CN114317661B - 一种制备多重活性胶原的方法 - Google Patents
一种制备多重活性胶原的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114317661B CN114317661B CN202210137537.7A CN202210137537A CN114317661B CN 114317661 B CN114317661 B CN 114317661B CN 202210137537 A CN202210137537 A CN 202210137537A CN 114317661 B CN114317661 B CN 114317661B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- collagen
- feed liquid
- solution
- skin
- molecular weight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 197
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 197
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 195
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000003825 pressing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 121
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 33
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 19
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 16
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 16
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 13
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 12
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 6
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 6
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 6
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 4
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000270 Ficain Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 3
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 235000019836 ficin Nutrition 0.000 claims description 3
- POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N ficin Chemical compound FI=CI=N POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 3
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 claims description 2
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 abstract description 41
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 abstract description 9
- 238000009826 distribution Methods 0.000 abstract description 7
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 abstract description 4
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 abstract description 3
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 abstract description 3
- 239000012466 permeate Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 29
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 25
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 24
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 16
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 10
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 10
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 9
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 9
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 8
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 8
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 6
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 6
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 6
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 5
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 4
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000009759 skin aging Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 102100030944 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase K Human genes 0.000 description 3
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 3
- 230000000431 effect on proliferation Effects 0.000 description 3
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108010058734 transglutaminase 1 Proteins 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 2
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol dimethacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCOC(=O)C(C)=C STVZJERGLQHEKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- -1 microneedle Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000037394 skin elasticity Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 206010024604 Lipoatrophy Diseases 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 206010040880 Skin irritation Diseases 0.000 description 1
- 101000693530 Staphylococcus aureus Staphylokinase Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001736 capillary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000002932 luster Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008099 melanin synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 229920006284 nylon film Polymers 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000013215 result calculation Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 1
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000036556 skin irritation Effects 0.000 description 1
- 231100000475 skin irritation Toxicity 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
本发明公开了一种制备多重活性胶原的方法，包括如下步骤：(1)预处理；(2)去除杂蛋白；(3)酶解；(4)梯度化反应；(5)压滤；(6)纳滤；(7)冷冻干燥，得到所述多重活性胶原。该胶原保持了胶原蛋白的三螺旋活性结构，分子量为1～300kDa，呈梯度分布，分子量50kDa以上的大分子胶原所占比例为25％～30％，分子量10～50kDa的中分子胶原所占比例为55％～60％，分子量10kDa以下的小分子胶原所占比例为10％～20％。不同分子量的胶原能渗透到皮肤的不同层面，大分子胶原填充基底层，中分子胶原进入真皮层，小分子胶原提供肌肤所需营养。本发明多重活性胶原尤其适合应用于医美化妆品行业。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性胶原制备的领域，尤其是涉及一种制备多重活性胶原的方法。
背景技术
胶原是皮肤组织的主要蛋白质成分，胶原是由成纤维细胞合成的，随着年龄的增加，成纤维细胞的合成能力下降，若皮肤中缺乏胶原蛋白，胶原纤维就会发生交联固化，使细胞间粘多糖减少，皮肤便会失去柔软、弹性和光泽，发生老化，同时真皮的纤维断裂、脂肪萎缩、汗腺及皮脂腺分泌减少，使皮肤出现色斑、皱纹等一系列老化现象。
美容胶原是一种新型抗衰老美容材料。美容胶原与人体组织亲和性很好，有利于自身组织的修复再生。实验表明，注射胶原蛋白几周后，体内成纤维细胞、脂肪细胞及毛血管向注射的胶原蛋白内移行，组合成自身胶原蛋白，从而形成正常的结缔组织，使受损老化的皮肤得到填充和修复，达到延缓皮肤衰老的目的。由于在皮肤衰老过程会发生一系列的变化，胶原蛋白的独特结构性能决定了其具有广阔的市场应用前景。也不断的促使人们对胶原蛋白及其制品进入广泛深入的研究和产品的技术创新，特别是用在生物医学领域的胶原蛋白以及含胶原蛋白制品将会不断出现，越来越多的满足了人们的不同需要。运用它来预防和延缓皮肤衰老，胶原蛋白将会更广泛地造福人类。
众所周知，医美化妆品中的有效成分(如胶原、透明质酸等)只有进入表皮或真皮并在该部位聚集才能发挥其特有的功效。例如，美白产品中的美白剂需要透过角质层作用于表皮中的基底层，阻断黑色素的产生。体外补充胶原蛋白使其进入真皮层补充体内的胶原纤维，才能恢复皮肤的弹性。但是由于胶原是大分子物质，很难直接被皮肤吸收利用，所以往往需要通过医美技术(如注射、微针、水光枪等)使胶原蛋白进入到真皮层，发挥其特有的功效，单单靠涂抹很难使胶原蛋白得到有效的利用。一些更小分子量的胶原蛋白肽，虽然能被皮肤吸收利用，但因为其已经在酸、碱、热、酶的作用下水解成胶原蛋白水解产物，其三螺旋结构已经完全丧失，不具备胶原蛋白特有的生物活性功能，只能作为营养剂被人体吸收利用。
因此，开发一种既能够被人体皮肤吸收，又能保持胶原蛋白的三螺旋活性结构的多重活性胶原，使胶原蛋白能进入到真皮层，发挥其促进细胞增殖迁移、调节组织修复再生、延缓皮肤衰老等生物功效，对于医美化妆品行业的发展具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种制备多重活性胶原的方法。本发明胶原是一种既能够被人体皮肤吸收，又能保持胶原蛋白的三螺旋活性结构的多重活性胶原。采用不同的动物皮片组织(猪皮、鱼皮或牛皮)经预处理和酶解工艺提取出大分子的胶原蛋白，再通过梯度化反应、纯化、冻干等工艺，制备多重活性胶原。
本发明的技术方案如下：
一种制备多重活性胶原的方法，包括以下步骤：
(1)预处理：将动物皮片进行预处理，去除毛发和脂肪；
(2)去除杂蛋白：将预处理完成的皮片，用NaOH和/或NaCl浸泡处理；
(3)酶解：将步骤(2)处理后的皮片投入到醋酸溶液中，加入一定量的胃蛋白酶，酶解处理；
(4)梯度化反应：步骤(3)得到的酶解溶液分成至少两份；
a.其中第一份，调节料液温度至38～42℃，匀速搅拌，待料液完全失去粘度，加入一定量的胃蛋白酶，调节料液pH值为1.8～2.2，反应温度为25～37℃，反应一段时间；反应结束，调节料液pH值至10.0～10.5，保持一段时间，再调节料液pH值至7.0～7.5，完成后，室温保存；
b.其中第二份，加入一定量的蛋白酶，升温至40～45℃，pH至4～4.5，反应一段时间；反应结束，调节料液pH值至10.0～10.5，保持一段时间，再调节料液pH值至7.0～7.5，完成后，室温保存；
c.将上述第一份和第二份得到的料液混合；
(5)压滤：将上述步骤(4)制备得到的料液，用滤布袋过滤去除残渣，再经过0.45μm和5μm滤芯过滤后，得到溶液；
(6)纳滤：用纳滤设备先将压滤后的料液浓缩，然后再洗滤脱盐；
(7)冷冻干燥：将步骤6得到的料液用冻干机冷冻干燥，得到所述多重活性胶原。
进一步的，所述步骤(1)具体包括以下步骤：将动物湿皮片用剃毛器剔除表面长毛，用剖层机剖去绒毛层和脂肪层，清洗干净后用粉碎机切成碎片，冷冻备用。
进一步的，所述步骤(2)中，NaOH溶液的浓度为4％～8％，优选4％～6％；NaCl溶液的浓度为8％～15％，优选10％～12％；料液比为1:5～1:10，优选1:8；浸泡时间为0.5～4h，优选2～3h。
进一步的，所述步骤(3)中，胃蛋白酶的添加量为0.1％～1％，优选0.5％～0.8％；料液比为1:20～1:80，优选1:40～1:60；酶解pH为1.8～2.2，优选2.0；酶解温度为4～25℃，优选20～25℃；酶解时间为24～48h，优选36～40h。
进一步的，所述步骤(4)中，分成两份溶液，所述第一份溶液与所述第二份溶液的体积比为1:1～3:1，优选2:1。
进一步的，所述步骤(4)a中，胃蛋白酶的添加量为0～0.5％，优选0.1％～0.3％；反应时间为3～8h，优选3～5h。
进一步的，所述步骤(4)b中，所述蛋白酶为菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或两种；蛋白酶的添加量为0.003％～0.1％，优选0.005％～0.008％；反应时间为2～6h，优选4～5h。
进一步的，所述步骤(5)中，经过2次压滤，第一次用5μm滤芯过滤，第二次用0.45μm滤芯过滤。
一种由所述的方法制备获得的多重活性胶原，所述胶原的分子量范围为1～300kDa，呈梯度分布；分子量50kDa以上的大分子胶原所占比例为25％～30％，分子量10～50kDa的中分子胶原所占比例为55％～60％，分子量10kDa以下的小分子胶原所占比例为10％～20％。
一种所述的多重活性胶原在制备修复/护理皮肤的药品、保健品或者护肤品中的用途。
本发明有益的技术效果在于：
因为现有技术具有以下三大缺点：
1.从动物组织中提取的活性胶原多为大分子胶原，分子量通常为300kDa及以上，很难被人体皮肤吸收。涂抹于皮肤表面后不能得到有效的利用，需要通过医美技术(如注射、微针、水光枪等)使胶原蛋白进入到真皮层，发挥其真正的生物功效。
2.从动物组织中提取的胶原蛋白肽，分子量通常在几千到几万不等，虽然分子量小的胶原蛋白肽能被皮肤吸收，但是因其已经在酸、碱、热、酶的作用下水解成胶原蛋白水解产物，其三螺旋结构已经完全丧失，不具备胶原蛋白特有的生物活性功能，只能作为营养剂被人体吸收利用。
3.功效比较单一。
本发明克服了上述缺点，具有以下三大优点：
1.通过酶解-梯度化反应，制备得到的多重活性胶原，分子量为1～300kDa，呈梯度分布，分子量50kDa以上的大分子胶原所占比例为25％～30％，分子量10～50kDa的中分子胶原所占比例为55％～60％，分子量10kDa以下的小分子胶原所占比例为10％～20％。(原因：不同分子量的胶原能渗透到皮肤的不同层面，大分子胶原(分子量50kDa以上)填充基底层，促进基底层角蛋白细胞细胞增殖、迁移和分化，新的角质细胞代替受损细胞，形成强韧的角质层，完成皮肤屏障的修复；中分子胶原(分子量10～50kDa)进入真皮层，提供细胞支架，利于细胞再生与迁移，促进成纤维细胞增殖，分泌胶原及弹性蛋白，促进胶原蛋白再生，提高肌肤弹性。小分子胶原(分子量10kDa以下)被吸收后，提供肌肤所需营养，从而加速新陈代谢，由内而外的改善肤质，使皮肤表面光洁、清透。)
2.多重活性胶原保持了胶原蛋白的三螺旋结构，具有生物活性功能。(原因：通过先变性再复性的技术，使大分子量和中分子量的胶原仍具有三螺旋结构。胶原的生物学功能的发挥主要取决于其具有的三螺旋结构，一旦三螺旋结构遭到破坏，甚至丧失，其生物学功能也就不复存在了。)
3.多重活性胶原兼具损伤修复、抗衰、保湿的功效。(通过角质形成细胞、成纤维细胞和SLS刺激表皮模型进行功效评价验证。)
附图说明
图1为多重活性胶原制备原理图；
图2为本发明工艺流程图；
图3为实施例1制备得到的多重活性胶原的GPC分子量分布图谱；
图4为实施例1制备得到的多重活性胶原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图5为实施例1制备得到的多重活性胶原的圆二色谱图；
图6为不同浓度实施例1制备得到的多重活性胶原溶液培养下角质形成细胞形态学图；
图7为不同浓度实施例1制备得到的多重活性胶原溶液培养下成纤维细胞形态学图；
图8为实施例1制备得到的多重活性胶原对角质形成细胞、成纤维细胞增殖结果；
图9为实施例1制备得到的多重活性胶原对角质形成细胞迁移结果；
图10为实施例1制备得到的多重活性胶原对成纤维细胞迁移结果；
图11为实施例1制备得到的多重活性胶原对成纤维细胞内抗衰基因表达量的检测结果；
图12为实施例1制备得到的多重活性胶原对模型的组织形态改善检测结果；
图13为实施例1制备得到的多重活性胶原对模型内屏障相关蛋白表达量的检测结果；
图14为实施例1制备得到的多重活性胶原对模型的组织活力改善检测结果；
图15为实施例1制备得到的多重活性胶原对模型内天然保湿因子PCA，UCA表达量的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场渠道购获得的常规试剂产品。
原理如附图1所示，该多重活性胶原保持了胶原蛋白的三螺旋活性结构，分子量为1～300kDa，呈梯度分布，分子量50kDa以上的大分子胶原所占比例为25％～30％，分子量10～50kDa的中分子胶原所占比例为55％～60％，分子量10kDa以下的小分子胶原所占比例为10％～20％。不同分子量的胶原能渗透到皮肤的不同层面，大分子胶原填充基底层，促进基底层角蛋白细胞细胞增殖、迁移和分化，新的角质细胞代替受损细胞，形成强韧的角质层，完成皮肤屏障的修复；中分子胶原进入真皮层，提供细胞支架，利于细胞再生与迁移，促进成纤维细胞增殖，分泌胶原及弹性蛋白，促进胶原蛋白再生，提高肌肤弹性。小分子胶原被吸收后，提供肌肤所需营养，从而加速新陈代谢，由内而外的改善肤质，使皮肤表面光洁、清透。此发明制备得到的多重活性胶原可作为一种新型的胶原蛋白原料，尤其适合应用于医美化妆品行业。
实施例1
一种制备多重活性胶原的方法，工艺流程如附图2所示，具体包括以下步骤：
1.将湿猪皮用剖层机，剖去毛发层和脂肪层，清洗干净后用粉碎机切成碎片，冷冻备用。
2.1.取预处理完成的猪皮1000g，浸泡在8％NaOH溶液中，料液比为1：5，浸泡时间为2h，然后用纯化水清洗数遍，甩干。
2.2.取处理完后的皮片，浸泡在10％氯化钠溶液中，料液比1：5，浸泡时间为2h，然后用纯化水清洗三遍，甩干。
3.将碱和盐处理后的皮片投入到0.5moL/L醋酸溶液中，加入2g胃蛋白酶，调节料液pH为1.8～2.0，20～25℃下酶解反应48h。
4.反应结束，将酶解液按体积比2：1分成两份。
4.1.其中第1份，调节料液温度至38～42℃，匀速搅拌，待料液完全失去粘度。然后加入1g胃蛋白酶，调节料液pH值为1.8～2.2，料液温度为37℃，反应5h。反应结束，调节料液pH值至10.0～10.5，保持5h以上，再调节料液pH值至7.0～7.5，完成后，室温保存。
4.2.其中第2份，加入0.015g菠萝蛋白酶，升温至45℃，调节料液pH至4～4.5，反应4h。反应结束，调节料液pH值至10.0～10.5，保持5h以上，再调节料液pH值至7.0～7.5，完成后，室温保存。
4.3.将上述两份料液混合均匀，10℃以下静置24～48h。
5.静置结束，将料液用滤布袋过滤去除残渣，再经过5μm及0.45μm滤芯过滤后，得到澄清透明的溶液。
6.然后用纳滤设备先将压滤后的料液浓缩4～5倍，然后再洗滤脱盐，直至洗脱液的电导率<200us为洗脱终点。
7.最后将上述制备得到的多重活性胶原溶液用冻干机冷冻干燥，即得多重活性胶原。
实施例2
一种制备多重活性胶原的方法，工艺流程如附图2所示，具体包括以下步骤：
1.将湿猪皮用剖层机，剖去毛发层和脂肪层，清洗干净后用粉碎机切成碎片，冷冻备用。
2.1.取预处理完成的猪皮1000g，浸泡在4％NaOH溶液中，料液比为1：10，浸泡时间为3h，然后用纯化水清洗数遍，甩干。
2.2.取处理完后的皮片，浸泡在15％氯化钠溶液中，料液比1：10，浸泡时间为0.5h，然后用纯化水清洗三遍，甩干。
3.将碱和盐处理后的皮片投入到0.5moL/L醋酸溶液中，加入5g胃蛋白酶，调节料液pH为1.8～2.0，20～25℃下酶解反应24h。
4.反应结束，将酶解液按体积比1：1分成两份。
4.1.其中第1份，调节料液温度至38～42℃，匀速搅拌，待料液完全失去粘度。然后加入2.5g胃蛋白酶，调节料液pH值为1.8～2.2，料液温度为37℃，反应8h。反应结束，调节料液pH值至10.0～10.5，保持5h以上，再调节料液pH值至7.0～7.5，完成后，室温保存。
4.2.其中第2份，加入0.04g无花果蛋白酶，升温至45℃，调节料液pH至4～4.5，反应2h。反应结束，调节料液pH值至10.0～10.5，保持5h以上，再调节料液pH值至7.0～7.5，完成后，室温保存。
4.3.将上述两份料液混合均匀，10℃以下静置24～48h。
5.静置结束，将料液用滤布袋过滤去除残渣，再经过5μm及0.45μm滤芯过滤后，得到澄清透明的溶液。
6.然后用纳滤设备先将压滤后的料液浓缩4～5倍，然后再洗滤脱盐，直至洗脱液的电导率<200us为洗脱终点。
7.最后将上述制备得到的多重活性胶原溶液用冻干机冷冻干燥，即得多重活性胶原。
实施例3
一种制备多重活性胶原的方法，工艺流程如附图2所示，具体包括以下步骤：
1.将湿牛皮用剖层机，剖去毛发层和脂肪层，清洗干净后用粉碎机切成碎片，冷冻备用。
2.1.取预处理完成的牛皮1000g，浸泡在6％NaOH溶液中，料液比为1：8，浸泡时间为0.5h，然后用纯化水清洗数遍，甩干。
2.2.取处理完后的皮片，浸泡在12％氯化钠溶液中，料液比1：8，浸泡时间为4h，然后用纯化水清洗三遍，甩干。
3.将碱和盐处理后的皮片投入到0.5moL/L醋酸溶液中，加入10g胃蛋白酶，调节料液pH为2.0～2.2，10～15℃下酶解反应36h。
4.反应结束，将酶解液按体积比3：1分成两份。
4.1.其中第1份，调节料液温度至38～42℃，匀速搅拌，待料液完全失去粘度。然后加入4g胃蛋白酶，调节料液pH值为1.8～2.2，料液温度为37℃，反应3h。反应结束，调节料液pH值至10.0～10.5，保持5h以上，再调节料液pH值至7.0～7.5，完成后，室温保存。
4.2.其中第2份，加入0.01g木瓜蛋白酶，升温至45℃，调节料液pH至4～4.5，反应6h。反应结束，调节料液pH值至10.0～10.5，保持5h以上，再调节料液pH值至7.0～7.5，完成后，室温保存。
4.3.将上述两份料液混合均匀，10℃以下静置24～48h。
5.静置结束，将料液用滤布袋过滤去除残渣，再经过5μm及0.45μm滤芯过滤后，得到澄清透明的溶液。
6.然后用纳滤设备先将压滤后的料液浓缩4～5倍，然后再洗滤脱盐，直至洗脱液的电导率<200us为洗脱终点。
7.最后将上述制备得到的多重活性胶原溶液用冻干机冷冻干燥，即得多重活性胶原。
实施例4
一种制备多重活性胶原的方法，工艺流程如附图2所示，具体包括以下步骤：
1.将湿猪皮用剖层机，剖去毛发层和脂肪层，清洗干净后用粉碎机切成碎片，冷冻备用。
2.1.取预处理完成的猪皮1000g，浸泡在5％NaOH溶液中，料液比为1：8，浸泡时间为2h，然后用纯化水清洗数遍，甩干。
2.2.取处理完后的皮片，浸泡在10％氯化钠溶液中，料液比1：8，浸泡时间为3h，然后用纯化水清洗三遍，甩干。
3.将碱和盐处理后的皮片投入到0.5moL/L醋酸溶液中，加入5g胃蛋白酶，调节料液pH为2.0～2.2，4～10℃下酶解反应36h。
4.反应结束，将酶解液按体积比2：1分成两份。
4.1.其中第1份，调节料液温度至38～42℃，匀速搅拌，待料液完全失去粘度。然后加入2.5g胃蛋白酶，调节料液pH值为1.8～2.2，料液温度为37℃，反应5h。反应结束，调节料液pH值至10.0～10.5，保持5h以上，再调节料液pH值至7.0～7.5，完成后，室温保存。
4.2.其中第2份，加入0.06g中性蛋白酶，升温至45℃，调节料液pH至4～4.5，反应4h。反应结束，调节料液pH值至10.0～10.5，保持5h以上，再调节料液pH值至7.0～7.5，完成后，室温保存。
4.3.将上述两份料液混合均匀，10℃以下静置24～48h。
5.静置结束，将料液用滤布袋过滤去除残渣，再经过5μm及0.45μm滤芯过滤后，得到澄清透明的溶液。
6.然后用纳滤设备先将压滤后的料液浓缩4～5倍，然后再洗滤脱盐，直至洗脱液的电导率<200us为洗脱终点。
7.最后将上述制备得到的多重活性胶原溶液用冻干机冷冻干燥，即得多重活性胶原。
测试例1
本测试例测试实施例1条件下制备的多重活性胶原分子量分布。
1、凝胶渗透色谱(GPC)法
方法：将多重活性胶原用超纯水溶解至浓度为2mg/mL，经0.22μm膜过滤后，采用凝胶渗透色谱(GPC，色谱柱：TSK～GEL G3000SWxL)对试验品进行分子量测定，流动相：NaAc～HAc(pH 4.5)，流速：0.5mL/min，柱温：25℃，进样体积：20μL。检测结果如图3、表1所示。
表1各实施例多重活性胶原分子量分布
图3为实施例1条件下制备得到的多重活性胶原的GPC分子量分布图谱。从图可以看出，多重活性胶原的GPC图谱在不同的时间点都有相对应的峰出现，说明多重活性胶原的分子量呈梯度分布，经计算得到各实施例的不同分子量物质所占比例及平均分子量如表1所示。从表中可以看出，多重活性胶原的平均分子量(Mw)在50kDa左右，呈梯度分布，分子量50kDa以上的大分子胶原所占比例为25％～30％，分子量10～50kDa的中分子胶原所占比例为55％～60％，分子量10kDa以下的小分子胶原所占比例为10％～20％。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
方法：取多重活性胶原，用纯化水溶解至浓度为2～4mg/mL的溶液，即为供试品。按《中华人民共和国药典(四部)》(2020年版)通则0541电泳法规定的方法(SDS～聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为15％，加样量为10～20μL)进行检测。
图4为实施例1条件下制备得到的多重活性胶原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。从图可以进一步证实多重活性胶原的分子量呈梯度分布，相对分子量呈1～300kDa分布。
测试例2
本测试例对实施例1条件下制备的多重活性胶原的三螺旋结构进行表征。
方法：取多重活性胶原，用纯化水溶解至浓度为0.5mg/mL的溶液，即为供试品。将供试品放置于4～10℃环境下48小时后进行测试。测试条件：扫描波长：190～260nm；带宽：1nm；比色皿长度：1mm；测试温度：22～25℃。
胶原蛋白的圆二色谱在197nm左右有个明显的负吸收峰，在221nm左右有个较弱的正吸收峰，属于典型的胶原三股螺旋构象结构。而胶原蛋白在变性过程中会伴随着221nm处的摩尔椭圆度少量减小以及199nm处摩尔椭圆度的增加，胶原蛋白完全变性时，221nm处的正峰完全消失，三股螺旋结构瓦解呈无规卷曲构象。即在221nm左右有正吸收峰说明有胶原蛋白三螺旋结构存在。图5为实施例1条件下制备得到的多重活性胶原的圆二色谱图。从图中可以看到，多重活性胶原在197nm左右的负吸收峰及221nm处的正吸收峰是典型的胶原螺旋构象结构，说明多重活性胶原具有稳定的三螺旋结构。
本发明申请改变反应条件等因素，最终所得的多重活性胶原的部分性能如表2所示。
表2各实施例条件下制备得到的多重活性胶原部分性能指标
测试例3
本测试例对实施例1条件下制备的多重活性胶原进行损伤修复、抗衰、、保湿等功效评价。
1、多重活性胶原安全浓度筛选(细胞毒性)
方法：(1)细胞接种：设立样品组与溶剂对照组，每组设两个复孔。按相应的接种密度接种细胞至24孔板中，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育过夜。
(2)配液：根据MTT检测结果，配制0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL多重活性胶原溶液，作为受试物工作液。
(3)给药：待24孔板细胞铺板率达到50％时，进行给药，样品组加入不同浓度的受试物，溶剂对照组加入培养液，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育24h。
(4)细胞观察：孵育结束后，显微镜下观察细胞形态并拍照。
图6为实施例1条件下制备得到的不同浓度多重活性胶原溶液培养下角质形成细胞形态学图；图7为实施例1条件下制备得到的不同浓度多重活性胶原溶液培养下成纤维细胞形态学图。从图中可以看出，实施例1条件下制备得到的多重活性胶原对于角质形成细胞在1mg/mL的范围内无细胞毒性，对于成纤维细胞在0.5mg/mL的范围内无细胞毒性。
2、基于细胞水平的损伤修复功效评价(细胞增殖、迁移)
细胞增殖方法：
(1)细胞接种：以3.5E3个/孔的细胞接种量接种细胞至96孔板中，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育过夜。
(2)配液：用无血清培养基作为空白对照，10％NBS溶液作为阳性对照，配制1mg/mL多重活性胶原溶液，作为角质形成细胞的受试物工作液；配制0.5mg/mL多重活性胶原溶液，作为成纤维细胞的受试物工作液。
(3)给药：待96孔板中细胞的铺板率达到20％～30％时，进行分组给药，每孔给药量为200μL，每组设3个复孔。培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中分别培养24h、48h、72h。
(4)检测：待细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入MTT工作液(0.5mg/mL，现配现用)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加150μL DMSO，在490nm处读取OD值。48h和72h的96孔板分别进行半换液处理，48h和72h后，进行上述MTT检测操作。
(5)细胞相对活力计算：根据公式计算，
图8为实施例1条件下制备得到的多重活性胶原对角质形成细胞和成纤维细胞增殖结果。从图中可以看出，与空白对照组相比，阳性对照组在24h、48h、72h均表现出细胞活力增长趋势，阳性对照组具有增殖作用，说明本次测试体系有效；试验样品多重活性胶原在浓度为1mg/mL的条件下，在角质形成细胞上作用24h、48h和72h，对角质形成细胞的增殖有显著促进作用；在浓度为0.5mg/mL的条件下，在成纤维细胞上作用24h、48h和72h，对成纤维细胞的增殖有显著促进作用，说明多重活性胶原对角质形成细胞和成纤维细胞均有明显的促进细胞增殖的效果。
细胞迁移方法：
(1)接种：按2E5个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育过夜。
(2)配液：用无血清培养基作为空白对照，10％NBS溶液作为阳性对照，配制1mg/mL多重活性胶原溶液，作为角质形成细胞的受试物工作液；配制0.5mg/mL多重活性胶原溶液，作为成纤维细胞的受试物工作液。
(3)给药：待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔给药量为2mL，每组设3个复孔。空白对照组每孔加入细胞培养液(无血清)；阳性对照组每孔加入含10％NBS的细胞培养液；样品组每孔加入相应浓度样品的细胞培养液(无血清)，培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)继续培养24h。
(4)划痕：样品后孵育结束后，进行划痕。用1000μL枪头在六孔板中纵向划两道，竖痕作为基线(枪头垂直尺子边缘)，痕间距保持在2cm；划完竖痕后，垂直于基线，在六孔板中轴线附近水平划痕。用枪头划痕时尽量用力均匀，尽量使划痕的宽度保持一致。
(5)清洗：划痕结束后，用PBS清洗细胞3次，加入正常的细胞培养液，培养箱(37℃、5％CO2、
95％RH)培养24h。
(6)拍照：划痕后0h在4倍镜下拍照，划痕24h后，用PBS清洗一次，4倍镜下拍照。
图9为实施例1条件下制备得到的多重活性胶原对角质形成细胞迁移结果；图10为实施例1条件下制备得到的多重活性胶原对成纤维细胞迁移结果。从图中可以看出，与空白对照组相比，试验样品多重活性胶原在1mg/mL的浓度下对角质形成细胞有明显的促进细胞迁移作用(p<0.01)；在0.5mg/mL的浓度下对成纤维细胞有明显的促进细胞迁移作用(p<0.01)。说明多重活性胶原对角质形成细胞和成纤维细胞均有明显的促进细胞迁移的效果。
综上所述，表明多重活性胶原具有一定的损伤修复功效。
3、基于成纤维细胞的抗衰功效评价(抗衰基因检测)
方法：(1)细胞接种：按1.8E5个/孔的接种密度接种成纤维细胞至6孔板，培养箱37、5％CO2中孵育过夜。
(2)配液：以无血清培养基作为空白对照，配制0.5mg/mL多重活性胶原溶液，作为受试物工作液。
(3)给药：待6孔板中细胞铺板率达到40％～50％时，进行分组给药，每孔给药量为2mL，每组设3个复孔。给药完成后将6孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2)中孵育培养24h。
(4)收样：2mL/孔PBS清洗两次，每孔加入1mL RNAiso Plus，吹打裂解细胞后收样。
(5)基因检测：依据试剂盒说明书，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR检测，采用2-△△CT方法进行结果计算。
图11为实施例1条件下制备得到的多重活性胶原对成纤维细胞内抗衰基因表达量的检测结果。从图中可以看出，与空白对照组(BC)相比，试验样品多重活性胶原在0.5mg/mL的浓度下，对成纤维细胞内基因Collagen I、Collagen IV和Laminin的表达量具有明显的提升作用(p<0.01)。说明多重活性胶原具有一定的抗衰功效。
4、基于模型的屏障损伤修复、保湿功效评价
方法：(1)、样品制备：
i.0.4％SLS母液配置：称取0.0080SLS溶于2mL PBS溶液中，0.22μm过滤，配制成0.4％SLS母液，备用。
ii.0.2％SLS工作液配置：吸取0.5mL 0.4％SLS溶液，加入0.5mL PBS配制成0.2％SLS工作液。
iii.阳性对照组(WY14643)工作液配置：称取10mg WY14643粉末溶于1mL DMSO中，配制成30mM WY14643母液；将8.3μL的WY14643母液(30mM)加入到5mL模型培养液中，配制成50μM的工作液，备用。
iv.样品配置：称取25mg的多重活性胶原，溶于5mL的PBS中，配成5mg/mL的母液，过滤，备用。吸取样品母液500μL加入500μL 0.4％SLS母液，混匀备用。
(2)、给药操作：
i.将模型转移到6孔板中(提前添加0.9mL模型培养液)，在6孔板上标注测试组编号。
ii.取配置好的不同组工作液25μL加于模型表面，阴性对照组和阳性对照组表面添加0.2％的SLS溶液，样品组添加相应浓度的工作液，用镊子夹取尼龙膜覆盖在每个模型表面，使样品均匀分布于模型表面，置于CO2培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中孵育24h。
iii.孵育结束后，用装有无菌PBS溶液的洗瓶清洗模型表面残留的受试物，用无菌棉签轻轻拭去模型内、外残留液体。
(3)、组织形态和屏障相关蛋白(FLG、LOR和TGM1)检测：取用于组织形态检测的模型用4％的多聚甲醛进行固定处理，固定24h后，将模型环切取下，分别进行H&E染色和屏障相关蛋白(FLG、LOR和TGM1)的免疫组化检测，显微镜下拍照观察，采集图片并分析。
(4)、组织活力检测：
i.根据实验分组，取用于组织活力检测的模型开展组织活力检测。
ii.MTT孵育：模型清洗结束后，根据模型数量准备24孔板，并做相应标记。每孔加入0.3mL的MTT工作液(1mg/mL)。将装有模型的24孔板放置于培养箱(37℃、5％CO2、95％RH)中，孵育3h±5min。
iii.异丙醇浸提：MTT孵育结束后，PBS清洗模型外表面，并用无菌棉签擦干，转移到新的24孔板中，并标记。在模型内加入2mL异丙醇，用封口膜密封24孔板，在孔板振摇器上震荡2h。
iv.酶标仪读数：用200μL移液器枪头刺穿模型，使异丙醇浸提液从模型内流出到24孔板中。丢弃被刺穿的模型，吹打每孔内的异丙醇浸提液3次使其充分混匀。混匀后，从每孔中吸取2份200μL异丙醇浸提液，分别加入96孔板的对应孔中，做好标记。采用异丙醇作为调零孔。酶标仪570nm波长读取吸光度(OD)值。
v.计算：按以下公式计算各试验分组的相对组织活力：
(给药孔OD—调零孔OD)/(对照孔OD—调零孔OD)＝Tissue Viability(％)
(5)、天然保湿因子检测：将孵育清洗后的皮肤模型(每组4个)用手术刀环切下，转移到1.5mL EP管中，加入500μL超纯水，使用超声振荡处理30min；离心后取上清液转移至新的Ep管中，并加入100μL流动相，利用高效液相色谱仪分别进行PCA和UCA的检测分析。最后绘制PCA、UCA标准曲线，通过液相检测的峰面积计算样品中PCA和UCA的含量。同时采用BCA试剂盒测定样品蛋白浓度，最终样品结果以PCA或UCA含量比相应蛋白含量的方式输出。
图12为实施例1条件下制备得到的多重活性胶原对模型的组织形态改善检测结果。从图中可以看出，与阴性对照组相比，试验样品多重活性胶原在浓度为2.5mg/mL时，在/>模型条件处理下，模型角质层疏松、活细胞层减少的现象得到明显的改善，空泡减少，活细胞数增多。说明多重活性胶原对受损组织的形态改善具有促进作用。
图13为实施例1条件下制备得到的多重活性胶原对模型内屏障相关蛋白表达量的检测结果。从图中可以看出，与阴性对照组相比，试验样品多重活性胶原在浓度为2.5mg/mL时，在/>模型条件处理下，屏障相关蛋白FLG、LOR和TGM1的蛋白表达量明显提升(p<0.05)。说明多重活性胶原能促进受损组织内屏障相关蛋白FLG、LOR和TGM1的表达，使其含量明显提升。
图14为实施例1条件下制备得到的多重活性胶原对模型的组织活力改善检测结果。从图中可以看出，与阴性对照组相比，试验样品多重活性胶原在浓度为2.5mg/mL时，在/>模型条件处理下，组织活力明显提升(p<0.01)。说明多重活性胶原能有效提升受损组织的组织活力。
图15为实施例1条件下制备得到的多重活性胶原对模型内天然保湿因子PCA，UCA表达量的检测结果。从图中可以看出，与阴性对照组相比，试验样品多重活性胶原在浓度为2.5mg/mL时，在/>模型条件处理下，对天然保湿因子PCA，UCA的表达量显著升高。说明多重活性胶原具有一定的保湿功效。
综上所述，在皮肤刺激损伤中，样品多重活性胶原可明显提升组织活力，改善组织形态，提升屏障相关蛋白FLG、LOR和TGM1的蛋白表达量，说明多重活性胶原具有一定的屏障损伤修复功效。同时，样品多重活性胶原对天然保湿因子PCA，UCA的表达量显著升高，说明多重活性胶原具有一定的保湿功效。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。
Claims (6)
1.一种制备多重活性胶原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）预处理：将动物皮片进行预处理，去除毛发和脂肪；
（2）去除杂蛋白：将预处理完成的皮片，用NaOH和/或NaCl浸泡处理；
（3）酶解：将步骤（2）处理后的皮片投入到醋酸溶液中，加入一定量的胃蛋白酶，酶解处理；
（4）梯度化反应：将步骤（3）得到的酶解溶液分成至少两份；
a.其中第一份，调节料液温度至38~42℃，匀速搅拌，待料液完全失去粘度，加入一定量的胃蛋白酶，调节料液pH值为1.8~2.2，反应温度为25~37℃，反应一段时间；反应结束，调节料液pH值至10.0~10.5，保持一段时间，再调节料液pH值至7.0~7.5，完成后，室温保存；
b.其中第二份，加入一定量的蛋白酶，升温至40~45℃，pH至4~4.5，反应一段时间；反应结束，调节料液pH值至10.0~10.5，保持一段时间，再调节料液pH值至7.0~7.5，完成后，室温保存；
c.将上述第一份和第二份得到的料液混合；
（5）压滤：将上述步骤（4）制备得到的料液，用滤布袋过滤去除残渣，再依次经过5μm和0.45μm滤芯过滤后，得到溶液；
（6）纳滤：用纳滤设备先将压滤后的料液浓缩，然后再洗滤脱盐；
（7）冷冻干燥：将步骤6得到的料液用冻干机冷冻干燥，得到所述多重活性胶原；
所述步骤（3）中，胃蛋白酶的添加量为0.1%~1%；料液比为1:20~1:80；酶解pH为1.8~2.2；酶解温度为4~25℃；酶解时间为24~48h；
所述步骤（4）a中，胃蛋白酶的添加量为0.1~0.5%，反应时间为3~8h；
所述步骤（4）b中，所述蛋白酶为菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶中的一种或两种；蛋白酶的添加量为0.003%~0.1%；反应时间为2~6h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）具体包括以下步骤：将动物湿皮片用剃毛器剔除表面长毛，用剖层机剖去绒毛层和脂肪层，清洗干净后用粉碎机切成碎片，冷冻备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，NaOH溶液的浓度为4%~8%、NaCl溶液的浓度为8%~15%、料液比为1:5~1:10、浸泡时间为0.5~4h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，分成两份溶液，所述第一份溶液与所述第二份溶液的体积比为1:1~3:1。
5. 由权利要求1~4任一项所述的方法制备获得的多重活性胶原，其特征在于，所述胶原的分子量范围为1~300 kDa，呈梯度分布；分子量50kDa以上的大分子胶原所占比例为25%~30%，分子量10~50kDa的中分子胶原所占比例为55%~60%，分子量10kDa以下的小分子胶原所占比例为10%~20%。
6.一种权利要求5所述的多重活性胶原在制备修复/护理皮肤的药品、保健品或者护肤品中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210137537.7A CN114317661B (zh) | 2022-02-15 | 2022-02-15 | 一种制备多重活性胶原的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210137537.7A CN114317661B (zh) | 2022-02-15 | 2022-02-15 | 一种制备多重活性胶原的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114317661A CN114317661A (zh) | 2022-04-12 |
| CN114317661B true CN114317661B (zh) | 2024-04-09 |
Family
ID=81029827
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210137537.7A Active CN114317661B (zh) | 2022-02-15 | 2022-02-15 | 一种制备多重活性胶原的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114317661B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114634563A (zh) * | 2022-02-16 | 2022-06-17 | 惠州华阳医疗器械有限公司 | 活性胶原提取液及制备方法、系统以及护肤品及制备方法 |
| CN115944545B (zh) * | 2023-03-10 | 2023-05-26 | 广州贝塔健康生物科技有限公司 | 一种三螺旋胶原蛋白真皮水凝胶及其制备方法和应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4894441A (en) * | 1987-03-12 | 1990-01-16 | Istituto Gentili S.P.A. | Process for the preparation of collagen and obtained product |
| US5316942A (en) * | 1993-06-16 | 1994-05-31 | Battelle Memorial Institute | Process for the production of low-cost soluble high-molecular weight collagen |
| JP2006151847A (ja) * | 2004-11-26 | 2006-06-15 | Nitta Gelatin Inc | コラーゲンペプチド組成物とその製造方法、化粧料組成物 |
| CN1903918A (zh) * | 2006-07-31 | 2007-01-31 | 华南理工大学 | 一种提取胶原的方法及用胶原制备胶原蛋白的方法 |
| CN107522782A (zh) * | 2017-09-26 | 2017-12-29 | 天津市天大天福生物技术有限公司 | 一种梯度胶原蛋白及胶原多肽分子的制备方法及其应用 |
| CN107653291A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-02-02 | 西藏央金生态农牧科技有限公司 | 多步酶法协同制备藏牦牛皮胶原蛋白和胶原多肽的方法 |
| CN112608380A (zh) * | 2020-12-03 | 2021-04-06 | 青岛大学附属医院 | 一种猪皮一定范围分子量胶原蛋白制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109602896A (zh) * | 2019-01-11 | 2019-04-12 | 无限极（中国）有限公司 | 一种胶原蛋白肽和弹性蛋白肽的组合物及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-02-15 CN CN202210137537.7A patent/CN114317661B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4894441A (en) * | 1987-03-12 | 1990-01-16 | Istituto Gentili S.P.A. | Process for the preparation of collagen and obtained product |
| US5316942A (en) * | 1993-06-16 | 1994-05-31 | Battelle Memorial Institute | Process for the production of low-cost soluble high-molecular weight collagen |
| JP2006151847A (ja) * | 2004-11-26 | 2006-06-15 | Nitta Gelatin Inc | コラーゲンペプチド組成物とその製造方法、化粧料組成物 |
| CN1903918A (zh) * | 2006-07-31 | 2007-01-31 | 华南理工大学 | 一种提取胶原的方法及用胶原制备胶原蛋白的方法 |
| CN107522782A (zh) * | 2017-09-26 | 2017-12-29 | 天津市天大天福生物技术有限公司 | 一种梯度胶原蛋白及胶原多肽分子的制备方法及其应用 |
| CN107653291A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-02-02 | 西藏央金生态农牧科技有限公司 | 多步酶法协同制备藏牦牛皮胶原蛋白和胶原多肽的方法 |
| CN112608380A (zh) * | 2020-12-03 | 2021-04-06 | 青岛大学附属医院 | 一种猪皮一定范围分子量胶原蛋白制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114317661A (zh) | 2022-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114317661B (zh) | 一种制备多重活性胶原的方法 | |
| CN110237022A (zh) | 一种冻干粉、溶媒及其应用 | |
| CN103505377B (zh) | 一种具皮肤活性的多肽组合物 | |
| CN102762189B (zh) | 包含长角豆提取物作为促进水通道蛋白表达活性剂的化妆品和/或药物组合物 | |
| JP5887407B2 (ja) | 複合コラーゲンスポンジ及びその製造方法 | |
| KR20120092494A (ko) | 분해 안정화된, 생체 적합성 콜라겐 매트릭스 | |
| CN111991336B (zh) | 一种多效凝胶精华及其制备方法与应用 | |
| CN109674686A (zh) | 一种修护受损皮肤的组合物及其制备方法 | |
| CN116987151B (zh) | 一种脐带间充质干细胞上清液在皮肤修复以及抗衰老组合物中的制备方法及应用 | |
| CN113318003A (zh) | 一种水母多肽及其应用 | |
| Levenson et al. | Some studies of wound healing: experimental methods, effect of ascorbic acid and effect of deuterium oxide | |
| CN102892404B (zh) | 豌豆的肽水解产物作为保湿活性剂的用途 | |
| CN111557863A (zh) | 一种含透明质酸和多元醇的组合物在提高水溶性维生素皮肤透过性中的应用 | |
| CN111588652A (zh) | 一种含透明质酸和多元醇的组合物及其应用 | |
| CN1875920B (zh) | 重组人血白蛋白和酵母酵素混合物、含有此混合物的组合物，其制备工艺及用途 | |
| CN108815094A (zh) | 一种细胞外基质冻干粉的用途 | |
| CN111961119B (zh) | 多肽在制备促进胶原蛋白分泌的药物或化妆品中的用途 | |
| CN115363988A (zh) | 一种胶原面膜纸的制备方法 | |
| CN114053166B (zh) | 一种酰化ⅰ型胶原蛋白水光针的制备方法 | |
| CN110526958B (zh) | 一种活力修复肽Tvigour A及其应用 | |
| JP2533376B2 (ja) | 皮膚化粧料 | |
| CN111700818A (zh) | 一种祛皱抗衰人参多肽化妆水及其制备方法 | |
| CN117599033B (zh) | 一种抗皮肤老化制剂及其应用 | |
| CN109700669A (zh) | 一种胶原蛋白面膜及其制备方法 | |
| CN108812639A (zh) | 一种细胞外基质冻干粉 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |