-C12脂肪酸、C9-C12脂肪酸鹽、C9-C12脂肪酸之單甘油酯、C9-C12脂肪酸之二酸甘油酯、C9-C12脂肪酸之三酸甘油酯或其組合。
  6. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該抗EMT劑係C10-C12脂肪酸、C10-C12脂肪酸鹽、C10-C12脂肪酸之單甘油酯、C10-C12脂肪酸之二酸甘油酯、C10-C12脂肪酸之三酸甘油酯或其組合。
  7. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該抗EMT劑係C10脂肪酸、C10脂肪酸鹽或其組合。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之用途，其中該組成物係包含約1%至約40%(w/v)白蛋白之水性白蛋白製劑。
  9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之用途，其中該鹽係鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、銅鹽或其組合。
  10. 如申請專利範圍第9項之用途，其中該鹽係鈉鹽。
  11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之用途，其中該組成物進一步包含醫藥活性劑。
  12. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該活性劑係抗癌藥物，且該藥物係用於治療癌症。
  13. 如申請專利範圍第12項之用途，其中該抗癌藥物係紫杉烷。
  14. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該紫杉烷係紫杉醇或多西紫杉醇。
  15. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之用途，其中該白蛋白組成物係由醫師建議用於治療該疾病或病狀。
  16. 如申請專利範圍第1項至第11項及第15項中任一項之用途，其中該疾病或病狀係：出血、低血容積症、燒傷、急性肝衰竭、肝功能障礙、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫症候群、硬化、新生兒溶血病、心肺繞道手術、腎病、癌症、肝腎症候群、敗血症、器官灌注或器官再灌注。
  17. 一種組成物之用途，其用於製備用於抑制或減小受試者之上皮- 間葉轉變(EMT)之藥物，其中該組成物包含：-無促EMT劑或低濃度促EMT劑；及/或-一定含量促EMT劑及抗EMT劑，其中促EMT劑：抗EMT劑之比係7：3至0：10；其中：-該促EMT劑係辛酸、辛酸鹽或其組合；-該抗EMT劑係C9-C14脂肪酸、C9-C14脂肪酸鹽、C9-C14脂肪酸之單甘油酯、C9-C14脂肪酸之二酸甘油酯、C9-C14脂肪酸之三酸甘油酯或其組合；且-促EMT劑之該低濃度係小於0.02M；-限制條件為，當該促EMT劑及該抗EMT劑係脂肪酸時，其係單獨的脂肪酸或二酸甘油酯或三酸甘油酯之一部分。
  18. 如申請專利範圍第17項之用途，其中促EMT劑之該低濃度係0.01M或更少。
  19. 如申請專利範圍第17項之用途，其中促EMT劑之該低濃度係0.001M或更少。
  20. 如申請專利範圍第17項之用途，其中促EMT劑：抗EMT劑之比係5：5至0：10。
  21. 如申請專利範圍第20項之用途，其中促EMT劑：抗EMT劑之比係約0：10。
  22. 如申請專利範圍第17項至第21項中任一項之用途，其中該抗EMT劑係C9-C12脂肪酸、C9-C12脂肪酸鹽、C9-C12脂肪酸之單甘油酯、C9-C12脂肪酸之二酸甘油酯、C9-C12脂肪酸之三酸甘油酯或其組合。
  23. 如申請專利範圍第22項之用途，其中該抗EMT劑係C10-C12 脂肪酸、C10-C12脂肪酸鹽、C10-C12脂肪酸之單甘油酯、C10-C12脂肪酸之二酸甘油酯、C10-C12脂肪酸之三酸甘油酯或其組合。
  24. 如申請專利範圍第23項之用途，其中該抗EMT劑係C10脂肪酸、C10脂肪酸鹽、C10脂肪酸之單甘油酯、C10脂肪酸之二酸甘油酯、C10脂肪酸之三酸甘油酯或其組合。
  25. 如申請專利範圍第17項至第24項中任一項之用途，其中該鹽係鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽、銅鹽或其組合。
  26. 如申請專利範圍第25項之用途，其中該鹽係鈉鹽。
  27. 如申請專利範圍第17項至第26項中任一項之用途，其中該組成物進一步包含醫藥活性劑。
  28. 如申請專利範圍第27項之用途，其中該活性劑係抗癌藥物，且該藥物係用於治療癌症。
  29. 如申請專利範圍第28項之用途，其中該抗癌藥物係紫杉烷。
  30. 如申請專利範圍第29項之用途，其中該紫杉烷係紫杉醇或多西紫杉醇。
  31. 如申請專利範圍第17項至第27項中任一項之用途，其中該藥物係用於治療以下疾病或病狀：出血、低血容積症、燒傷、急性肝衰竭、肝功能障礙、低白蛋白血症、成人呼吸窘迫症候群、硬化、新生兒溶血病、心肺繞道手術、腎病、癌症、肝腎症候群、敗血症、器官灌注、器官再灌注、瘢痕形成、牛皮癬或濕疹。
  32. 如申請專利範圍第17項至第27項中任一項之用途，其中促EMT劑及抗EMT劑之總濃度係在5mg/kg至300mg/kg受試者每劑量之間以供經口或局部投與。
  33. 如申請專利範圍第32項之用途，其中該總濃度係在10mg/kg至 100mg/kg每劑量之間。
  34. 如申請專利範圍第17項至第27項中任一項之用途，其中該總濃度係在0.5mg/kg至100mg/kg該受試者之間每劑量以供靜脈內、腹膜內、經直腸、肌肉內或皮下投與。
  35. 如申請專利範圍第34項之用途，其中該總濃度係在0.5mg/kg至4mg/kg每劑量之間。
  36. 如申請專利範圍第17項至第27項、第32項及第33項中任一項之用途，其中該組成物係局部投與，且該藥物係用於治療燒傷、用於預防瘢痕形成或用於治療瘢痕、牛皮癬或濕疹。
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