CN101081865B

CN101081865B - 鹿茸促生长释放因子(deer ghrf)提取及其制备方法

Info

Publication number: CN101081865B
Application number: CN2007100686590A
Authority: CN
Inventors: 朱成钢; 王利忠
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-05-16
Filing date: 2007-05-16
Publication date: 2010-09-01
Anticipated expiration: 2027-05-16
Also published as: CN101081865A

Abstract

本发明涉及由鹿茸提取促生长释放因子(GHRF)的方法，其依次包括以下步骤：(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；(2)超滤鹿茸浸提液并收集分子量介于1k～10kDa之间的鹿茸提取物；并(3)将上述鹿茸提取物进行分子排阻高效液相层析，收集含鹿茸生长激素释放激素的峰。另外，本发明还涉及由该方法制备的富含生长激素释放激素的鹿茸提取物以及该鹿茸提取物在药品、食品、化妆品和饲料等方面的应用。

Description

鹿茸促生长释放因子(DEER GHRF)提取及其制备方法

技术领域

本发明属于鹿茸提取物的医用或食用制品领域。更具体地来说，本发明涉及由鹿茸提取生长激素释放激素(GHRH)的方法以及富含生长激素释放激素的鹿茸提取物。另外，本发明还涉及该鹿茸提取物在药品、食品、化妆品和饲料等方面的应用。

背景技术

鹿茸(鹿尚未骨化的幼角)和鹿角作为传统的中药材，具有强筋健骨、补肾壮阳、疏通血脉等功效，自古以来就被广泛应用于配制成为各种滋补药品、食品、保健品和化妆品。通过现代药物化学研究分析，鹿茸中含有许多种生理活性成分，包括磷脂、生物胺类化合物、前列腺素、维生素、氨基酸、无机盐、不保护脂肪酸、皮质醇等。随着现代生物技术高速发展，人们发现鹿茸中除了含有上述各种生理活性成分之外，其中还含有胰岛素样生长因子(IGF-1)、胰岛素、人生长激素(HGH)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、生长激素释放激素(GHRH)、成纤维生长因子(FGF)等大分子活性蛋白质。以上各种活性成分，尤其是各种活性蛋白质，相互协同作用，发挥功效。其中，生长激素释放激素具有突出的药理作用。

生长激素释放激素(GHRH)又称为促生长释放因子(或生长激素释放因子，GHRF)或生长激素调节激素，其能够正向调控生长激素(GH)的作用，促进垂体合成、分泌GH，从而通过GH提高体内IGF-1水平来促进细胞分裂。因此，GHRH已经被应用于治疗由于生长不充分而引起的疾病，如肌肉萎缩、慢性肾功能不全、特纳综合症等(参见中国专利CN1635898A、CN1432577A等)。另外，由于GHRH能够促进动物生长，因而已经广泛用作食品或饲料添加剂。

然而，在传统的鹿茸加工过程中，鹿茸直接粉碎后服用，颗粒较大，造成吸收效率低下；有时，鹿茸的加工需要经过加热煎煮、烘干等步骤，高温会使其中的GHRH等蛋白质变性，从而降低乃至丧失它们的功效。另一种传统的加工方式是将鹿茸浸泡在高浓度酒精含量的酒中，制成药酒服用。但是由于酒中含有高浓度的作为有机溶剂的酒精，会使GHRH等蛋白质变性，而且从大颗粒鹿茸中也不利于溶解出GHRH等蛋白质，因而会导致鹿茸中的GHRH利用效率低下，造成资源浪费。另外，高浓度酒精含量的药酒也限制了每次的服用量。目前，我们还没有发现有从鹿茸中提取生长激素释放激素的报道。

针对现有技术中存在的缺陷，为了提高鹿茸材料的使用效率，经过长期艰苦的研究摸索，本发明人获得了一种提取鹿茸生长激素释放激素的方法以及富含生长激素释放激素的鹿茸提取物。这些产品的制备采用天然中药原料，没有引入有害化学试剂，安全性佳，易于为消费者所接受。

发明内容

本发明的发明目的在于提供提取鹿茸生长激素释放激素(DEER GHRF)的方法以及富含生长激素释放激素的鹿茸提取物，并提供了该鹿茸提取物在药品、食品、化妆品和饲料等方面的应用。

具体而言，在第一个方面，本发明提供了一种提取鹿茸生长激素释放激素的方法，其依次包括以下步骤：

(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；

(2)超滤鹿茸浸提液并收集分子量介于1k～10kDa之间的鹿茸提取物；并

(3)将上述鹿茸提取物进行分子排阻高效液相层析，收集含鹿茸生长激素释放激素的洗脱峰。在本文中，术语“鹿茸生长激素释放激素”指的是来自鹿茸的具有生长激素释放激素活性的蛋白质。通过本领域普通技术人员熟悉的实验手段(如，本文实施例中提到的实验方法)就可以判断提取自鹿茸的蛋白质是否具有生长激素释放激素活性，并检测出该蛋白质的纯度，如分析层析洗脱的图谱。优选本发明的鹿茸生长激素释放激素纯度大于90％，更优选大于95％。

本文中，鹿茸浸提液指的是用水或缓冲液对鹿茸进行浸渍而得的提取液，其中含有鹿茸中的水溶性成分，包括生长激素释放激素。本发明优选选用新鲜鹿茸或冷藏的新鲜鹿茸作为原材料，这样有利于最大限度地保存GHRH的含量和活性。本文中所用的术语“新鲜”指的是采集鹿茸后6小时内就开始进行加工制备本发明的纳米化制品或进行冷藏了，优选加工或冷藏不迟于采集后的3小时，更优选不迟于1小时，最优选不迟于20分钟。本文中所用的术语“冷藏”指的是将鹿茸保存于0℃以下的环境中，优选保存于-20℃的环境中。优选浸提鹿茸前先将鹿茸粉碎(如，切片、研磨、匀浆和/或超声波破碎)，这样有利于提高浸提出有效成份的效率。通过离心和/或过滤等方式，可以收集鹿茸浸提液，去除不溶物质。

步骤(2)中，将鹿茸浸提液进行超滤并收集分子量介于1k～10kDa之间的鹿茸提取物，优选提取分子量为2k～8kDa之间的鹿茸提取物。其中，术语“鹿茸提取物”本身指的是提取自鹿茸的含有GHRH的水溶性成分。在一个具体实施方式，本发明对鹿茸浸提液的超滤是通过选用截留1kDa和10kDa的超滤膜进行2次超滤，收集截留相应分子量的成分并收集，并优选更进一步对收集到的成分进行浓缩和冷冻干燥，由此得到鹿茸提取物。浓缩和冷冻干燥是本领域技术人员所常用的手段，如可以使用聚乙二醇20000进行浓缩，然后用冷冻干燥机将浓缩液以-30℃～-50℃的干燥机工作温度来进行干燥，通常干燥后产品的含水量为3％～10％。

分子排阻高效液相层析是本领域普通技术人员所熟知的，优选那些已经商品化的。目前已经有成熟的方法来检测生长激素释放激素，优选用本发明实施例中的活性检测方法来确定含鹿茸生长激素释放激素的峰并收集。在进行分子排阻高效液相层析时，可以使用含不同NaCl浓度(优选为0.1～0.3mol/L的NaCl)和/或不同pH(优选为pH6～8)的缓冲液进行洗脱，收集含鹿茸生长激素释放激素的峰。在本发明的一个具体实施方式中，分子排阻高效液相层析优选为TSK2000SW柱层析。更具体而言，TSK2000SW柱层析使用含0.2mol/L NaCl的pH6.8的缓冲液平衡和洗脱。其中，缓冲液是本领域普通技术人员所熟知的，如常用于多肽、蛋白质溶解的缓冲液(参见《分子克隆试验指南》(科学出版社，2002年))，优选磷酸钠或磷酸钾缓冲液。

在第二个方面，本发明提供了一种鹿茸提取物的制备方法，其依次包括以下步骤：

(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；并

(2)超滤鹿茸浸提液并收集分子量介于1k～10kDa之间的鹿茸提取物。其中，术语“鹿茸提取物”本身指的是提取自鹿茸的含有GHRH的水溶性成分。通过本领域普通技术人员熟悉的实验手段(如，本文实施例中提到的实验方法)就可以判断鹿茸提取物是否具有生长激素释放激素活性，并检测出该蛋白质的纯度。本发明第二个方面方法的步骤(1)和(2)分别如本发明第一个方面所述，可以看作本发明第一个方面方法的一部分。优选本发明第二个方面方法在步骤(1)和(2)完成后，还进一步包括以下步骤：将所述鹿茸提取物进行分子排阻高效液相层析，收集富含鹿茸生长激素释放激素的鹿茸提取物。这样得到的鹿茸提取物是富含鹿茸生长激素释放激素的鹿茸提取物。其中，所述富含鹿茸生长激素释放激素的鹿茸提取物中的生长激素释放激素的蛋白质纯度大于90％，优选大于95％。本领域普通技术人员通过诸如分析层析洗脱的图谱，能够很容易地测定出蛋白质浓度，优选分析TSK2000SW柱层析洗脱的图谱。

在第三个方面，本发明提供了本发明第二个方面的方法制备的含有生长激素释放激素的鹿茸提取物。该鹿茸提取物除了生长激素释放激素之外，还具有来源于鹿茸的其他成分。本发明优选该鹿茸提取物中鹿茸生长激素释放激素的蛋白质纯度大于90％，更优选大于95％。该鹿茸提取物具有生长激素释放激素活性，能够促进垂体合成、分泌GH，从而通过GH提高体内IGF-1水平来促进细胞分裂。因此，GHRH已经被应用于治疗由于生长不充分而引起的疾病，并促进生长，在本发明的具体实施方式中，其活性达到了GHRH标准品的96％。

在第四个方面，本发明提供了含有本发明第三个方面的鹿茸提取物的制剂。鹿茸提取物可以和药学上可接受的辅剂组合从而加工各种制剂。药学上可接受的辅剂包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等，它们与活性成分相容。运用药学上可接受的辅剂制备制剂对本领域普通技术人员来说是公知的。本发明的制剂优选为单位剂量形式，如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释放形式)、粉剂、混悬剂、颗粒剂、酊剂、糖浆剂、乳液剂、悬浮液、针剂等剂型，从而适合各种给药形式，例如口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等的给药形式。在本发明的具体实施方式中，制剂优选为鹿茸生长激素释放激素冻干剂，其由本发明第三个方面的鹿茸提取物冷冻干燥而得。

在第五个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述方法提取的鹿茸生长激素释放激素、本发明第三个方面的鹿茸提取物或本发明第四个方面的制剂在制备用于刺激细胞增殖和/或促进生长的药品、食品和/或饲料中的应用。由于GHRH能够促进垂体合成、分泌GH，从而通过GH提高体内IGF-1水平来促进细胞分裂，因此可治疗由于生长不充分而引起的疾病或改善这些疾病的症状，，如肌肉萎缩、慢性肾功能不全、特纳综合症等。

对于药品来说，可以对需要促进刺激细胞增殖和/或促进生长的患者进行给药。给药的剂量和形式一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、病情、患病时间、身体状况等)确定。一般而言，GHRH计，给药的剂量为0.001～100mg/kg患者体重，优选为0.01～1mg/kg，优选为0.02～0.1mg/kg。给药形式可以根据各种药物制剂的剂型来确定，适合的给药形式有口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等给药形式，优选使用口喷剂或胶囊剂口服给药。

对于食品或饲料来说，由于是天然制品，而且鹿茸本身有着悠久的使用历史，健康人或动物服用一定量的本发明的GHRH、提取物或制品有助于维持其正常的细胞增殖的功效，促进生长。本发明的GHRH、提取物或制品可以单独作为食品或饲料使用，但是优选添加到其他常规食品或饲料中使用，例如，可以添加到常规的饮料、食品和/或饲料中配合应用。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

附图说明

图1显示了粗GHRH的TSK2000SW柱层析图谱。

图2显示了纯化后GHRH的TSK2000SW柱层析图谱。

具体实施方式

实施例1，鹿茸的预处理

取新鲜鹿茸0.5kg，用冷冻切片机将鹿茸切成厚度为1～2mm的切片，然后加入适量(200mL)预冷的去离子水在4℃用匀浆机进行粉碎，匀浆操作进行至匀浆中没有可见的组织块时结束。对得到的产物以5000转/分钟(rpm)离心20分钟，取上清液。在离心沉淀中加入200mL预冷的去离子水，重悬沉淀后再次以5000rpm离心20分钟，取上清液。然后，重复上述重悬、离心过程一次，取上清液。合并各次离心分离所得的上清液，得到经预处理后的鹿茸浸提液580mL。

实施例2，鹿茸生长激素释放激素的层析纯化和其冻干剂的制备

取580mL实施例1中得到的鹿茸浸提液进行2次超滤。首次超滤用截留分子量为10kDa的超滤膜(购自Millopore，Ultrapore)，保留滤出液。然后将滤出液用截留分子量为1kDa(购自Millopore，Ultrapore)的超滤膜进行超滤，弃去滤出液。用200mL预冷的去离子水溶出超滤膜截留的物质，保留溶出液待用。然后将该超滤膜再用200mL预冷的去离子水溶出，弃去超滤膜，合并所得的两次溶出液，装入透析袋，用聚乙二醇20000进行浓缩。使用冷冻干燥机将洗脱液在-30～-50℃冷冻干燥，得干燥后的粗产品210毫克，其中该粗产品的含水量不超过8％。将粗产品，溶于含0.2mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.8)中，配成含粗产品7毫克/毫升的溶液。分6次上样于用含0.2mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.8)平衡好的TSK2000SW柱(购自TOSOH公司)，并以流速0.6ml/分钟用含0.2mol/L NaCl的0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.8)洗脱，并用紫外检测仪在280nm波长处进行检测，洗脱图谱如图1所示。通过如实施例3所述的检测方法检测各个洗脱级分的产物，发现在10～15分钟收集到的峰为鹿茸生长激素释放激素。因此，收集该目的蛋白峰，即为鹿茸生长激素释放激素，使用冷冻干燥机在-30～-50℃冷冻干燥，得到冻干剂165mg。将冻干剂以上述方法重新溶解并进行TSK2000SW柱层析，图谱如图2所示，通过面积归一法计算得到GHRH的纯度达到96.5％。

实施例3，生长激素释放激素的检测

根据《分子克隆试验指南》(科学出版社，2002年)和Velicelebi G等的GHRH活性检测法(Proc Natl Acad Sci U S A.1986，83(15)：5397-5399)检测鹿茸生长激素释放激素。用原代培养的小鼠垂体前叶细胞分泌生长因子的能力来检测GHRH的生物活性，通过与GHRH标准品(购自Bachem公司)比较，在加入实施例2得到的鹿茸生长激素释放激素溶液的实验组中，其对原代培养的小鼠垂体前叶细胞分泌生长因子能力具有较好的促进作用，达到了GHRH标准品活性的96％。

Claims

1.提取鹿茸生长激素释放激素(DEER GHRF)的方法，其依次包括以下步骤：

(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；

(3)将上述鹿茸提取物进行分子排阻高效液相层析，收集含鹿茸生长激素释放激素的洗脱峰；所述分子排阻高效液相层析为TSK2000SW柱层析。

2.根据权利要求1的方法，其中提取的鹿茸生长激素释放激素纯度大于90％。

3.根据权利要求2的方法，其中提取的鹿茸生长激素释放激素纯度大于95％。

4.鹿茸提取物的制备方法，其依次包括以下步骤：

(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；

(3)将所述鹿茸提取物进行分子排阻高效液相层析，收集富含鹿茸生长激素释放激素的鹿茸提取物；所述分子排阻高效液相层析为TSK2000SW柱层析。

5.根据权利要求4的方法，其中所述富含鹿茸生长激素释放激素的鹿茸提取物中的生长激素释放激素的蛋白质纯度大于90％。

6.根据权利要求5的方法，其中所述富含鹿茸生长激素释放激素的鹿茸提取物中的生长激素释放激素的蛋白质纯度大于95％。

7.权利要求4-6之任一的方法制备的含有生长激素释放激素的鹿茸提取物。

8.根据权利要求7的鹿茸提取物，其中生长激素释放激素的蛋白质纯度大于90％。

9.根据权利要求8的鹿茸提取物，其中生长激素释放激素的蛋白质纯度大于95％。

10.鹿茸生长激素释放激素冻干剂，其由权利要求7、8或9所述的鹿茸提取物冷冻干燥而得。

11.权利要求7、8或9所述的鹿茸提取物或权利要求10所述的鹿茸生长激素释放激素冻干剂在制备用于刺激细胞增殖和/或促进生长的药品、食品和/或饲料中的应用。