CN101020715B - 鹿茸神经生长因子(deer ngf)提取及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及由鹿茸提取神经生长因子(DEER NGF)的方法，其包括对鹿茸浸提液进行一步阳离子交换层析和阶段梯度洗脱。另外，本发明还涉及由该方法制备的富含神经生长因子的鹿茸提取物以及该鹿茸提取物在药品、食品和保健品等方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于鹿茸提取物的医用或食用制品领域。更具体地来说，本发明涉及由鹿茸提取神经生长因子(DEER NGF)的方法以及由该方法制备的富含神经生长因子的鹿茸提取物。另外，本发明还涉及该鹿茸提取物在药品、食品和保健品等方面的应用。
背景技术
鹿茸(鹿尚未骨化的幼角)和鹿角作为传统的中药材，具有强筋健骨、补肾壮阳、疏通血脉等功效，自古以来就被广泛应用于配制成为各种滋补药品、食品、保健品和化妆品。通过现代药物化学研究分析，鹿茸中含有许多种生理活性成分，包括磷脂、生物胺类化合物、前列腺素、维生素、氨基酸、无机盐、不饱和脂肪酸、皮质醇等。随着现代生物技术高速发展，人们发现鹿茸中除了含有上述各种生理活性成分之外，其中还含有胰岛素样生长因子(IGF-1)、胰岛素、人生长激素(HGH)、促生长释放因子(GHRF-6)、神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维生长因子(FGF)等大分子活性蛋白质。以上各种活性成分，尤其是各种活性蛋白质，相互协同作用，发挥功效。其中，神经生长因子具有突出的药理作用。
神经生长因子对神经组织具有多种营养性生物效应，能够促进神经元生长、分化，修复神经损伤，因此可治疗多种神经疾病，如老年性痴呆症、帕金森氏症、神经末梢炎症等(参见中国专利CN1144693A、CN1304772A)。此外，神经生长因子还具有免疫调节、抑制某些肿瘤的有丝分裂、促进创口组织的修复反应等作用。
然而，在传统的鹿茸加工过程中，鹿茸直接粉碎后服用，颗粒较大，造成吸收效率低下；有时，鹿茸的加工需要经过加热煎煮、烘干等步骤，高温会使其中的NGF等蛋白质变性，从而降低乃至丧失它们的功效。另一种传统的加工方式是将鹿茸浸泡在高浓度酒精含量的酒中，制成药酒服用。但是由于酒中含有高浓度的作为有机溶剂的酒精，会使NGF等蛋白质变性，而且从大颗粒鹿茸中也不利于溶解出NGF等蛋白质，因而会导致鹿茸中的NGF利用效率低下，造成资源浪费。另外，高浓度酒精含量的药酒也限制了每次的服用量。
为了提高鹿茸材料的使用效率，人们尝试了各种方法提取鹿茸中富含神经生长因子的有效成分。例如，中国专利CN1133651C披露了一种从蛇毒中提取NGF的方法，预处理后，需要经过三步层析，生产工艺复杂而且条件较为苛刻；中国专利CN1104095A中公开了一种含有NGF的鹿茸生长因子制剂，预处理后，需要对鹿茸浸提液进行超滤、CM-32柱层析和Sephadaex G50柱层析，不但需要换层析柱，而且没有提供洗脱峰的图谱，收集到的所谓活性峰只有标号，需要重新摸索才能重复该方法。
针对现有技术中存在的缺陷，经过长期艰苦的研究摸索，本发明人获得了一种提取鹿茸神经生长因子的方法，该方法通过阶段梯度洗脱，预处理后，仅仅需要一步层析就可以获得高纯度的神经生长因子，大大简化了生产工艺的复杂程度，便于在大规模生产中控制质量，节约成本。
发明内容
本发明的发明目的在于提供提取鹿茸神经生长因子的方法以及由该方法制备的富含神经生长因子的鹿茸提取物，并提供了该鹿茸提取物在药品、食品、保健品和化妆品等方面的应用。
具体而言，在第一个方面，本发明提供了一种提取鹿茸神经生长因子的方法，其包括，对鹿茸浸提液进行一步阳离子交换层析和阶段梯度洗脱。其中，术语“一步”指的是在本发明的方法中，仅仅在同一种层析柱(即阳离子交换层析柱)上进行上样和洗脱，而不包括进行其他层析的步骤。本发明由于只进行一种层析，因此工艺较之现有技术更简单，节约了生产成本，适合在大规模生产中推广。阳离子交换层析是本领域普通技术人员所熟知的，优选那些已经商品化的。在本发明的一个具体实施方式中，阳离子交换层析优选为CM-Cellulose32柱层析。术语“阶段梯度洗脱”指的是分阶段洗脱，每阶段用含不同NaCl浓度和/或不同pH的缓冲液进行洗脱。缓冲液是本领域普通技术人员所熟知的，如常用于多肽、蛋白质溶解的缓冲液(参见《分子克隆试验指南》(科学出版社，2002年))。优选阳离子交换层析和阶段梯度洗脱包括，将鹿茸浸提液调节至pH3～5并使鹿茸浸提液中的NaCl浓度达到0.3～0.5mol/L，然后上样于阳离子交换层析柱，再依次用含0.7～0.85mol/L NaCl的pH3～5的缓冲液、含0.7～0.85mol/L NaCl的pH6～8的缓冲液和含0.9～1.1mol/L NaCl的pH6～8的缓冲液进行洗脱，收集含鹿茸神经生长因子的峰。目前已经有成熟的方法来检测神经生长因子，优选用本发明实施例中的活性检测方法来确定含鹿茸神经生长因子的峰并收集。优选可以包括进一步浓缩的步骤。
本文中，鹿茸浸提液指的是用水或缓冲液对鹿茸进行浸渍而得的提取液，其中含有鹿茸中的水溶性成分，包括神经生长因子。本发明优选选用新鲜鹿茸或冷藏的新鲜鹿茸作为原材料，这样有利于最大限度地保存NGF的含量和活性。本文中所用的术语“新鲜”指的是采集鹿茸后6小时内就开始进行加工制备本发明的纳米化制品或进行冷藏了，优选加工或冷藏不迟于采集后的3小时，更优选不迟于1小时，最优选不迟于20分钟。本文中所用的术语“冷藏”指的是将鹿茸保存于0℃以下的环境中，优选保存于-20℃的环境中。优选浸提鹿茸前先将鹿茸粉碎(如，切片、研磨、匀浆和/或超声波破碎)，这样有利于提高浸提出有效成份的效率。通过离心和/或过滤等方式，可以收集鹿茸浸提液，去除不溶物质。
优选本发明第一个方面的方法，其依次包括如下步骤：
(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；
(2)将鹿茸浸提液调节至pH4并使鹿茸浸提液中的NaCl浓度达到0.4mol/L，然后上样于CM-Cellulose32柱，再依次用含0.8mol/L NaCl的pH4的缓冲液、含0.8mol/L NaCl的pH7的缓冲液和含1mol/L NaCl的pH7的缓冲液进行洗脱，收集含鹿茸神经生长因子的峰。
在第二个方面，本发明提供了一种具有神经生长因子活性的鹿茸提取物的制备方法，其包括，对鹿茸浸提液进行一步阳离子交换层析和阶段梯度洗脱。其中，术语“一步”指的是在本发明的方法中，仅仅在同一种层析柱(即阳离子交换层析柱)上进行上样和洗脱，而不包括进行其他层析的步骤。本发明由于只进行一种层析，因此工艺较之现有技术更简单，节约了生产成本，适合在大规模生产中推广。阳离子交换层析是本领域普通技术人员所熟知的，优选那些已经商品化的。在本发明的一个具体实施方式中，阳离子交换层析优选为CM-Cellulose32柱层析。术语“阶段梯度洗脱”指的是分阶段洗脱，每阶段用含不同NaCl浓度和/或不同pH的缓冲液进行洗脱。缓冲液是本领域普通技术人员所熟知的，如常用于多肽、蛋白质溶解的缓冲液(参见《分子克隆试验指南》(科学出版社，2002年))。优选阳离子交换层析和阶段梯度洗脱包括，将鹿茸浸提液调节至pH3～5并使鹿茸浸提液中的NaCl浓度达到0.3～0.5mol/L，然后上样于阳离子交换层析柱，再依次用含0.7～0.85mol/L NaCl的pH3～5的缓冲液、含0.7～0.85mol/L NaCl的pH6～8的缓冲液和含0.9～1.1mol/L NaCl的pH6～8的缓冲液进行洗脱，收集含鹿茸神经生长因子的峰。目前已经有成熟的方法来检测神经生长因子，优选用本发明实施例中的活性检测方法来确定含鹿茸神经生长因子的峰并收集。优选可以包括进一步浓缩的步骤。更优选本发明第一个方面的方法，其依次包括如下步骤：
(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；
(2)将鹿茸浸提液调节至pH4并使鹿茸浸提液中的NaCl浓度达到0.4mol/L，然后上样于CM-Cellulose32柱，再依次用含0.8mol/L NaCl的pH4的缓冲液、含0.8mol/L NaCl的pH7的缓冲液和含1mol/L NaCl的pH7的缓冲液进行洗脱，收集含鹿茸神经生长因子的峰。
在第三个方面，本发明提供了本发明第一个方面的方法提取的鹿茸神经生长因子。该NGF对神经组织具有多种营养性生物效应，能够促进神经元生长、分化，修复神经损伤。在本发明的具体实施方式中，该NGF能促使神经节长出长而密的突起，活性达到1.5×104BU/mL。
在第四个方面，本发明提供了本发明第二个方面的方法制备的具有神经生长因子活性的鹿茸提取物。该鹿茸提取物具有神经生长因子活性，能够促进神经元生长、分化，修复神经损伤。在本发明的具体实施方式中，该鹿茸提取物能促使神经节长出长而密的突起，活性达到1.5×104BU/mL。
在第五个方面，本发明提供了含有本发明第四个方面的鹿茸提取物的制剂。鹿茸提取物可以和药学上可接受的辅剂组合从而加工各种制剂。药学上可接受的辅剂包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等，它们与活性成分相容。运用药学上可接受的辅剂制备制剂对本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的制剂优选为单位剂量形式，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂等剂型，从而适合各种给药形式，例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等的给药形式。在本发明的具体实施方式中，制剂优选为鹿茸神经生长因子冻干剂，其由本发明第四个方面的鹿茸提取物冷冻干燥而得。
在第六个方面，本发明提供了本发明第三个方面的鹿茸神经生长因子、本发明第四个方面的鹿茸提取物或本发明第五个方面的制剂在制备用于促进神经元生长或分化的药品、食品和/或保健品中的应用。在第七个方面，本发明提供了本发明第三个方面的鹿茸神经生长因子、本发明第四个方面的鹿茸提取物或本发明第五个方面的制剂在制备用于修复神经损伤的药品、食品和/或保健品中的应用。由于NGF能够促进神经元生长、分化，修复神经损伤，因此可治疗多种神经疾病或改善这些疾病的症状，如老年性痴呆症、帕金森氏症、神经末梢炎症等。
对于药品来说，可以对需要促进神经元生长或分化和/或需要修复神经损伤的患者进行给药。给药的剂量和形式一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、病情、患病时间、身体状况等)确定。一般而言，NGF计，给药的剂量为0.001～100mg/kg患者体重，优选为0.01～1mg/kg，优选为0.02～0.1mg/kg。给药形式可以根据各种药物制剂的剂型来确定，适合的给药形式有口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等给药形式，优选使用口喷剂或胶囊剂口服给药。
对于食品和/或保健品来说，由于是天然制品，而且鹿茸本身有着悠久的使用历史，健康人服用一定量的本发明的NFG、提取物或制品有助于维持其正常的神经元生长、分化，具有健脑的功效。本发明的NFG、提取物或制品可以单独作为食品和/或保健品使用，也可以添加到其他食品和/或保健品中使用，例如，可以添加到常规的饮料、食品和/或保健品中配合应用。
本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
附图说明
图1显示了NGF离子交换层析图谱，其中箭头所指的峰为鹿茸神经生长因子所在的峰。
图2显示了NGF的SDS-PAGE图谱，其中左边的条带为鹿茸神经生长因子，而右边的条带为分子量标记。
具体实施方式
实施例1，鹿茸的预处理
取新鲜鹿茸0.5kg，用冷冻切片机将鹿茸切成厚度为1～2mm的切片，然后加入适量(200mL)预冷的去离子水在4℃用匀浆机进行粉碎，匀浆操作进行至匀浆中没有可见的组织块时结束。对匀浆物以5000转/分钟(rpm)离心20分钟，取上清液。在沉淀中加入200mL预冷的去离子水，重悬沉淀后再次以5000rpm离心20分钟，取上清液。然后，重复上述重悬、离心过程一次，取上清液。合并各次离心分离所得的上清液，装入截留分子量10000Da的透析袋(购自Sigma公司)，于4℃对0.02mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)透析30分钟，然后换磷酸钾缓冲液重复透析，共进行6次，得到经预处理后的鹿茸浸提液850mL。
实施例2，鹿茸神经生长因子的层析纯化及冻干剂的制备
向850mL实施例1中得到的鹿茸浸提液中加入95mL 0.5mol/L HAc-NaAc缓冲液(pH4.0)，使得溶液的pH值降至4.0，然后再向其中加入固体NaCl，使溶液中的NaCl终浓度为0.4mol/L，充分混匀后静置10分钟，然后，5000rpm离心5分钟。取900mL上清液上样于CM-Cellulose32柱(5.5cm×10cm)(购自Pharmacia公司)，然后进行阶段梯度洗脱。阶段梯度洗脱时依次以10mL/分钟的流速使用400mL含0.8mol/L NaCl的0.5mol/L HAc-NaAc缓冲液(pH4.0)、350mL含0.8mol/L NaCl的0.5mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)和500mL含1mol/L NaCl的0.5mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)进行洗脱并用紫外检测仪在280nm波长处进行检测(洗脱图谱如图1所示)。通过如实施例3所述的检测方法检测各个洗脱级分经透析得到的产物，发现如图1中“目的蛋白峰”所指的峰为鹿茸神经生长因子。因此，收集该目的蛋白峰，装入截留分子量3500Da的透析袋，于4℃对0.02mol/L磷酸钾缓冲液(pH6.8)透析30分钟，然后换磷酸钾缓冲液重复透析，共进行6次。由此得到纯化的鹿茸神经生长因子溶液180mL。将溶液装入透析袋，用聚乙二醇20000进行浓缩。然后将浓缩液冷冻，然后在-70摄氏度下用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到鹿茸神经生长因子冻干剂172mg。
实施例3，神经生长因子的检测
根据《分子克隆试验指南》(科学出版社，2002年)和翟雷等的测试方法(微生物学免疫学进展，1999，27(1)：43-46)检测鹿茸神经生长因子。将实施例2得到的鹿茸神经生长因子溶液进行SDS-PAGE(15％聚丙烯酰胺分离胶、4％积层胶、10mA恒流电泳)，电泳结束后以考马斯亮兰染色，电泳凝胶照片如图2所示，在分子量约14kD处有神经生长因子单一条带，通过图像分析得其纯度达到96％。用鸡胚背根神经节的生长来检测NGF的生物活性：在加入缓冲液的空白对照组中，鸡胚背根神经节没有突起生长；而在加入实施例2纯化后得到的鹿茸神经生长因子溶液的实验组中，鸡胚背根神经节长出长而密的突起，活性为1.5×104BU/mL，比活为1.57×104BU/mg(参比品为鼠源NGF，购自Sigma公司)。
Claims (7)
1.提取鹿茸神经生长因子的方法，其依次包括如下步骤：
(1)用冷冻切片机将新鲜鹿茸0.5kg切成厚度为1～2mm的切片，然后加入200mL预冷的去离子水在4℃用匀浆机粉碎直至匀浆中没有可见的组织块，再以5000rpm离心20分钟，取上清液；在沉淀中加入200mL预冷的去离子水，重悬沉淀后再次以5000rpm离心20分钟，取上清液；重复上述重悬、离心过程一次，取上清液；合并各次离心分离所得的上清液，装入购自Sigma公司的截留分子量10000Da的透析袋，于4℃用0.02mol/L pH6.8的磷酸钾缓冲液透析30分钟，然后换磷酸钾缓冲液重复透析，共进行6次，得到经预处理后的鹿茸浸提液850mL；
(2)对鹿茸浸提液进行一步阳离子交换层析和阶段梯度洗脱，其包括，在850mL步骤(1)中得到的鹿茸浸提液中加入95mL 0.5mol/L HAc-NaAc的pH4.0的缓冲液，使得溶液的pH值降至4.0，并向其中加入固体NaCl，使其中的NaCl终浓度为0.4mol/L，充分混匀后静置10分钟，再以5000rpm离心5分钟，然后取900mL上清液上样于购自Pharmacia公司的5.5cm×10cm的CM-Cellulose32柱；再依次以10mL/分钟的流速用400mL含0.8mol/L NaCl的0.5mol/L HAc-NaAc的pH4.0的缓冲液、350mL含0.8mol/L NaCl的0.5mol/L pH7.0的磷酸钾缓冲液和500mL含1mol/L NaCl的0.5mol/L pH7.0的磷酸钾缓冲液进行阶段梯度洗脱并用紫外检测仪在280nm波长处进行检测；收集含鹿茸神经生长因子的蛋白峰，装入截留分子量3500Da的透析袋，于4℃用0.02mol/L pH6.8的磷酸钾缓冲液透析30分钟，然后换磷酸钾缓冲液重复透析，共进行6次，得到纯化的鹿茸神经生长因子溶液180mL，再将溶液装入透析袋，用聚乙二醇20000进行浓缩。
2.具有神经生长因子活性的鹿茸提取物的制备方法，其包括，对鹿茸浸提液进行一步阳离子交换层析和阶段梯度洗脱，其中所述阳离子交换层析为CM-Cellulose32柱层析，而且其中所述阳离子交换层析和阶段梯度洗脱包括，将鹿茸浸提液调节至pH3～5并使鹿茸浸提液中的NaCl浓度达到0.3～0.5mol/L，然后上样于阳离子交换层析柱，再依次用含0.7～0.85mol/L NaCl的pH3～5的缓冲液、含0.7～0.85mol/L NaCl的pH6～8的缓冲液和含0.9～1.1mol/L NaCl的pH6～8的缓冲液进行洗脱，收集含鹿茸神经生长因子的峰。
3.根据权利要求2的方法，其依次包括如下步骤：
(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；
(2)将鹿茸浸提液调节至pH4并使鹿茸浸提液中的NaCl浓度达到0.4mol/L，然后上样于CM-Cellulose32柱，再依次用含0.8mol/L NaCl的pH4的缓冲液、含0.8mol/L NaCl的pH7的缓冲液和含1mol/L NaCl的pH7的缓冲液进行洗脱，收集含鹿茸神经生长因子的峰。
4.权利要求1-3之任一的方法制备的具有神经生长因子活性的鹿茸提取物。
5.鹿茸神经生长因子冻干剂，其由权利要求4所述的鹿茸提取物冷冻干燥而得。
6.权利要求4所述的鹿茸提取物或权利要求5所述的鹿茸神经生长因子冻干剂在制备用于促进神经元生长或分化的药品、食品和/或保健品中的应用。
7.权利要求4所述的鹿茸提取物或权利要求5所述的鹿茸神经生长因子冻干剂在制备用于修复神经损伤的药品、食品和/或保健品中的应用。
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