CN104436168B - 一种促进细胞再生的组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进细胞再生的组合物及其制备方法和用途。本发明的一种促进细胞再生的组合物是通过以下方法制备得到的：首先于体外培养人体骨髓间叶干细胞，在无血清的DMEM末代培养液中添加人类干细胞生长因子、白血球生长因子及蚬萃取物，使得人体骨髓间叶干细胞可分泌多种人类生长因子以形成人类生长因子组合物，最后再以油包水‑水包油（Water–in‑Oil‑in‑Water，W/O/W）的微脂体包埋技术包埋，即得。经包埋而成的组合物可经由表皮涂抹方式，促进表皮组织伤口愈合再生、减少疤痕产生，并可活化毛囊黑色素细胞及刺激毛囊细胞再生。此外亦可经由口服方式，促进脑部受损黑质细胞再生修护与海马回区神经细胞新生，以及刺激骨髓造血干细胞增生。

Description

一种促进细胞再生的组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种促进细胞再生的组合物及其制备方法和用途。具体而言，本发明涉及一种含有人类生长因子及利用微脂体包埋技术包埋的促进细胞再生的组合物及其制备方法。

背景技术

皮肤不但具有调节人体的体温、水分等功能，也是人体免疫系统的第一道防线，一旦失去表皮的保护就极容易遭受外来病原感染。而经历烧伤、溃疡、发炎、放射线治疗、手术以及糖尿病的患者，长时间处于皮肤缺损及异常的情形下，容易造成感染而对身体产生莫大的伤害。而人体内部组织器官因老化、疾病所造成的凋亡、功能衰竭等，尤其是脑部退化性疾病或急性损伤造成的脑部伤害，影响人类的健康甚巨，因此组织细胞伤口愈合及再生修护机制是一项重要的医学研究领域。

目前用于治疗伤口及促进愈合的药物多为杀菌剂、抗生素、皮质类固醇激素等，对于伤口愈合皆各有其缺点，且伤口愈合率差。因而发展出人工皮肤或其它皮肤替代物、细胞治疗等方法。相关研究指出，在皮肤的伤口愈合过程中，有多种生长因子扮演了重要的角色。皮肤受伤后，血小板会释放出其中所含的多种生长因子及细胞激素，包括表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、碱性纤维母细胞生长因子（basic fibroblast growthfactor，bFGF）、血小板衍化生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、人类胰岛素生长因子（insulin-like growth factor，IGF-1）、血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）、转化生长因子α（transforming growth factor-α，TGF-α）、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、介白素（interleukin，IL）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、激活素（activin）、肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor，TNF-α）等。这些生长因子可吸引嗜中性白血球（neutrophil）和巨噬细胞（macrophage）朝向伤口处聚集，以清除受伤组织、细胞并吞噬感染物，亦可活化附近的纤维母细胞及角质细胞以及诱导周围血管进行血管新生作用。

另一方面，伤口部位的纤维母细胞会在某些生长因子，特别是PDGF及TGF-β的影响下，转型为肌纤维母细胞。这些肌纤维母细胞会大量表达α肌动蛋白（α-actin）以利收缩伤口，并合成胶原蛋白纤维。这些沉积于伤口处的胶原蛋白纤维的排列方式受到肌纤维母细胞收缩的影响而与原本正常组织的胶原蛋白纤维列方式不同，因而形成疤痕组织。在受伤后第四星期开始一直到约六个月间，疤痕组织中的胶原蛋白会重新排列，而使得疤痕组织的外形及机能接近原先的正常组织。近来有研究指出，TGF-β于伤口愈合的调节上，不仅对巨噬细胞与纤维细胞有趋化性，并可刺激第Ⅰ型及第Ⅱ型胶原蛋白的mRNA的转录作用，以促进伤口中胶原蛋白的聚积，以提高伤口的愈合率。故TGF-β经证实可产生无疤的上皮再生作用，并加速愈合因放射线照射所形成的皮肤伤口。研究指出，在哺乳动物的胚胎时期可分泌大量TGF-β，然而，成体哺乳动物的表皮于受伤时，所分泌的TGF-β的含量却非常少，是以出生后的伤口，易有肌纤维细胞收缩而造成的疤痕。

由于生长因子对于伤口的再生修复机制扮演了重要的角色，各种如G-CSF、EGF、bFGF、IGF-1、PDGF-BB及VEGF生长因子皆已广泛运用于医药及美容保养产业。而针对G-CSF而言，早已在医疗上治疗骨髓移植用途多年，而目前在临床上也有注射到栓塞型中风病人身上，可以帮助脑部瘀血区域的复原。此病人若接受一般复健治疗半年到一年，能恢复部分肌力，但不一定能站得起来，但是在中风3天内连续5天注射G-CSF后，3个月内可站可走，甚至有人能跑能跳，恢复相当迅速。因为G-CSF将骨髓中的干细胞逼到周边血管，中风处会有蛋白质表达，吸引干细胞到患处修补，分化成脑神经、血管等细胞，因此有助中风患者迅速恢复。此外，G-CSF可保护神经，使脑神经不致因中风缺血而坏死，并有抗发炎作用，可抑制中风处的发炎组织及细胞。但G-CSF注射治疗仅对栓塞型脑中风有效，出血型中风仍以血块清除手术为主。而目前的科学报告中证实，SCF与G-CSF组合应用于阿兹海默症与栓塞型脑中风动物实验，效果远较单独使用G-CSF为更好。因此多种生长因子复方做为不同用途的医药应用，将会具有其市场价值。

然而，目前在利用基因工程以大量制备上述生长因子时，需将表达上述人类生长因子的基因个别插入载体内以大量繁殖，并进一步纯化其表达的人类生长因子。虽然此种方法可降低成本，但其缺点在于纯化后的蛋白质的纯度不一，且可能含有内毒素或其他不良的蛋白质，而影响疗效或并发过敏反应；此外，一个质体要同时插入三种以上的生长因子蛋白质基因，且皆有表达活性，难度非常高，若欲同时操作多个选殖质体既费时又费工；再者，以原核生物或真菌类来表达人类生长因子蛋白质时，大部分所产生的蛋白质的活性会降低。

另一方面，干细胞治疗则是利用人类成体干细胞，例如位于骨髓、表皮、肠道等部位的干细胞来治疗各种疾病。由人类骨髓分离的间叶干细胞（human mesenchymal stemcell，hMSC）是一种成体干细胞，其具有多种分化潜能，在不同的培养环境下可分化成骨骼、软骨、肌肉、皮肤等组织，又有易于分离、培养与体外增生速度快的特性，已有多项研究证实其可强化组织细胞的再生愈合机制。然而，以干细胞注射或手术移植入人体，需要长期的临床试验以评估异体干细胞移植是否产生免疫排斥反应。再者，干细胞治疗耗费的医疗资源以及金钱亦高于一般疗法。

因此，需要提出一种方法，可以结合基因工程以及干细胞疗法的优点并改进其缺点。亦即，需要一种方法可同时提供三种以上由人类细胞表达的生长因子蛋白质，同时可通过一般外用或口服的途径施用该生长因子，以促进组织细胞的再生修护。

发明内容

鉴于上述问题，本发明提出了一种含有人类生长因子，并利用微脂体包埋技术包埋的促进细胞再生的组合物及其制备方法。

因此，本发明一方面提供一种用于制备人类生长因子的组合物，其包含人类干细胞生长因子（stem cell factor，SCF）、白血球生长因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）以及蚬萃取物，其中，优选的，该人类干细胞生长因子、白血球生长因子及蚬萃取物的浓度皆为5～100ng/ml。

所述的“蚬萃取物”又叫“蚬精粉”，可购买自市场，同时也可通过以下方法制备得到：将吐沙后的生蚬放入沸水中煮10-60分钟，随后将蚬肉经冷冻干燥制成冻干粉末进行萃取。将蚬冻干粉末溶于其约10倍体积的乙醇中搅拌萃取，之后离心取出上清液，过滤后减压浓缩得到一干燥物，最后将该干燥物溶于70%乙醇溶液即得。

另一方面，本发明提供一种用于制备人类生长因子的方法。首先，在初代培养液中进行人体骨髓间叶干细胞的初代培养。接着，去除初代培养液中的悬浮细胞并选择贴壁细胞，并以继代培养液进行继代培养。其后，选择贴壁细胞并以前述组合物制备的末代培养液进行末代培养，上述末代培养液是一种无血清DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养液，并且添加微生物基因工程产制的人类干细胞生长因子（SCF）、白血球生长因子（G-CSF）以及蚬萃取物，使得人体骨髓间叶干细胞可表达多种人类生长因子组合物于第四日的末代培养分泌液中，最后再以油包水-水包油（Water–in-Oil-in-Water，W/O/W）的微脂体包埋技术包埋。

特殊配方的末代培养液可使得贴壁骨髓干细胞能够分泌多种人类生长因子至末代培养分泌液中，以形成含有多种人类生长因子的溶液。亦即，上述多种人类生长因子溶液至少包含人类骨髓干细胞所分泌的多种人类生长因子的组合物，即为本发明所称的“人类生长因子组合物”。上述的组合物包含至少三种以上选自下列群组的生长因子：SCF、EGF、VEGF-D、VEGF、bFGF、中性粒细胞活化肽78（ENA-78）、生长调节致癌基因（Growth-regulatedoncogene，GRO）、干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）、IGF-1、血管生成素（Angiogenin）、单核球趋化性蛋白质1（MCP-1）、PDGF-BB、胎盘生长因子（placenta growth factor，PIGF）、TGF-β1、金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1；TIMP-2）、瘦体素（leptin）、血小板生长因子（thrombopoietin，Tpo）、趋化因子（RANTES）、IL-6、IL-8等21种细胞激素。

利用本发明实施例的制备人类生长因子的方法，可轻易得到一种人类生长因子组合物，其中所含的人类生长因子的种类、活性、安全性皆高于利用基因工程所产生者。且根据本发明实施例的方法所得到的生长因子组合物至少包含多种和细胞再生相关的生长因子，可有效提升细胞再生的能力。

此外，根据本发明实施例的特殊配方的末代培养液，不但可在人类生长因子组合物制备过程中提供额外的养分给人体骨髓间叶干细胞，亦有助于提升本发明实施例的用以促进细胞再生的组合物中所含的人类生长因子组合物促进细胞再生的能力。

又一方面，本发明提供一种用以促进细胞再生的组合物，上述组合物至少包含本发明的人类生长因子组合物、营养成分、乳化剂溶液、油相液体，以及增加安定性与耐胃酸的胶体。上述营养成分包含根据本发明实施例制备人类生长因子组合物时，所用的营养液的一部份。上述乳化剂溶液以及油相液体可将人类骨髓干细胞制造的复合组合物以油包水-水包油（Water–in-Oil-in-Water，W/O/W）的方式包埋成一种安定性高的微脂体包埋物。不仅以表皮涂抹方式，利用磷脂层膜易渗透吸收的特性，将抗皱的赋活因子运送至肌肤底层释放，从肌肤表皮层稳固干细胞环境，达到防护干细胞增植的功效，有效抗皱与避免老化，促进细胞再生；亦可以口服方式，通过消化道到血液循环中，仍然具有修护表皮外伤的生物活性。

根据本发明的具体实施例，该促进细胞再生的组合物所包埋成的微脂体包埋物可应用于实验动物的人造伤口。涂抹于人造伤口上，可观察到该组合物可促进伤口愈合，减缓伤口发炎及感染的机率，并减少疤痕的产生。此外，该组合物涂抹于受试者的皮肤上，可观察到皱纹明显减少，青春痘数量变少，并减缓痘疤的产生，因此可知该组合物可运用于制备促进伤口愈合，减缓伤口发炎及感染的医药组合物或辅助物。

本发明的一具体实施例为灰发动物的应用，使用本发明的灰发动物模式，仿真人类因老化而造成毛囊黑色素细胞死亡，所造成的白发征状。涂抹本发明的促进细胞再生的组合物，可明显观察到实验动物的白发征状明显改善，说明此组合物可应用于制备活化毛囊黑色素细胞，改善因衰老而造成的白发的医药组合物或辅助物。

本发明的一具体实施例为秃发动物的应用，使用本发明的秃发动物模式，仿真人类的秃发模式。涂抹本发明的促进细胞再生的组合物，可明显观察到实验动物的秃发征状明显改善，而应用于受试者的头皮上，可明显观察到受试者的发量明显增加，毛囊密度提高，发色变深等现象，说明本发明的组合物可应用于制备刺激毛囊生长，活化毛囊黑色素细胞的医药组合物或辅助物。

本发明的一具体实施例为延缓脑部神经退化的应用，帕金森是目前老龄常见的神经退化性疾病之一，因此本发明以帕金森动物试验为例，通过神经毒物1-甲基-4-酚基-1,2,3,6-四氢嘌呤（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）造成小鼠产生帕金森氏症的动物征状，再给予小鼠口服本发明的促进细胞再生的组合物。由结果显示，帕金森氏症模式小鼠口服本发明的组合物后，可明显减缓大脑黑质区多巴胺神经细胞的退化，增加脑内多巴胺的分泌，并促进大脑海马回神经细胞的增生，说明本发明的组合物可应用于制备延缓脑部退化性神经疾病的医药组合物或辅助物。

本发明的一具体实施例为促进血液造血干细胞的应用，给予受试者口服本发明的促进细胞再生的组合物后，可明显增加血液中造血干细胞数量，说明本发明的组合物可应用于制备促进血液造血干细胞的医药组合物或辅助物。

本发明的该等及其他方面，可通过以下的较佳具体实施例的描述以及图式，得以更为明晰；即便其中可能会有变化或修饰，但皆不背离本发明所揭露的新颖观念的精神及范畴。

附图说明

出于阐释本发明的目的，在图式中显示当前较佳的实施例。然而，应理解的是，本发明不限于图式中的较佳实施例。

图1显示人类生长因子抗体微阵图，其中(A)为人类生长因子抗体微阵芯片所列举的人类生长因子种类；(B)为在含有干细胞生长因子（SCF）及白血球生长因子（G-CSF）的末代培养液中所分泌的人类生长因子；(C)为在含有干细胞生长因子（SCF）、白血球生长因子（G-CSF）及蚬萃取物的末代培养液中所分泌的人类生长因子。

图2显示在ELISA试验中利用标准品求得本发明的生长因子的浓度，其中(A)显示干细胞生长因子的浓度及(B)显示血管内皮生长因子的浓度。

图3提供本发明制备的微脂体的结构示意图，其中(A)显示光学显微镜下的微脂体结构；(B)显示荧光显微镜下的微脂体结构；及(C)显示微脂体制备时与油相及水相液体的相关示意图。

图4显示口服包埋白血球生长因子（G-SCF）的微脂体对增加血液中白血球数目的效果。

图5显示小鼠皮肤伤口愈合的情形，其中使用本发明所提供的促进细胞再生的组合物时，(A)为第0日的伤口影像，(B)为第3日的伤口影像；未使用本发明所提供的促进细胞再生的组合物时，(C)为第0日的伤口影像，(D)为第3日的伤口影像。

图6显示小鼠伤口愈合率的比较图。

图7显示小鼠毛囊黑色素细胞活化的情形，其中(A)、(C)、(E)分别为阳性对照组在第9、14、21天的情形，及(B)、(D)、(F)分别为试验组在第9、14、21天的情形。

图8显示小鼠毛囊细胞增生的情形，其中(A)、(C)、(E)、(G)分别为阳性对照组在第0、7、14、21天的情形，及(B)、(D)、(F)、(H)分别为试验组在第0、7、14、21天的情形。

图9显示皮肤伤口愈合与淡化细纹的情形，其中(A)、(C)、(E)、(G)为涂抺本发明所提供的促进细胞再生的组合物前的皮肤状况，及(B)、(D)、(F)、(H)为涂抺30日后的皮肤状况。

图10显示人体头部毛囊细胞增生及活化黑色素细胞的情形，其中(A)、(C)、(E)为涂抺本发明所提供的促进细胞再生的组合物前的头发状况，及(B)、(D)、(F)为涂抺后的头发状况。

图11显示小鼠黑质区多巴胺神经细胞退化的情形，其中(A)为正常小鼠；(B)为施以MPTP注射的小鼠；及(C)为施以MPTP注射且给予本发明所提供的促进细胞再生的组合物治疗的小鼠。

图12显示小鼠海马回区新生神经细胞增生的情形，其中(A)为正常小鼠；(B)为施以MPTP注射的小鼠；及(C)为施以MPTP注射且给予本发明所提供的促进细胞再生的组合物治疗的小鼠。

图13显示慢性帕金森小鼠脑部多巴胺浓度的比较图。

图14显示急性帕金森小鼠脑部多巴胺浓度的比较图。

图15显示利用流式细胞仪分析服用本发明所提供的促进细胞再生的组合物，影响人类血液中造血干细胞增生的情形，其中(A)、(C)、(E)服用前的情形，及(B)、(D)、(F)为服用后的情形。

具体实施方式

在下列具体实施例中，本发明将被更特定地描述。值得注意的是，下列所述本发明的具体实施例仅是用于说明，并非为详列或限缩本发明范围至所揭露的特定形式。

实施例（一）

制备人类生长因子的方法

该方法包含下列步骤：

(a)在初代培养液中进行人体骨髓间叶干细胞的初代培养；

(b)去除初代培养液中的悬浮细胞并选择贴壁细胞，并以继代培养液进行继代培养；以及

(c)选择继代培养液中的贴壁细胞，并以末代培养液进行末代培养。上述末代培养液为无血清培养液且含有人类生长因子和／或蚬萃取物，以使得贴壁细胞能够分泌多种生长因子至末代培养液中，以形成人类生长因子溶液。

在上述步骤中，是将健康人体骨髓间叶干细胞（购自The National DiseaseResearch Interchange，NDRI，USA）以含10%胎牛血清的DMEM培养液（Dulbecco’s modifiedeagle medium，购自Gibico，Cat.No.12100-061）作为初代培养液，进行初代培养3日。接着去除初代培养液中的悬浮细胞并选择贴壁细胞，再以含10%胎牛血清的DMEM培养液作为继代培养液，进行继代培养3日。继代培养之后，以末代培养液进行末代培养3日，上述末代培养液为一种无血清培养液，且含有约5～100ng/ml SCF及G-CSF，和/或蚬萃取物5～100ng/ml。

蚬萃取物的制备方式为：将吐沙后的生蚬放入沸水中煮10-60分钟，随后将蚬肉经冷冻干燥制成冻干粉末进行萃取。将蚬冻干粉末溶于其约10倍体积的乙醇中搅拌萃取，之后离心取出上清液，过滤后减压浓缩得到一干燥物，最后将该干燥物溶于70%乙醇溶液即得。

在末代培养步骤中，末代培养液中的贴壁细胞可分泌复数种人类生长因子至末代培养液中，以形成一种人类生长因子组合物。该人类生长因子组合物至少包含三种下列生长因子：SCF、EGF、VEGF-D、VEGF、bFGF、ENA-78、GRO、IFN-γ、IGF-1、Angiogenin（血管生成素）、MCP-1、PDGF-BB、PIGF、TGF-β1、TIMP-1、TIMP-2、leptin、Tpo、RANTES、IL-6以及IL-8。

继代培养步骤可视需求重复至多20次。且可在继代培养步骤后将经培养的人体骨髓间叶干细胞冷冻保存，且此一冷冻保存的人体骨髓间叶干细胞经解冻后可再度进行继代培养，但解冻后的人体骨髓间叶干细胞的继代培养次数最多只可重复3次。

在本发明的一具体实施例中，可于末代培养液中加入营养液，上述营养液包含至少一种氨基酸和/或至少一种维生素。上述的氨基酸可为丙氨酸、精氨酸、天门冬酰氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、麸氨酸、甘氨酸、组氨酸、异白氨酸、白氨酸、离氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸，且所选的每种氨基酸的浓度约为5～100mg/L。上述的维生素可为维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D2、维生素E、维生素H、维生素K3、氯化胆碱、叶酸、或肌醇，且所选的每种维生素的浓度约为0.1～10mg/L。

在本发明一实施例中，将利用本发明实施例制备的人类生长因子组合物进行透析，以进一步纯化该人类生长因子组合物。根据本发明的一具体实施例，利用一3.5KD的透析膜（购自Pierce，SnakeSkin^ＴＭPleated Dialysis Tubing，3,500MWCO）来进行上述人类生长因子组合物的透析，透析可持续进行约3～5日。通过透析步骤，可实质上移除人类生长因子溶液中分子量小于3,500道尔顿（Dalton，D）的物质，因而达到纯化人类生长因子溶液的目的。

由于根据本发明实施例欲制备的人类生长因子组合物中所含的人类生长因子的分子量皆远大于3.5KD，例如EGF的分子量约为6KD而TGF-β3的分子量更高达250KD，故根据本发明实施例的方法所产生的人类生长因子大部分会留存于透析膜之中。最后，收集透析膜中留存的溶液，其至少包含三种人类生长因子。此种利用本发明实施例的方法所制备的人类生长因子组成的特征在于包含至少三种可侦测的生长因子（侦测方法将于下文详述），上述生长因子可以是SCF、EGF、VEGF-D、VEGF、bFGF、ENA-78、GRO、IFN-γ、IGF-1、Angiogenin、MCP-1、PDGF-BB、PIGF、TGF-β1、TIMP-1、TIMP-2、leptin、Tpo、RANTES、IL-6以及IL-8。

实施例（二）

人类生长因子组合物的定性分析

以人类细胞介素抗体微阵芯片（RayBio^ＴＭHuman Cytokine Antibody Arrays）检测该透析液中的生长因子组成，检测结果如图1的人类生长因子抗体微阵图所示。由图1(A)可以发现，根据本发明实施例制备的人类生长因子组成所含的人类生长因子种类及其侦测极限（limit of detection，LoD）如下：EGF（侦测极限1pg/ml）、bFGF（侦测极限10000pg/ml）、IGF-1（侦测极限10pg/ml）、PDGF（侦测极限1000pg/ml）、VEGF（侦测极限100pg/ml）、TGF-β1（侦测极限100pg/ml）、Angiogenin（侦测极限10pg/ml）、IFN-γ（侦测极限100pg/ml）、RANTES（侦测极限2000pg/ml）、Thrombopoietin（侦测极限100pg/ml）、TIMP（侦测极限1pg/ml）、GRO（侦测极限100pg/ml）、IL-6（侦测极限1pg/ml）、以及IL-8（侦测极限1pg/ml）。

本说明书中，“侦测极限”一词是指利用本发明实施例的方法进行人类生长因子定性分析时，所采用的检测方法的最低侦测浓度。换句话说，待测样本中所含的特定人类生长因子的浓度，必须至少等同于或大于检测方法所用的侦测极限，才可能被检测出来，在此种情形下，亦可将该特定人类生长因子称为“可侦测的”人类生长因子。而额外添加蚬萃取物于末代培养液中，可观察到各种生长因子有显著的增加（图1(B)、图1(C)及表一）。

表一生长因子于微阵芯片中浓度的相对倍数

此外，分别利用SCF RayBio^ＴＭELISA Kit套组以及VEGF RayBio^ＴＭELISA Kit套组，针对SCF与VEGF二种生长因子进行定量分析，其结果如图2(A)及图2(B)所示。以各套组内所附的SCF与VEGF标准品做回归直线，可求得本发明实施例制备的人类生长因子组合物中，SCF的浓度约为138pg/ml，而VEGF的浓度约为25130pg/ml。

相较于现有技术中所用的干细胞培养方法，培养液中不含可侦测的TGF-β3（侦测极限100pg/ml）以及SCF（侦测极限10pg/ml），亦即利用现有技术中干细胞培养方法，培养液中TGF-β3含量小于100pg/ml，且SCF含量小于10pg/ml。另外，利用现有技术中干细胞培养方法，培养液中VEGF的浓度仅为约200-500pg/ml。然而，本发明实施例的人类生长因子组合物中，则含有可侦测的TGF-β3，亦即TGF-β3的含量大于等于100pg/ml，且所含的SCF浓度（138pg/ml）以及VEGF浓度（25130pg/ml）皆远高于现有技术。

实施例（三）

促进细胞再生的组合物

在本发明的另一具体实施例中，提出一种用以促进细胞再生的组合物，其至少包含根据本发明实施例的人类生长因子组合物、一营养成分、一乳化剂溶液、以及一油相液体。上述营养成分包含根据本发明实施例制备人类生长因子时所用的营养液的一部份，在较佳的实施例中，营养成分至少包含一或多种氨基酸和/或维生素。上述的乳化剂溶液及油相液体可将人类生长因子组合物及营养成分以油包水-水包油（W/O/W）的方式包埋成一微脂体包埋物。

乳化剂溶液包含约0.5-1%的Tween80、以及约1-10％的山梨糖醇半油酸脂（sorbitan sesquioleate，Arlacel83）。在本发明的具体实施例中，上述乳化剂溶液可更包含约80-90%的纯水、约1-10%的玻尿酸和/或约1-10%的葡萄糖。

油相液体包含约1-10%的卵磷脂、约1-10%的胆固醇以及约80-90%的磷脂质。在本发明的实施例中，能够以其它油脂成分取代上述的磷脂质，例如篦麻油和/或矿物油。

根据本发明的实施例，更可在上述用以促进表皮细胞再生的组合物中加入水溶性胶体，以增加微脂体包埋物的安定性。水溶性胶体包含约1-10%的Tween20、约1-10%的丙二醇（propylene glycol，PG）、约1-10%的聚乙二醇-600（polyethylene glycol，PEG-600）、以及约1-5%的胶体物质，其中上述胶体物质可以是三仙胶、透明胶、或其组合物。在本发明的具体实施例中，水溶性胶体可更包含约1-10%的玻尿酸。

根据本发明的一具体实施例，在约4℃下于约10ml纯水中加入约2-5公克Tween80、约2-5公克Arlacel83、约3-5公克玻尿酸和约2-5公克葡萄糖加以溶解，以制备成总体积约20ml的乳化剂溶液。另一方面，将约5-10公克卵磷脂、以及约2-5公克胆固醇加入约20-30ml篦麻油和约10-20ml矿物油中，以制备成总体积约40ml的油相液体。此外，在约60-80ml的纯水中，加入约10-20公克Tween20、约10-20公克PG、约2-5公克PEG-600、约5-10公克三仙胶、以及约10-20公克玻尿酸，以制备成总体积约120ml的水溶性胶体。

在约4℃下取约20ml乳化剂溶液以及等体积（即，约20ml）的经3.5KD透析膜透析的人类生长因子组合物。接着，缓慢加入约40ml油相液体，以8,000-10,000rpm的高压均质机于约4℃下搅拌均匀，搅拌持续约10-20分钟。以形成微脂体奈米颗粒（W/O/W）结构。最后，加入约120ml水溶性胶体，以2,500-3,000rpm的均质机于约4℃下搅拌均匀，搅拌持续约20分钟，最终所得的乳糜状组合物（图3(C)），即为本发明实施例的用以促进细胞再生的组合物。于光学显微镜下观察，可明显观察到微脂体奈米颗粒（W/O/W）的结构（图3(A)），而当组合物包含绿色荧光蛋白时，于荧光显微镜观察可发现荧光蛋白确实包埋于微脂体奈米颗粒内部，呈现绿色荧光（图3(B)）。

在本实施例中，加入水溶性胶体的目的在于增加微脂体奈米颗粒的安定性，可使微脂体奈米颗粒内的水溶性蛋白质于室温保持活性达2～3年的久，此外进行小鼠口服试验时，以G-CSF做为测试包埋物，其可促进血液中白血球的增生，与注射对照组比较，经由包埋的G-CSF可通过口服方式，通过肠胃道细胞，达到注射的效果（图4），说明本包埋方式可有效保护生长因子，避免受到胃蛋白酵素的分解。

实施例（四）

小鼠皮肤伤口愈合/表皮细胞再生试验

在本发明具体实施例中，以小鼠皮肤伤口愈合试验测试本发明的用以促进细胞再生的组合物对伤口愈合率的影响。本试验共分为二组，一组试验组（以包埋生长因子的微脂体处理）及一组对照组（以包埋生理食盐水的微脂体处理），每组各利用6只八周龄大的BALB/C鼠，将每只小鼠以灭菌处理的解剖刀于小鼠剃毛后的背部剪下0.5×0.5cm²的伤口，随即以显微镜观察小鼠皮肤伤口，并撷取及记录第0日伤口影像，并以软件计算第0日伤口面积。

在伤口造成一小时后，于各组试验用小鼠的伤口上均匀涂抹约100μl的微脂体。其后，每隔24小时，分别以同样的方式涂抹约100μl的微脂体，一共涂抹三次。第三次涂抹后24小时，即伤口产生后的第3日，以显微镜观察小鼠皮肤伤口，并撷取及记錄第3日伤口影像，并以软件计算第3日伤口面积。

本实施例所用的显微镜是连接电荷耦合组件（Charge Coupled Device，CCD）以撷取小鼠皮肤伤口的影像，并于撷取影像后，将该影像传输至计算机进行影像处理及伤口面积计算、统计；影像处理及伤口面积计算所使用的软件为Northern Eclipse imagesystem；而数据统计则以软件SigmaStat program（2002）进行分析，时以单项变方分析（One-way Analysis of Variance，ANOVA）的邓肯氏多变域测验（Duncan’s New MultipleRange Test,DMRT）进行计算。

小鼠皮肤伤口影响如图5所示。图5(A)为试验组小鼠第0日的伤口影像；图5(B)为试验组的小鼠第3日的伤口影像；图5(C)为对照组小鼠第0日的伤口影像；以及图5(D)为对照组小鼠第3日的伤口影像。由实验结果可以发现，经过本发明实施例的用以促进细胞再生的组合物（试验组）处理三天后的小鼠皮肤伤口面积，明显小于对照组的小鼠皮肤伤口面积。

以影像处理软件计算各组小鼠第0天及第3天的皮肤伤口面积，以换算伤口愈合率，其计算方式如下：

伤口愈合率(%)=（第0日的皮肤伤口面积－第3天的皮肤伤口面积）/第0日皮肤伤的口面积×100%。

各组小鼠伤口愈合率平均值结果图6，其中试验组小鼠的伤口愈合率为77.9±7.8%，而对照组小鼠的伤口愈合率为58.7±4.4%。由第6图可以发现，相对于对照组来说，试验组的小鼠伤口愈合率具有显著差异（p<0.05）。

实施例（五）

小鼠灰发试验

在本发明的具体实施例中，以灰发动物模式以测试本发明改善动物灰发的效果，该动物模式是使用C3H以及BALB/C杂交老鼠的F1子代，该F1子代除毛后，以含有1-20%的对苯二酚（hydroquinone）与1-20%的甘醇酸（glycolic acid）的美白胶连续涂抹7天后，处理部位再生毛发呈现白色，由于毛囊老化时的黑色素细胞易缺乏酪氨酸酶的活性，酪氨酸酶是主要形成黑色素的重要关键酵素，而该美白胶则会抑制酪氨酸酶的活性。本发明所建立的灰发模式动物，其亲代之一的BALB/C鼠因具有同型酪氨酸酶缺陷基因（Tyr－/Tyr－）而呈现白色，另一亲代C3H鼠则具有同型酪氨酸酶基因(Tyr+/Tyr+)而呈现褐色，因此其F1杂交子代具有异型酪氨酸酶基因(Tyr+/Tyr－)，该F1子代在处理美白药物后，极为容易缺乏酪氨酸酶而产生白毛，情形相似于人类因老化而产生的白发；因此，若含生长因子的微脂体可使灰发动物模式的毛发颜色变深，则此微脂体应该也可在人类的灰发上具有相同的效果。在此试验中共分2组，包括：使用美白胶及以包埋磷酸盐缓冲液（phosphate bufferedsaline，PBS）的微脂体处理的灰发模式动物，作为阳性对照组；以及使用美白胶及含生长因子的微脂体处理的灰发模式动物，以作为试验组。每组具有6只老鼠，整个试验共重复3次。在第0天局部涂抹药物前，试验动物背部毛发（约2x2cm2大小）以镊子除毛，第2天上午开始以50μl的微脂体处理脱毛部位，一天一次共处理3周，下午则以美白胶处理，一天一次连续处理一周，在此实验过程中，微脂体比美白胶多处理2周。

小鼠灰发试验影响如图7所示，在第9天时，与对照组比较，试验组的小鼠可观察到其背部皮肤已有黑色素沉积的现象（图7(B)）；于第14天时，此时小鼠背部毛发已开始出现，而试验组的小鼠其背部发色则呈现灰黑色（图7(D)），而对照组的小鼠发色则呈现灰白色（图7(C)），而于第21天时，可明显观察到，试验组的小鼠，其毛发已呈现深黑色（图7(F)），而对照组仍呈现灰白色（图7(E)）。

此实验证明，本发明的组合物确实可活化毛囊黑色素细胞，改善因老化而呈现的白发征状。

实施例（六）

小鼠秃发试验

在本发明的具体实施例中，以秃发动物模式以测试本发明改善动物秃发的效果，该动物模式系使用C57BL/6J以及CBA/J杂交老鼠的F1子代，该F1子代再以睪固酮处理后，造成秃发动物模式，C57BL/6J自发突变鼠具有秃发的外表，其带有同型jb/jb基因，以突变鼠作为母本，以CBA/J鼠作为父本，进行杂交得到的子代称为B6CBAF1/j杂交鼠；目前已证实该杂交鼠母鼠可经由注射睾酮（testosterone，1mg/mice/day）3周而造成秃发，由于杂交鼠母鼠比杂交鼠公鼠对睾酮更敏感，因此以该杂交鼠母鼠作为本发明雄性秃（AndrogeneticAlopecia，AGA）模式动物。

在此试验中共分2组，包括：使用睾酮及以微脂体包埋PBS的雄性秃模式动物，作为阳性对照组；以及使用睾酮后使用含生长因子的微脂体处理的雄性秃模式动物，以作为试验组。每组具有6只老鼠，整个试验共重复3次。在第0天局部涂抹药物前，试验动物背部毛发（约2x2cm²大小）以镊子除毛，第2天下午开始以睪固酮处理，一天一次共处理3周，在此同时，在上午以50μl的微脂体处理脱毛部位，一天一次共处理3周。

小鼠雄性秃试验影响如图8所示，从阳性对照组可观察到至第21天时，实验鼠的背部毛发仍是停止生长的情况，而试验组的小鼠，可发现至第14天（图8(F)），小鼠背部脱毛处的皮肤开始有黑色素产生，而至第21天（图8(H)），与对照组相比（图8(G)），小鼠的毛发已完全恢复为脱毛前的状态。此实验证明，本发明的组合物确实可刺激毛囊细胞增生，改善秃发。

实施例（七）

人类皮肤试验

试验对象的数据如表二所示，于试验前拍照记录各试验对象的试验部位，如图9(A)、9(C)、9(E)、及9(G)所示。

表二人类皮肤试验对象的数据

试验者	性别	年龄	试验部位	试验前	试验后
						试验者1	男	44	眼尾皱纹处	图9(A)	图9(B)
试验者2	男	29	额头青春痘	图9(C)	图9(D)
						试验者3	女	20	脸部青春痘	图9(E)	图9(F)
试验者4	女	25	脸部青春痘	图9(G)	图9(H)

将实施例三所制得的含生长因子的微脂体局部涂抹于各试验者的试验部位，每日涂抹2次，一次涂抹2ml，连续涂抹30日后，拍照记录各试验对象的试验部位，如图9(B)、9(D)、9(F)、及9(H)所示。由图9(A)及9(B)可以看出，连续使用本发明所提供的促进细胞再生的组合物30日后，可以使脸部皱纹淡化。此外，由图9(D)、9(F)及9(H)也可看出，本发明所提供的促进细胞再生的组合物亦可使脸部皮肤的疤痕（如青春痘）淡化。

实施例（八）

人类秃发试验

试验对象的数据如表三所示，于试验前拍照记录各试验对象的试验部位，如图10(A)、10(C)及10(E)所示。

表三人类秃发试验对象的数据

试验者	性别	年龄	试验部位	试验前	试验后
						试验者1	女	22	头顶	图10(A)	图10(B)
试验者2	男	42	头顶	图10(C)	图10(D)
						试验者3	男	44	前额	图10(E)	图10(F)

将实施例三所制得的含生长因子的微脂体局部涂抹于各试验者的试验部位，每日涂抹2次，一次涂抹2ml，连续涂抹4至6个月后，拍照记录各试验对象的试验部位，如图10(B)、10(D)及10(F)所示。由图10(B)及图10(D)可以看出，连续使用本发明所提供的促进细胞再生的组合物4至6个月后，可以改善头发灰发以及促进毛囊的生长，使头发密度增加。此外，由图10(F)也可看出，本发明所提供的促进细胞再生的组合物亦可活化毛囊细胞的生长，增加使用者前额部位的发量。

实施例（九）

延缓小鼠脑部退化试验

在本发明的具体实施例中，以小鼠帕金森动物模式测试本发明实施例的促进细胞再生的组合物用以延缓脑部神经细胞退化的影响。使用8～12周C57BL/6的公鼠，分为三组，其中试验组为连续给予10天含生长因子的微脂体，每日喂食二次，每次剂量为0.2ml，前述微脂体给予至第6天时，开始进行MPTP注射，剂量为18mg/kg，并以皮下注射方式连续施打5天；MPTP组的微脂体则为包埋PBS；以及对照组为使用包埋PBS的微脂体及皮下注射PBS。MPTP处理后第10天，将小鼠牺牲，取其脑部进行切片，以抗体标定多巴胺神经细胞来分析黑质区多巴胺神经细胞的数目，以及以抗体标定新生细胞来分析前述微脂体对新生细胞的影响。由图11可看出，以MPTP处理后，会造成小鼠黑质区多巴胺神经细胞数量减少（图11(B)），而同时辅以含生长因子的微脂体喂食的小鼠，可明显减缓其黑质区多巴胺神经细胞数量的减少（图11(C)）。而在图12中可明显观察到，以含生长因子的微脂体喂食的小鼠，其海马回区新生细胞的数目明显增加（图12(C)）。另外，将小鼠脑部纹状体分离后，以高压液相层析仪分析脑内多巴胺含量，由图13中可以看出，与MPTP组比较，试验组的小鼠，其脑内多巴胺的含量有明显增加的趋势。

而在急性试验方面，使用8～12周C57BL/6的公鼠，分为五组，其中一组为PBS组不给予含生长因子的微脂体而改成给予PBS，其他四组连续给予6天含生长因子的微脂体，每日喂食二次，每次剂量为0.2ml，在第2天时，连续给予4次MPTP（18mg/kg腹腔注射），每次间隔2小时，之后于注射MPTP后第7、14、21及28天时牺牲小鼠取其脑部纹状体测其脑内多巴胺浓度，由图14可看出，随着时间的增加，脑内多巴胺有增加的趋势，可推测本发明的促进细胞再生的组合物对于帕金森氏症具有改善的效果。

由上述实施例可说明，以MPTP处理后的小鼠，会造成其脑部神经细胞退化，进而造成脑部多巴胺分泌降低，造成小鼠出现帕金森征状，而通过给予本发明的促进细胞再生的组合物后，确实可延缓脑部神经细胞的退化，刺激脑部海马回区新生细胞的数目，以及回复脑内多巴胺的分泌。

实施例（十）

增加人类血液造血干细胞试验

以本发明的促进细胞再生的组合物进行人类血液造血干细胞试验，试验对象以口服方式使用含生长因子的微脂体，每次20毫升，每天服用1次，并于试验前及试验后抽血。受试者血液经分离白血球后，以抗体标定造血干细胞后，再以流式细胞仪分析血液内造血干细胞所占的比例。结果如图15所示，服用含生长因子的微脂体1个月后，2名受试者体内血液中造血干细胞的比例分别从0.11%及0.19%（图15(A)及(C)），增加至0.28%及0.34%（图15(B)及(D)），而服用含生长因子的微脂体12个月后，可明显观察到受试者血液中造血干细胞的比例从0.22%增加至4.59%，说明本发明的促进细胞再生的组合物，可通过口服的方式刺激血液中造血干细胞的比例，进而达到促进细胞及组织再生的功能。

由上述本发明的较佳实施例可得知，本发明具有下列优点。首先，通过本发明实施例的制备人类生长因子的方法，使得人体骨髓间叶干细胞可产生人类生长因子组合物，上述人类生长因子组合物至少包含复数种与伤口愈合/细胞再生相关的生长因子。此外，由于这些生长因子是由人体骨髓间叶干细胞所表达，其成分和人体自身表达的生长因子相同且不含原核内毒素。另一方面，这些生长因子的活性及种类亦优于人类成体细胞和/或基因重组的异种细胞所表达的。

再者，根据本发明的具体实施例，可于末代培养液中加入一营养液，其含有一或更多种氨基酸和/或维生素，可在培养过程中提供额外的养分给人体骨髓间叶干细胞。此外，根据本发明制备用以促进细胞再生的组合物时，不需移除末代培养时额外加入的营养液，因而最终用以促进细胞再生的组合物中所含的营养液可额外提供表皮、真皮组织再生、以及胶原纤维重整所需的养份，而和本发明实施例的人类生长因子组合物产生一种加乘效果，进一步提升表皮及真皮组织的伤口愈合和/或胶原纤维重整能力。

最后，上述用以促进细胞再生的组合物不仅可透过微脂体包埋法以形成一种可内用或外服的生长因子微脂体，更可加入一人工皮肤或一皮肤替代物中，以促进表皮细胞再生，或作为皮肤医学或药妆用品的活性或辅助成分应用。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求书所请求保护的范围为准。

Claims (9)

1.一种制备人类生长因子的方法，该方法包含：

进行初代培养，其是在初代培养液中培养人体骨髓间叶干细胞；

取出该初代培养液中的贴壁细胞，并以继代培养液以进行继代培养；以及

取出该继代培养液中的贴壁细胞，并以末代培养液进行末代培养，让该末代培养液中的贴壁细胞分泌多种生长因子至该末代培养液中以形成人类生长因子溶液，其中该末代培养液为无血清培养液且包含蚬的乙醇萃取物。

2.如权利要求1所述的方法，其中该初代培养液以及该继代培养液为不含胎牛血清的DMEM培养液。

3.如权利要求1所述的方法，其中该初代培养的步骤进行3日。

4.如权利要求1所述的方法，其中该继代培养的步骤进行3日。

5.如权利要求1所述的方法，至少更包含重复进行该继代培养的步骤，其中该重复次数最多20次。

6.如权利要求1所述的方法，其中该末代培养的步骤进行3日。

7.如权利要求1所述的方法，其中该蚬的乙醇萃取物浓度为5-100ng/ml。

8.如权利要求1所述的方法，更包含取出该人类生长因子溶液进行透析，以纯化该人类生长因子溶液。

9.如权利要求8所述的方法，其中利用3500道尔顿的透析膜进行透析，且该透析步骤进行3-5日。