CN1875920A - 重组人血白蛋白和酵母酵素混合物、含有此混合物的组合物，其制备工艺及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人血白蛋白和酵母酵素混合物，此混合物可以利用PCR技术构建的含人血白蛋白基因的巴斯德毕赤酵母经过一定规模的发酵培养和简洁有效的分离提取工艺直接得到，此工艺可作为规模化生产工艺。本发明还公开了含有此混合物的组合物以及它们在皮肤保湿、防皱、除皱、美白方面的用途。

Description

重组人血白蛋白和酵母酵素混合物、含有此混合物的组合物，其制备工艺及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，更进一步，本发明属于重组生物产品混合物，含有此混合物的组合物，其制备工艺及用途。

背景技术

回顾化妆品的演变历史：第一代为纯物理、普通性油质类化妆品；第二代为油水混合技术化妆品；第三代为纯天然的，是从植物中提取的精华成分制成的化妆品；第四代为仿生化妆品，是运用生物技术从动物机体中提取制造与人体自然结构相仿，并略具有亲和力的生物制品。随着科学技术的进步和美容界的不断要求，仿生化妆品很快被新一代化妆品所代替。第五代纯生物化妆品—纯生物制剂是科学技术领域的又一次重大突破，含纯生物的化妆品在美容界更是备受青睐。

随着生物医学技术的发展，人工重组生物工程的突破，生物细胞因子广泛地应用于美容化妆品，使得美容修复的概念真正在美容护肤中提倡起来。科学家们利用DNA重组技术将人体蛋白质基因构建到其他菌株中，让人的基因按指令在菌株内合成某种蛋白，获得具有生物效应的生物细胞因子类和其它类产品，如：重组人表皮生长因子rh-EGF、碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)，干细胞因子(SCF)和人白细胞介素-11(interleukin)、aFGF、细胞修复因子TGF-B、干扰素、端粒(tecomeres)修复因子(TRF)等，并将这些高效生物因子添加到化妆品中，使得适量补充某些外源性蛋白质成为可能。它们既可加快皮肤损伤过程中胶原合成的速度，增加血管内皮细胞受体敏感性，加速破损细胞的上皮组织愈合，有效地减少了继发感染及愈合延迟现象。

白蛋白(HSA)作为人体血浆中含量最丰富的蛋白，在化妆品领域早有所应用。它由585个氨基酸组成，呈非糖基化单链结构的心型结构，能可逆性结合内源和外源性物质，临床上用于治疗严重的低蛋白血症和失血性休克，维持人体渗透压，结合并运输营养物和代谢物，HSA有很重要的的药用和科研价值。

在化妆品领域，白蛋白作为水溶性蛋白质，为中性缓冲液，有良好的生物兼容性，可在皮肤表面形成一层保湿膜，能够去除皱纹、使皮肤光滑细腻晶莹透亮。但由于原材料来源限制和高制备成本限制了白蛋白在化妆品领域的应用。

在EXOVIR INC(US)公司抗皱化妆品专利(专利号：EP0180968)中使用白蛋白作为皮肤抗皱剂，对舒展眼部、前额、嘴部、颈部及脸颊的细小皱纹非常有效，使面容恢复青春。

美国NEW CENTURY的FOR USE IN CLEANSING OR DERMATOLOGICAL PRODUCTSFOR SKIN OR HAIR专利中(申请号：WO0249671)中使用重组人血白蛋白作为肥皂、洗发露、面霜、洗液、凝胶油膏等中的添加成分，吸附在头发和皮肤表面，恢复组织结构，作为活性成分降低过敏反应。如洗发露中使用白蛋白可减少头皮发痒，避免或减少头皮屑。

专利号5,948,609提到白蛋白以全长或片断或修饰的形式应用。

美国专利Cosmetic composition comprising human serum albuminobtained from transgenic non-human animals(专利号：NZ522669)白蛋白来源于转基因动物的奶中，经过过滤、沉淀、层析(如离子交换和亲和层析)等步骤得到，残存牛血清白蛋白0.05-2.5％，甚至0.5-1.0％。作为化妆品中面霜、洗液、油、凝胶、水凝胶和防晒霜中添加成分。

美国专利Composition for therapeutic and cosmetic botulinum toxin(专利号：US2004037853)使用来自Delta Biotechnology LTD酵母表达的重组人血白蛋白作为美容注射剂肉毒杆菌毒素中的赋形剂，效果良好。

在中国专利中，发明名称为含有动物血清的化妆品(中国发明专利公开号：CN1090753)公开了来自动物血源的动物血清加入到化妆品中易于被皮肤吸收的内容。

发明名称为一种润肤霜的发明专利(中国发明专利公开号：CN1085424)公开了使用人血白蛋白和甘草提取液及甘油成分作为改善粗燥、保湿和防止皲裂的化妆品。

从以上专利可发现，目前化妆品中所使用白蛋白一部分来自人血或动物血分离提纯、另一部分来自重组基因产品，都经过复杂的分离过程，是单一成分。血液来源产品还存在原料供应紧张，产品存在HIV病毒、肝炎病毒以及疯牛病病毒污染的潜在威胁。随着生物技术的发展，重组产品的开发越来越受到重视。

发明内容

本发明利用基因重组技术，在分离过程中创造性地保留了人血白蛋白和酵母酵素成分，提高了美容效果。在组方上针对水溶性蛋白在较高温度或有乙醇存在时均会变性，易被菌类破坏的特性(常规化妆品均不存在这个问题)，进行了组方研究，将重组人血白蛋白做成刺激性低、具有明显保湿，抗皱，增白等作用并且外观和可接受性较好的系列化妆品。

本发明中公开的重组人血白蛋白和酵母酵素混合物是指由重组人血白蛋白和部分酵母分泌物酵母酵素(酵母多糖和酵母蛋白)组成，可由巴斯德毕赤酵母或啤酒酵母表达，经过简洁有效的分离提取工艺直接得到。

本发明公开了一种重组人血白蛋白(rHSA)和酵母酵素混合物及其制备工艺、含该混合物的组合物以及它们在化妆品及其它领域的应用，进一步说，是采用基因重组技术，通过巴斯德毕赤酵母分泌表达、有效的分离提取，独创性地同时保留了具有光滑和去皱效果rHSA及有益的酵母组分：酵母酵素，如酵母蛋白和酵母多糖，使其具有独特的美容功效。本发明还涉及一组化妆品的组合物，更确切地说，是一种含有上述混合物的可应用于化妆品的组合物，用于肌肤(眼部，脸部或全身)的保湿，抗皱，增白等，可以为水溶液，水凝胶，水包油乳液，水包油或油包水膏霜等。

本发明公开了一种含有重组人血白蛋白和酵母酵素混合物以及能够工业化操作的生产此混合物的方法：利用巴斯德毕赤酵母分泌表达得到发酵液，发酵液经过以下步骤，得到目的物。

(1)发酵液经高速离心得发酵上清，上清液柱层析脱盐处理，去除游离小分子杂质和部分异味；

(2)脱盐后组分加热处理，去除部分色素和源自甲醇毕式酵母的异味；

(3)加热后离心分离，上清液经二次柱层析分离；

(4)膜浓缩。

其中，步骤(1)中脱盐处理的详细步骤为巴斯德甲醇酵母经过5-10天的低温发酵，发酵液高速离心后，经膜过滤(1.2-0.22um)去除残余颗粒，以1％-50％柱体积的上样量，优选5-30％的上样量进入Sephadex G-10或G-15或G-25或G-50coarse或medium或fine介质进行分，优选G-25fine介质(瑞典发玛西亚公司生产)。分离收集含重组人血白蛋白和酵母酵素组分A。

步骤(2)加热处理步骤中的详细步骤为步骤(1)中组分A，加入热稳定剂、金属螯合剂和脱色剂后进行60-80℃，10-60分钟的加热，灭活蛋白酶活性。热稳定剂为辛酸钠，金属螯合剂可以为EDTA或EGTA之一，脱色剂可以为硅藻土或活性炭，优化地选择活性炭作为脱色和除味剂。加入量1-10％，优选7％(W/V比)。

步骤(3)加热溶液经2000-10000rpm高速离心10-40分钟后，经0.22um膜过滤，得到组分B，B组分进入G-25脱盐柱进行层析分离并换液至pH7.0的柠檬酸钠或磷酸盐溶液中。收集包含重组人血白蛋白的组分C。

步骤(4)为步骤(3)得到的组分C经1-5万截流量的超滤膜包，优选3万膜包(MILLIPORE 公司生产)进行超滤浓缩至最终浓度5-20％。无菌分装，每瓶50ml，称组分D。

本发明工艺简洁，直接得到含有重组人血白蛋白和部分酵母分泌物酵母酵素(酵母多糖和酵母蛋白)的混合物-组分D。工艺路线短，收率高，具有较高工业化价值。同时所保留的酵母多糖和酵母蛋白是化妆品的功效成分，甘露聚糖(属于酵母多糖)能扩张毛细血管，激活皮肤基底层的朗罕细胞，增强其在皮肤局部的免疫功能和修复功能，促进其清除皮肤色素，抗氧化性损害(包括紫外线)、抗衰老增加皮肤的弹性等。酵母多糖和酵母蛋白是酵母酵素成分，也就是酵母分泌的“代谢产物”，使皮肤变得晶莹剔透。

本发明具有原材料不受限制，没有病毒污染、不含激素类物质，可通过规模效应和技术能力的提高降低生产成本，有潜在的竞争优势，蛋白序列完全与人血白蛋白一致，营养价值高等特点。其中酵母多糖和酵母蛋白有协同重组人血白蛋白改善多皱、松弛、干燥、泛黄晦暗皮肤。令肌肤光滑，白皙润泽，富有弹性。延缓衰老的功效，是当今的生物化妆品追逐的热点。

本发明还公开了一组含有重组人血白蛋白和酵母酵素混合物的组合物，含有上述的重组人血白蛋白和酵母酵素混合物、乳化剂、增稠剂、保湿剂和防腐剂。

本发明公开的组合物，乳化剂可以是卵磷脂，胆甾醇，吐温(20，40，60，80)，斯盘(20，40，60，80)，十二烷基硫酸钠，月桂醇硫酸酯钠之一或其混和物。

本发明公开的组合物，增稠剂可以是卡波姆，泊洛沙姆，HPMC，MC，GALLENGUM，透明质酸钠，凡士林，碳氢矿物油，以及十四烷酸异丙酯或棕榈酸酯等油腻感小的一类物质。也包括各种各样的脂肪，油类、蜡类，包括羊毛脂，脂肪酸，脂肪醇，三甘油酯，蜡酯及多元醇酯之一或其混和物。

本发明公开的组合物，保湿剂为本技术领域人员熟知的丙二醇、丁二醇或甘油，维生素类(VA，VE)，脂肪酸(亚油酸，亚麻酸，花生四稀酸)，泛醇，胆固醇，神经酰胺，透明质酸钠，芦荟之一或其混和物。

本发明公开的组合物，防腐剂可以为尼泊金乙酯、丁酯、甲酯，硫柳汞，咪唑烷基脲，氯甲酚之一。

本发明公开的化妆品组合物，各组分的比例为重组人血白蛋白和酵母酵素混合物0.05-2.5％(w/w)，乳化剂0.1-15％(w/w)，增稠剂(0.05-30％)(w/w)，保湿剂(0.005-20％)(w/w)，防腐剂(0.0005-1％)(w/w)，其余为水。优选为重组人血白蛋白和酵母酵素混合物0.5-1.5％(w/w)，乳化剂0.5-10％(w/w)，增稠剂(0.1-20％)(w/w)，保湿剂(0.01-10％)(w/w)，防腐剂(0.005-0.1％)(w/w)，其余为水，(w/w指各组分的重量占总重量的百分比)。

本发明制剂产品具有下述特点：

(1)为水溶液时，如实施例1，可作为润肤水，柔肤水，化妆水，爽肤水等。

(2)为透明或半透明的半固体水凝胶时，如实施例2，黏度随外应力的增加而降低，具有良好的生物相容性，粘性适中，润滑性好，对眼部无刺激性，可用于眼部和脸部抗皱保湿。

(3)为水包油乳液时，如实施例3，有较强的润滑感，皮肤亲和力强，可接受性好，可用于眼部，面部甚至全身的保湿或增白。

(4)为水包油或油包水膏霜时，如实施例4，保湿时间长，可均匀铺展。

(5)以棉布、小织布(无纺布、水刺布等)、木浆、生物纤维或类似材料为载体，将本发明的水溶液、透明或半透明的半固体水凝胶、乳液等产品浸泡于所述载体，制备成皮肤贴膜(眼贴、面贴、颈贴等)，如实施例5，可用于皮肤的快速除皱、保湿、增白等。

(6)本发明加入的乳化剂和增稠剂，不影响重组人血白蛋白稳定性，且外观美观，作为化妆品可接受性强。经动物试验证明，无刺激性，并经志愿者试用，具有较明显的抗皱，保湿和增白效果。

本发明的优选组分是上述的重组人血白蛋白和酵母酵素混合物(含酵母多糖和酵母蛋白)，加以乳化剂，保湿剂，增稠剂、防腐剂制成适合皮肤用的化妆品。本发明的化妆品组合也可以添加防晒剂，或中草药去斑成分制成特殊用途化妆品。本发明公开的组合物，还可以含有透皮促进剂：可以为氮酮，肉豆蔻酸异丙酯(IPM)，棕榈酸异丙酯，氮-甲基吡咯烷酮之一。本发明中还可以含有pH调节剂为三乙醇胺、氢氧化钾或氢氧化钠等。

本发明还公开了重组人血白蛋白和酵母酵素混合物作为细胞因子稳定剂方面的用途，本发明所指的细胞因子，可以为表皮生长因子EGF，人粒细胞集落刺激因子G-CSF，干细胞因子SCF，细胞修复因子TGF-B等。

附图说明

附图1：第一步离心得到的发酵上清液染色分析结果，左图用希夫试剂染色法(针对多糖和糖蛋白)得到；右图用考玛斯量蓝染色法SDS-PAGE得到；

附图2：制备例3得到的终产品电泳图；

Lane 1、2：上样10ug

Lane 3、4：上样8ug

Lane 5、6：上样6ug

Lane 7、8：上样2ug

附图3：制备例3得到的终产品在Superdex 200柱HPLC分析结果。

具体实施方式

以下制备例、实施例、实验例仅仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。

主要原辅料来源：重组人血白蛋白发酵液按中国发明专利申请号200510068171.9制备(华北制药新药研发公司)；卵磷脂(phospholipid gmbh)；甘油(张家口市化学试剂厂)；十八醇(上海华东师范大学化工厂，进口分装)；羊毛脂(天津化学试剂有限公司)；胆固醇(北京化学试剂公司)；凡士林(上海华灵康复器械厂)；单硬脂酸甘油酯(河北高碑店市春光试剂厂)；卡泊姆(美国诺誉化工有限公司)；膜(上海兴亚净化材料厂)；其余均为市售。

仪器：79-3型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器厂)，HS-3C酸度计(上海雷磁仪器厂)；乳匀机(上海弗鲁克公司)。

重组人血白蛋白和酵母酵素混合物制备例

制备例1

(1)一次脱盐处理

由PCR技术构建含人血白蛋白基因的巴斯德甲醇酵母菌在800L罐上经过周期8天的低温发酵，发酵液在10000转高速离心30分钟，得发酵上清液。

上清液经1.2um膜过滤去除残余不溶物，以3％柱体积的上样量，进入G-25fine介质(瑞典发玛西亚公司生产)分离。

(2)加热处理

收集包含rHSA的G-25组分(称组分A)，加入热稳定剂辛酸钠，金属螯合剂EDTA-2Na和加入1％(W/V比)活性炭后进行60℃，60分钟的加热，灭活蛋白酶活性，热稳定剂辛酸钠，金属螯合剂EDTA-2Na加入量按中国发明专利申请号200510068187.X进行。

(3)二次脱盐处理

加热溶液经10000rpm高速离心30分钟后，经0.22um膜过滤，得到组分B，B组分进入G-25脱盐柱进行层析分离并换液至pH7.0的柠檬酸钠中。收集包含重组人血白蛋白的组分C。

(4)浓缩分装

C组分经10KD的超滤膜包(MILLIPORE公司生产)进行超滤浓缩至最终总蛋白浓度5％(50mg/ml)，重组人血白蛋白和酵母酵素的浓度为7.66％(76.6mg/ml)。无菌分装，每瓶50ml，称组分D。

制备例2：

同制备例1，只是步骤(1)一次脱盐处理中上样量按20％柱体积进行，分离介质为G-15(瑞典发玛西亚公司生产)分离。步骤(2)加热处理中活性碳加入量优选4％(W/V比)，进行80℃，10分钟的加热处理，步骤(3)的柠檬酸钠改为磷酸钠溶液。

制备例3

同制备例1，只是步骤(1)一次脱盐处理，上样量以50％柱体积进行，进入G-25medium介质(瑞典发玛西亚公司生产)进行分离。步骤(2)中活性炭加入量为7％(W/V比)，进行72℃，20分钟的加热处理。得到的组分D最终总蛋白浓度5％(50mg/ml)，重组人血白蛋白和酵母酵素的浓度为10％(100mg/ml)。

制备例1-3得到的终产品结果分析见表1：

                         表1

产品名	产品质量及制备收率
							收率％	单体含量％(HPLC方法)	酵母多糖含量mg/mg总蛋白	色素比值A280/A350	酵母蛋白mg/g总蛋白	外观
	制备例1产品	95.6	76	0.52	0.090	12.2							澄清，基本无异味
制备例2产品							92.0	73	0.72	0.085	10	澄清，基本无异味
	制备例3产品	86.1	74.0	0.99	0.075	4.5							澄清，无味

上表中，酵母多糖和酵母蛋白的含量相加即为酵母酵素的含量；收率为步骤(1)-(4)中总蛋白的收率，单体为rHSA单体。

总蛋白浓度测定，Bradford方法(参照碧云天生产Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明)。

糖分析电泳结果见图1(电泳方法参照《分子克隆》第二版918页，糖染色方法参照张惟杰《糖复和物生化研究技术》第80页“多糖的凝胶电泳”)。

单体白蛋白含量测定：以HPLC方法，Superdex 200柱分析(参照林炳承等编写的《高压液相色谱在生命科学中的应用糖复和物生化研究技术》第92页凝胶色谱)，结果见图3。

酵母蛋白测定：ELISA方法检测(参照Cygnus Technologies《PichiaPastoris Host Cell Proteins》说明书)。

多糖含量测定：硫酸-苯酚法(参照张惟杰《糖复和物生化研究技术》第11页)

源于酵母的色素值A350/A280：紫外分光光度计法(参照DELTA专利“高纯度白蛋白生产方法”第40-41页，申请号96195824.3)。

实施例 含重组人血白蛋白和酵母酵素混合物的组合物实施例见表2

表2(表中数据为各组分的重量占配方总重量的重量百分比)

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5
						重组人血白蛋白和酵母酵素混合物	0.2	2	0.2	0.5	0.25
甘油	3	5	10	5
						丙二醇	4	-	-	-	4
丁二醇	-	-	-	-	5
						凡士林	-	-	-	10
月桂醇硫酸酯钠	-	-	-	1
						卡泊姆1342	0.01	0.5	0.1	-	0.1
吐温-60	1	-	2	1
						胆固醇	-	-	3	-
聚乙二醇400	-	-	-	5
						卵磷脂	-	-	5	-
甘油单硬酯酸酯	-	-	-	2
						尼泊金乙酯	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
去离子水加至	100	100	100	100	100
						无纺布	-	-	-	-	浸泡
性状	透明溶液	透明或半透明凝胶	类白色乳液	类白色霜	湿润的无纺布

表2中重组人血白蛋白和酵母酵素混合物为制备例3得到的终产品-组分D，对应的数据以重组人血白蛋白和酵母酵素的重量计。

实验例1重组人血白蛋白和酵母酵素混合物除皱和保湿效果实验

将重组人血白蛋白和酵母酵素混合物(制备例3的产品，蛋白浓度5％，即50mg/ml)原液，用超纯水稀释制备5组样品(各组的比例均为体积比)

第一组1∶49(重组人血白蛋白和酵母酵素混合物：水)

第二组1∶9(重组人血白蛋白和酵母酵素混合物：水)

第三组1∶4(重组人血白蛋白和酵母酵素混合物：水)

第四组1∶1.5(重组人血白蛋白和酵母酵素混合物：水)

第五组1∶0(重组人血白蛋白和酵母酵素混合物：水)

每组征集30名志愿者，进行去除眼角皱纹实验。右眼使用上述产品，每天一次，左眼不用。

第一组使用1个月，80％有效，20％无效；

第二组使用1个月，90％有效，10％无效；

第三组使用1个月，30％显效，60％有效，10％无效；

第四组使用半个月，40％显效，50％有效，10％无效；

第五组使用十天，50％显效，40％有效，10％无效；。

本实验例中，疗效标准：皱纹消失，为显效；皱纹变浅，为有效；皱纹无好转，为无效。受试者大多反映使用本品后有舒适感，皮肤光滑细腻，保湿作用明显。

实验例2 含有重组人血白蛋白和酵母酵素混合物对重组人表皮生长因子的稳定性实验，结果见表3、表4。

A重组人表皮生长因子rh-E G F原液rh-EGF2000IU/ml(华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供)

B重组人血白蛋白和酵母酵素混合物(实施例3的终产品-组分D)

第一组：A重组人表皮生长因子rh-EGF原液rh-EGF2000IU/ml；

第二组：A+B水溶液，含A 2000IU B重组人血白蛋白浓度0.6mg/ml，酵母酵素浓度0.6mg/ml；

第三组：A+B水溶液，含A 2000IU B重组人血白蛋白2.4mg/ml，酵母酵素2.4mg/ml；

第四组：A+B水溶液，含A 2000IU B重组人血白蛋白4.0mg/ml，酵母酵素4.0mg/ml；

                         表3

A活性单位(室温放置，25℃)
					时间(月)	第一组	第二组	第三组	第四组
0	2000.0	2000.0	2000.0	2000.0
					1	1725.07	2105.2	2005.25	1975.95
2	1562.05	1900.50	2015.50	2125.52
					3	815.65	1765.20	1925.50	2050.20
4	602.05	1825.60	1907.50	1982.32
					5	205.2	1536.53	1875.62	1900.65
6	57.25	1385.25	1830.65	1960.66

表4

A活性单位(放置，37C)
					时间(月)	第一组	第二组	第三组	第四组
0	2000.0	2000.0	2000.0	2000.0
					1	25.2	1805.65	1925.25	2005.32
2	0	1505.33	1725.4	1856.60
					3	0	1000.65	1650.20	1680.20

rh-EGF单位测定用BaIB/c3T3细胞株/MTT比色法生物学活性测定方法(参照2005年版《中国药典三部》附录XH)

从以上两表可以看出，加入含有重组人血白蛋白和酵母酵素混合物后表皮生长因子的稳定性大大提高。

实验例3 含有重组人血白蛋白和酵母酵素混合物的组合物的眼刺激实验

根据《化妆品卫生规范》(1999)对样品进行了急性眼刺激性试验，结果如下。实验方法按实施例1、2制备出的样品，用家兔(新西兰大耳白，河北省实验动物中心，雌雄兼有，体重2~3kg)进行眼刺激性试验。

试验方法：每组4只动物，实验时，以卡芥苗注射器或小匙取受试物约0.1ml(g)直接滴(涂)入实验动物左侧的结膜囊中，被动闭合其上下眼睑6秒在24小时内不冲洗动物眼睛作不冲洗眼刺激性试验。同一动物的右眼以生理盐水作为对照。随后于1、24、48和72小时及第4天和第7天按《化妆品卫生规范》中急性眼刺激性和腐蚀性试验所载的表1与表2进行反应评分及眼刺激性强度分级，共分为无刺激性、轻度刺激性、中度刺激性、重度刺激性4个档次。

打分结果见表5：

       表5实施例1眼刺激性试验结果(n＝4)

观察时间(小时)	角膜	虹膜	结膜	积分情况
					1	0	0	0	0
24	0	0	0.5	0.5
					48	0	0	0.5	0.5
72	0	0	0	0
					96	0	0	0	0
168	0	0	0	0

表6实施例2眼刺激性试验结果(n＝4)

观察时间(小时)	角膜	虹膜	结膜	积分情况
					1	0	0	0	0
24	0	0	0.25	0.25
					48	0	0	0	0
72	0	0	0	0
					96	0	0	0	0
168	0	0	0	0

结果表明，4只家兔各测试点无论是一次还是多次眼刺激试验，其结膜、虹膜、角膜和对照眼各测试时间点眼刺激反应积分最高平均积分为0.5分，在兔眼中只造成轻微不适和轻微充血，裂隙灯下检查表明组织中无变化，停药后三者积分均为0，均未达到刺激程度标准，证明该眼霜无刺激性。

实验例  4含有重组人血白蛋白和酵母酵素混合物的组合物的皮肤刺激性试验

皮肤刺激实验方法(肉眼观察)依据《化妆品卫生规范》进行。病理积分≥4或肉眼观察平均积分≥2为超标限值。样品为实施例3和4制备的样品。

完整性皮肤刺激试验一次性刺激试验：家兔4只，体重1.75～2.2kg，雌雄各半。试验前24h，兔背二侧皮肤剪毛各3cm×6cm；给样品时取0.2g，直接涂抹在右侧皮肤上，左侧涂蒸馏水0.2ml，再分别包扎固定24h；试验后用蒸馏水洗净擦干。去除受试物，于1、24、48h观察涂抹部位皮肤反应。

完整皮肤一次性刺激试验结果：参照规定标准，进行对皮肤刺激积分计数，试验侧和对照侧1、24和48h均为0，即无论哪一组，均无红斑或水肿现象，表明受试物的刺激强度为无刺激性。

完整皮肤多次刺激试验：家兔6只，体重1.9～2.2kg，雌雄各半。试验前24h，脱去脊椎两侧毛，面积分别为3cm×6cm；单笼饲养，右侧脱毛区涂0.2g，左侧涂蒸馏水作对照；每日一次，连续涂药14d，每天涂样品前根据情况剪毛，注意不得损伤皮肤；每天观察皮肤反应。并取涂样品部位的皮肤进行病理学、组织学检查。

完整皮肤多次刺激试验结果表明：6只家兔均无真皮血管扩张、充血、水肿现象，判断受试物对皮肤无明显刺激性。

实验例5 含有重组人血白蛋白和酵母酵素混合物的组合物稳定性实验见表7、表8

实施例得到的组合物分别在25℃放置6个月和40℃放置3个月后检测总蛋白含量(检测方法见本发明第十页)和单体蛋白含量(电泳方法参照《分子克隆》第二版918页还原SDS-PAGE进行扫描后所得数据)

                表7(室温放置，25℃)

	实施例1		实施例2		实施例3		实施例4
									放置时间(月)	总蛋白含量mg/g产品	白蛋白单体变化	总蛋白含量mg/g产品	白蛋白单体变化	总蛋白含量mg/g产品	白蛋白单体变化	总蛋白含量mg/g产品	白蛋白单体变化
0	0.1	72.3％	1	72.3％	0.1	72.3％	0.25	72.3％
									1	0.08	71.5	1.1	73.0	0.08	69.5	0.26	71.2
2	0.08	69.6	0.8	70.6	0.09	87.6	0.23	69.6
									3	0.09	70.6	0.9	69.6	0.1	72.3	0.21	71.2
4	0.12	68.5	1.0	68.9	0.11	69.8	0.26	68.5
									5	0.1	71.6	0.9	71.7	0.1	71.6	0.23	72.0
6	0..09	70.2	0.9	70.9	0.9	70.6	0.24	70.2

表8(40℃放置)

	实施例1		实施例2		实施例3		实施例4
									放置时间(月)	总蛋白含量mg/g产品	白蛋白单体变化	总蛋白含量mg/g产品	白蛋白单体变化	总蛋白含量mg/g产品	白蛋白单体变化	总蛋白含量mg/g产品	白蛋白单体变化
0	0.1	72.3％	1	72.3％	0.1	72.3％	0.25	72.3％
									1	0.07	70.5	0.8	69.0	0.08	69.5	0.24	69.5
2	0.08	68.6	0.9	69.6	0.09	68.9	0.24	70.2
									3	0.09	69.0	0.9	71.1	0.09	70.2	0.23	70.2

由以上两表可以看出，组合物中重组人血白蛋白稳定性良好。

实验例6含有重组人血白蛋白和酵母酵素混合物的组合物志愿者使用后抗皱

效果评价

使用方法：选择志愿者40名(女性，年龄30-40岁)，早晚涂抹于眼角皮肤，14天为1疗程，一只眼所用样品为实施例2样品，另一只眼为空白对照品。用样品侧疗效标准：皱纹消失，为显效；皱纹变浅，为有效；皱纹无好转，为无效。治疗效果显效10例(25％)，有效26例(65％)，无效4例(10％)，总有效率90％。受试者大多反映使用本品后有舒适感，保湿作用明显。

Claims (19)

1.一种重组人血白蛋白和酵母酵素混合物，其中重组人血白蛋白与酵母酵素重量比为1∶0.5-1.0。

2.权利要求1所述混合物的制备方法，包括将经过PCR技术构建的含人血白蛋白基因的巴斯德毕赤酵母进行发酵得到发酵液，发酵液经以下步骤：

(1)发酵液经离心得发酵上清，上清液脱盐处理；

(2)加热处理，离心分离；

(3)二次脱盐换液；

(4)膜浓缩。

3.权利要求2所述的方法，其中步骤(1)脱盐用介质为Sephadex G-10或G-15或G-25或G-50 coarse或medium或fine介质，优选G-25 fine介质。

4.权利要求2所述的方法，其中步骤(2)加热处理在热稳定剂、金属螯合剂和脱色剂存在的情况下进行，热稳定剂为辛酸钠，金属螯合剂可以为EDTA或EGTA之一，脱色剂可以为硅藻土或活性炭，优化地选择活性炭；加热处理温度为60~80℃，10~60分钟。

5.权利要求2所述的方法，其中步骤(3)采用使用G-25脱盐柱换液至pH7.0的柠檬酸钠或磷酸盐溶液中。

6.一种组合物，含有权利要求1的混合物、保湿剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂。

7.权利要求6所述的组合物，其中保湿剂可以是丙二醇或甘油，维生素类(VA，VE)，脂肪酸(亚油酸，亚麻酸，花生四稀酸)，泛醇，胆固醇，神经酰胺，透明质酸钠，芦荟之一或其混和物。

8.权利要求6所述的组合物，其中增稠剂可以是卡波姆，泊洛沙姆，HPMC，MC，GALLEN GUM，透明质酸钠，凡士林，碳氢矿物油，以及十四烷酸异丙酯或棕榈酸酯；也可以为脂肪，油类、蜡类、包括羊毛脂，脂肪酸，脂肪醇，三甘油酯，蜡酯及多元醇酯之一或其混和物。

9.权利要求6所述的组合物，其中的乳化剂可以是卵磷脂，胆甾醇，吐温20、40、60、80，斯盘20、40、60、80，十二烷基硫酸钠，月桂醇硫酸酯钠之一或其混和物。

10.权利要求6所述的组合物，其中防腐剂可以是尼泊金乙酯、丁酯、甲酯、硫柳汞、咪唑烷基脲、氯甲酚之一。

11.权利要求6-10任一所述的组合物，各组分的比例为重组人血白蛋白和酵母酵素混合物0.05-5.0％，乳化剂0.1-15％，增稠剂0.05-30％，保湿剂0.005-20％，防腐剂0.0005-1％，其余为水。

12.权利要求11所述的组合物，各组分的比例为重组人血白蛋白和酵母酵素混合物0.5-2.5％，乳化剂0.5-10％，增稠剂0.1-20％，保湿剂0.01-10％，防腐剂0.005-0.1％，其余为水。

13.权利要求1所述的混合物在皮肤保湿、防皱、除皱、美白方面的用途。

14.权利要求1所述的混合物作为细胞因子稳定剂的用途。

15.权利要求6-12任一所述的组合物在皮肤保湿、防皱、除皱、美白方面的用途。

16.含有权利要求1所述混合物的制剂，包括水溶液、水凝胶、乳液、膏霜或皮肤贴膜。

17.含有权利要求6-12任一所述组合物的制剂，包括水溶液、水凝胶、乳液、膏霜或皮肤贴膜。

18.一种含有权利要求1所述混合物的皮肤贴膜，所述贴膜以棉布、小织布、木浆或生物纤维为载体。

19.一种含有权利要求6-12任一所述组合物的皮肤贴膜，所述贴膜以棉布、小织布、木浆或生物纤维为载体。

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